Dubbelhartsgjutning mikro-datortomografi, eller DUCT, möjliggör visualisering, digitalisering och segmentering av två rörsystem samtidigt för att underlätta 3D-analys av organarkitektur. DUCT kombinerar ex vivo injektion av två radiopaque hartser följt av mikro-datortomografi skanning och segmentering av tomographic data.
Levern är det största inre organet hos människor och möss, och hög autofluorescens utgör en betydande utmaning för att bedöma organets tredimensionella (3D) arkitektur på helorgansnivå. Leverarkitektur kännetecknas av flera förgrenande lumeniserade strukturer, som kan fyllas med harts, inklusive kärl- och gallträd, vilket etablerar ett mycket stereotypt mönster i den annars hepatocytrika parenkym. Detta protokoll beskriver rörledningen för att utföra dubbelhartsgjutning mikro-datortomografi, eller “DUCT”. DUCT innebär att injicera portalvenen och den gemensamma gallgången med två olika radiopaque syntetiska hartser, följt av vävnad fixering. Kvalitetskontroll genom att rensa en lob, eller hela levern, med ett optiskt clearingmedel, möjliggör förkontroll av lämpligt injicerade prover. I den andra delen av DUCT-rörledningen kan en lob eller hela levern användas för mikro-datortomografi (microCT) skanning, (semi-)automatiserad segmentering och 3D-rendering av portalens venösa och gallnät. MicroCT resulterar i 3D-koordinatdata för de två hartserna som möjliggör kvalitativ såväl som kvantitativ analys av de två systemen och deras rumsliga relation. DUCT kan appliceras på postnatal och vuxen muslever och kan vidare utvidgas till andra rörformiga nätverk, till exempel kärlnät och luftvägar i lungorna.
Orgelhartsgjutning är en teknik som går tillbaka till 1600-talet1. Ett av de första exemplen på modern hartsgjutning utfördes på den mänskliga levern från en obduktion. Intrahepatic galla kanaler fylldes med ett kontrastmedel blandat med gelatin, följt av imaging med en röntgen CT scan2. Syftet med DUCT-tekniken är att visualisera, digitalisera och analysera två tubulära hartsgjutna nätverk, tillsammans, i 3D.
DUCT bygger på omfattande befintlig kunskap om ensystems leverhartsgjutning3,4,5,6,7,8 och sträcker sig till samtidig 3D-visualisering och analys av två system9. DUCT avancerad enkelhartsgjutning till dubbel hartsgjutning genom att blanda två radiopaque hartser av olika kontrast och injicera dessa hartser i två olika nätverk, särskilt den gemensamma gallgången och portalvenen. DUCT kan appliceras på unga postnatala möss med reproducerbara resultat redan efter födseln dag 15 (P15). Jämfört med mikroskopibaserade avbildningstekniker är den största fördelen att DUCT är snabbare, antikroppsfri och att autofluorescens av levervävnad inte stör avbildningen. Vidare tillhandahåller DUCT kvantitativa data som beskriver lumeniseringsstatus, intern diameter, nätverksanslutning och perfusion. Differentiering mellan förekomsten av lumenbildande celler och deras de facto morfogenes i rör är avgörande för att analysera organ där dukulära celler är närvarande men inte bildar rör, som kan vara fallet i Alagille syndrom10. Den största nackdelen med DUCT är den begränsade penetrationen av hartset, som är trögflytande och inte går in i rör med liten kaliber (<5 μm). DUCT kan appliceras för alla rörformiga strukturer efter bestämning av injektionsingången, såsom kranskärlens och venösa cirkulationssystem, luftvägarna, den extrahepatiska gallgången eller lymfkärlen. Det skulle därmed kunna underlätta hela organarkitektur analys av andra vävnader såsom lungor och bukspottkörtel.
MicroCT-segmenterade bilder kan bearbetas med hjälp av kommersiellt tillgängliga bildbehandlingsprogram, till exempel ImageJ, eller specialskrivna pipelines (t.ex. MATLAB). Den hartsinsprutade levern kan analyseras kvalitativt för nätverksexpansion och anslutning eller kvantitativt för volym, längd, förgrening, tortuositet hos ett enda system och interaktionen mellan två system som avståndet mellan två system eller branchpointberoende (förgrenar sig system 1 i närheten av system 2-förgrening?). DUCT-rörledningen som omfattar hartsinjektion, microCT-skanning och CT-datasegmentering, i kombination med detaljerad kvantitativ analys av arkitektoniska mekanismer i två rörsystem, kan ge en standard för helleveranalys i djurmodeller.
Flera kritiska steg avgör DUCT-framgång, från provberedning till CT-enhetens parametrar. För att uppnå bästa resultat bör välkontrast, välinsprutat och bubbelfritt harts användas för att möjliggöra enkel digital bearbetning med automatiserad tröskel för att få 3D-data, bilder och filmer. Med utbildning och efter detta protokoll, 90% av injektionerna är framgångsrika och resulterar i reproducerbara data. Det är viktigt att använda färskt gult harts för att uppnå bästa kontrast mellan de två injicerade systemen. Det gula hartset har en mycket stark radiopacitet, medan det blå hartset har oidentifierbar radiopacitet. Toppresultat uppnås inom de första tre månaderna efter öppnandet av en ny gul hartsflaska. Med tiden fälls harts ut, och efter längre lagring (>6 månader) kommer de gula och gröna hartserna inte längre att kunna särskiljas i CT-skanningar. Bilder med dålig kontrast kräver omfattande och tidskrävande manuell spårning och segmentering av de två systemen. Därefter är välsträckt slang oumbärlig för att passa in i den gemensamma gallgången hos vuxna möss och gemensam gallkanal och portalven hos postnatala möss. Injektionsstället måste skapas varsamt. Om den gemensamma gallgången skärs upp tvärgående, är det troligt att den lossnar från den omgivande vävnaden, vilket förhindrar framgångsrikt inträde av slangen. Detta steg är särskilt känsligt för postnatala möss där den gemensamma gallgången dras tillbaka och “krullar upp” om den har lossnat från sin omgivande vävnad, vilket gör införandet av slangen extremt utmanande. Den gemensamma gallgångens ingång och injektion kan kräva viss övning. När du förbereder slangen med harts och under hela injektionen, undvik bubbelbildning eftersom bubblor kommer att skapa negativt utrymme i CT-bilderna och kräver tidskrävande manuell korrigering. Det är viktigt att försiktigt massera levern genom att rulla över ytan med en våt bomullspinne under och efter injektionsförfarandet eftersom detta underlättar jämn spridning av harts. Efter avslutad injektion och avlägsnande av slangen måste silkessystknuten dras åt snabbt och försiktigt, så hartset inte strömmar ut ur levern innan det polymeriseras helt. För framgångsrik mikroCT-avbildning måste provet vara korrekt fastsatt med agaros och termiskt anpassat för att eliminera rörelseartefakter i CT-data. Förvärvsinställningarna är också av avgörande betydelse, som bör optimeras för att nå en adekvat rumslig upplösning för att lösa fina strukturer.
Tekniska ändringar av injektionsförfarandet kan göras för att uppnå injektion hos yngre möss. För närvarande begränsas hartsgjutning av yngre muslever av tillgången på tillräckligt tunna slangar, med PE10 som den minsta kommersiellt tillgängliga slangen. tanimizu m.fl. framgångsrikt injicerat kolbläck i embryonala dag 17 (E17) gemensam galla kanal med hjälp av glas kapillärer11. Framtida tester av om harts kan levereras via kapillär av glas skulle därför vara av intresse. DUCT anpassades ytterligare för att injicera andra rörformiga system såsom luftvägarna och pulmonell gatan vaskulaturen i lungorna9. Dubbelhartsinjektionen kan också modifieras för att användas med andra kommersiellt tillgängliga hartser, eller detta protokoll kan användas för injektioner med kolbläck.
En av de viktigaste begränsande faktorerna i DUCT-rörledningen är hartsviskositeten. DUCT kan endast användas för hartsgjutning av rörformiga strukturer över en diameter av 5 μm. I denna datauppsättning kan hartset penetrera rör med den minsta diametern på 5 μm9. Denna storleksbegränsning utesluter analys av fina duktuler och små kapillärer. För att ytterligare föra DUCT-rörledningen vidare till mindre kalibriga kärl bör andra kommersiellt tillgängliga hartser testas, eller utvecklingen av nya radiopapper med låg viskositet kan förbättra lumenpenetrationen.
I Hankeova et al.9 jämfördes DUCT med två andra vanliga tekniker, dubbla kolbläckinjektioner följt av vävnadsrensning och standardfotografering och iDISCO+ med färgning av blodkärlen med alfa-slät muskelcell aktin och galla kanaler med cytokeratin 7, följt av 3D imaging9. DUCT överträffade de andra två metoderna när det gäller dubbel analys (som var utmanande för iDISCO + på grund av hög leverautoscens), 3D-avbildning och kvantifiering (inte möjligt med kolbläckinjektion) och lumenisering (DUCT tillhandahåller data för den interna lumenarkitekturen och systemperfusion). Som nämnts ovan är huvudbegränsningen för DUCT den minsta lumenstorleken som kan injiceras och analyseras (5 μm gräns), en parameter där både kolbläckinjektion och iDISCO+ presterade bättre. DUCT är överlägsen enkel systemhartsgjutning3,5,6 eftersom det möjliggör analys av varje injicerat system separat och underlättar också dubbel 3D-undersökning för att studera det arkitektoniska förhållandet mellan de två systemen.
DUCT kan tillämpas för att studera två rörformade nätverk i 3D. Som bevis på princip användes DUCT för att visualisera lever galla och portal ven system och pulmonell gatan vaskulatur och luftvägarna i lung9. De intrahepatiska gallgångarna utvecklas intill portalvenen, och portalvenen ger en strukturell mall och signalcenter som reglerar tillväxten och differentieringen av gallträdet12. I Hankeova et al.9 utforskade DUCT gallregenerering i en musmodell för den mänskliga pediatriska sjukdomen Alagille syndrom. DUCT avslöjade tidigare orapporterade arkitektoniska mekanismer som gallsystemet använde för att uppnå en vild-typ-liknande volym9. Alagille syndrom möss använde två olika strategier: (1) i hilar och centrala regioner i levern, galla systemet ökade sin förgrening, och (2) i levern periferi, de novo-genererade galla trummor var mycket plågsam. Dessa två faktorer kombinerades för att ge en nästan normal gallsystem volym, trots den onormala arkitekturen. Dessutom upptäckte DUCT onormal galla trumman förgrening som inträffade oberoende av portal ven förgrening och galla kanaler bildar anslutande broar mellan två portal vener9. Dessa fenotyper skulle vara omöjliga att upptäcka i enda harts gjutning och kan misstolkas i 2D histologiska avsnitt som galla trumman spridning. DUCT tillhandahåller således data som beskriver 3D-arkitekturen för två rörformiga nätverk på hela organ- eller lobnivå med möjlighet till kvalitativ och djupgående kvantitativ analys. DUCT kan vara en ny standard för postnatal leverutveckling och leverregenereringsanalyser i olika djurmodeller.
The authors have nothing to disclose.
Vi tackar Kari Huppert och Stacey Huppert för deras expertis och hjälp med gallgångsburkulering och deras laboratorie gästfrihet. Vi tackar också Nadja Schultz och Charlotte L. Mattsson för deras hjälp med gemensam gallgångsburkulering.
Vi tackar följande beviljande organ för deras stöd:
För arbete i ERA Lab: Karolinska Institutet (2-560/2015-280), Stockholms Läns Landsting (CIMED (2-538/2014-29)), Ragnar Söderbergs stiftelse (Stiftelsens startbidrag), Europeiska föreningen för leverstudier (Daniel Alagille Award), Hjärt-Lungfonden (20170723) och Vetenskapsrådet (2019-01350).
För arbete i JK Lab: Vi bekräftar CzechNanoLab Research Infrastructure som stöds av MEYS CR (LM2018110). J.K. tack vare stödet från bidraget FSI-S-20-6353.
1.5 mL SafeSeal micro tubes | Sarstedt | 72.706 | |
23 G butterfly needle with tubing | BD bioscience | 367283 | |
25 G needle | BD bioscience | 305122 | |
30 G needle | BD bioscience | 305106 | |
Agarose | Top-Bio | P045 | |
Benzyl alcohol | Sigma Aldrich | 108006 | |
Benzyl benzoate | Sigma Aldrich | B6630 | |
Corning 50 mL tubes | Sigma Aldrich | CLS430829-500EA | polypropylene |
Cotton swabs | Medicarier | 60406 | |
Dissection Microscope | Leica Camera AG | Leica M60 | |
Dulbecco's phosphate-buffered saline | ThermoFisher Scientific | 14190144 | |
Ethanol 70% | VWR | 83801.41 | |
Falcon tube 15 mL | Verkon | 331.850.084.006 | |
Forceps curved | Fine Science Tools | 11051-10 | Fine Graefe 10 cm curved |
Forceps straight | Fine Science Tools | 11050-10 | Fine Graefe 10 cm straight |
Formaldehyde solution | Sigma Aldrich | F8775 | |
GE Phoenix v|tome|x L 240 | Waygate Technologoies | micro computed tomography scanner | |
Hanks' Balanced Salt Solution | ThermoFisher Scientific | 14025092 | |
Heparin | Leo Pharma | B01AB01 | 5000 IE/mL |
Isolfurane | Baxter | FDG9623 | |
Methanol | ThermoFisher Scientific | 11413413 | |
MICROFIL | Flowtech | MV-122 | synthetic resin yellow |
MICROFIL | Flowtech | MV-120 | synthetic resin blue |
MICROFIL | Flowtech | MV-diluent | clear resin diluent |
Pasteur pipette | Verkon | 130.690.424.503 | |
Peristaltic pump | AgnThos | 010.6131.M20 | |
phoenix datos|x 2.0 software | Baker Hughes | CT data reconstruction software | |
Rocker | VWR | 444-0142 | |
Silk suture | AgnThos | 14757 | Black silk, 4-0, sterile, 100 m |
Skin scissor | Fine Science Tools | 14058-09 | Iris straight tip 9 cm |
Spring scissor | Fine Science Tools | 15000-03 | Vannas micro, straight tip 2 mm |
Syringe 1 mL Luer | BD bioscience | 303172 | |
Tubing PE10 | BD bioscience | 427401 | |
Tubing PE50 | BD bioscience | 427411 | |
VG Studio MAX 3.3 software | Volume Graphics GmbH | CT data processing and analysis software |