Dobbel harpiksstøping av mikro-beregnet tomografi, eller DUCT, muliggjør visualisering, digitalisering og segmentering av to rørformede systemer samtidig for å lette 3D-analyse av organarkitektur. DUCT kombinerer ex vivo-injeksjon av to radiopakke harpikser etterfulgt av mikro-beregnet tomografiskanning og segmentering av tomografiske data.
Leveren er det største indre organet hos mennesker og mus, og høy autofluorescens utgjør en betydelig utfordring for å vurdere organets tredimensjonale (3D) arkitektur på hele organnivå. Leverarkitektur er preget av flere forgrening lumeniserte strukturer, som kan fylles med harpiks, inkludert vaskulære og biliære trær, og etablerer et svært stereotypt mønster i det ellers hepatocyttrike parenchyma. Denne protokollen beskriver rørledningen for å utføre dobbel harpiksstøping av mikroberegnet tomografi, eller “DUCT”. DUCT innebærer å injisere portalvenen og vanlig gallekanal med to forskjellige radiopakke syntetiske harpikser, etterfulgt av vevsfiksering. Kvalitetskontroll ved å fjerne en lobe, eller hele leveren, med et optisk clearingmiddel, gjør det mulig å forhåndsscreene passende injiserte prøver. I den andre delen av DUCT-rørledningen kan en lobe eller hele leveren brukes til mikro-beregnet tomografi (microCT) skanning, (semi-)automatisert segmentering og 3D-gjengivelse av portalens venøse og biliære nettverk. MicroCT resulterer i 3D-koordinatdata for de to harpiksene som muliggjør kvalitativ og kvantitativ analyse av de to systemene og deres romlige forhold. DUCT kan brukes på postnatal og voksen mus lever og kan videre utvides til andre rørformede nettverk, for eksempel vaskulære nettverk og luftveier i lungene.
Organharpiksstøping er en teknikk som dateres tilbake til 1600-tallet1. Et av de første eksemplene på moderne harpiksstøping ble utført på den menneskelige leveren fra en obduksjon. Intrahepatiske gallekanaler ble fylt med et kontrastmiddel blandet med gelatin, etterfulgt av avbildning med røntgen CT-skanning2. Målet med DUCT-teknikken er å visualisere, digitalisere og analysere to rørformede harpiksstøpte nettverk, i tandem, i 3D.
DUCT er basert på den omfattende eksisterende kunnskapen om leverharpiksstøping i ett system3,4,5,6,7,8 og strekker seg til samtidig 3D-visualisering og analyse av to systemer9. DUCT avanserte enkeltharpiksstøping til dobbel harpiksstøping ved å blande to røntgentette harpikser med forskjellig kontrast og injisere disse harpiksene i to forskjellige nettverk, spesielt den vanlige gallekanalen og portalvenen. DUCT kan påføres unge postnatale mus med reproduserbare resultater så tidlig som postnatal dag 15 (P15). Sammenlignet med mikroskopibaserte avbildningsteknikker, er den største fordelen at DUCT er raskere, antistofffri, og levervevs autofluorescens forstyrrer ikke avbildning. Videre gir DUCT kvantitative data som beskriver lumeniseringsstatus, intern diameter, nettverkstilkobling og perfusjon. Differensiering mellom tilstedeværelsen av lumendannende celler og deres de facto morfogenese i rør er avgjørende for å analysere organer der kanalceller er til stede, men ikke danner rør, som det kan være tilfelle i Alagille syndrom10. Den største ulempen ved DUCT er den begrensede penetrasjonen av harpiksen, som er viskøs og ikke kommer inn i rør med et lite kaliber (<5 μm). DUCT kan brukes på hvilken som helst rørformet struktur etter å ha bestemt injeksjonsinngangspunktet, for eksempel arterielle og venøse sirkulasjonssystemer, luftveier, ekstrahepatisk gallekanal eller lymfatiske kar. Det kan dermed legge til rette for hel organarkitekturanalyse av andre vev som lunger og bukspyttkjertel.
MikroCT-segmenterte bilder kan behandles ved hjelp av kommersielt tilgjengelig bildebehandlingsprogramvare, for eksempel ImageJ, eller spesialskrevne rørledninger (f.eks. Den harpiksinjiserte leveren kan analyseres kvalitativt for nettverksutvidelse og tilkobling eller kvantitativt for volum, lengde, forgrening, tortuositet av et enkelt system, og samspillet mellom to systemer som avstanden mellom to systemer, eller grenpunktavhengighet (forgrener system 1 seg i nærheten av system 2-forgrening?). DUCT-rørledningen som omfatter harpiksininjeksjon, mikro-CT-skanning og CT-datasegmentering, kombinert med detaljert kvantitativ analyse av arkitektoniske mekanismer i to rørformede systemer, kan gi en standard for hele leveranalyse i dyremodeller.
Flere kritiske trinn bestemmer DUCT-suksess, fra prøvepreparering til parametrene til CT-enheten. For å oppnå de beste resultatene, bør godt kontrasterte, godt injiserte og boblefrie harpiks brukes til å tillate enkel digital behandling med automatisert terskelverdi for å skaffe 3D-data, bilder og filmer. Med opplæring og følg denne protokollen er 90% av injeksjonene vellykkede og resulterer i reproduserbare data. Det er viktig å bruke fersk gul harpiks for å oppnå den beste kontrasten mellom de to injiserte systemene. Den gule harpiksen har en veldig sterk radiokapasitet, mens den blå harpiksen har uoppdagelig radiokapasitet. Toppresultater oppnås i løpet av de første tre månedene etter åpning av en ny gul harpiksflaske. Med tiden utfelles harpiks, og etter lengre lagring (>6 måneder) vil de gule og grønne harpiksene ikke lenger skille seg ut i CT-skanninger. Bilder med dårlig kontrast krever omfattende og tidkrevende manuell sporing og segmentering av de to systemene. Deretter er godt strukket rør uunnværlig for å passe inn i den vanlige gallekanalen til voksne mus og vanlig gallekanal og portalåre av postnatale mus. Inngangspunktet for injeksjonen må opprettes med forsiktighet. Hvis den vanlige gallekanalen er kuttet åpen tverrgående, er det sannsynlig å løsne fra det omkringliggende vevet, og forhindrer vellykket inngang av slangen. Dette trinnet er spesielt delikat for postnatale mus der den vanlige gallekanalen trekker seg tilbake og “krøller seg opp” hvis den har løsnet fra det omkringliggende vevet, noe som gjør innsetting av slangen ekstremt utfordrende. Den vanlige gallekanalen oppføring og injeksjon kan kreve litt øvelse. Mens du forbereder slangen med harpiks og gjennom hele injeksjonen, unngå bobledannelse da bobler vil skape negativ plass i CT-bildene og kreve tidkrevende manuell korreksjon. Det er viktig å forsiktig massere leveren ved å rulle over overflaten med en fuktet bomullspinne under og etter injeksjonsprosedyren, da dette letter jevn harpiksspredning. Etter ferdigstillelse av injeksjon og fjerning av slangen, må silke sutur knuten strammes raskt og forsiktig, slik at harpiksen ikke strømmer ut av leveren før den polymeriserer helt. For vellykket mikro-avbildning må prøven festes riktig med agarose og termisk tilpasset for å eliminere bevegelsesartefakter i CT-dataene. Anskaffelsesinnstillingene er også av avgjørende betydning, som bør optimaliseres for å oppnå en tilstrekkelig romlig løsning for å løse fine strukturer.
Tekniske modifikasjoner på injeksjonsprosedyren kan gjøres for å oppnå injeksjon hos yngre mus. For tiden er harpiksstøping av yngre muselever begrenset av tilgjengeligheten av tilstrekkelig tynne rør, med PE10 som den minste kommersielt tilgjengelige slangen. Tanimizu et al. injiserte vellykket karbonblekk i embryonal dag 17 (E17) vanlig gallekanal ved hjelp av glasskapillærer11. Fremtidig testing av om harpiks kan leveres via glasskapillær vil derfor være av interesse. DUCT ble videre tilpasset for å injisere andre rørformede systemer som luftveiene og lungearteriens vaskulatur i lungene9. Den doble harpiksinjeksjonen kan også modifiseres for bruk sammen med andre kommersielt tilgjengelige harpikser, eller denne protokollen kan brukes til injeksjoner med karbonblekk.
En av de viktigste begrensende faktorene i DUCT-rørledningen er harpiksviskositeten. DUCT kan bare brukes til harpiksstøping av rørformede strukturer over en diameter på 5 μm. I dette datasettet kan harpiksen trenge inn i rør med den minste diameteren på 5 μm9. Denne størrelsesbegrensningen utelukker analyse av fine ductules og små kapillærer. For ytterligere å fremme DUCT-rørledningen til mindre kaliberfartøy, bør andre kommersielt tilgjengelige harpikser testes, eller utviklingen av nye radiopaque-midler med lav viskositet kan forbedre lumenpenetrasjonen.
I Hankeova et al.9 ble DUCT sammenlignet med to andre vanlige teknikker, dobbeltkarbonblekkinjeksjoner etterfulgt av vevsrydding og standardfotografering, og iDISCO+ med farging av blodårene med alfa-glatt muskelcelle actin og gallekanaler med cytokeratin 7, etterfulgt av 3D-avbildning9. DUCT utkonkurrerte de to andre metodene når det gjaldt dobbel analyse (som var utfordrende for iDISCO + på grunn av høy lever autofluorescence), 3D-avbildning og kvantifisering (ikke mulig med karbonblekkinjeksjon), og lumenisering (DUCT gir data for den interne lumenarkitekturen og systemperfusjonen). Som nevnt ovenfor er hovedbegrensningen av DUCT den minste lumenstørrelsen som kan injiseres og analyseres (5 μm grense), en parameter der både karbonblekkinjeksjon og iDISCO + presterte bedre. DUCT er overlegen enkeltsystemharpiksstøping3,5,6 fordi det tillater analyse av hvert injisert system separat og letter også dobbel 3D-undersøkelse for å studere det arkitektoniske forholdet mellom de to systemene.
DUCT kan brukes til å studere to rørformede nettverk i 3D. Som prinsippbevis ble DUCT brukt til å visualisere leverens galle- og portalåresystemer og lungearteriens vaskulatur og luftveier i lung9. De intrahepatiske gallekanalene utvikler seg ved siden av portalvenen, og portalvenen gir en strukturell mal og signalsenter som regulerer veksten og differensiering av biliærtreet12. I Hankeova et al.9 utforsket DUCT biliær regenerering i en musemodell for den menneskelige barnesykdommen Alagille syndrom. DUCT avslørte tidligere urapporterte arkitektoniske mekanismer som biliærsystemet brukte for å oppnå et vilt-type-lignende volum9. Alagille syndrom musene brukte to forskjellige strategier: (1) i hilar og sentrale regioner i leveren, biliærsystemet økte sin forgrening, og (2) i leveren periferi, de novo-genererte gallekanaler var svært tortuous. Disse to faktorene kombinert for å gi et nesten normalt biliært systemvolum, til tross for den unormale arkitekturen. Videre oppdaget DUCT unormal gallekanalgrening som skjedde uavhengig av portalvenegrening og gallekanaler som danner forbindelsesbroer mellom to portalårer9. Disse fenotypene ville være umulige å oppdage i enkeltharpiksstøping og kunne feiltolkes i 2D histologiske seksjoner som gallekanalproliferasjon. DUCT gir dermed data som beskriver 3D-arkitekturen til to rørformede nettverk på hele organ- eller lobenivå med mulighet for kvalitativ og grundig kvantitativ analyse. DUCT kan være en ny standard for postnatal leverutvikling og leverregenereringsanalyser i ulike dyremodeller.
The authors have nothing to disclose.
Vi takker Kari Huppert og Stacey Huppert for deres ekspertise og hjelp til gallekanalkannasjon og deres laboratoriegjestfrihet. Vi takker også Nadja Schultz og Charlotte L. Mattsson for deres hjelp med vanlig gallekanalkannasjon.
Vi takker følgende tilskuddsbyråer for deres støtte:
For arbeid i ERA Lab: Karolinska Institutet (2-560/2015-280), Stockholms Läns Landsting (CIMED (2-538/2014-29)), Ragnar Söderbergs stiftelse (Svensk stiftelses startstipend), European Association for the Study of the Liver (Daniel Alagille Award), Swedish Heart-Lung Foundation (20170723) og Vetenskapsrådet (2019-01350).
For arbeid i JK Lab: Vi anerkjenner CzechNanoLab Forskningsinfrastruktur støttet av MEYS CR (LM2018110). J.K. takket være støtten fra grant FSI-S-20-6353.
1.5 mL SafeSeal micro tubes | Sarstedt | 72.706 | |
23 G butterfly needle with tubing | BD bioscience | 367283 | |
25 G needle | BD bioscience | 305122 | |
30 G needle | BD bioscience | 305106 | |
Agarose | Top-Bio | P045 | |
Benzyl alcohol | Sigma Aldrich | 108006 | |
Benzyl benzoate | Sigma Aldrich | B6630 | |
Corning 50 mL tubes | Sigma Aldrich | CLS430829-500EA | polypropylene |
Cotton swabs | Medicarier | 60406 | |
Dissection Microscope | Leica Camera AG | Leica M60 | |
Dulbecco's phosphate-buffered saline | ThermoFisher Scientific | 14190144 | |
Ethanol 70% | VWR | 83801.41 | |
Falcon tube 15 mL | Verkon | 331.850.084.006 | |
Forceps curved | Fine Science Tools | 11051-10 | Fine Graefe 10 cm curved |
Forceps straight | Fine Science Tools | 11050-10 | Fine Graefe 10 cm straight |
Formaldehyde solution | Sigma Aldrich | F8775 | |
GE Phoenix v|tome|x L 240 | Waygate Technologoies | micro computed tomography scanner | |
Hanks' Balanced Salt Solution | ThermoFisher Scientific | 14025092 | |
Heparin | Leo Pharma | B01AB01 | 5000 IE/mL |
Isolfurane | Baxter | FDG9623 | |
Methanol | ThermoFisher Scientific | 11413413 | |
MICROFIL | Flowtech | MV-122 | synthetic resin yellow |
MICROFIL | Flowtech | MV-120 | synthetic resin blue |
MICROFIL | Flowtech | MV-diluent | clear resin diluent |
Pasteur pipette | Verkon | 130.690.424.503 | |
Peristaltic pump | AgnThos | 010.6131.M20 | |
phoenix datos|x 2.0 software | Baker Hughes | CT data reconstruction software | |
Rocker | VWR | 444-0142 | |
Silk suture | AgnThos | 14757 | Black silk, 4-0, sterile, 100 m |
Skin scissor | Fine Science Tools | 14058-09 | Iris straight tip 9 cm |
Spring scissor | Fine Science Tools | 15000-03 | Vannas micro, straight tip 2 mm |
Syringe 1 mL Luer | BD bioscience | 303172 | |
Tubing PE10 | BD bioscience | 427401 | |
Tubing PE50 | BD bioscience | 427411 | |
VG Studio MAX 3.3 software | Volume Graphics GmbH | CT data processing and analysis software |