Dieses Protokoll führt Schritte der Metabarcoding-Analyse ein, die auf 16S rRNA- und 18S rRNA-Gene abzielen, um schädliche Algenblüten und ihr assoziiertes Mikrobiom in Meerwasserproben zu überwachen. Es ist ein leistungsfähiges molekulares Werkzeug, erfordert aber mehrere Verfahren, die hier Schritt für Schritt visuell erklärt werden.
Das Monitoring schädlicher Algenblüten (HABs) wurde weltweit durchgeführt, und Chile, ein für seine Fischerei und Aquakultur bekanntes Land, nutzt zu diesem Zweck seit Jahrzehnten intensiv Mikroskopie- und Toxinanalysen. Molekularbiologische Methoden wie Hochdurchsatz-DNA-Sequenzierung und bakterielle Assemblage-basierte Ansätze werden gerade erst im chilenischen HAB-Monitoring eingeführt, und die Verfahren sind noch nicht standardisiert. Hier werden schrittweise 16S rRNA und 18S rRNA Metabarcoding Analysen zur Überwachung chilenischer HABs vorgestellt. Nach einer neueren Hypothese spielt die algen-bakterielle mutualistische Assoziation eine kritische synergetische oder antagonistische Beziehung, die für die Initiierung, Aufrechterhaltung und Regression der Blüte verantwortlich ist. Daher kann die Überwachung von HAB aus algenbakterieller Perspektive ein breiteres Verständnis der HAB-Mechanismen und die Grundlage für die Frühwarnung liefern. Die Metabarcoding-Analyse ist eines der am besten geeigneten molekularbasierten Werkzeuge für diesen Zweck, da sie massive algenbakterielle taxonomische Informationen in einer Probe nachweisen kann. Die visuellen Verfahren der Probenahme bis zur Metabarcodierungsanalyse hierin enthalten spezifische Anweisungen, die darauf abzielen, Fehler zu reduzieren und zuverlässige Daten zu sammeln.
Es ist bekannt, dass viele marine Phytoplanktonarten endogene Toxine produzieren, und wenn sich diese Arten in ausreichender Anzahl ansammeln, sind sie schädlich für die Meeresumwelt. Solche schädlichen Algenblüten (HABs) werden heute an den Küsten der meisten Kontinente der Welt beobachtet1. Toxisches Phytoplankton sammelt sich zuerst im Muschelgewebe an und führt bei der Verdauung zu Krankheit und Tod in höheren trophischen Ebenen von Organismen, einschließlich des Menschen. In der Folge haben diese Ereignisse schwerwiegende Auswirkungen auf die lokale Wirtschaft, die Sozioökonomie und die öffentliche Gesundheit2. Der Schaden für die Weltwirtschaft, der durch HABs verursacht wird, wird auf Millionen bis Milliarden von Dollar pro Jahr geschätzt3. Chile ist eines von vielen Ländern, die unter häufigen HABs leiden.
Chile ist ein Land mit langem Land, das sich über 4.300 km nördlich und südlich erstreckt. Das langgestreckte westliche Land blickt auf den Pazifischen Ozean, was natürlich die Chancen erhöht, dass Chile HABs erlebt. Vor allem im Süden Chiles gibt es viele weltberühmte Lachs-Aquakulturen, und jedes Mal, wenn ein HAB in der Region auftritt, führen die Algentoxine dazu, dass massiver Zuchtlachse krank wird undstirbt 4,5,6. In Chile war das Jahr, in dem die HAB die Wirtschaft am härtesten traf, 2016 mit einem geschätzten jährlichen Verlust von 800 Millionen US-Dollar7,8. Die verursachenden toxischen Algenarten variieren je nach Jahr und Standort. Für den Fall 2016 verursachte ein Komplex von Alexandrium catanella und Pseudochattonella verruclosa eine weit verbreitete HAB in den meisten Teilen der südlichen chilenischen Küste7,8. Die jüngste HAB in Chile trat mit der ursächlichen Algenart Heterosigma Akashiwo im März 2021 in Camanchaca im Süden Chiles auf, wo das Gebiet über eine große Lachsfarm verfügt.
Chile führt die Küstenüberwachung seit vielen Jahren mit zwei Hauptmethoden durch; Beobachtung des Meerwassers mit Mikroskopen zur regelmäßigen Identifizierung toxischer Algenarten und Messung des Toxingehalts in Schalentieren durch biochemische Assays9. Die Früherkennung von toxischen Algen- und Toxinwerten in Schalentieren verhindert HABs nicht; Diese Analysen können jedoch sofortige Gegenmaßnahmen auslösen und Schäden für lokale Gemeinschaften reduzieren. Um die Wirksamkeit dieser Strategie weiter zu stärken, wurde kürzlich unser konventionelles chilenisches HAB-Monitoringprogramm um eine molekularbasierte Analysemethode zum Nachweis von Algen und verwandten Bakteriengemeinschaften in Meerwasserproben erweitert. Insbesondere wurde eine Massive Parallel Sequencing-Methode unter Verwendung von Metabarcoding ausgewählt, die auf 16S rRNA- und 18S rRNA-Gene abzielt. Obwohl diese Technik komplizierte Verfahren und teure Maschinen und Reagenzien erfordert, handelt es sich um eine fortschrittliche Technologie, die Tausende von Algen- und Bakteriengattungen / -arten in einer Meerwasserprobe gleichzeitig nachweisen kann.
Es wird spekuliert, dass die Ursachen von HAB vielfältig sind, wie Temperatur und Jahreszeit, aber es ist unmöglich, sie zu verallgemeinern. Dies liegt daran, dass HAB-Arten und -Häufigkeiten von der Region und den raumzeitlichen Bedingungen abhängen, einschließlich natürlicher Phänomene wie geografische Einzigartigkeit, aufkeimende Nährstoffmischung und Elementabfluss vom Land aufgrund von Erosion2,10,11,12. Zusätzlich beeinflussen künstliche Faktoren wie Eutrophierung lokale HABs12,13. Aufgrund des komplexen Multifaktors ist es nicht einfach, eine genaue HAB-Vorhersage zu treffen. In den letzten Jahren gibt es die Ansicht, dass spezifische Bakterienpopulationen mit der Entwicklung von HABs als einem der Faktoren in Verbindung gebracht werden können, und die Forschung zur Unterstützung dieser Hypothese wurde zunehmend offensichtlich14,15,16,17,18. Molekularbiologische Techniken werden im Allgemeinen verwendet, um die bakterielle Assemblage zu untersuchen; eine solche standardisierte Methode ist im chilenischen HAB-Monitoring9jedoch noch nicht etabliert. Um die Algen-Bakterien-Assoziation mit HABs zu untersuchen, ist es unerlässlich, gleichzeitig Metabarcoding-Analysen für die aktuellen chilenischen Küstenüberwachungsprogramme durchzuführen. Daher stellt dieses Protokoll unser chilenisches HAB-Überwachungsprogramm visuell vor und konzentriert sich auf ein schrittweises Verfahren zur Analyse des Nachweises von Algen- und Bakterienarten in Meerwasserproben mittels Metabarcoding-Analyse.
Das vollständige Protokoll, das unser chilenisches HAB-Überwachungsprogramm beschreibt, ist in Yarimizu et al.9verfügbar. Es umfasst die Verfahren der Meerwasserprobenahme, des mikroskopischen Algenartennachweises, der Algen-Bakterien-Gendetektion, der Pigmentanalyse, der meteorologischen Datenerfassung sowie physikalischer und chemischer Wassereigenschaftstests. Das schrittweise Protokoll der 16S rRNA- und 18S rRNA-Metabarcoding-Analyse für den Algen- und Bakterienspeziesnachweis ist als Preprint19verfügbar. Dieses Protokoll demonstriert insbesondere Metabarcoding-Analyseschritte, da es der komplizierteste Teil und das Highlight unseres HAB-Monitoring-Programms ist. Dieses Protokoll beinhaltet auch eine Einführung in das Programm und den mikroskopischen Nachweis von Algenarten. Bei der Analyse von Algenarten durch Metabarcoding ist es wichtig, gleichzeitig eine Mikroskopie durchzuführen, um die Ergebnisse der beiden Methoden zu überprüfen. Dieses Protokoll beinhaltet nicht die Verwendung von Software für die Taxonomiezuweisung, aber die Datenbankempfehlung wird am Ende des folgenden Abschnitts kurz erläutert.
Dieses Protokoll führte erfolgreich eine 18S rRNA- und 16S rRNA-Gen-Metabarcoding-Analyse durch, um Algen- und Bakterienarten in Meerwasserproben zur Überwachung chilenischer HABs zu identifizieren. Die dominanten Algen und einige kleinere Algen, die durch dieses Protokoll nachgewiesen wurden, stimmten mit denen überein, die durch Mikroskopie erhalten wurden, was die Zuverlässigkeit des Protokolls bestätigte. Der Höhepunkt des Protokolls ist, dass die Analyse Alexandrium spp. und Pseudochattonella spp.,die beiden problematischsten HAB verursachenden Arten im Süden Chiles, aus dem Meerwasser von Metri auch in geringer Häufigkeit nachgewiesen hat. Insbesondere Pseudochattonella spp. sind schwer zu identifizierende Arten unter dem Mikroskop, da die Zellen klein sind und unter Licht oder Verwendung von Fixiermitteln leicht gerissen werdenkönnen 27,28. Metabarcoding kann Algenarteninformationen liefern, die in Meerwasserproben, die die Mikroskopie nicht identifizieren kann, kaum vorhanden sind. Das Protokoll erkannte auch über 30 Bakterienarten. Obwohl zu diesem Zeitpunkt nicht bekannt ist, wie diese Bakterien mit dem Algenwachstum zusammenhängen, wird die massive Datenerhebung von Algen-Bakterienarten in der Zeitreihenanalyse möglicherweise so wichtige Entdeckungen liefern. Daher wird das Hinzufügen von Metabarcoding-Analysen zu den herkömmlichen chilenischen HAB-Überwachungsprogrammen zweifellos die derzeitige Effizienz der HAB-Überwachung stärken. Tatsächlich kann dieses visuelle Protokoll für die Metabarcoding-Analyse nicht nur für die Algen-Bakterien-Überwachung des chilenischen Wassers von Vorteil sein, sondern auch für die Küstenüberwachungsprogramme in anderen von HAB betroffenen Gebieten weltweit.
Obwohl dieses Protokoll die oben genannten Vorteile bot, sollten die Nachteile der Methode diskutiert werden. Wie im visuellen Protokoll zu sehen ist, ist die Metabarcoding-Methode zeitaufwendig und komplex und erfordert teure Maschinen und Reagenzien. Das Laborpersonal muss speziell geschult werden, sonst verschwendet es Material, Arbeit und Zeit. Darüber hinaus muss der Algennachweis durch Metabarcoding mit der Mikroskopie gepaart werden, um zu überprüfen, ob dieselben dominanten Spezies aus den beiden orthogonalen Methoden identifiziert werden29. Die Mikroskopie ist zum größten Teil ein nicht-invasives Werkzeug, um Algenarten zu identifizieren, was bedeutet, dass es schwieriger ist, Fehler zu machen, wenn die Algenarten einzigartige und scheinbare Formen haben. Natürlich kann es zu menschlichem Versagen kommen, wenn die Arten sehr ähnliche Formen haben. Auf der anderen Seite, da die Metabarcoding-Analyse mehrere Schritte erfordert, erhöht sie natürlich die Fehler. Es könnte sich um eine verwechselte Probe, eine falsche Reagenzienzugabe oder das Fehlen einiger Verfahren handeln. Daher ist es wichtig, die Metabarcoding-Ergebnisse mit denen der Mikroskopie zu vergleichen. Schließlich ist das Protokoll nur qualitativ anwendbar, und die Ergebnisse müssen für die relative Häufigkeit berechnet werden. Wie Lamb et al. im Jahr 2019 feststellten, ist das derzeitige Metabarcoding als quantitative Leistung immer noch begrenzt, und es ist zusätzliche Forschung erforderlich, bevor Metabarcoding sicher für quantitative Anwendungen genutzt werden kann30.
Dieses Protokoll wurde für 140 – 170 Proben pro Durchlauf aus dem 16S Metagenomic Sequencing Library Preparation Manual von Illumina Inc. optimiert. Das optimierte Protokoll wurde viele Male getestet und weiter modifiziert, um diese endgültige Version herauszugeben. Daher wird dringend empfohlen, jeden Schritt genau zu befolgen. Der kritischste Teil des Protokolls ist, dass besondere Sorgfalt erforderlich ist, um eine Probenkontamination zu vermeiden. Die Pipetten und die Laminar-Flow-Haube müssen jederzeit mit 70% Alkohol und UV-Strahlung gereinigt werden, und sterilisierbare Materialien sollten autoklaviert werden. Die Primer und Reagenzien sollten bei jedem neuen Durchlauf direkt aus dem Vorrat verdünnt werden, oder die Wiederverwendung von Reagenzien und die Exposition gegenüber mehreren Verdünnungen können eine Probenkontamination verursachen. Das Protokoll gibt an, wann der Vorgang außerhalb der Laminar-Flow-Haube durchgeführt werden kann. Sofern nicht anders, sollten Proben in einer gereinigten Laminar-Flow-Haube behandelt werden. Wenn Sie mit mehreren 8-Rohr-Streifen gleichzeitig arbeiten, wird empfohlen, den ersten 8-Rohr-Streifen zu bearbeiten und zu verschließen, bevor Sie zum nächsten 8-Rohr-Streifen übergehen. Wenn Sie den Deckel lange offen lassen, kann dies zu einer Probenkontamination führen, da die rRNA-Gene 16S und 18S in der Umgebung sehr allgegenwärtig sind. Die angegebene Zeit, wie Mischzeit und Inkubationszeit, sollte wie genau beschrieben befolgt werden, da die beste Dauer für jeden Schritt basierend auf den mehreren Testläufen ausgewählt wurde. Überschüssige oder unzureichende Zeit kann beispielsweise die Probenausbeute verringern. Der Prozess sollte nur an dem Teil gestoppt werden, von dem das Protokoll sagt, dass er gestoppt werden kann. Es ist wichtig, eine Negativkontrolle zu haben, da sie bestätigt, dass die positiven Ergebnisse keine künstlichen falsch positiven Ergebnisse sind. Schließlich wird dringend empfohlen, die Tage zu planen, da es mindestens fünf Tage dauert, um alle Schritte zu bearbeiten, und einige Teile nicht bis zum nächsten Halteschild gestoppt werden können.
Die Einschränkung der taxonomischen Zuordnung für sequenzierte Daten wird hier kurz erwähnt. Neu entdeckte Nukleotidsequenzen für Bakterien- und Algenarten werden täglich in der Datenbank aktualisiert. Während gut untersuchte Algen- und Bakterienarten zuverlässig registriert werden, werden in der Datenbank auch viele Sequenzen für unbekannte Arten aktualisiert. Es zeigt, dass die Auflösung der registrierten Nukleotidsequenzen nicht immer für die Artidentifizierung ausreicht, sondern nur für die Gattungsidentifizierung. Daher muss die mikroskopische Artidentifizierung orthogonal durchgeführt werden. Die Einrichtung einer Open-Access-Pipeline für diese Arbeit hat einen wesentlichen Vorteil, da sie mit einem großen Satz sequenzierter Daten gleichzeitig umgehen und effizient untersuchen kann, wenn ein Fehler auftritt. Darüber hinaus erfolgt die Ausgabe von DADA2 in einer Text- oder CSV-Datei, was die weitere statistische Analyse erleichtert. Auf der anderen Seite ist ein großer Server erforderlich, um taxonomische Zuweisungen durchzuführen, insbesondere wenn ein Dataset groß ist. Um die Pipeline einzurichten, werden Ingenieure benötigt, um die Pipeline einzurichten, und die Fachleute müssen Parameter, Betrieb, Linux und Bioinformatik verstehen.
Neben dem Umfang als HAB-Monitoring-Tool kann die Nutzung dieses Protokolls für investigative Forschungszwecke erweitert werden. Zum Beispiel gibt es laufende Debatten zwischen der chilenischen Regierung und lokalen Fischern zusammen mit Umweltfriedensverbänden über die erhöhte Anzahl lokaler HAB31,32. Die Regierung behauptet, dass dies auf ein Naturphänomen wie die globale Erwärmung und El Niño zurückzuführen ist, während die späteren Parteien behaupten, dass die Lachsaquakultur die Ursache ist. Lachs ist keine einheimische Art Chiles und war vor einem halben Jahrhundert nicht in chilenischem Wasser. Die chilenische Regierung zu dieser Zeit zielte darauf ab, die Wirtschaft zu steigern und Arbeitsplätze für arme Gebiete zu schaffen, indem sie ein Lachsgeschäftentwickelte 33. Mit der Intervention aus Übersee für Kapitalgewinn machte Chile großen Erfolg in der Entwicklung der Aquakultur im Stil von Gehegen, und die Zahl der Lachse hat in den letzten Jahrzehnten bemerkenswert zugenommen31,32,33. In der Folge wurde eine große Menge an Futter für Lachs ins Meer geworfen, was die Einheimischen zu der Vermutung veranlasste, dass die Lachsaquakultur der Grund für die häufigen lokalen HABs31,32ist. Die Wahrheit ist jetzt unbekannt, aber sie muss schließlich verstanden werden, damit Strategien zum Schutz der lokalen Meeresumwelt, der Wirtschaft und der menschlichen Gesundheit vor HABs entwickelt werden können. Die molekulare Analyse der lokalen Algen-Bakterien-Beziehung kann zu einer schrittweisen Klärung für ein solches Thema beitragen. Zum Beispiel kann die Technik die Algen- und Bakterienarten durchsuchen, die zuvor nicht im ozeanischen Zielgebiet vorhanden waren, aber in den letzten Jahren dramatisch zugenommen haben, was der Studie von Sakai et al. zur Entdeckung einer nicht aufgezeichneten Population von Yamato-Salamandern (Hynobius vandenburghi) durch GIS- und eDNA-Analyse34ähnelt. Daher hat dieses Metabarcoding-Protokoll über das HAB-Monitoring-Tool hinaus das Potenzial, für andere potenzielle Kunden verwendet zu werden.
The authors have nothing to disclose.
Diese Studie wurde durch den Zuschuss (JPMJSA1705) für eine Studie zur Wissenschafts- und Technologieforschungspartnerschaft für die Überwachung von Algen für nachhaltige Entwicklung in Chile (SATREPS-MACH) unterstützt. Wir danken Dr. Sandra Rios (Universidad de Los Lagos) für die Erlaubnis, einen Filmclip zu verwenden. Wir danken Neal Andrew Holland für sein fleißiges Korrekturlesen des Manuskripts. Wir danken den Mitgliedern der Laborgruppe von CREAN-IFOP in Puerto Montt, Chile, für die Beratung bei der Identifizierung von Phytoplankton.
1.5 mL single tube | ThermoFisher | Q32856 | sterile |
1.5 mL tubes | ThermoFisher | 2150N | sterile |
8-strip 0.2 mL PCR tubes and flat cap | ThermoFisher | AB0451 & 4323032 | sterile |
96-well 0.2 mL PCR plate | ThermoFisher | N8010560 | |
AccuRuler 100 bp DNA Ladder | MaestroGen | 02001-500 | |
Chelex 100 Chelating Resin | Bio-Rad | 1432832 | |
Chemical Duty Vacuum Pressure Pump | MilliporeSigma | WP6122050 | |
D1000 Reagents | Agilent Technologies | 5067-5583 | |
D1000 sample buffer | Agilent Technologies | 5067-5602 | |
DNA loading dye (Blue/Orange Loading Dye 6X) | Promega | G1881 | |
Ethanol Molecular Biology Grade | E7023 | Merck KGaA | |
Filtration device | ThermoFisher | 09-740-36H, 09-740-23E | |
Fluorescent DNA concentration measurement kit (Qubit dsDNA HS Assay kit) | Thermo Fisher Scientific | Q32851 | |
Fluorometer (Qubit4 Fluorometer) | ThermoFisher | Q33238 | |
Fragment analysis verification matrix (D1000 ScreenTape) | Agilent Technologies | 5067-5582 | |
Fragment Analyzer (Agilent Tapestation 4150) | Agilent | G2992AA | |
GelRed Nucleic Acid Gel Stain | Biotium | 41002 | |
Generic bench vortexer (Vortex Genie 2) | Scientific Industries | SI-0236 | |
Heat block | |||
High performance sequencing-grade DNA polymerase (KAPA HiFi Hotstart ReadyMix), 2X | Roche | KK2602 | |
HT1 Hybridization buffer | Illumina | 20015892 | |
Illumina Nextera XT v2 Index Kit set A, B, C and D | Illumina | FC-131-2001, -2002, -2003, -2004 | |
Laminar hood cabinet | Biobase Co. | Biobase PCR-800 PCR Cabinet | |
Loading tips (Specific for Agilent TapeStation systems) | Agilent Technologies | 5067-5598 | |
Magnetic beads DNA cleanup system (ProNex® Size-Selective Purification System) | Promega | NG2002 | |
Magnetic stand for 96 wells (Magnetic Stand-96) | ThermoFisher | AM10027 | |
Micro-seal film for 96-well plate | ThermoFisher | 4311971 | sterile |
MiSeq Reagent Kit v3 | Illumina | MS-102-3003 | includes pre-filled, ready-to-use reagent cartridges. |
MiSeq system | Illumina | SY-410-1003 | includes pre-installed software |
Molecular grade nuclease-free water | Integrated DNA Technologies | 11-05-01-04 | |
Molecular grade sodium hydroxide (NaOH) 1M | Merck KGaA | 1091371000 | |
Multichannel pipettes | Not specified | Not specified | |
Multi-Purpose Agarose | Cleaver Scientific | CSL-AG500 | |
Ow D2 Wide-Gel Electrophoresis System | ThermoFisher | D2 | |
Ow EC-105 Compact Power Supply | ThermoFisher | 105ECA-115 | |
Pellet Pestle— Cordless Motor | ThermoFisher | K749540-0000 | |
PhiX control Kit v3 | Illumina | FC-110-300 | ready-to-use control library for Illumina sequencing |
Pipette tips | Not specified | Not specified | sterile |
Pipettes | Not specified | Not specified | 2, 10, 20, 100, 1000 μL |
SterivexTM GP 0.22 μm filter unit | MilliporeSigma | SVGP01050 | |
Tabletop centrifuge | Eppendorf 5427R Centrifuge | Eppendorf AG | |
TBE buffer | ThermoFisher | B52 | |
TE buffer (pH 8.0) | ThermoFisher | AM9849 | |
Terr PCR Direct FFPE Kit | Takara Bio USA | 639284 | includes 2X Terra PCR Direct Buffer |
Terra PCR Direct Polymerase Mix, 1.25 U/μL | Takara Bio USA | 639271 | High performance Inhibitor-tolerant DNA polymerase |
ThermalCycler (MiniAMP Plus Thermal Cycler) | ThermoFisher | A37835 | |
TransIlluminator and image capture system | Analytik Jena, AG | GelDoc-ItTS2 Imager | |
Whatman 1.0 m pore-sized membrane | MilliporeSigma | WHA111110 |