Summary
El presente protocolo explica un método para alimentar con provisiones contaminadas con pesticidas a las larvas de las abejas solitarias, Osmia excavata. El procedimiento examina la ecotoxicidad del pesticida para las larvas de las abejas solitarias.
Abstract
Las evaluaciones actuales del riesgo ecológico de los plaguicidas en polinizadores han considerado principalmente solo las condiciones de laboratorio. Para las larvas de abejas solitarias, la ingestión de provisiones contaminadas con pesticidas puede aumentar la tasa de mortalidad de las larvas, disminuir la tasa de recolección y la población de abejas solitarias adultas en el próximo año desde una perspectiva demográfica. Pero hay estudios limitados sobre los efectos de los pesticidas en las larvas de abejas solitarias. Por lo tanto, comprender cómo los plaguicidas influyen en las larvas de las abejas solitarias debe considerarse una parte integral de la evaluación del riesgo ecológico de los plaguicidas. Este estudio presenta un método para exponer las larvas de abeja solitaria, Osmia excavata, a dosis letales o subletales de pesticidas, rastreando el aumento de peso larval, la duración del desarrollo, la capacidad de eclosión y la conversión de la eficiencia del consumo de alimentos ingeridos. Para demostrar la efectividad de este método, las larvas de O. excavata fueron alimentadas con provisiones que contenían dosis letales agudas y subletales de clorpirifos. Luego, se investigaron los índices anteriores de las larvas tratadas. Esta técnica ayuda a predecir y mitigar el riesgo de pesticidas para los polinizadores.
Introduction
Los polinizadores desempeñan un papel fundamental en los servicios ecosistémicos de la agricultura mundial moderna. Mientras que las abejas melíferas (Apis mellifera; Hymenoptera: Apidae) han sido tradicionalmente considerados como los polinizadores económicos esenciales de los cultivos, investigaciones recientes sugieren que Osmia (Hymenoptera: Megachilidae) también es muy importante para mejorar la polinización de ciertos cultivos, aumentar el tamaño de la fruta y el número de semillas, y reducir la proporción de fruta asimétrica en huertos comerciales en diferentes partes del mundo1. Osmia excavata ha sido considerada una especie ideal para la polinización de manzanas, principalmente en Asia, como en el norte y noroeste de China y Japón 2,3,4. Puede proporcionar servicios de polinización para ciertos cultivos con similares o a veces con mayor eficiencia. En este sentido, se ha demostrado que reemplazan o trabajan en sinergia con las abejasmelíferas 4,5,6.
Las características biológicas de O. excavata son únicas en comparación con las abejas sociales. Su actividad univoltina, solitaria y de anidación ocurre principalmente en primavera y principios de verano. Los nidos de O. excavata se encuentran generalmente en agujeros preexistentes, típicamente en madera muerta, plantas huecas, tubos de paja y tallo de bambú en la condición natural3. El adulto O. excavata emerge de su capullo para aparearse, recolectar polen y construir un nido para poner huevos, que comienzan a eclosionar una semana después. Los huevos fertilizados se convierten en hembras, mientras que los huevos no fertilizados se convierten en machos3. Las hembras se distribuyen en el fondo del tubo de abeja, y las disposiciones correspondientes son más significativas. En contraste, los machos estaban en la proximidad de la salida del tubo con provisiones menores7, por lo que los machos salen primero y las hembras salen después. La hembra mezcla el polen con una pequeña cantidad de néctar en una mancha húmeda, la única fuente de alimento para cada larva en la célula8.
Varios estudios han reportado una disminución en la población de insectos polinizadores 9,10. El uso extensivo de plaguicidas ha sido identificado como uno de los principales factores para reducir la abundancia y diversidad de polinizadores y también puede poner en peligro los servicios de polinización11,12. Para reducir y mitigar los efectos adversos de los plaguicidas, es necesario realizar una evaluación del riesgo de plaguicidas para los polinizadores. Algunos países han establecido marcos regulatorios para garantizar la seguridad de las abejas de los plaguicidas utilizados13,14. Estudios recientes han demostrado que Osmia era más susceptible a los pesticidas que las abejasmelíferas 1,15.
Curiosamente, la mayoría de las evaluaciones de riesgo se centraron en las abejas melíferas adultas 11,12; se ha realizado poca investigación sobre O. excavata, especialmente las larvas. Además, la mortalidad de Osmia causada directamente por pesticidas se considera más comúnmente16. Aún así, las toxicidades crónicas como el aumento de peso larval, la duración del desarrollo, los patrones de alimentación, la capacidad de eclosión, el comportamiento adulto posterior y la fecundidad pueden tener el mismo daño que las toxicidades letales agudas y a menudo se ignoran debido a la falta de un método experimental efectivo para las abejas solitarias17.
Hasta ahora, se utilizan dos métodos para evaluar los efectos de los plaguicidas en las larvas de abejas solitarias: (1) se aplicó una cantidad adecuada de plaguicida en el lugar localizado de provisiones sin eliminar el huevo de abejas solitarias 1,18,19,20; 2) la sustitución de las provisiones por mezclas artificiales de polen y néctar que contengan una cantidad específica de plaguicida21. Sin embargo, existen algunas limitaciones para los dos métodos anteriores. El primero solo puede medir la toxicidad aguda, pero no la toxicidad crónica porque las larvas ingirieron toda la dosis en un corto período de tiempo; esto último conduciría a una alta tasa de mortalidad debido a la manipulación humana1. Aquí, se describió el método de inmersión para estudiar la ecotoxicidad de los plaguicidas a O. excavata en condiciones de investigación altamente controladas mediante la simulación del comportamiento de la alimentación larvaria con plaguicida residual en las provisiones en el entorno real. El método de este estudio resuelve las desventajas de los dos métodos anteriores y es adecuado para medir los efectos de una sustancia peligrosa sobre la toxicidad aguda y crónica.
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Protocol
1. Preparación de la sonda de alimentación
- Perfore un orificio (~ 0,3 mm de diámetro) en la tapa de un tubo centrífugo de 2 ml con una plancha de bobinado eléctrica (consulte la Tabla de materiales). Use un tubo de centrífuga de este tipo para mantener una larva de O. excavata y su masa de provisión.
2. Preparación del plaguicida
- Disolver el plaguicida de grado técnico (ver Tabla de Materiales) en acetona para adquirir soluciones madre de 1 x 104 μg i.mL-1. Luego, realice diluciones de gradiente de la solución a más de cinco concentraciones.
NOTA: En este estudio se utilizaron clorpirifos a 0.1, 0.2, 0.4, 0.8, 1.6, 3.2, 6.4 μg a.i. mL-1 .
3. Preparación de las disposiciones
- Adquirir tubos de abeja de plástico que contengan provisiones (ver Tabla de Materiales) y larvas recién eclosionadas de O. excavata de un programa de cría en masa.
NOTA: No se utilizaron pesticidas desde 20 días antes de la floración hasta todo el período de floración; Los resultados del análisis químico mostraron que los contenidos de plaguicidas de uso común en cincuenta disposiciones seleccionadas al azar estaban por debajo de los niveles mínimos de prueba. - Separe las provisiones y las larvas suavemente usando un cepillo suave. Seleccione las larvas hembras según el tamaño de la provisión y la posición de la célula dentro del nido9. Luego, coloque provisiones de tamaño uniforme y larvas femeninas seleccionadas en placas de Petri (60 mm de diámetro) y déjelas a un lado para su uso.
NOTA: Cincuenta disposiciones fueron seleccionadas al azar para analizar el contenido de plaguicidas de uso común: clorpirifos, imidacloprid, fendifenurón, phoxim, avermectina. Los parámetros del cepillo suave son (a) diámetro del cepillo: 0,3 mm, (b) longitud del cepillo: 2 cm, (c) longitud de la pluma: 18 cm.
4. Tratamiento de la provisión con plaguicidas
- Remoje las provisiones seleccionadas de tamaño uniforme (a partir de la etapa 3.2) en plaguicida diluido (a partir de la etapa 2.1; clorpirifos a 0.1, 0.2, 0.4, 0.8, 1.6, 3.2, 6.4 μg i.mL-1) durante 10 s utilizando una jaula. Remoje la comprobación de control (CK) en disolvente al 0,2% (acetona en este estudio).
NOTA: Hay tres réplicas por tratamiento de concentración, y cada réplica consistió en 60 disposiciones. La diferencia de dosis de cada disposición se puede reducir seleccionando provisiones de tamaño uniforme. - Mida el volumen de solución plaguicida antes y después de tratar las provisiones con el plaguicida. A continuación, calcule el volumen sumergido de insecticida en cada tratamiento, incluidas 60 provisiones de masa (Tabla suplementaria 1). Coloque las provisiones en tubos centrífugos separados con orificios (a partir del paso 1.1) después del secado al aire en una mesa de trabajo estéril.
NOTA: Antes del experimento, coloque las jaulas que contienen las provisiones en la solución de pesticida y luego mida el volumen de solución de pesticida antes y después del remojo para eliminar el error. - Transfiera las larvas femeninas individualmente a la superficie de las provisiones secas naturalmente usando un cepillo suave.
NOTA: Una larva en un tubo.
5. Condiciones de crecimiento
- Remonte las larvas de O. excavata en una cámara de crecimiento en la oscuridad, 65%-75% de humedad relativa y 25 ± 2 °C16.
6. Examen de los resultados
- La prueba de toxicidad letal aguda
- Medir la mortalidad de las larvas después de colocarlas en el tratamiento y las disposiciones de control (CK) durante 48 h.
NOTA: El criterio de muerte: cuando las larvas no respondieron al tacto leve utilizando un cepillo suave debajo de lámparas de luz negra22. Se utilizaron lámparas de luz negra para simular las condiciones de crecimiento oscuro de las larvas y evitar la influencia de la luz en las larvas al verificar los indicadores de crecimiento. Para eliminar el error humano, también se midieron las mortalidades con y sin eliminación de larvas de las provisiones después de 48 h en los grupos de control. - Pesar 60 provisiones antes y después de 48 h de ensayos de cría de insectos para determinar la cantidad de provisiones consumidas por cada larva.
- Calcular la dosis de plaguicida en cada concentración consumida por cada larva de acuerdo con el porcentaje de provisión consumida y el contenido de plaguicida en cada disposición.
NOTA: La ecuación para el cálculo de la dosis es23:
donde, D es la dosis consumida de plaguicida por cada larva; W1 es el peso de 60 provisiones antes de la infusión de plaguicida; W2 es el peso restante de 60 provisiones después de 48 h; V1 es el volumen de plaguicida antes de la inmersión para 60 provisiones; V2 es el volumen de plaguicida después de la inmersión para 60 provisiones; C es la concentración del plaguicida.
- Medir la mortalidad de las larvas después de colocarlas en el tratamiento y las disposiciones de control (CK) durante 48 h.
- La prueba de toxicidad subletal
- Pesar las larvas antes de los ensayos de cría y después de 14 días de tratamientos para determinar el aumento de peso larvario.
- Observe O. excavata diariamente durante el capullo bajo lámparas de luz negra para medir la duración del desarrollo larvario.
- Pesar las porciones restantes de provisiones después de 14 días de alimentación con provisiones tratadas y CK para calcular el consumo y la eficiencia de conversión de los alimentos ingeridos (ECI)24.
- Examine el número de eclosiones disparando los capullos con una tijera pequeña cuando las abejas de control emergen en adultos.
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Representative Results
El contenido de plaguicidas de uso común, clorpirifos, imidacloprid, fendifenurón, phoxim, avermectina en provisiones fue inferior al límite de cuantificación (0,01-0,02 mg kg-1) en el grupo de control; estos resultados excluyeron la influencia de los residuos de plaguicidas en cada tratamiento. Se evaluó la mortalidad con y sin eliminación de larvas de provisiones después de 48 h en grupos control; los resultados no mostraron diferencias significativas (Tabla 1), lo que indica un error humano menor.
En el ensayo de toxicidad letal aguda (Cuadro 2), las provisiones se empaparon en siete soluciones plaguicidas diluidas (0,1, 0,2, 0,4, 0,8, 1,6, 3,2 y 6,4 μg de clorpirifós a.i. mL-1) y acetona al 0,2% (como grupo control). Un análisis de regresión log-probit evaluó la dosis letal mediana (valores deDL 50) de plaguicida a O. excavata de acuerdo con las dosis ingeridas de plaguicidas (que oscilan entre 0,0001-0,005 μg i.a.mL-1) y la mortalidad correspondiente de larvas después de 48 h de tratamientos. Los resultados mostraron que el valor de LD50 de clorpirifos para las larvas de O. excavata fue de 0.001 (0.001-0.002) μg a.i. abeja-1.
En la prueba de toxicidad subletal, el aumento de peso larval, la duración del desarrollo, la tasa de eclosión, el consumo y la ICE de O. excavata se evaluaron bajo las concentraciones de remojo de 0,1, 0,2, 0,4 y 0,8 μg i.i. mL-1 de clorpirifos. Se utilizó un análisis de covarianza (ANCOVA) para determinar los cambios relacionados con el tratamiento en el desarrollo (excepto la tasa de eclosión) y la utilización de alimentos de O. excavata. Por el contrario, la masa de provisión inicial se utilizó como covariable. A medida que la dosis aumentó, los valores índice de aumento de peso larval, consumo e ICC disminuyeron para los tratamientos, con los valores más bajos en relación con el control observado en 0,013 μg de clorpirifos de abeja-1 . Por el contrario, la duración más prolongada del desarrollo larvario se observó en 0,016 μg de clorpirifós de abeja-1 i. en comparación con el tratamiento de control (Figura 1).
Los impactos del clorpirifós en la tasa de eclosión se evaluaron mediante el análisis unidireccional de varianza (ANOVA) y la prueba de diferencia menos significativa (LSD) de Tukey. La correlación de Pearson también se realizó para analizar la relación entre las dosis ingeridas de clorpirifos y la tasa de eclosión de O. excavata. Aquí, los resultados de este análisis mostraron que existe una relación lineal negativa significativa para los tratamientos (R2 = 0,82, P = 0,03). La tasa de eclosión fue considerablemente menor cuando las dosis ingeridas superaron los 0,002 μg de abeja-1 que las del tratamiento control (Figura 2).
Figura 1: Efecto del clorpirifós en el crecimiento, desarrollo y alimentación de O. excavate. (A), (C), (D): después de 14 días de tratamiento; (B): antes del capullo de O. excavar. Las diferentes letras minúsculas indican diferencias significativas entre los tratamientos a P < 0,05. Los números para cada promedio de puntos de datos con SD. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Relación entre las dosis ingeridas de clorpirifos y la tasa de eclosión de O. excavate. Las diferentes letras minúsculas indican diferencias significativas entre los tratamientos a P < 0,05; Los números para cada promedio de puntos de datos con SD. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Tratamientos | Mortalidad | |
| Repetición | Significar | |
| Con eliminación de larvas | 11.91% | 9,67% a |
| 7.63% | ||
| 9.46% | ||
| Sin eliminación de larvas | 6.88% | 8,28% a |
| 7.37% | ||
| 10.59% | ||
Tabla 1: La mortalidad con y sin eliminación de larvas de provisiones después de 48 h en grupos control. Las mismas letras minúsculas indican que no hay diferencias significativas entre los tratamientos a P < 0,05.
| Insecticida | Pendiente ± SE | Df | χ2 (P) | DA50 (IC 95%) (μg a.i. abeja−1) |
LD90 (IC del 95%) (μg i.a. abeja−1) |
| Clorpirifos | y=3,23+0,30x | 5 | 5.38 (0.37) | 0.001 (0.001-0.002) | 0.02 (0.012-0.038) |
Tabla 2: Toxicidad de Chlorpyrifos a Osmia excavata después de 48 h de tratamientos. SE - error estándar; Df - grado de libertad; χ2- valores de Chi-cuadrado; IC - intervalo confidencial.
Cuadro complementario 1: El volumen sumergido de insecticida en cada tratamiento, incluyendo 60 provisiones de masa. Haga clic aquí para descargar esta tabla.
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Discussion
Para los polinizadores adultos, hay dos métodos principales para medir la ecotoxicidad de los pesticidas. Uno es el método de contacto, en el que el pesticida se aplica al protórax de los insectos adultos; el otro es el método de toxicidad gástrica, en el que los polinizadores adultos son alimentados con agua de miel que contiene el pesticida25,26. En los últimos años, se ha encontrado que el efecto de polinización y la tasa de eclosión de O. excavata son relativamente bajos27. Se especula que la influencia de la aplicación de pesticidas en el crecimiento y desarrollo de las larvas es una de las principales razones. Sin embargo, hay pocos informes sobre los métodos de evaluación de la toxicidad de los plaguicidas para las larvas de O. excavata. En este estudio, se propone un método eficaz para evaluar el impacto de los plaguicidas en la mortalidad, el crecimiento y el desarrollo, y la alimentación de las larvas de O. excavata contaminando las masas de provisión con pesticidas.
Muchos estudios utilizaron solución de sacarosa que contiene concentraciones de medios letales para evaluar la toxicidad de los pesticidas para las abejas melíferas 28,29,30. Las principales vías de exposición a plaguicidas a las abejas solitarias fueron la ingestión larvaria o adulta, el contacto y la transmisión transovarial31. El método en este estudio simuló la respuesta de las abejas adultas solitarias al contacto directo y alimentarse de alimentos que contienen pesticidas en el campo. Para las larvas de abeja solitarias, su respuesta fue alimentarse del pesticida residual en las masas de provisión de acuerdo con la característica biológica. Además, el plaguicida expuesto a provisiones en el campo incurriría en degradación, volatilización, conducción a otros tejidos antes de ser comido por las larvas de O. excavata. Por lo tanto, es mejor evaluar la ecotoxicidad de los pesticidas para O. excavata analizando la dosis de plaguicida ingerida por las larvas que utilizando la concentración de plaguicidas para la inmersión.
Las disposiciones varían significativamente en tamaño, lo que puede afectar sustancialmente la masa de larvas y adultos. Se seleccionaron provisiones y larvas femeninas para minimizar el error en función del tamaño de la provisión y la posición de la célula dentro del nido. Además, después de la selección por el método anterior, se seleccionaron aún más las disposiciones con tamaños similares. Aunque esta parte de la carga de trabajo es relativamente grande, es esencial para las estadísticas de consumo de alimentos por larva y el volumen de pesticidas en cada concentración en el presente estudio. En consecuencia, la cantidad de ingesta del pesticida podría calcularse con precisión. El trabajo de seguimiento que determina el residuo de plaguicidas en provisiones en diferentes momentos después de la aplicación en el campo ayudará a guiar el tiempo de liberación del adulto O. excavata y reducir el efecto adverso de los pesticidas en las larvas de O. excavata.
El clorpirifós tiene una alta tasa de letalidad para las larvas de O. excavata, que fue similar a los resultados reportados en polinizadores adultos (Apis mellifera y Apis cerana)32,33. Se puede ver que el método en este estudio puede predecir la toxicidad de los pesticidas para las larvas de O. excavata. Sin embargo, estudios previos han encontrado que la baja mortalidad no es una respuesta uniforme al estrés y no indica ningún efecto adverso en los polinizadores. Por ejemplo, los neonicotinoides son insuficientes para causar la muerte aguda de las abejas34, pero pueden afectar la capacidad de aprendizaje olfativo y la memoria y las actividades de anidación y recolección 35,36,37,38,39,40. Por lo tanto, es esencial evaluar la toxicidad crónica de los pesticidas en las larvas de O. excavata para una comprensión integral de la ecotoxicidad de los pesticidas para los polinizadores desde una perspectiva demográfica. Pero este método evaluó el aumento de peso larval, la duración del desarrollo, los patrones de alimentación y la capacidad de eclosión de las larvas de O. excavata. No se evaluó la capacidad de vuelo y fecundidad después de la emergencia en adultos.
El presente estudio todavía tiene algunas limitaciones. Se suponía que las provisiones absorbían el 100% de la solución sumergida. Aún así, esta suposición debe verificarse analíticamente, ya que los volúmenes y la humedad de cada disposición pueden dar lugar a concentraciones diferentes, lo que indica que tanto los alimentos ingeridos como la verificación de las concentraciones nominales de prueba utilizadas en los alimentos son necesarias al notificar los criterios de valoración de toxicidad sobre una base de dosis. Por lo tanto, sigue siendo necesario verificar las concentraciones de plaguicidas en las disposiciones utilizando un método analítico en el futuro.
En resumen, el método presentado ayudará a los investigadores a mejorar el riesgo ecológico de los pesticidas para las larvas de abejas solitarias mediante la evaluación de los criterios de valoración relacionados con la mortalidad, el aumento de peso larvario, la duración del desarrollo, la capacidad de eclosión y los patrones de alimentación. La técnica puede mejorar potencialmente la seguridad del uso de pesticidas mediante la generación de datos cuantitativos relacionados con las larvas de abejas solitarias que serían difíciles de adquirir utilizando experimentos de semicampo y campo. Los efectos adversos de los pesticidas en las abejas solitarias se pueden predecir y mitigar mejor utilizando esta técnica.
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Disclosures
Los autores no tienen conflictos de intereses que declarar.
Acknowledgments
Este estudio fue apoyado por el Programa Nacional Clave de I + D de China (2017YFD0200400), el Proyecto Principal de Innovación Científica y Tecnológica (2017CXGC0214), el Equipo de Innovación de la Industria apícola de la provincia de Shandong, el Proyecto de Innovación en Ciencia y Tecnología Agrícola de la Academia de Ciencias Agrícolas de Shandong (CXGC2019G01) y el Proyecto de Innovación en Ciencia y Tecnología Agrícola de la Academia de Ciencias Agrícolas de Shandong (CXGC2021B13).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Abamectin | Jinan Lvba Pesticide Co. Ltd | ||
| Black-light lamps | Kanghua Medical Device Co., Ltd | ||
| Centrifugal tube box with 100 Wells | Shanghai Rebus Network Technology Co., Ltd | ||
| Centrifuge tube | Shanghai Rebus Network Technology Co., Ltd | 2 mL; Serve as bee tube | |
| Electric soldering iron | Kunshan Kaipai Hardware Electromechanical Co., Ltd | ||
| Electronic scale | Sartorius Scientific Instruments (Beijing) Co., Ltd | 3137510295 | |
| Graduated cylinder | Anhui Weiss Experimental Equipment Co. Ltd | ||
| Petri dishes (60 mm diameter) | Qingdao jindian biochemical equipment co., LTD | ||
| Pollen provision | Yantai Bifeng Agricultural Science and Technology Co. Ltd | ||
| Soft brush | Wengang Wenhai painting material factory | ||
| Solitary bees | Yantai Bifeng Agricultural Science and Technology Co. Ltd |
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