Summary
Dubbelhartsgjutning mikro-datortomografi, eller DUCT, möjliggör visualisering, digitalisering och segmentering av två rörsystem samtidigt för att underlätta 3D-analys av organarkitektur. DUCT kombinerar ex vivo injektion av två radiopaque hartser följt av mikro-datortomografi skanning och segmentering av tomographic data.
Abstract
Levern är det största inre organet hos människor och möss, och hög autofluorescens utgör en betydande utmaning för att bedöma organets tredimensionella (3D) arkitektur på helorgansnivå. Leverarkitektur kännetecknas av flera förgrenande lumeniserade strukturer, som kan fyllas med harts, inklusive kärl- och gallträd, vilket etablerar ett mycket stereotypt mönster i den annars hepatocytrika parenkym. Detta protokoll beskriver rörledningen för att utföra dubbelhartsgjutning mikro-datortomografi, eller "DUCT". DUCT innebär att injicera portalvenen och den gemensamma gallgången med två olika radiopaque syntetiska hartser, följt av vävnad fixering. Kvalitetskontroll genom att rensa en lob, eller hela levern, med ett optiskt clearingmedel, möjliggör förkontroll av lämpligt injicerade prover. I den andra delen av DUCT-rörledningen kan en lob eller hela levern användas för mikro-datortomografi (microCT) skanning, (semi-)automatiserad segmentering och 3D-rendering av portalens venösa och gallnät. MicroCT resulterar i 3D-koordinatdata för de två hartserna som möjliggör kvalitativ såväl som kvantitativ analys av de två systemen och deras rumsliga relation. DUCT kan appliceras på postnatal och vuxen muslever och kan vidare utvidgas till andra rörformiga nätverk, till exempel kärlnät och luftvägar i lungorna.
Introduction
Orgelhartsgjutning är en teknik som går tillbaka till 1600-talet1. Ett av de första exemplen på modern hartsgjutning utfördes på den mänskliga levern från en obduktion. Intrahepatic galla kanaler fylldes med ett kontrastmedel blandat med gelatin, följt av imaging med en röntgen CT scan2. Syftet med DUCT-tekniken är att visualisera, digitalisera och analysera två tubulära hartsgjutna nätverk, tillsammans, i 3D.
DUCT bygger på omfattande befintlig kunskap om ensystems leverhartsgjutning3,4,5,6,7,8 och sträcker sig till samtidig 3D-visualisering och analys av två system9. DUCT avancerad enkelhartsgjutning till dubbel hartsgjutning genom att blanda två radiopaque hartser av olika kontrast och injicera dessa hartser i två olika nätverk, särskilt den gemensamma gallgången och portalvenen. DUCT kan appliceras på unga postnatala möss med reproducerbara resultat redan efter födseln dag 15 (P15). Jämfört med mikroskopibaserade avbildningstekniker är den största fördelen att DUCT är snabbare, antikroppsfri och att autofluorescens av levervävnad inte stör avbildningen. Vidare tillhandahåller DUCT kvantitativa data som beskriver lumeniseringsstatus, intern diameter, nätverksanslutning och perfusion. Differentiering mellan förekomsten av lumenbildande celler och deras de facto morfogenes i rör är avgörande för att analysera organ där dukulära celler är närvarande men inte bildar rör, som kan vara fallet i Alagille syndrom10. Den största nackdelen med DUCT är den begränsade penetrationen av hartset, som är trögflytande och inte går in i rör med liten kaliber (<5 μm). DUCT kan appliceras för alla rörformiga strukturer efter bestämning av injektionsingången, såsom kranskärlens och venösa cirkulationssystem, luftvägarna, den extrahepatiska gallgången eller lymfkärlen. Det skulle därmed kunna underlätta hela organarkitektur analys av andra vävnader såsom lungor och bukspottkörtel.
MicroCT-segmenterade bilder kan bearbetas med hjälp av kommersiellt tillgängliga bildbehandlingsprogram, till exempel ImageJ, eller specialskrivna pipelines (t.ex. MATLAB). Den hartsinsprutade levern kan analyseras kvalitativt för nätverksexpansion och anslutning eller kvantitativt för volym, längd, förgrening, tortuositet hos ett enda system och interaktionen mellan två system som avståndet mellan två system eller branchpointberoende (förgrenar sig system 1 i närheten av system 2-förgrening?). DUCT-rörledningen som omfattar hartsinjektion, microCT-skanning och CT-datasegmentering, i kombination med detaljerad kvantitativ analys av arkitektoniska mekanismer i två rörsystem, kan ge en standard för helleveranalys i djurmodeller.
Protocol
Protokollet som beskrivs i denna studie godkändes och följer djurskyddsreglerna och djurskyddsbestämmelserna från Stockholms Norra Djurförsöksetiska nämnd. De djur som användes i denna studie var vilda eller homozygous Jag1H268Q mutanta möss på en blandad C3H/N och C57bl6J bakgrund. Både män och kvinnor ingick i studien. Djuren användes vid postnatal dag 15 eller som vuxna mellan 3 och 8 månader.
1. Dubbla hartsinjektioner
- Förberedelse
- Förbered hartslösning. För dubbla systemhartsinjektioner, förbered både gula och gröna hartser enligt beskrivningen i stegen 1.1.2-1.1.4.
- Förbered 1 ml alikvot spädt harts per mus.
- Gult harts: Späd gult silikongummi (hög radiopacitet) med klar utspädning i 3:1 för att bereda gult harts för injektion.
- Grönt harts: Blanda blått silikongummi (oidentifierbar radiopacitet) med klar utspädning i en 1:1 utspädning för att förbereda blått harts. För att generera grönt harts, blanda det utspädda blå hartset med det utspädda gula hartset i ett förhållande av 1:1. Virvla det gröna hartset noggrant tills färgen är homogen.
OBS: Blått harts har mycket låg radiopacitet som inte kan detekteras med microCT, vilket därför kräver utspädning med gult harts för att skapa två hartser med olika radiopaciteter.
VARNING: Harts kan innehålla blykromat, som är cancerframkallande. Det producerar giftiga gaser i en brand. Hantera med försiktighet och kassera hartset som farligt avfall. - Förbered två injektionsset (injektionsuppsättning #1 och injektionsuppsättning #2) med slangar enligt beskrivningen i stegen 1.1.6-1.1.11.
OBS: För vuxna möss (>P30 (postnatal dag 30) = P30 - 2 år), använd injektionsset #1 (PE10 slangar med 0,6 mm ytterdiameter) för vanlig gallkanalinjektion och injektionsuppsättning #2 (PE50 slangar med 0,96 mm ytterdiameter) för portalveninsprutning. För unga postnatala möss (upp till P30), förbered två #1 injektionsset, en för gallgång och en för portalveninjektion (ingen injektionsuppsättning # 2 eftersom portalvenen är för smal för att rymma PE50-slangar). - För att förbereda injektionsuppsättning #1, skär 30 cm PE10-slangar och sträck ena änden av slangen för hand genom att dra den tills den blir så tunn som möjligt (figur 1A,B, cirka 0,15 mm diameter, icke-sträckt PE10-slangar är 0,6 mm diameter).
- Skär spetsen på den sträckta PE10-slangen diagonalt för att skapa en fasad spets (bild 1B).
- Anslut den osträckta änden av PE10-slangen till en 30 G-nål (bild 1A, injektionsuppsättning #1).
- För att förbereda injektionsuppsättning #2, skär 30 cm PE50-slangar och sträck ena änden av slangen för hand genom att dra den tills den blir tillräckligt tunn för att passa in i portalvenen (figur 1A, B, cirka 0,7 mm, icke-sträckt PE50-slang är 0,96 mm diameter).
- Skär spetsen på den sträckta PE50-slangen diagonalt för att skapa en fasad spets (bild 1B).
- Anslut den icke-sträckta änden av PE50-slangen till en 23 G nål (figur 1A, injektionsuppsättning #2).
OBS: Varje injektionsset kan endast användas för en injektion eftersom hartset härdar i sprutan och slangarna. Justera storleken på den sträckta och fasade spetsen baserat på storleken på den gemensamma gallgången och portalvenen på musen, beroende på dess ålder, genotyp och fenotyp. När du är osäker på slangens storlek och passform, sätt in slangen i lämplig kanal eller kärl efter snittet och innan slangen fylls med harts. Om slangen är för bred för att få plats i kanalen/kärlet, sträck den vidare. - Bedöva djuret genom isofluraninandning (första 4% i induktionskammaren och ~ 2% med noskonen).
- Placera musen på en ventilerad bänk på en dissekeringsplatta medan musen andas isofluran genom noskonen. Kontrollera att djuret är medvetslöst med en institut/IRB-rekommenderad metod, t.ex. genom att klämma en av tassarna.
VARNING: Isofluran kan orsaka dåsighet eller yrsel vid inandning och kan orsaka skador på hjärt-kärlsystemet och centrala nervsystemet genom långvarig eller upprepad exponering. Andas inte in det. Hantera ämnet på en ventilerad bänk och i välventilerade utrymmen.
OBS: Det är möjligt att använda en annan bedövningsmetod, så länge den är kompatibel med hjärtperfusion. - När djuret är medvetslöst, spraya ventralsidan med 70% etanol för att förhindra störningar från päls.
- Använd hudsax, skär huden, fascian och muskelskiktet från mitten av bukhålan och skär igenom till brösthålan för att exponera de inre organen.
- Ta tag i xiphoidprocessen med tång för att lyfta bröstbenet och skära membranet och revbensburen på båda sidor för att exponera hjärtat och lungorna.
- Ta bort revbenskorgen genom att skära genom revbenen på vänster och höger sida av bröstkorgen med sax. Var extra försiktig så att du inte skadar levern eftersom detta kommer att resultera i läckage av hartset.
- Använd raka tångar, dra hjärtat mot levern och skär bort rätt förmak.
- Sätt in en fjärilsnål (23 G), ansluten till en peristaltisk perfusionspump, i vänster kammare. Perfusera musen transcardially med Hanks balanserad saltlösning (HBSS) och heparin (1 U/g mus kroppsvikt). Perfusera i 3 min med en perfusionshastighet på 5 mL/min.
OBS: Om musen perfunderas korrekt blir de inre organen bleka, särskilt levern. Om lungorna istället blir vita sätts nålen in i höger kammare och ska flyttas om. Efter perfusion exsanguineras musen och kan avlägsnas från noskonen och isofluranen. - Stäng av isofluranpumpen.
- Hartsinjektion - Gallsystemhartsgjutning
- Flytta musen till dissekeringsmikroskopet, buken upp, svansen mot experimenteraren och gå bort från experimenteraren. De anatomiska landmärkena av intresse är avbildade i figur 2A.
- Lokalisera den sämre vena cava (figur 2A) genom att flytta tarmen åt sidan. Använd vårsaxen för att göra ett litet tvärgående snitt i den sämre vena cava för att tillåta frisättning av levervaskulärt tryck (figur 2Bi).
- Exponera den gemensamma gallgången och portalvenen enligt beskrivningen i steg 1.2.4- 1.2.6.
- Flytta tarmen och bukspottkörteln till höger sida (av experimenteraren) med hjälp av en fosfatbuffrad saltlösning (PBS)-fuktad bomullspinne.
- Vänd den ventrala sidan av levern mot hjärtat med hjälp av DEN PBS-fuktade bomullspinnen för att exponera den viscerala ytan och hilarregionen.
- Lokalisera den gemensamma gallgången som löper från hilarregionen över bukspottkörteln och in i tarmen vid oddis sfinkter (figur 2Bii, vanlig gallgång skisserad med den gula prickade linjen, svarta pilspetsar pekar mot Sfinkter of Oddi).
OBS: Se till att levern är fuktig under hela proceduren genom att sprinkla den med PBS. - Rensa omgivande vävnad (område ~ 5 mm) från den gemensamma gallgången med raka tångar. Placera silkessykningstråden (storlek 4-0, 0,17 mm, 3 - 5 cm lång) under den gemensamma gallgången (figur 2Bii) och knyt en lös överhandsknut runt den gemensamma gallgången (figur 2Biii).
OBS: Välj ett område för knuten halvvägs mellan hilarregionen och sfinktern i Oddi och på något avstånd från portalvenen så att efter att suturen har dragits runt den gemensamma gallgången, kommer den inte att störa portalveninjektionen. - Håll vårsaxen platt mot den gemensamma gallgången för att göra ett snett snitt på den gemensamma gallgången på den plats där den gemensamma gallgången kommer in i bukspottkörteln och tarmarna bredvid Oddis sfinkter. (Figur 2Biv), gul prickad linje beskriver sfinktern i Oddi-regionen, betonad av svarta pilspetsar).
OBS: Detta är ett avgörande steg. Gör ett snedt och inte ett tvärsnitt och gör ett snitt; snå inte gallgången. Att skära genom hela gallgången gör införandet av slangen mycket utmanande. - Strax före användning, blanda 1 ml av det gula hartset med 50 μL av härdningsmedlet (genom att fylla och tömma 1 ml spruta) och fyll en 1 ml Luer spruta med harts - härdningsmedel blandning.
- Anslut den fyllda sprutan med slangen (ställ in #1). Tryck på kolven för att fylla slangen helt. Se till att harts-/härdningsmedlets blandning droppar från slangspetsen.
OBS: Undvik och ta bort bubblor i sprutan och slangen för bästa resultat. - Använd tång, räta ut området runt det gemensamma gallgångssnittet och för in slangen i öppningen i den gemensamma gallgången (figur 2Bv), med den längsta kanten av den fasade spetsen nedåt mot gallgångens dorsala sida. Denna orientering säkerställer att harts kan lämna slangöppningen, som är vänd uppåt, in i kanalen (figur 2Bv).
- Dra åt silkestrådknuten för att säkra slangen inuti den gemensamma gallgången (figur 2Bvi).
- Injicera hartset i den gemensamma gallgången. Observera gallblåsan och de enskilda leverloberna.
- Massera levern med en PBS-våt bomullspinne för att hjälpa till att sprida hartset lika. Hartsfyllda gallgångars terminalgrenar (hos möss av vild typ) är svagt synliga vid leverytan.
OBS: Förväntad tid att fylla levern är 30 -100 s. - Sluta injicera hartset när prickar av harts uppträder vid leverytan (figur 2Ci, blå pilspetsar) eller när motståndet är uppfyllt.
OBS: Arbeta så snabbt som möjligt eftersom hartset börjar härda efter tillsats av hartshärdningsmedlet. Arbetstiden från tillsats av härdningsmedlet är cirka 15 min. - Ta bort slangen genom att dra ut den ur den gemensamma gallgången och dra snabbt åt silkeknuten med tång för att förhindra att hartset läcker ut. Skär bort de lösa ändarna av silkessyssten, så att de inte stör portalveninjektionen.
- Kasta slangen som innehåller harts och återstående harts i det farliga avfallet och nålen i vassavfallet.
- Hartsinjektion - Portal venhartsgjutning
- Rensa portalvenen (område ~5 mm) från dess omgivande vävnad ca 2 cm från dess ingång till levern med raka tångar. Placera silkessykningstråden (storlek 4-0, 0,17 mm, 3 - 5 cm lång) under portalvenens rensade område (figur 2Ci) och knyt en lös överhandsknut (figur 2Cii).
- Gör ett längsgående snitt i portalvenen distala levern och knuten (figur 2Ciii).
- Blanda 1 ml av det gröna hartset med 50 μL av härdningsmedlet (genom att fylla på och tömma en 1 ml spruta) och fyll 1 ml Luerspruta med hartshärdningsmedlet.
- Anslut den fyllda sprutan med slangen (ställ in #2 för >P30 möss, ny uppsättning #1 för
OBS: Undvik och ta bort bubblor i sprutan och slangen för bästa resultat. - Använd tång genom att räta ut portalvenen genom att dra den omgivande vävnaden mot experimenteraren och för in slangen med den längsta kanten av den fasade spetsen mot kärlets dorsala sida (figur 2Ciii).
- Dra åt silkestråden för att säkra slangen i portalvenen.
- Injicera hartset i portalvenen. Observera blodkärlen som fylls med harts. Massera levern med en PBS-våt bomullspinne för att hjälpa till att sprida hartset lika (figur 2Civ).
- Sluta injicera hartset när alla blodkärl är fyllda (ändarna av portalvener är synliga i leverperifären) eller när motståndet är uppfyllt.
OBS: Arbeta snabbt eftersom hartset börjar härda efter tillsats av härdningsmedlet. Arbetstiden från tillsats av härdningsmedlet är cirka 15 min för injektionsuppsättning #1 och 25 min för injektionsuppsättning #2. - Ta bort slangen genom att dra ut slangen från portalvenen och dra snabbt åt sidenknuten med tång för att förhindra att hartset läcker ut.
- Kasta slangen som innehåller harts och återstående harts i det farliga avfallet och nålen i vassavfallet.
- Lever dissekering och fixering
- Dissekera ut hela levern genom att skära bort den från den omgivande vävnaden och membranet.
- Placera försiktigt hela levern i ett tomt koniskt rör på 50 ml med den ventrala sidan vänd uppåt och ryggsidan vilande på väggen i det koniska röret för att förhindra deformation av levern. Förvara det koniska röret horisontellt över natten vid 4 °C för att hartset ska härda helt.
OBS: Alla behållare som är tillräckligt stora för att passa levern kan användas istället för 50 ml koniskt rör. Att använda en platt bottenbehållare ökar sannolikheten för att levern inte deformeras. - Separera levern i enskilda lober. Gör ett urval av de lober som ska användas för mikroCT-analys (1.4.4-1.4.5) eller kvalitetskontroll (1.4.6-1.4.8). Använd eventuellt hela levern för både optisk clearing och microCT utan att separera den i enskilda lober.
OBS: Leverarkitekturen i gall- och kärlsystemen är olika i varje lob, och matchade lobanalyser krävs därför. Den optiska rensningen stör inte microCT-skanningen, och lober som används för kvalitetskontroll kan därefter skannas med microCT. Omvänt kan prover som skannas med microCT därefter optiskt rensas för jämförelse. Hela leveranalysen är därmed möjlig. I möss av vildtyp (C3H/C57bl6 genetisk bakgrund) fylls rätt mediala lob först av hartsinjektioner, vilket gör detta till en lämplig lob för mikroCT-analys, med högsta reproducerbarhet. Den vänstra sidoloben är den största loben, där det därför är enkelt att förskärma för injektionskvalitet. Valet av lober (eller hel lever) som används för kvalitetskontroll och microCT-skanning är beroende av djurmodellen och forskningsfrågan. - I en ventilerad huva, förbered 4% formaldehydlösning (10-20 ml per rör). Fixera lober som används för microCT med 4% formaldehyd över natten vid 4 °C och tvätta efteråt en gång med PBS (10-20 ml per rör).
- Samla formaldehydavfall i en separat behållare. Håll leverloberna i PBS vid 4 °C för korttidsförvaring eller 70% etanol för långtidsförvaring. Fortsätt med avsnitt 2: Mikro-datortomografi.
VARNING: Formaldehyd orsakar akut toxicitet vid förtäring, inandning eller hudkontakt. Formaldehyd är en brandfarlig vätska och ånga. Det orsakar svåra hudskador och ögonskador. Kan orsaka en allergisk hudreaktion. Dödligt vid inandning (koncentrerat eller i pulver). Kan orsaka irritation i luftvägarna. Misstänks orsaka genetiska defekter. Kan orsaka cancer. Orsakar skador på organ (ögon, centrala nervsystemet). Försiktighetsförklaringar - håll dig borta från värme, heta ytor, gnistor, öppna lågor och andra antändningskällor. Rökning förbjuden. Använd skyddshandskar och skyddskläder. Vid spill, ta omedelbart av alla kläder som var förorenade. Vid kontakt med huden: skölj det förorenade området med vatten. Vid inandning: avlägsna personen till frisk luft och övervaka andningen om det är bekvämt. Ring omedelbart ett giftcenter/ läkare. Om i ögonen: skölj ögonen med vatten i flera minuter. Om det finns och är möjligt, ta bort kontaktlinser. - För kvalitetskontroll, fixera de återstående lober (minst en) med 50% metanol (blandad med avjoniserat vatten) i minst 4 h, gunga vid rumstemperatur, följt av 100% metanol över natten gungning vid rumstemperatur. Samla metanolavfall i en separat behållare.
VARNING: Metanol orsakar akut toxicitet vid förtäring, inandning eller hudkontakt. Metanol är en brandfarlig vätska och ånga. Använd skyddshandskar och skyddskläder. Undvik att andas vid hantering och håll dig borta från eld och värme. Tvätta huden noggrant efter användning. Vid spill, ta omedelbart av alla förorenade kläder. Skölj huden med vatten. Vid inandning: Avlägsna personen till frisk luft och håll dig bekväm för andning. Vid inandning, förtäring eller exponerad, ring ett giftcenter/ läkare. - I en ventilerad huva, förbered bensylalkohol och bensylbensoat (BA: BB, 1:2) (5-10 ml per lob).
- Placera leverloben i ett 15- eller 50- ml polypropylenrör (beroende på lobens storlek) som innehåller BABB-lösning. Låt den gunga i rumstemperatur tills den är genomskinlig. Detta steg kan ta mellan 2-16 h beroende på lobens storlek.
OBS: BABB-lösningen löser upp vissa typer av plast. Det är säkert att lagra proverna i polypropylenrör eller glasbehållare.
VARNING: Bensylbensoat kan orsaka akut toxicitet vid förtäring. Det är giftigt för vattenlevande organismer med långvariga effekter. Försiktighetsförklaringar: tvätta huden noggrant efter hantering. Det är skadligt vid förtäring, hudkontakt eller inandning. Undvik att andas in rök/ångor. Tvätta händerna noggrant efter hantering. Ät, drick eller rök inte när du använder denna produkt. Vid förtäring - ring ett giftcenter/läkare om du är sjuk Använd i ventilerade utrymmen. Samla spill. Kassera innehåll/behållare till en godkänd avfallshanteringsanläggning. - Kontrollera injektionens kvalitet. Endast väl injicerad lever ska skannas med microCT.
2. Mikroberäkningstomografi
- Provberedning
- Förbered 1% agarosgel genom att blanda 100 ml destillerat vatten och 1 g agarospulver. Placera blandningen i en mikrovågsugn och koka lösningen tills agarospulvret löser sig.
- Temperera 1% agarosgel till ~ 40 °C för att undvika termiska skador på leverprovet.
- Placera loben/loberna av intresse i ett koniskt rör på 15 ml och fyll den med 1% agarosegel till cirka 2/3 av rörets totala volym. Det här steget minimerar oönskad provrörelse under CT-mätning.
- CT-mätning
Obs: Följande steg är CT-enhetsberoende, och specifika inställningar och åtgärder kan skilja sig åt för olika CT-enheter och tillverkare. I detta protokoll var den mikro-beräknade tomografiskannern som användes utrustad med ett nanofokusröntgenrör (180 kV/ 15 W) och plattskärmsdynamik 41|100 (4048 px x 4048 px, pixelstorlek 100 mm med binning 2) för CT-mätningarna.- Montera det koniska röret på 15 ml med provet på rotationssteget på en CT-anordning och låt det termiskt anpassa sig till mätkammaren i minst 1 tim.
- När provet är termiskt anpassat centrerar du det i synfältet (FOV).
- Optimera källprovet och provdetektoravstånden (SSD, SDD) för att uppnå tillräcklig voxelupplösning, t.ex. 12 μm för ett vuxenprov av murinlever eller 6,5 μm för
- Ställ in anskaffningsparametrarna (dvs. accelererande spänning och ström, exponering, binning, medelvärde) enligt CT-enhetstillverkarens rekommendationer för att nå en tillräcklig nivå av detekterad signal. Dessa parametrar är inte bara CT-enhetsberoende utan också provberoende och bör optimeras för varje prov. I Hankeova et al.9 var inställningarna: 80 kV accelererande spänning, 160 μA accelererande ström, 400 ms exponeringstid och 2000 bilder.
- Starta en CT-mätning. Använd en dedikerad tomografisk rekonstruktionsprogramvara för att rekonstruera CT-data.
3. Analys och datasegmentering
OBS: Följande steg är programberoende av bildbehandling. specifika inställningar och åtgärder kan variera beroende på vilken programvara som används.
- Läs in CT-data: Välj kommandot Importera > > fil. Ett ytterligare urval är beroende av det specifika formatet på de CT-data som ska behandlas.
- Använd funktionen Surface Determination på den övre panelen för att segmentera hartset i data med hjälp av global trösklar. I dialogfönstret bestämmer du tröskelvärdet med histogramutvärdering genom att ställa in positionen för den röda "Isovalue"-linjen för att segmentera endast de hartsfyllda kärlen (dvs. som omfattas av den gula linjen i den presenterade "Förhandsgranskningspanelen") (figur 3A).
- På den vänstra panelen väljer du modulen Skapa ROI från volym/CAD/mesh för att skapa en region av intresse (ROI) för de hartsfyllda kärlen. Använd alternativet Skapa ROI(er) från Heldragen i dialogfönstret, välj namnet på den bearbetade volymen och bekräfta.
- Eliminera felaktig segmentering av bruskluster i bakgrundsregionen för denna ROI. Markera denna ROI på höger panel, högerklicka på den och välj modulen Split ROI.
- I dialogfönstret anger du parametern Minsta volym [voxel] för att utesluta alla bruspartiklar – det här värdet är experiment- och databeroende och måste optimeras för varje prov som ska analyseras (bild 3B).
- Skapa släta, kontinuerliga och fasta kanalmasker utan artefakter i den hartsgjutna ROI - t.ex. närvaro av luftbubblor eller hartsläckage.
- Använd modulen Utjämning på den vänstra panelen, ställ in parametern Utjämningsstyrka på 1 eller 2 (beroende på enskilda data, när högre värden kan leda till modelldeformation, särskilt när det gäller fina strukturer). Kör den här processen två gånger om det behövs (bild 3C).
- Identifiera och separera de enskilda rörformiga systemen i den segmenterade hartsmasken.
- Skapa en separat ROI för systemet fyllt med det mer absorptiva hartset (det gula hartset som används för den gemensamma gallkanalinjektionen) med högre intensitetsvärden i CT-data. Följ proceduren som beskrivs i steg 3.2. (Figur 3Di).
- Markera den nya ROI och hartsmasken ROI, högerklicka och välj Subtrahera ROI(S) och subtrahera den nya AVKASTNINGEN från hartsmasken ROI för att skapa en ny ROI för det återstående rörsystemet (figur 3Dii, iii).
- Exportera de resulterande ROM:erna för båda rörsystemen i olika format, baserat på operatörspreferenser, för efterföljande bearbetning i olika program. Bearbeta vidare de resulterande ROIs i en volymgrafikprogramvara för att exportera den slutliga visualiseringen i form av en bild eller en video.
Representative Results
Vad man ska göra
Framgångsrik dubbelhartsinjektion uppnås när både intrahepatic gallgångarna och portalvenvaskulaturen är välfyllda. Som ett steg för kvalitetskontroll möjliggör röjning av en lob (till exempel den vänstra sidoloben) verifiering av en framgångsrik injektion, följt av avbildning av lober av intresse. Den optiskt rensade loben kan skannas senare med hjälp av microCT; därför är det möjligt att optiskt rensa hela levern. I väl injicerad muslever bör portalvenvaskulaturen fyllas med harts tills leverperisfären och hartset ska vara synliga i sidogrenar (figur 4), och denna arkitektur återerövras troget i mikroCT skannade och segmenterade data. Vidare bör väl injicerade intrahepatiska gallgångar vara synliga bredvid huvudportalvengrenarna som sträcker sig nästan till periferin, och harts bör vara synligt i de stora sidogrenarna. Om kontrollloben klarar kvalitetskontrollen kan loberna (inklusive den optiskt rensade) skannas med microCT. Resultatet av segmenterade data från en välinsprutad lever visas för en P15-mus (figur 4A, B) och en vuxen mus (figur 4C, D).
Vad man inte ska göra
Intakt levervävnad är en förutsättning för framgångsrik injektion. Var extra försiktig när du skär bukhålan och membranet för att inte oavsiktligt hacka levervävnaden. Om det finns fysiska skador på levern under denna procedur är det mycket troligt att hartset läcker ut under portalveninjektion (figur 5A). Det är inte möjligt att uppnå en bra injektion av kärlsystemet om levern är fysiskt skadad.
Ett av de vanliga misstagen är att underfylla levern med harts som kan leda till utmaningar för visualisering eller analys. En av orsakerna till systemets underfyllning är hartshärdning i förtid i nålen eller spetsen på slangen innan injektionen är klar (figur 5B, blå pilspetsar, fästen visar stora bubblor). En bra praxis är att använda en injektionsuppsättning per djur och arbeta snabbt efter att härdningsmedlet har tillsatts hartset. Om hartset härdar under injektionen (som kan observeras av ett halvfyllt system, här exemplifierat med en halvfylld portalvenvaskulatur) ta bort slangen, skär spetsen på slangen (alltid diagonalt för att skapa en fasad spets) och tryck kolven. Om harts börjar droppa igen, sätt försiktigt in slangen igen och säkra den med suturen. Om hartset har härdat i nålen, byt ut slangen helt, fyll den med harts (undvik bubblor), sätt försiktigt in slangen igen och säkra den med suturen. Det kan vara utmanande att byta slangen, särskilt hos unga postnatala möss
Omvänt blir ett eller båda systemen överfyllda med harts (figur 5D). Det är nödvändigt att visuellt övervaka levern under hela injektionen. Gallsystemgjutning med harts är mer utmanande än portalvenhartsgjutning eftersom hartsfyllda kanaler endast är svagt synliga på leverytan, och det är svårt att bedöma när systemet är nästan fullt och när man ska stoppa. När små gula harts prickar uppträder på leverytan (figur 2Ci, blå pilspets), är detta ett tecken på att gallsystemet är helt fyllt och hartset börjar läcka ut ur kanalerna. Mindre hartsläckage kan korrigeras manuellt under mikroCT-datasegmentering (figur 5D, höger paneler).
Om injektionstrycket är för högt kan detta leda till att kärl eller kanaler spricker (figur 5E), irreversibelt skadligt kärl- eller kanalarkitektur. Levern kommer inte att vara lämplig för microCT skanning eller analys. För att undvika överfyllning av harts, optimera rätt volym och tryck som används för injektion i varje musmodell. Vid arbete med möss som har utmanats med en giftig diet, genetisk modifiering eller leverskada som påverkar gall- eller vensystemen, eller leverstelhet, kan injektionstrycket och volymen behöva justeras eftersom volym och tryck som tolereras kan skilja sig från möss av vildtyp. Detta protokoll beskriver den manuella injektionen av de två systemen, men det är möjligt att ansluta sprutan till en pump för att standardisera injektionstrycket. Bubblor är en annan mycket vanlig injektionsartefakt som leder till gles fyllning av rörformiga nätverk (figur 5F-H, blå pilspetsar). För att undvika bubbelbildning, se till att sprutan och slangen inte innehåller några bubblor, är helt fyllda med harts och hartset droppar från slangspetsen före injektion. Små bubblor som visas som negativa områden på microCT-data kan korrigeras manuellt under efterbehandlingssteg, även om detta är mödosamt.
Färskt är det bästa
Att använda färskt gult harts är en avgörande faktor som avsevärt påverkar kontrasten mellan de två hartserna och mikroCT-datasegmenteringen. När det nyöppnade hartset används (figur 6A) finns det en tydlig skillnad i kontrast mellan de gula hartsinsprutade gallgångarna (ljusvita) och de gröna hartsinsprutade portalvenerna (ljusgrå). Lever som injiceras med färskt harts bearbetas enkelt med hjälp av automatiserad global tröskel. Med långvarig lagring fälls hartset ut och kontrasten minskar. Efter 3 månaders lagring kan kontrasten fortfarande vara tillräcklig för att skilja portalvenen från gallgången (figur 6B), men nederbörd påverkar blandningen av de två hartserna, vilket är synligt som en heterogen opacitet i den fyllda portalvenen (Fig 6B, blå pilspetsar). Heterogen kontrast påverkar den automatiska tröskningen negativt och kräver manuella korrigeringar, vilket ökar bearbetningstiden. Om hartset är äldre än sex månader har kontrasten försämrats till en punkt där det inte är möjligt att skilja den gulinsprutade gallgången från den gröninsprutade portalvenen enbart baserat på deras kontrast (figur 6C). I detta fall måste gallgången och portalvenen segmenteras manuellt baserat på deras diameter och position i hilarregionen och följas manuellt genom hela mikroCT-data. Denna procedur är extremt tidskrävande och undviks bäst.
Bild 1: Injektionsset för hartsgjutning. (A) Injektionsset #1 består av en 30 G nål och PE10 slangar som är ~ 30 cm lång. Injektionsset #2 består av en 23 G nål och PE50 slangar ~ 30 cm långa. (B) Slangspetsen sträcks och skärs i vinkel för att skapa en fasad spets. Linjalen i A och B är en centimeter linjal, med större steg på 1 cm, mellanliggande steg på 5 mm och mindre steg på 1 mm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Bild 2: Diagram över dubbelt hartsgjutningsflöde. (A) Schemat som visar det murin venösa cirkulationssystemet och hjärtat med markerat höger atrium, som bör skäras bort före perfusion, och den vänstra ventrikeln i vilken nålen ska sättas in för perfusion för att tvätta bort blodet från cirkulationssystemet. Den sämre vena cava bör avskiljas under njurarna för att lindra vaskulär tryck. B) Flödesschema för insprutningsflöde för gallgångskanalharts. i) Zoombild av (A) som visar var IVC ska avskiljas. (ii) Bild föreställande den gemensamma gallgången (gul prickad linje) från lever hilar regionen till sfinktern i Oddi (svarta pilspetsar), med sutur tråd under den rensade gemensamma galla kanalen. iii) Lämplig position för lös överhandsknut runt gemensam gallgång. iv) Den gula prickade linjen och de svarta pilspetsarna märker Oddis sfinkter, vilket visar den sneda vinkeln för snitt och hur öppningen ska se ut efter det sneda vinkelsnittet. v) Schematisk som visar orienteringen av PE10-slangens fasadöppning (uppåt) vid införing. vi) Utseende av gult harts som injiceras. harts bör lätt passera den löst bundna knuten. IVC, sämre vena cava; CBD, vanlig gallgång. (C) Portal venharts injektion flöde diagram. i) Den gröna prickade linjen markerar portalvenen från hilarregionen. De blå pilspetsarna märker det överfyllda gallsystemet. ii) Lämplig plats för lös överhandsknut runt portalvenen. iii) Schematisk som visar avfasningsöppningen (uppåt) vid införandet. iv) Leverutseende vid injektion av grönt harts och gult harts. notera det hartsfyllda blodkärlet i leverperifären. PV, portalven. Figur 2A skapades med Biorender.com. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Figur 3: Mikro-CT-databehandling i volymgrafikprogramvara. (A) Ytbestämning, i) överskattat isovärde (aktuell förhandsgranskning av urvalet visas i gul färg), ii) underskattat isovärde, iii) optimalt val av isovärde för korrekt ytbestämning av portalvener och gallgångar. (B) Uppdelning av intresseområde (ROI) som skapas genom ytbestämning, i) ange värdet i dialogfönstret tillräckligt högt för att endast ett segment (det största) ska finnas kvar, ii) i gula ramar visas de mindre (uteslutna) partiklarna. C) Ytutjämning av data, i) utjämningsfunktionen finns på den vänstra panelen, ii) ställ in utjämnande styrka på 1 (max 2) och skapa ny utjämnad ROI, iii) utjämnade data. D) Uppdelning av enskilda rörsystem, i) i) i ytbestämningsfunktionen fastställs isovärdet så att endast gallsystemet ingår i urvalet (aktuell förhandsgranskning av urvalet visas i gul färg), ii) markera avkastningen för båda systemen och ROI för endast gallsystemet och subtrahera gallsystemet ROI från ROI i båda systemen. iii) Portalven som visas i grått, det gallsystem som visas i grönt. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Figur 4: Välinsprutade gallgångssystem (BD) och portalvensystem (PV) (A) Optiskt rensad höger medialalob (RML) av postnatal dag 15 (P15) lever injicerad med två hartser i de två systemen. Skalstång 1 mm. (B) 3D-rendering av P15 RML som visas i A) som visar portalvenvaskulatur i vitt och gallsystem i grönt. Skalstång 1 mm. (C) Optiskt rensad RML av vuxen lever injiceras med två hartser i de två systemen. Skalstång 1 mm. (D) 3D-rendering av RML för vuxna som visas i C och som visar portalvenvaskulatur i vitt och gallsystem i grönt. H = hilar, P = perifer. Skalstång 1 mm. Panelerna A, B, D är anpassade med tillstånd från Hankeova m.fl.9. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Figur 5: Vanliga utmaningar med dubbla hartsleverinjektioner. (A) Bilden föreställer en lever som oavsiktligt stals under den första öppningen av bukhålan, och hartset läcker genom snittet (blå pilspets). B) Dåligt injicerat portalvensystem på grund av hartshärdning. Blå pilspetsar märker tomma terminalgrenar och röda hakparenteser märker stora bubblor. Skalstång 1 mm. (C) Dåligt injicerat portalvensystem på grund av dålig transkardiär perfusion. Blå pilspetsar märker blod synligt i terminalgrenarna. Skalstång 1 mm. (D) Överfyllt gallsystem manifesterat av isolerade bollar av harts. De vänstra panelerna visar den optiskt rensade levern, och de högra panelerna visar den 3D-mikroCT-renderade bilden. De blå prickade konturerna visar inzoomningsregioner. De svarta pilspetsarna märker en del av levern som skadades under den optiska clearingen efter microCT-skanning. Skalstång 1 mm. (E) Högt tryck under hartsinjektion kan orsaka bristning av portalvenen (djuret i denna panel bär en Jag1H268Q-mutation), markerad med blå pilspetsar. Skalstång 1 mm. (F) Bubblor i hartset under portalveninjektion (blå pilspetsar) och (G) gallsysteminjektion (blå pilspets), skalstång 1 mm . (H) MicroCT-skanning av bubblor (blå pilspets), dåligt fyllda terminalgrenar (röda fästen) och hartsläckage (gul pilspets), skalstång 1 mm. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 6: Differentialhartskontrast. (A) Nyöppnat gult harts ger tillräcklig kontrast för att särskilja hartsinsprutade portalvener (grå) och gallgångar (vita). B) Tre månaders lagring av gult harts leder till utfällning av hartset, vilket resulterar i heterogen opacitet (gråvit portalven, blå pilspets). C) Långvarig lagring (>6 månader) av gult harts minskar kontrasten mellan portalvenen (grå) och gallgångarna (grå). Skalstreck 100 μm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Discussion
Flera kritiska steg avgör DUCT-framgång, från provberedning till CT-enhetens parametrar. För att uppnå bästa resultat bör välkontrast, välinsprutat och bubbelfritt harts användas för att möjliggöra enkel digital bearbetning med automatiserad tröskel för att få 3D-data, bilder och filmer. Med utbildning och efter detta protokoll, 90% av injektionerna är framgångsrika och resulterar i reproducerbara data. Det är viktigt att använda färskt gult harts för att uppnå bästa kontrast mellan de två injicerade systemen. Det gula hartset har en mycket stark radiopacitet, medan det blå hartset har oidentifierbar radiopacitet. Toppresultat uppnås inom de första tre månaderna efter öppnandet av en ny gul hartsflaska. Med tiden fälls harts ut, och efter längre lagring (>6 månader) kommer de gula och gröna hartserna inte längre att kunna särskiljas i CT-skanningar. Bilder med dålig kontrast kräver omfattande och tidskrävande manuell spårning och segmentering av de två systemen. Därefter är välsträckt slang oumbärlig för att passa in i den gemensamma gallgången hos vuxna möss och gemensam gallkanal och portalven hos postnatala möss. Injektionsstället måste skapas varsamt. Om den gemensamma gallgången skärs upp tvärgående, är det troligt att den lossnar från den omgivande vävnaden, vilket förhindrar framgångsrikt inträde av slangen. Detta steg är särskilt känsligt för postnatala möss där den gemensamma gallgången dras tillbaka och "krullar upp" om den har lossnat från sin omgivande vävnad, vilket gör införandet av slangen extremt utmanande. Den gemensamma gallgångens ingång och injektion kan kräva viss övning. När du förbereder slangen med harts och under hela injektionen, undvik bubbelbildning eftersom bubblor kommer att skapa negativt utrymme i CT-bilderna och kräver tidskrävande manuell korrigering. Det är viktigt att försiktigt massera levern genom att rulla över ytan med en våt bomullspinne under och efter injektionsförfarandet eftersom detta underlättar jämn spridning av harts. Efter avslutad injektion och avlägsnande av slangen måste silkessystknuten dras åt snabbt och försiktigt, så hartset inte strömmar ut ur levern innan det polymeriseras helt. För framgångsrik mikroCT-avbildning måste provet vara korrekt fastsatt med agaros och termiskt anpassat för att eliminera rörelseartefakter i CT-data. Förvärvsinställningarna är också av avgörande betydelse, som bör optimeras för att nå en adekvat rumslig upplösning för att lösa fina strukturer.
Tekniska ändringar av injektionsförfarandet kan göras för att uppnå injektion hos yngre möss. För närvarande begränsas hartsgjutning av yngre muslever av tillgången på tillräckligt tunna slangar, med PE10 som den minsta kommersiellt tillgängliga slangen. tanimizu m.fl. framgångsrikt injicerat kolbläck i embryonala dag 17 (E17) gemensam galla kanal med hjälp av glas kapillärer11. Framtida tester av om harts kan levereras via kapillär av glas skulle därför vara av intresse. DUCT anpassades ytterligare för att injicera andra rörformiga system såsom luftvägarna och pulmonell gatan vaskulaturen i lungorna9. Dubbelhartsinjektionen kan också modifieras för att användas med andra kommersiellt tillgängliga hartser, eller detta protokoll kan användas för injektioner med kolbläck.
En av de viktigaste begränsande faktorerna i DUCT-rörledningen är hartsviskositeten. DUCT kan endast användas för hartsgjutning av rörformiga strukturer över en diameter av 5 μm. I denna datauppsättning kan hartset penetrera rör med den minsta diametern på 5 μm9. Denna storleksbegränsning utesluter analys av fina duktuler och små kapillärer. För att ytterligare föra DUCT-rörledningen vidare till mindre kalibriga kärl bör andra kommersiellt tillgängliga hartser testas, eller utvecklingen av nya radiopapper med låg viskositet kan förbättra lumenpenetrationen.
I Hankeova et al.9 jämfördes DUCT med två andra vanliga tekniker, dubbla kolbläckinjektioner följt av vävnadsrensning och standardfotografering och iDISCO+ med färgning av blodkärlen med alfa-slät muskelcell aktin och galla kanaler med cytokeratin 7, följt av 3D imaging9. DUCT överträffade de andra två metoderna när det gäller dubbel analys (som var utmanande för iDISCO + på grund av hög leverautoscens), 3D-avbildning och kvantifiering (inte möjligt med kolbläckinjektion) och lumenisering (DUCT tillhandahåller data för den interna lumenarkitekturen och systemperfusion). Som nämnts ovan är huvudbegränsningen för DUCT den minsta lumenstorleken som kan injiceras och analyseras (5 μm gräns), en parameter där både kolbläckinjektion och iDISCO+ presterade bättre. DUCT är överlägsen enkel systemhartsgjutning3,5,6 eftersom det möjliggör analys av varje injicerat system separat och underlättar också dubbel 3D-undersökning för att studera det arkitektoniska förhållandet mellan de två systemen.
DUCT kan tillämpas för att studera två rörformade nätverk i 3D. Som bevis på princip användes DUCT för att visualisera lever galla och portal ven system och pulmonell gatan vaskulatur och luftvägarna i lung9. De intrahepatiska gallgångarna utvecklas intill portalvenen, och portalvenen ger en strukturell mall och signalcenter som reglerar tillväxten och differentieringen av gallträdet12. I Hankeova et al.9 utforskade DUCT gallregenerering i en musmodell för den mänskliga pediatriska sjukdomen Alagille syndrom. DUCT avslöjade tidigare orapporterade arkitektoniska mekanismer som gallsystemet använde för att uppnå en vild-typ-liknande volym9. Alagille syndrom möss använde två olika strategier: (1) i hilar och centrala regioner i levern, galla systemet ökade sin förgrening, och (2) i levern periferi, de novo-genererade galla trummor var mycket plågsam. Dessa två faktorer kombinerades för att ge en nästan normal gallsystem volym, trots den onormala arkitekturen. Dessutom upptäckte DUCT onormal galla trumman förgrening som inträffade oberoende av portal ven förgrening och galla kanaler bildar anslutande broar mellan två portal vener9. Dessa fenotyper skulle vara omöjliga att upptäcka i enda harts gjutning och kan misstolkas i 2D histologiska avsnitt som galla trumman spridning. DUCT tillhandahåller således data som beskriver 3D-arkitekturen för två rörformiga nätverk på hela organ- eller lobnivå med möjlighet till kvalitativ och djupgående kvantitativ analys. DUCT kan vara en ny standard för postnatal leverutveckling och leverregenereringsanalyser i olika djurmodeller.
Disclosures
Ett separat projekt i ERA-labbet finansieras av ModeRNA. ModeRNA hade ingen roll i projektet/protokollet som beskrivs här.
Acknowledgments
Vi tackar Kari Huppert och Stacey Huppert för deras expertis och hjälp med gallgångsburkulering och deras laboratorie gästfrihet. Vi tackar också Nadja Schultz och Charlotte L. Mattsson för deras hjälp med gemensam gallgångsburkulering.
Vi tackar följande beviljande organ för deras stöd:
För arbete i ERA Lab: Karolinska Institutet (2-560/2015-280), Stockholms Läns Landsting (CIMED (2-538/2014-29)), Ragnar Söderbergs stiftelse (Stiftelsens startbidrag), Europeiska föreningen för leverstudier (Daniel Alagille Award), Hjärt-Lungfonden (20170723) och Vetenskapsrådet (2019-01350).
För arbete i JK Lab: Vi bekräftar CzechNanoLab Research Infrastructure som stöds av MEYS CR (LM2018110). J.K. tack vare stödet från bidraget FSI-S-20-6353.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL SafeSeal micro tubes | Sarstedt | 72.706 | |
| 23 G butterfly needle with tubing | BD bioscience | 367283 | |
| 23 G needle | BD bioscience | 305892 | |
| 30 G needle | BD bioscience | 305106 | |
| Agarose | Top-Bio | P045 | |
| Benzyl alcohol | Sigma Aldrich | 108006 | |
| Benzyl benzoate | Sigma Aldrich | B6630 | |
| Corning 50 mL tubes | Sigma Aldrich | CLS430829-500EA | polypropylene |
| Cotton swabs | Medicarier | 60406 | |
| Dissection Microscope | Leica Camera AG | Leica M60 | |
| Dulbecco's phosphate-buffered saline | ThermoFisher Scientific | 14190144 | |
| Ethanol 70% | VWR | 83801.41 | |
| Falcon tube 15 mL | Verkon | 331.850.084.006 | |
| Forceps curved | Fine Science Tools | 11051-10 | Fine Graefe 10 cm curved |
| Forceps straight | Fine Science Tools | 11050-10 | Fine Graefe 10 cm straight |
| Formaldehyde solution | Sigma Aldrich | F8775 | |
| GE Phoenix v|tome|x L 240 | Waygate Technologoies | micro computed tomography scanner | |
| Hanks' Balanced Salt Solution | ThermoFisher Scientific | 14025092 | |
| Heparin | Leo Pharma | B01AB01 | 5000 IE/mL |
| Isolfurane | Baxter | FDG9623 | |
| Methanol | ThermoFisher Scientific | 11413413 | |
| MICROFIL | Flowtech | MV-122 | synthetic resin yellow |
| MICROFIL | Flowtech | MV-120 | synthetic resin blue |
| MICROFIL | Flowtech | MV-diluent | clear resin diluent |
| Pasteur pipette | Verkon | 130.690.424.503 | |
| Peristaltic pump | AgnThos | 010.6131.M20 | |
| phoenix datos|x 2.0 software | Baker Hughes | CT data reconstruction software | |
| Rocker | VWR | 444-0142 | |
| Silk suture | AgnThos | 14757 | Black silk, 4-0, sterile, 100 m |
| Skin scissor | Fine Science Tools | 14058-09 | Iris straight tip 9 cm |
| Spring scissor | Fine Science Tools | 15000-03 | Vannas micro, straight tip 2 mm |
| Syringe 1 mL Luer | BD bioscience | 303172 | |
| Tubing PE10 | BD bioscience | 427401 | |
| Tubing PE50 | BD bioscience | 427411 | |
| VG Studio MAX 3.3 software | Volume Graphics GmbH | CT data processing and analysis software |
References
- Narat, J. K., Loef, J. A., Narat, M. On the preparation of multicolored corrosion specimens. The Anatomical Record. 64, 155-160 (1936).
- Ludwig, J., et al. Anatomy of the human biliary system studied by quantitative computer-aided three-dimensional imaging techniques. Hepatology. 27, 893-899 (1998).
- Masyuk, T. V., Ritman, E. L., LaRusso, N. F. Quantitative assessment of the rat intrahepatic biliary system by three-dimensional reconstruction. American Journal of Pathology. 158, 2079-2088 (2001).
- Masyuk, T. V., Ritman, E. L., LaRusso, N. F. Hepatic artery and portal vein remodeling in rat liver: Vascular response to selective cholangiocyte proliferation. American Journal of Pathology. 162, 1175-1182 (2003).
- Sparks, E. E., et al. Notch signaling regulates formation of the three-dimensional architecture of intrahepatic bile ducts in mice. Hepatology. 51, 1391-1400 (2010).
- Cuervo, H., et al. Endothelial notch signaling is essential to prevent hepatic vascular malformations in mice. Hepatology. 64, 1302-1316 (2016).
- Thakurdas, S. M., et al. Jagged1 heterozygosity in mice results in a congenital cholangiopathy which is reversed by concomitant deletion of one copy of Poglut1 (Rumi). Hepatology. 63, 550-565 (2016).
- Walter, T. J., Sparks, E. E., Huppert, S. S. 3-Dimensional resin casting and imaging of mouse portal vein or intrahepatic bile duct system. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (68), e4272 (2012).
- Hankeova, S., et al. DUCT reveals architectural mechanisms contributing to bile duct recovery in a mouse model for Alagille syndrome. Elife. 1, 1-29 (2021).
- Andersson, E. R., et al. Mouse model of Alagille syndrome and mechanisms of Jagged1 missense mutations. Gastroenterology. 154, 1080-1095 (2018).
- Tanimizu, N., et al. Intrahepatic bile ducts are developed through formation of homogeneous continuous luminal network and its dynamic rearrangement in mice. Hepatology. 64, 175-188 (2016).
- Ober, E. A., Lemaigre, F. P. Development of the liver: Insights into organ and tissue morphogenesis. Journal of Hepatology. 68, 1049-1062 (2018).
