Summary
Il presente protocollo spiega un metodo per alimentare le larve delle api solitarie, Osmia excavata, con disposizioni contaminate da pesticidi. La procedura esamina l'ecotossicità del pesticida alle larve delle api solitarie.
Abstract
Le attuali valutazioni del rischio ecologico dei pesticidi sugli impollinatori hanno considerato principalmente solo le condizioni di laboratorio. Per le larve delle api solitarie, l'ingestione di provviste contaminate da pesticidi può aumentare il tasso di mortalità delle larve, diminuire il tasso di raccolta e la popolazione di api solitarie adulte nel prossimo anno da una prospettiva demografica. Ma ci sono studi limitati sugli effetti dei pesticidi sulle larve delle api solitarie. Pertanto, capire come i pesticidi influenzano le larve delle api solitarie dovrebbe essere considerato parte integrante della valutazione del rischio ecologico dei pesticidi. Questo studio presenta un metodo per esporre le larve dell'ape solitaria, Osmia excavata , a dosi letali o subletali di pesticidi, monitorando l'aumento di peso larvale, la durata dello sviluppo, la capacità di eclosione e la conversione dell'efficienza del consumo alimentare del cibo ingerito. Per dimostrare l'efficacia di questo metodo, le larve di O. excavata sono state alimentate con provviste contenenti dosi acute letali e subletali di clorpirifos. Quindi, sono stati studiati gli indici di cui sopra delle larve trattate. Questa tecnica aiuta a prevedere e mitigare il rischio di pesticidi per gli impollinatori.
Introduction
Gli impollinatori svolgono un ruolo fondamentale nei servizi ecosistemici della moderna agricoltura globale. Mentre le api mellifere (Apis mellifera; Gli imenotteri: Apidae) sono stati tradizionalmente considerati come gli impollinatori economici essenziali delle colture, recenti ricerche suggeriscono che Osmia (Hymenoptera: Megachilidae) è anche molto importante nel migliorare l'impollinazione per alcune colture, aumentando le dimensioni dei frutti e il numero di semi e riducendo la proporzione di frutta asimmetrica nei frutteti commerciali in diverse parti del mondo1. Osmia excavata è stata considerata una specie ideale per l'impollinazione delle mele, principalmente in Asia, come nel nord e nord-ovest della Cina e in Giappone 2,3,4. Può fornire servizi di impollinazione per alcune colture con efficienza simile o talvolta con maggiore efficienza. A questo proposito, è stato dimostrato che sostituiscono o lavorano in sinergia con le apimellifere 4,5,6.
Le caratteristiche biologiche di O. excavata sono uniche rispetto alle api sociali. La sua attività univoltina, solitaria e di nidificazione si verifica principalmente in primavera e all'inizio dell'estate. I nidi di O. excavata si trovano di solito in fori preesistenti, tipicamente in legno morto, piante cave, tubi di paglia e gambo di bambù nella condizione naturale3. L'adulto O. excavata emerge dal suo bozzolo per accoppiarsi, raccogliere polline e costruire un nido per deporre le uova, che iniziano a schiudersi una settimana dopo. Le uova fecondate si sviluppano in femmine, mentre le uova non fecondate si sviluppano in maschi3. Le femmine sono distribuite nella parte inferiore del tubo delle api e le disposizioni corrispondenti sono più significative. Al contrario, i maschi erano in prossimità dell'uscita del tubo con disposizioni minori7, quindi i maschi escono per primi e le femmine escono più tardi. La femmina mescola il polline con una piccola quantità di nettare in un blob umido, l'unica fonte di cibo per ogni larva nella cellula8.
Diversi studi hanno riportato una diminuzione della popolazione di insetti impollinatori 9,10. L'uso estensivo di pesticidi è stato identificato come uno dei principali fattori per ridurre l'abbondanza e la diversità degli impollinatori e può anche mettere in pericolo i servizi di impollinazione11,12. Per ridurre e mitigare gli effetti negativi dei pesticidi, è necessario condurre una valutazione del rischio dei pesticidi per gli impollinatori. Alcuni paesi hanno stabilito quadri normativi per garantire la sicurezza delle api dai pesticidi utilizzati13,14. Studi recenti hanno dimostrato che Osmia era più suscettibile ai pesticidi rispetto alle api da miele 1,15.
È interessante notare che la maggior parte delle valutazioni del rischio si sono concentrate sulle api adulte 11,12; poche ricerche sono state condotte su O. excavata, in particolare sulle larve. Inoltre, la mortalità di Osmia direttamente causata dai pesticidi è più comunemente considerata16. Tuttavia, le tossicità croniche come l'aumento di peso larvale, la durata dello sviluppo, i modelli di alimentazione, la capacità di eclosione, il successivo comportamento adulto e la fecondità possono avere lo stesso danno delle tossicità letali acute e sono spesso ignorate a causa della mancanza di un metodo sperimentale efficace per le api solitarie17.
Fino ad ora, due metodi sono utilizzati per valutare gli effetti dei pesticidi sulle larve delle api solitarie: (1) una quantità appropriata di pesticidi è stata applicata nel punto localizzato di disposizioni senza rimuovere l'uovo delle api solitarie 1,18,19,20; (2) sostituzione delle disposizioni con miscele artificiali di polline e nettare contenenti una quantità specifica di antiparassitario21. Tuttavia, ci sono alcune limitazioni ai due metodi di cui sopra. Il primo può misurare solo la tossicità acuta, ma non la tossicità cronica perché le larve hanno ingerito l'intera dose in un breve periodo di tempo; quest'ultimo porterebbe ad un alto tasso di mortalità a causa della manipolazione umana1. Qui, il metodo di immersione è stato descritto per studiare l'ecotossicità dei pesticidi a O. excavata in condizioni di ricerca altamente controllate, simulando il comportamento dell'alimentazione larvale con pesticidi residui nelle disposizioni nell'ambiente reale. Il metodo di questo studio risolve gli svantaggi dei due metodi di cui sopra ed è adatto per misurare gli effetti di una sostanza pericolosa sulla tossicità acuta e cronica.
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Protocol
1. Preparazione del tubo di alimentazione
- Praticare un foro (~ 0,3 mm di diametro) nel coperchio di un tubo di centrifuga da 2 ml utilizzando un ferro da avvolgimento elettrico (vedere Tabella dei materiali). Utilizzare un tale tubo centrifuga per mantenere una larva di O. excavata e la sua massa di fornitura.
2. Preparazione del pesticida
- Sciogliere il pesticida di grado tecnico (vedi Tabella dei materiali) in acetone per acquisire soluzioni stock di 1 x 104 μg a.i. mL-1. Quindi, eseguire diluizioni graduali della soluzione a più di cinque concentrazioni.
NOTA: in questo studio sono stati utilizzati clorpirifos a 0,1, 0,2, 0,4, 0,8, 1,6, 3,2, 6,4 μg a.i. mL-1 .
3. Preparazione delle disposizioni
- Acquisire tubi di plastica per api contenenti provviste (vedi Tabella dei materiali) e larve di O. excavata appena tratteggiate da un programma di allevamento di massa.
NOTA: Nessun pesticida è stato utilizzato da 20 giorni prima della fioritura all'intero periodo di fioritura; i risultati delle analisi chimiche hanno mostrato che i contenuti di pesticidi comunemente usati in cinquanta disposizioni selezionate a caso erano entrambi al di sotto dei livelli minimi di prova. - Separare le provviste e le larve delicatamente usando una spazzola morbida. Seleziona le larve femmine in base alle dimensioni della fornitura e alla posizione della cellula all'interno del nido9. Quindi, posizionare provviste di dimensioni uniformi e larve femminili selezionate in piastre di Petri (diametro 60 mm) e metterle da parte per l'uso.
NOTA: Cinquanta disposizioni sono state selezionate a caso per analizzare il contenuto di pesticidi comunemente usati: clorpirifos, imidacloprid, fendifenuron, phoxim, avermectina. I parametri della spazzola morbida sono (a) diametro del pennello: 0,3 mm, (b) lunghezza del pennello: 2 cm, (c) lunghezza della penna: 18 cm.
4. Fornire un trattamento con pesticidi
- Immergere le disposizioni selezionate di dimensioni uniformi (dal punto 3.2) in pesticidi diluiti (dal punto 2.1; clorpirifos a 0,1, 0,2, 0,4, 0,8, 1,6, 3,2, 6,4 μg a.i. mL-1) per 10 s utilizzando una gabbia. Immergere il controllo di controllo (CK) in solvente allo 0,2% (acetone in questo studio).
NOTA: esistono tre repliche per trattamento di concentrazione e ogni replica consisteva in 60 disposizioni. La differenza di dosaggio di ciascuna disposizione può essere ridotta selezionando disposizioni di dimensioni uniformi. - Misurare il volume della soluzione di pesticida prima e dopo aver trattato le disposizioni con il pesticida. Quindi, calcolare il volume immerso di insetticida in ciascun trattamento, comprese le 60 disposizioni di massa (Tabella supplementare 1). Posizionare le disposizioni in tubi centrifughi separati con fori (dal punto 1.1) dopo l'essiccazione all'aria su un piano di lavoro sterile.
NOTA: prima dell'esperimento, inserire le gabbie contenenti le disposizioni nella soluzione di pesticidi e quindi misurare il volume della soluzione di pesticidi prima e dopo l'ammollo per eliminare l'errore. - Trasferire le larve femminili individualmente sulla superficie delle provviste essiccate naturalmente usando una spazzola morbida.
NOTA: Una larva in un tubo.
5. Condizioni di crescita
- Allevare le larve di O. excavata in una camera di crescita al buio, 65%-75% di umidità relativa e 25 ± 2 °C16.
6. Esame dei risultati
- Il test di tossicità letale acuta
- Misurare la mortalità delle larve dopo averle posizionate sul trattamento e le disposizioni di controllo (CK) per 48 ore.
NOTA: I criteri di morte: quando le larve non hanno risposto al tocco lieve usando una spazzola morbida sotto lampade a luce nera22. Le lampade a luce nera sono state utilizzate per simulare le condizioni di crescita scure delle larve ed evitare l'influenza della luce sulle larve durante il controllo degli indicatori di crescita. Per eliminare l'errore umano, sono state misurate anche le morti con e senza rimozione delle larve dalle disposizioni dopo 48 ore nei gruppi di controllo. - Pesare 60 provviste prima e dopo 48 ore di prove di allevamento di insetti per determinare la quantità di provviste consumata da ciascuna larva.
- Calcola la dose di pesticida ad ogni concentrazione consumata da ciascuna larva in base alla percentuale di fornitura consumata e al contenuto di pesticidi in ciascuna fornitura.
NOTA: L'equazione per il calcolo della dose è23:
dove, D è la dose consumata di pesticida da ciascuna larva; W1 è il peso di 60 disposizioni prima dell'infusione di pesticida; W2 è il peso residuo di 60 provviste dopo 48 h; V1 è il volume di pesticida prima dell'immersione per 60 disposizioni; V2 è il volume di pesticida dopo l'immersione per 60 disposizioni; C è la concentrazione del pesticida.
- Misurare la mortalità delle larve dopo averle posizionate sul trattamento e le disposizioni di controllo (CK) per 48 ore.
- Il test di tossicità subletale
- Pesare le larve prima delle prove di allevamento e dopo 14 giorni di trattamenti per determinare l'aumento di peso larvale.
- Osserva O. excavata ogni giorno durante il bozzolo sotto lampade a luce nera per misurare la durata dello sviluppo larvale.
- Pesare le porzioni rimanenti di accantonamenti dopo 14 giorni dall'alimentazione con disposizioni trattate e CK per calcolare il consumo e l'efficienza della conversione degli alimenti ingeriti (ICE)24.
- Esamina il numero di eclosioni tagliando i bozzoli usando una piccola forbice quando le api di controllo emergono negli adulti.
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Representative Results
I tenori di antiparassitari di uso comune, clorpirifos, imidacloprid, fendifenuron, phoxim, avermectina nelle disposizioni erano inferiori al limite di quantificazione (0,01-0,02 mg kg-1) nel gruppo di controllo; questi risultati hanno escluso l'influenza dei residui di pesticidi su ciascun trattamento. È stata valutata la mortalità con e senza rimozione delle larve dalle provviste dopo 48 ore nei gruppi di controllo; i risultati non hanno mostrato differenze significative (Tabella 1), indicando un errore umano minore.
Nella prova di tossicità letale acuta (Tabella 2), le disposizioni sono state immerse in sette soluzioni di pesticidi diluiti (0,1, 0,2, 0,4, 0,8, 1,6, 3,2 e 6,4 μg a.i. mL-1 clorpirifos) e 0,2% di acetone (come gruppo di controllo). Un'analisi di regressione log-probit ha valutato la dose letale mediana (valori LD50) di pesticida a O. excavata in base alle dosi ingerite di pesticidi (che vanno da 0,0001-0,005 μg a.i. mL-1) e la corrispondente mortalità delle larve dopo 48 ore di trattamenti. I risultati hanno mostrato che il valore LD50 di clorpirifos per le larve di O. excavata era 0,001 (0,001-0,002) μg a.i. Bee-1.
Nel test di tossicità subletale, l'aumento di peso larvale, la durata dello sviluppo, il tasso di eclosione, il consumo e l'ECI di O. excavata sono stati valutati sotto le concentrazioni di ammollo di 0,1, 0,2, 0,4 e 0,8 μg a.i. mL-1 di clorpirifos. Un'analisi della covarianza (ANCOVA) è stata utilizzata per determinare i cambiamenti legati al trattamento nello sviluppo (ad eccezione del tasso di eclosione) e nell'utilizzo alimentare di O. excavata. Al contrario, la massa di fornitura iniziale è stata utilizzata come covariata. Con l'aumentare della dose, i valori indice di aumento di peso larvale, consumo ed ECI sono diminuiti per i trattamenti, con i valori più bassi rispetto al controllo osservati in 0,013 μg a.i. bee-1 chlorpyrifos. Al contrario, la durata dello sviluppo larvale più estesa è stata osservata in 0,016 μg a.i. ape-1 clorpirifos rispetto al trattamento di controllo (Figura 1).
Gli impatti del clorpirifos sul tasso di eclosione sono stati valutati utilizzando l'analisi unidirezionale della varianza (ANOVA) e il test della differenza meno significativa (LSD) di Tukey. La correlazione di Pearson è stata condotta anche per analizzare la relazione tra i dosaggi ingeriti di clorpirifos e il tasso di eclosione di O. excavata. Qui, i risultati di questa analisi hanno mostrato che esiste una significativa relazione lineare negativa per i trattamenti (R2 = 0,82, P = 0,03). Il tasso di eclosione era considerevolmente inferiore quando i dosaggi ingeriti superavano 0,002 μg a.i. bee-1 rispetto a quelli nel trattamento di controllo (Figura 2).
Figura 1: Effetto del clorpirifos sulla crescita, lo sviluppo e l'alimentazione di O. excavate. (A), (C), (D): dopo 14 giorni di trattamento; (B): prima del bozzolo di O. scavare. Diverse lettere minuscole indicano differenze significative tra i trattamenti a P < 0,05. I numeri per ogni punto dati media con SD. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Relazione tra i dosaggi ingeriti di clorpirifos e il tasso di eclosione di O. excavate. Diverse lettere minuscole indicano differenze significative tra i trattamenti a P < 0,05; I numeri per ogni punto dati media con SD. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
| Trattamenti | Mortalità | |
| Ripetizione | Significare | |
| Con rimozione delle larve | 11.91% | 9,67% a |
| 7.63% | ||
| 9.46% | ||
| Senza rimozione delle larve | 6.88% | 8,28% a |
| 7.37% | ||
| 10.59% | ||
Tabella 1: La mortalità con e senza rimozione delle larve dalle provviste dopo 48 ore nei gruppi di controllo. Le stesse lettere minuscole non indicano differenze significative tra i trattamenti a P < 0,05.
| Insetticida | Pendenza ± SE | Df | χ2 (P) | DL50 (IC 95%) (μg a.i. ape−1) |
LD90 (IC 95%) (μg a.i. ape−1) |
| Clorpirifos | y=3,23+0,30x | 5 | 5.38 (0.37) | 0.001 (0.001-0.002) | 0.02 (0.012-0.038) |
Tabella 2: Tossicità del clorpirifos per Osmia excavata dopo 48 ore di trattamenti. SE - errore standard; Df - grado di libertà; χ2- valori del Chi-quadrato; CI - intervallo confidenziale.
Tabella supplementare 1: il volume immerso di insetticida in ciascun trattamento, comprese le 60 disposizioni di massa. Fare clic qui per scaricare questa tabella.
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Discussion
Per gli impollinatori adulti, ci sono due metodi principali per misurare l'ecotossicità dei pesticidi. Uno è il metodo di contatto, in cui il pesticida viene applicato al protorace degli insetti adulti; l'altro è il metodo di tossicità gastrica, in cui gli impollinatori adulti vengono nutriti con acqua di miele contenente pesticida25,26. Negli ultimi anni, è stato riscontrato che l'effetto di impollinazione e il tasso di eclosione di O. excavata sono relativamente bassi27. Si ipotizza che l'influenza dell'applicazione di pesticidi sulla crescita e lo sviluppo delle larve sia una delle ragioni principali. Tuttavia, ci sono poche segnalazioni sui metodi di valutazione della tossicità dei pesticidi per le larve di O. excavata. In questo studio, viene proposto un metodo efficace per valutare l'impatto dei pesticidi sulla mortalità, la crescita e lo sviluppo e l'alimentazione delle larve di O. excavata contaminando le masse di approvvigionamento con pesticidi.
Molti studi hanno utilizzato una soluzione di saccarosio contenente concentrazioni medie letali per valutare la tossicità dei pesticidi per le api mellifere 28,29,30. Le principali vie di esposizione ai pesticidi alle api solitarie erano l'ingestione larvale o adulta, il contatto e la trasmissione transovarica31. Il metodo in questo studio ha simulato la risposta delle api adulte solitarie al contatto diretto e all'alimentazione di alimenti contenenti pesticidi sul campo. Per le larve di api solitarie, la sua risposta è stata quella di nutrirsi del pesticida residuo nelle masse di fornitura in base alle caratteristiche biologiche. Inoltre, il pesticida esposto alle disposizioni sul campo incorrerebbe in degradazione, volatilizzazione, conduzione ad altri tessuti prima di essere mangiato dalle larve di O. excavata. Pertanto, è meglio valutare l'ecotossicità dei pesticidi a O. excavata analizzando la dose di pesticidi ingerita dalle larve piuttosto che utilizzare la concentrazione di pesticidi per immersione.
Le disposizioni variano significativamente in termini di dimensioni, il che può influenzare sostanzialmente la massa di larve e adulti. Le provviste e le larve femminili sono state selezionate per ridurre al minimo l'errore in base alle dimensioni della fornitura e alla posizione della cellula all'interno del nido. Inoltre, dopo lo screening con il metodo di cui sopra, sono state ulteriormente selezionate disposizioni con dimensioni simili. Sebbene questa parte del carico di lavoro sia relativamente grande, è essenziale per le statistiche del consumo di cibo per larva e del volume di pesticidi a ciascuna concentrazione nel presente studio. Di conseguenza, la quantità di assunzione del pesticida potrebbe essere calcolata con precisione. Il lavoro di follow-up che determina il residuo di pesticidi nelle disposizioni in momenti diversi dopo l'applicazione sul campo contribuirà a guidare il tempo di rilascio dell'adulto O. excavata e ridurre l'effetto negativo dei pesticidi sulle larve di O. excavata.
Il clorpirifos ha un alto tasso di letalità per le larve di O. excavata, che era simile ai risultati riportati sugli impollinatori adulti (Apis mellifera e Apis cerana)32,33. Si può vedere che il metodo in questo studio può prevedere la tossicità dei pesticidi per le larve di O. excavata. Tuttavia, studi precedenti hanno scoperto che la bassa mortalità non è una risposta allo stress uniforme e non indica effetti avversi sugli impollinatori. Ad esempio, i neonicotinoidi sono insufficienti a causare la morte acuta delle api34 ma possono compromettere la capacità di apprendimento olfattivo e memoria e attività di nidificazione e raccolta 35,36,37,38,39,40. Pertanto, è essenziale valutare la tossicità cronica dei pesticidi sulle larve di O. excavata per una comprensione completa dell'ecotossicità dei pesticidi per gli impollinatori da una prospettiva demografica. Ma questo metodo ha valutato l'aumento di peso larvale, la durata dello sviluppo, i modelli di alimentazione e la capacità di eclosione delle larve di O. excavata. La capacità di fuga e la fecondità dopo l'emergere negli adulti non sono state valutate.
Il presente studio presenta ancora alcune limitazioni. Si presumeva che le disposizioni assorbissero il 100% della soluzione immersa. Tuttavia, questa ipotesi dovrebbe essere verificata analiticamente poiché i volumi e l'umidità di ciascuna disposizione possono comportare concentrazioni diverse, indicando che sia gli alimenti ingeriti che la verifica delle concentrazioni nominali di prova utilizzate negli alimenti sono necessari quando si segnalano endpoint di tossicità su base dose. Pertanto, è ancora necessario verificare le concentrazioni di pesticidi nelle disposizioni utilizzando un metodo analitico in futuro.
In sintesi, il metodo presentato aiuterà i ricercatori a migliorare il rischio ecologico dei pesticidi per le larve delle api solitarie valutando gli endpoint relativi alla mortalità, all'aumento di peso larvale, alla durata dello sviluppo, alla capacità di eclosione e ai modelli di alimentazione. La tecnica può potenzialmente migliorare la sicurezza dell'uso di pesticidi generando dati quantitativi relativi alle larve di api solitarie che sarebbero difficili da acquisire utilizzando esperimenti semi-campo e sul campo. Gli effetti negativi dei pesticidi sulle api solitarie possono essere meglio previsti e mitigati utilizzando questa tecnica.
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Disclosures
Gli autori non hanno conflitti di interesse da dichiarare.
Acknowledgments
Questo studio è stato supportato dal National Key R&D Program of China (2017YFD0200400), major scientific and technological innovation Project (2017CXGC0214), Bee Industry Innovation Team della provincia di Shandong, Agricultural Science and Technology Innovation Project della Shandong Academy of Agricultural Sciences (CXGC2019G01) e Agricultural Science and Technology Innovation Project della Shandong Academy of Agricultural Sciences (CXGC2021B13).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Abamectin | Jinan Lvba Pesticide Co. Ltd | ||
| Black-light lamps | Kanghua Medical Device Co., Ltd | ||
| Centrifugal tube box with 100 Wells | Shanghai Rebus Network Technology Co., Ltd | ||
| Centrifuge tube | Shanghai Rebus Network Technology Co., Ltd | 2 mL; Serve as bee tube | |
| Electric soldering iron | Kunshan Kaipai Hardware Electromechanical Co., Ltd | ||
| Electronic scale | Sartorius Scientific Instruments (Beijing) Co., Ltd | 3137510295 | |
| Graduated cylinder | Anhui Weiss Experimental Equipment Co. Ltd | ||
| Petri dishes (60 mm diameter) | Qingdao jindian biochemical equipment co., LTD | ||
| Pollen provision | Yantai Bifeng Agricultural Science and Technology Co. Ltd | ||
| Soft brush | Wengang Wenhai painting material factory | ||
| Solitary bees | Yantai Bifeng Agricultural Science and Technology Co. Ltd |
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