Summary
Ce protocole introduit des étapes d’analyse de métabarcodage, ciblant les gènes de l’ARNr 16S et de l’ARNr 18S, pour surveiller les proliférations d’algues nocives et leur microbiome associé dans les échantillons d’eau de mer. C’est un outil moléculaire puissant mais qui nécessite plusieurs procédures, qui sont expliquées visuellement ici étape par étape.
Abstract
La surveillance des proliférations d’algues nuisibles (HAB) a été mise en œuvre dans le monde entier, et le Chili, un pays célèbre pour ses pêches et son aquaculture, utilise intensivement des analyses microscopiques et de toxines depuis des décennies à cette fin. Les méthodes de biologie moléculaire, telles que le séquençage de l’ADN à haut débit et les approches basées sur l’assemblage bactérien, commencent tout juste à être introduites dans la surveillance hab chilienne, et les procédures n’ont pas encore été normalisées. Ici, les analyses de métabarcodage de l’ARNr 16S et de l’ARNr 18S pour la surveillance des HAB chiliens sont introduites par étapes. Selon une hypothèse récente, l’association mutualiste algue-bactérienne joue un rôle de relation synergique ou antagoniste critique expliquant l’initiation, le maintien et la régression de la floraison. Ainsi, la surveillance de la HAB du point de vue algal-bactérien peut fournir une compréhension plus large des mécanismes HAB et la base de l’alerte précoce. L’analyse par métabarcodage est l’un des outils moléculaires les mieux adaptés à cet effet, car elle peut détecter des informations taxonomiques algales-bactériennes massives dans un échantillon. Les procédures visuelles de l’échantillonnage à l’analyse du métacodage à barres fournissent ici des instructions spécifiques, visant à réduire les erreurs et la collecte de données fiables.
Introduction
De nombreuses espèces de phytoplancton marin sont connues pour produire des toxines endogènes, et lorsque ces espèces s’accumulent en nombre suffisant, elles sont nocives pour le milieu marin. De telles proliférations d’algues nuisibles (HAB) sont observées aujourd’hui sur les côtes de la plupart des continents du monde1. Le phytoplancton toxique s’accumule d’abord dans les tissus bivalves, entraînant la maladie et la mort à des niveaux trophiques plus élevés d’organismes, y compris les humains, lors de la digestion. Par la suite, ces événements ont de graves répercussions sur l’économie locale, la socioéconomie et la santé publique2. Les dommages causés à l’économie mondiale par les HAB sont estimés à des millions à des milliards de dollars chaque année3. Le Chili est l’un des nombreux pays souffrant de fréquentes HAB.
Le Chili est un pays de longues terres, s’étendant sur plus de 4 300 km au nord et au sud. Les terres occidentales allongées font face à l’océan Pacifique, ce qui augmente naturellement les chances que le Chili connaisse des HAB. Surtout dans le sud du Chili, il existe de nombreuses salmonicultures de renommée mondiale, et chaque fois qu’un HAB se produit dans la région, les toxines algales entraînent la maladie et la mort de saumons d’élevage massifs4,5,6. Au Chili, l’année où le HAB a frappé le plus durement l’économie a été 2016, avec une perte annuelle estimée à 800 millions de dollars7,8. Les espèces d’algues toxiques responsables varient selon l’année et l’emplacement. Pour le cas de 2016, un complexe d’Alexandrium catanella et de Pseudochattonella verruclosa a provoqué un HAB répandu dans la majeure partie de la côte sud du Chili7,8. Le HAB le plus récent au Chili s’est produit avec l’espèce d’algue causale d’Heterosigma Akashiwo en mars 2021 à Camanchaca, située dans le sud du Chili, où la région possède une grande ferme salmonicole.
Le Chili effectue une surveillance côtière depuis de nombreuses années en utilisant deux méthodes principales; observer l’eau de mer au microscope pour identifier régulièrement les espèces d’algues toxiques et mesurer les niveaux de toxines dans les mollusques et crustacés par des essais biochimiques9. La détection précoce des niveaux d’algues toxiques et de toxines dans les mollusques et crustacés n’empêche pas les HAB; cependant, ces analyses peuvent déclencher des contre-mesures immédiates et réduire les dommages causés aux communautés locales. Pour renforcer davantage l’efficacité de cette stratégie, une méthode d’analyse moléculaire a récemment été ajoutée à notre programme de surveillance HAB chilien conventionnel pour détecter les algues et les communautés bactériennes connexes dans les échantillons d’eau de mer. Plus précisément, une méthode de séquençage parallèle massif utilisant le métacodage à barres qui cible les gènes de l’ARNr 16S et de l’ARNr 18S a été choisie. Bien que cette technique nécessite des procédures compliquées et des machines et des réactifs coûteux, il s’agit d’une technologie de pointe capable de détecter des milliers de genres /espèces d’algues et de bactéries présents dans un échantillon d’eau de mer à la fois.
Les causes de HAB sont supposées être diverses, telles que la température et la saison, mais il est impossible de les généraliser. En effet, les espèces et les fréquences HAB dépendent de la région et des conditions spatio-temporelles, impliquant des phénomènes naturels tels que l’unicité géographique, le mélange de nutriments ascendants et le ruissellement des éléments de la terre en raison del’errosion2, 10,11,12. De plus, des facteurs artificiels tels que l’eutrophisation influencent les HAB locaux12,13. En raison du multifacteur complexe, il n’est pas facile de faire une prédiction HAB précise. Au cours des dernières années, il existe un point de vue selon lequel des populations bactériennes spécifiques peuvent être liées au développement des HAB comme l’un des facteurs, et la recherche à l’appui de cette hypothèse a été de plus en plus évidente14,15,16,17,18. Les techniques de biologie moléculaire sont généralement utilisées pour étudier l’assemblage bactérien; toutefois, une telle méthode normalisée n’a pas encore été établie dans la surveillance des HABchiliens 9. Pour étudier l’association algue-bactérienne avec les HAB, il est impératif d’effectuer simultanément une analyse de métacodage à barres pour les programmes actuels de surveillance côtière chilienne. Ainsi, ce protocole introduit visuellement notre programme de surveillance HAB chilien, en se concentrant sur une procédure par étapes pour analyser la détection d’espèces d’algues et de bactéries dans des échantillons d’eau de mer à l’aide d’une analyse par métacodage à barres.
Le protocole complet décrivant notre programme chilien de surveillance HAB est disponible dans Yarimizu et al.9. Il comprend les procédures d’échantillonnage de l’eau de mer, la détection microscopique des espèces d’algues, la détection des gènes algales-bactériens, l’analyse des pigments, la collecte de données météorologiques et les essais physiques et chimiques des propriétés de l’eau. Le protocole par étapes de l’analyse par métabarcodage de l’ARNr 16S et de l’ARNr 18S pour la détection des espèces algales et bactériennes est disponible en préimpression19. Ce protocole démontre particulièrement les étapes d’analyse du métabarcodage puisqu’il s’agit de la partie la plus compliquée et du point culminant de notre programme de surveillance HAB. Ce protocole comprend également une introduction du programme et la détection microscopique des espèces d’algues. Lors de l’analyse d’espèces d’algues par métacodage à barres, il est crucial d’effectuer simultanément la microscopie pour vérifier les résultats des deux méthodes. Ce protocole n’inclut pas comment utiliser un logiciel pour l’affectation de taxonomie, mais la recommandation de base de données est brièvement énoncée à la fin de la section suivante.
Protocol
1. Prélèvement et prétraitement des échantillons
- Prélever environ 3 L d’échantillon d’eau à partir de l’endroit cible.
- Filtrer 1 L d’échantillon d’eau pour l’analyse de l’ARNr 16S par filtration en tandem (membrane de 1 μm et de la taille d’un pore de 0,2 μm) pour séparer les bactéries libres et attachées.
- Filtrer un autre échantillon d’eau de 1 L pour l’analyse de l’ARNr 18S (détection du phytoplancton) à travers une seule filtration avec une membrane de 0,2 μm.
REMARQUE: La filtration de l’échantillon d’eau doit être terminée dans les 12 heures suivant l’échantillonnage. - Coupez la membrane filtrée en deux avec des ciseaux chirurgicaux stériles et enveloppez-la avec du papier d’aluminium. Conserver à -20 °C jusqu’à 1 mois ou passer à l’étape suivante.
- Extraire l’ADN avec la méthode Chelex comme décrit9. Conserver à -20 °C jusqu’à 1 mois.
2. Analyse au microscope
- Transférer 1 mL de l’échantillon d’eau par une pipette sur une grille-glissière de 1 mL.
- Observez l’échantillon au microscope.
- Enregistrer les noms et la quantité d’espèces de phytoplancton.
3. Analyse du métabarcodage de l’ARNr 16S et de l’ARNr 18S
REMARQUE: Ce processus comprend sept sections: préparation, première génération d’amplicon PCR, premier nettoyage amplicon, indexation par deuxième PCR, deuxième vérification et nettoyage de l’amplicon PCR, ajustement de la concentration d’ADN et dénaturation et séquençage de l’ADN. L’ensemble du processus prend un minimum de 5 jours (40 h) par un personnel de laboratoire expérimenté. Voir le tableau des matériaux pour les numéros de produits et les fabricants.
- Préparation
- Nettoyez les pipettes et l’armoire à hotte laminaire avec de l’éthanol à 70%, puis l’exposition aux UV pendant 30 minutes fréquemment. Stériliser les matériaux à utiliser.
- Décongeler les échantillons d’ADN à température ambiante, centrifuger à 100 x g pendant 2 min et transférer 100 μL de chaque surnageant d’échantillon sur des bandes à 8 tubes.
- Première génération d’amplicons PCR
REMARQUE: Effectuez les procédures suivantes dans une armoire à hotte laminaire. Diluez toujours les amorces à partir de 1 μM jusqu’à la concentration cible avec de l’eau de qualité PCR pour éviter la contamination des amorces.- Préparer le premier mélange maître PCR dans un tube stérile de 1,5 mL pour les réactions (Tableau 1, Tableau 2).
- Aliquoter 22,5 μL du mélange maître dans une bande de 8 tubes et ajouter 2,5 μL d’échantillon d’ADN. Utilisez 2,5 μL d’eau de qualité PCR pour le contrôle négatif.
- Exécutez le premier cycle de PCR (Tableau 3).
- Préparer 100 mL de gel agarose-TBE à 2 % contenant 10 μL de 1x colorant de gel d’acide nucléique.
- Charger un mélange de 1,5 μL de 1x colorant à charge d’ADN et de 4 μL de produit PCR sur le gel d’agarose. En outre, chargez une échelle d’ADN de 100 bp sur le gel.
- Effectuer une électrophorèse à 100 V pendant 30 min.
- Assurez-vous qu’il existe une bande comprise entre 500 et 600 bp sous une capture d’image en lumière UV. La bande primer-dimère est ronde 80 bp.
REMARQUE: Les échantillons d’eau de mer contiennent des inhibiteurs de la PCR. Les amplicons manquants peuvent parfois être résolus en diluant les échantillons 1:100 ou 1:1000 avec de l’eau de qualité PCR. - Conservez les premiers produits PCR à -20 °C jusqu’à l’étape suivante.
ATTENTION : Ne pas dépasser une semaine de stockage.
- Premier nettoyage de l’amplicon PAR PCR
REMARQUE: Cette section peut être effectuée à l’extérieur d’une armoire à hotte laminaire.- Utilisez un système de nettoyage de l’ADN des billes magnétiques pour éliminer les résidus de réaction par PCR, y compris les produits d’apprêt-dimère.
- Transférer 20 μL de chaque premier produit PCR nettoyé sur une nouvelle plaque de 96 puits. Scellez la plaque avec un film de micro-joint. Conserver à -20 °C jusqu’à ce que l’étape suivante se poursuive.
ATTENTION : Ne pas dépasser plus d’une semaine de stockage.
- Indexation par deuxième PCR
REMARQUE: Dans cette section, les premiers produits PCR purifiés seront amplifiés avec diverses combinaisons d’amorces d’indice.- Diluer tous les apprêts d’indice 1 et d’indice 2 (tableau 4) à 1 μM avec de l’eau de qualité PCR dans 8 bandes PCR tubulaires placées dans une armoire à hotte laminaire.
REMARQUE: Les étapes de cette section peuvent désormais être effectuées à l’extérieur d’une armoire à hotte laminaire, car les amorces d’index sont spécifiques au premier adaptateur en porte-à-faux des réactions PCR. - Amorce de l’indice de position 1 dans une ligne horizontale Amorces de l’indice 2 dans une ligne verticale (Tableau 5).
- Dans une nouvelle plaque de 96 puits, ajoutez 12,5 μL de formulation prête à démarrer à chaud à chaque puits.
- Ajouter 2,5 μL de chaque amorce d’indice (1 μM) à chaque puits comme dans le tableau 4 à l’aide d’une pipette multicanal.
- Ajouter 7,5 μL de premier produit PCR purifié.
- Mélanger doucement en pipetant vers le haut et vers le bas 10 fois. Couvrez la plaque avec un film de micro-joint.
- Exécutez le deuxième cycle de PCR (Tableau 3).
- Conserver la plaque à -20 °C.
ATTENTION : Ne pas dépasser une semaine de stockage.
- Diluer tous les apprêts d’indice 1 et d’indice 2 (tableau 4) à 1 μM avec de l’eau de qualité PCR dans 8 bandes PCR tubulaires placées dans une armoire à hotte laminaire.
- Deuxième vérification et nettoyage de l’amplicon PCR
- Utilisez un analyseur de fragments et le réactif associé. Vortex et réactif spin down avant utilisation.
- Laissez le tampon d’échantillon et le ruban d’écran d’ADN s’équilibrer à température ambiante pendant 30 minutes. Ensuite, placez la bande d’écran ADN dans un analyseur de fragments.
- Mélanger 2 μL de tampon d’échantillon et 3 μL de deuxième amplicon PCR dans de nouvelles bandes de 8 tubes. Insérez les 8 bandes de tubes dans l’analyseur de fragments. Appuyez sur Exécuter pour démarrer.
ATTENTION : La formation de bulles d’air doit être évitée. - Assurez-vous que les deuxièmes amplicons PCR sont d’environ 613 pb (600 - 630 pb) pour les gènes de l’ARNr 16S et 18S.
- Purifier les produits de deuxième PCR à l’aide d’un système de nettoyage de l’ADN des billes magnétiques.
- Ajustement de la concentration d’ADN
- Mesurer la concentration d’ADN dans les deuxièmes produits PCR purifiés à l’aide d’un spectrophotomètre de quantification des acides nucléiques.
- Calculer la concentration du gène cible en nM, en tenant compte de la taille moyenne de la bibliothèque finale de 613 pb pour les gènes de l’ARNr 16S et 18S :
- Diluer chaque deuxième produit PCR purifié avec de l’eau PCR stérile à 4 nM dans une nouvelle plaque de puits de 0,2 mL 96.
REMARQUE: La plaque peut être stockée à -20 ° C ici. Sinon, le reste des procédures doit être effectué sans arrêt. - Aliquote 3 μL de chaque produit PCR de 4 nM seconde et mélanger le tout dans un nouveau tube stérile de 1,5 mL sous forme de bibliothèque groupée. Gardez le tube à 4 °C ou sur un bain de glace en tout temps.
- Mesurer la concentration de la bibliothèque regroupée pour confirmation à l’aide d’un spectrophotomètre de quantification des acides nucléiques. Ajuster la concentration à 4 nM si elle est supérieure à 4 nM.
REMARQUE: L’ADN surconcentré produit des nombres de lecture surestimés, ce qui entrave l’analyse.
- Dénaturation et séquençage de l’ADN
REMARQUE: Cette section utilise le système Illumina MiSeq avec des réactifs spécifiques. Voir les numéros de produit dans le tableau des matériaux.
REMARQUE: Suivez strictement le temps. Décongeler tous les réactifs à l’exception des cartouches le jour du séquençage.- Un jour avant le séquençage, retirez une cartouche de réactif prête à l’emploi préremplie à partir de -20 °C et conservez-la à 4 °C pour la décongélation.
- Réglez un bloc thermique adapté aux tubes centrifuges de 1,5 mL à 96 °C.
- Placez le tampon d’hybridation sur la glace.
- Diluer le NaOH de qualité moléculaire de 1 N à 0,2 N dans un nouveau tube avec de l’eau de qualité PCR.
- Diluer une bibliothèque de contrôle prête à l’emploi avec un tampon TE (pH 8,0) de 10 nM à 4 nM dans un nouveau tube (c.-à-d. 2 μL de bibliothèque de contrôle + 3 μL de tampon TE).
- Mélanger 16 μL de 4 nM de bibliothèque d’échantillons regroupés avec 4 μL de bibliothèque de contrôle de 4 nM dans un nouveau tube étiqueté « 1 ».
- Mélanger 10 μL d’échantillon dans le tube « 1 » avec 10 μL de NaOH 0,2 N dans un nouveau tube étiqueté « 2 ».
- Vortex le tube 2 pendant 5 s, tourner brièvement vers le bas et incuber à température ambiante pendant 5 min.
- Ajouter 980 μL de tampon d’hybridation au tube 2.
- Dans un nouveau tube étiqueté « 3 », mélanger 260 μL l’échantillon du tube 2 avec 390 μL de tampon d’hybridation. Mélanger en inversant le tube.
- Incuber le tube 3 à 96 °C pendant 2 min et le placer immédiatement sur de la glace pendant un maximum de 2 min.
- Retirez la cartouche du réfrigérateur à 4 °C.
- Configurez la feuille d’échantillon pour le séquençage avec chaque adaptateur d’index 1 et d’index 2 correspondant comme dans le tableau 6.
- Retirez la cellule de flux du kit MiSeq v3. Nettoyez doucement la cellule d’écoulement avec de l’eau PCR stérile de qualité moléculaire.
REMARQUE: Ne versez pas d’eau sur les points capillaires de la cellule d’écoulement. Essuyez doucement l’eau de la cellule d’écoulement avec du papier non fibreux. - Chargez le volume total du tube 3 (650 μL) dans la cartouche.
- Dans le logiciel de fonctionnement de l’instrument, sélectionnez séquençage et suivez les instructions. Insérez la cellule de flux, le tampon d’incorporation et la cartouche. Charger la feuille d’échantillonnage. Appuyez sur Exécuter pour lancer la réaction.
REMARQUE: Cette exécution de séquence prendra 3-5 jours. Les données seront automatiquement téléchargées sur la plateforme Basespace. Les données brutes seront stockées dans deux dossiers de l’ordinateur : dossier d’analyse contenant des fichiers fastq et sortie contenant des fichiers bcl et des images jpeg.
4.Affectation taxonomique aux données de séquençage
- Traitement des fichiers FASTQ
REMARQUE: DADA2 package23 de R24 est l’une des bases de données recommandées pour traiter les fichiers FASTQ. La ligne directrice est disponible à l’adresse [https://github.com/mickeykawai/exec_dada2]. Cette ligne directrice a été préparée en adoptant la version récente du didacticiel sur le pipeline DADA2 [https://benjjneb.github.io/dada2/tutorial.html].- Traitez les séquences brutes d’extrémités appariées FASTQ pour le rognage, le filtrage de la qualité, la déreplication et le comptage de séquences uniques, l’inférence d’échantillons, la fusion en contigs et la suppression de séquences chimériques.
- Utiliser selon les paramètres spécifiés par DADA2 pour les fragments de gènes d’ARNr 16S et d’ARNr 18S; trimLefts=0, 0, truncLens=[Vérifiez la qualité de la séquence et réglez-la sur une longueur appropriée].
REMARQUE : Les valeurs par défaut pour les autres paramètres sont maxN=0, maxEE=2,2, trancQ=2.
- Affectation de taxonomie
REMARQUE : La base de données d’ARNr SILVA est recommandée pour l’affectation de taxonomie pour DADA2 [silva_nr_v132_train_set.fa.gz est défini par défaut].- Retirez les chloroplastes et les OTO mitochondriaux pour l’analyse des fragments de gènes d’ARNr 16S. Retirer les singletons de l’analyse de l’ARNr 16S et de l’ARNr 18S.
- Raréfiez tous les échantillons à une profondeur de séquençage uniforme en fonction de l’échantillon ayant la profondeur de séquençage la plus faible.
- Enregistrez le nombre de lectures, d’OTU attribués et à quel niveau, les lectures filtrées et le nombre de singletons exclus.
- Analyse statistique
- Effectuer une analyse statistique des données microbiennes à l’aide des paquets R de phyloseq25 et vegan26.
Representative Results
Ce protocole utilise l’analyse du métacodage à barres du gène de l’ARNr 18S pour identifier les espèces d’algues dans les échantillons d’eau de mer. Un résultat représentatif est illustré à la figure 1, dans laquelle l’eau de mer recueillie à Metri, Puerto Montt, Chili (−41,597; −72,7056) le 19 février 2019, a été analysée avec ce protocole. Le résultat a montré un total de 13 750 lectures avec plus de 30 espèces d’algues dans l’échantillon d’eau de mer. L’algue dominante dans cet échantillon était Navicula spp. avec une abondance relative de 70,77 %. En outre, une abondance suffisante a été observée pour Micromonas (6,40%), Chaetoceros spp. (4,44%), Scripsiella spp. (2,44%) et Prorocentrum spp. (1.28%). Pseudochattonella spp.,l’un des plus grands responsables d’algues toxiques de la HAB chilienne, a été détecté avec 0,52% de cet échantillon d’eau de mer.
Pour vérifier la fiabilité des données, les espèces d’algues identifiées par l’analyse du gène de l’ARNr 18S ont été comparées à celles obtenues par microscopie dans le même échantillon d’eau de mer (Figure 2). Conformément à l’analyse du gène de l’ARNr 18S, la microscopie a montré que l’espèce dominante était Navicula spp. avec une abondance relative de 74,1 % et Prorocentrum spp. (0,60 %) en tant qu’espèce mineure. Inversement, Heterocapsa spp. (9,04%) documenté à partir d’observations microscopiques n’a pas été identifié par l’analyse du gène de l’ARNr 18S dans cet échantillon. Il y avait 12,6% de petites cellules de phytoplancton non identifiables enregistrées par microscopie. Cela pourrait être Micromonas, selon les résultats de l’ARNr 18S.
Le protocole utilise l’analyse du métacodage à barres du gène de l’ARNr 16S pour identifier les espèces bactériennes dans les échantillons d’eau de mer. Un résultat représentatif est illustré à la figure 3, dans laquelle la même eau de mer utilisée pour l’analyse du gène de l’ARNr 18S a été analysée avec l’analyse du gène de l’ARNr 16S. Le résultat a montré un total de 31 758 lectures avec plus de 30 espèces bactériennes dans l’échantillon d’eau de mer. Il convient de souligner que cet échantillon d’eau de mer a été passé à travers des membranes filtrantes en tandem (tailles de pores de 1 μm et 0,2 μm) pour séparer les bactéries libres des bactéries attachées. Ensuite, les cellules capturées par chaque membrane filtrante ont été traitées pour l’extraction de l’ADN, suivie de l’analyse du gène de l’ARNr 16S. Le résultat représentatif de la figure 3 montre des espèces de bactéries identifiées à partir d’une membrane de 0,2 μm de la taille d’un pore, qui sont définies comme des bactéries libres. La bactérie dominante vivant librement était Amylibacter spp. avec une abondance relative de 20,02%, suivie du clade Ia (13,53%) et d’Aligiphilus spp. (7.06%). Les autres espèces bactériennes détectées dans cet échantillon d’eau de mer étaient relativement également réparties. La même analyse peut être effectuée pour les cellules capturées par une membrane de la taille d’un pore de 1 μm que la détection d’espèces de bactéries attachées.
Lorsque ces essais de méta-codage à barres sont effectués à des moments planifiés sur une certaine période d’étude, les résultats peuvent être résumés sous forme d’analyse de séries chronologiques. Une façon de le faire est de tracer l’abondance relative d’espèces d’algues et de bactéries particulières en fonction du temps pour trouver un modèle de croissance unique. La figure 4 montre un diagramme de série chronologique représentatif d’Alexandrium et de Pseudochattonella à Metri, au Chili. Une autre façon de résumer une analyse de méta-codage à barres de séries chronologiques consiste à tracer tous les algues et bactéries identifiés en fonction du temps, représentant le changement de population de certains groupes d’organismes. La figure 5 et la figure 6 résument l’abondance relative de tous les genres et ordres bactériens, respectivement, qui sont détectés dans l’eau de mer de Metri sur une période de cinq mois.
Tableau 1 : Contenu du premier mélange maître PCR : Le tableau indique la teneur du mélange principal par réaction pour les analyses d’ARNr 16S et d’ARNr 18S. Les séquences d’amorce sont répertoriées dans le tableau 3. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.
Tableau 2 : Séquences d’amorce : Les amorces pour la première PCR sont répertoriées pour les analyses d’ARNr 16S et d’ARNr 18S. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.
Tableau 3 : Cycles de PCR : Les cycles thermiques de la première PCR et de la deuxième PCR sont répertoriés. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.
Tableau 4 : Séquences d’index : Les amorces de l’indice 1 (i7) et de l’index 2 (i5) à utiliser pour la deuxième PCR sont répertoriées. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.
Tableau 5 : Exemple de positionnement de l’indice 1 et de l’indice 2 : Pour réduire les erreurs, les amorces d’index doivent être placées en premier dans la position et l’aliquote de chacun est transférée sur une plaque de 96 puits à l’aide d’une pipette multicanal. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.
Tableau 6 : Exemple de feuille d’échantillonnage : Avant le séquençage, une feuille d’échantillons doit être créée correspondant aux adaptateurs d’index 1 et d’index 2. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.
Figure 1: Résultat représentatif de l’analyse du métacodage à barres de l’ARNr 18S : Les espèces d’algues présentes dans un échantillon d’eau de mer prélevé à Metri, Los Lagos, Chili, le 19 février 2019, ont été identifiées par le test de métabarcodage de l’ARNr 18S. Les séquences assignées « inconnu » ont été éliminées et l’abondance relative de chaque espèce identifiée a été tracée. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 2: Résultat représentatif de l’analyse microscopique : Les espèces d’algues ont été identifiées à partir d’un échantillon d’eau de Metri, Los Lagos, Chili, le 19 février 2019, par microscopie. La quantité de chaque espèce a été comptée manuellement et tracée. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 3: Résultat représentatif de l’analyse du métacodage à barres de l’ARNr 16S : Les espèces bactériennes présentes dans un échantillon d’eau de Metri, Los Lagos, Chili, le 19 février 2019, ont été identifiées par le test de métabarcodage de l’ARNr 16S. L’abondance relative de chaque espèce identifiée a été tracée. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 4: Diagramme représentatif des séries chronologiques d’Alexandrium spp. et de Pseudochattonella spp. obtenu à partir du métabarcodage de l’ARNr 18S à Metri, Chili : Figure réimprimée à partir de Yarimizu et al9. Les deux espèces d’algues toxiques, Alexandrium et Pseudochattonella, ont été surveillées sélectivement par analyse de l’ARNr 18S au fil du temps, et l’abondance relative a été tracée en fonction du point temporel. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 5: Graphique de série chronologique représentatif du genre obtenu à partir de l’ARNr 16S et du métacodage à barres de l’ARNr 18S : Tous les genres bactériens et eucaryotes identifiés dans l’eau de Metri, au Chili, surveillés pendant cinq mois. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 6: Diagramme de séries chronologiques d’ordre représentatif obtenu à partir de l’ARNr 16S et du métacodage à barres de l’ARNr 18S : Tous les ordres bactériens et eucaryotes identifiés dans l’eau de Metri, au Chili, surveillés pendant cinq mois. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Tableau S1 et Tableau S2:
Tableau S1: Données brutes pour les figures 5 et 6. Tableau S2: Résultat du contrôle de qualité sur les données brutes de la figure 5 et de la figure 6. Veuillez cliquer ici pour télécharger ces tableaux.
Discussion
Ce protocole a effectué avec succès une analyse du métabarcodage du gène de l’ARNr 18S et de l’ARNr 16S afin d’identifier les espèces algales et bactériennes dans les échantillons d’eau de mer pour la surveillance des HAB chiliens. Les algues dominantes et quelques algues mineures détectées par ce protocole étaient cohérentes avec celles obtenues par microscopie, confirmant la fiabilité du protocole. Le point culminant du protocole est que l’analyse a détecté Alexandrium spp. et Pseudochattonella spp.,les deux espèces causant des HAB les plus problématiques dans le sud du Chili, dans l’eau de mer de Metri même à une faible abondance. Surtout, Pseudochattonella spp. sont des espèces difficiles à identifier au microscope parce que les cellules sont petites et se rompent facilement sous la lumière ou l’utilisation de fixateurs27,28. Le métacodage à barres peut fournir des informations sur les espèces d’algues qui sont à peine présentes dans les échantillons d’eau de mer que la microscopie ne peut pas identifier. Le protocole a également détecté plus de 30 espèces bactériennes. Bien que la façon dont ces bactéries sont liées à la croissance des algues soit inconnue à ce stade, la collecte massive de données sur les espèces algales-bactériennes dans l’analyse des séries chronologiques fournira peut-être des découvertes aussi importantes. Ainsi, l’ajout de l’analyse de métabarcodage aux programmes de surveillance HAB chiliens conventionnels renforcera sans aucun doute l’efficacité actuelle de la surveillance HAB. En fait, ce protocole visuel pour l’analyse du métacodage à barres peut être bénéfique non seulement pour la surveillance algale-bactérienne de l’eau chilienne, mais aussi pour les programmes de surveillance côtière dans d’autres zones touchées par le HAB dans le monde entier.
Bien que ce protocole ait fourni les avantages susmentionnés, les inconvénients de la méthode doivent être discutés. Comme on le voit dans le protocole visuel, la méthode de méta-codage à barres prend du temps et est complexe, nécessitant des machines et des réactifs coûteux. Le personnel du laboratoire doit être spécialement formé, sinon il gaspillera du matériel, de la main-d’œuvre et du temps. De plus, la détection d’algues par métacodage à barres doit être associée à la microscopie pour vérifier que les mêmes espèces dominantes sont identifiées à partir des deux méthodes orthogonales29. La microscopie est un outil non invasif, pour la plupart, pour identifier les espèces d’algues, ce qui signifie qu’il est plus difficile de faire des erreurs lorsque les espèces d’algues ont des formes uniques et apparentes. Bien sûr, l’erreur humaine peut se produire si les espèces ont des formes très similaires les unes aux autres. D’autre part, comme l’analyse du métabarcodage nécessite plusieurs étapes, elle augmente naturellement les erreurs. Il peut s’agir d’un échantillon mélangé, d’un mauvais ajout de réactif ou de l’absence de certaines procédures. Par conséquent, il est essentiel de comparer les résultats du métacodage à barres avec ceux obtenus par microscopie. Enfin, le protocole n’est applicable que qualitativement, et les résultats doivent être calculés pour l’abondance relative. Comme Lamb et al. l’ont déclaré en 2019, le métacodage à barres actuel en tant que performance quantitative est encore limité, et des recherches supplémentaires sont nécessaires avant que le métacodage à barres puisse être utilisé en toute confiance pour des applications quantitatives30.
Ce protocole a été optimisé pour 140 à 170 échantillons par série à partir du manuel de préparation de la bibliothèque de séquençage métagénomique 16S publié par Illumina Inc. Le protocole optimisé a été testé à plusieurs reprises et modifié pour publier cette version finale. Par conséquent, il est fortement recommandé de suivre chaque étape avec précision. La partie la plus critique du protocole est qu’une attention particulière est nécessaire pour éviter la contamination des échantillons. Les pipettes et la hotte à flux laminaire doivent être nettoyées à 70 % d’alcool et d’exposition aux UV en tout temps, et les matériaux stérilisables doivent être autoclavés. Les amorces et les réactifs doivent être dilués directement à partir du stock à chaque nouvelle série, sinon la réutilisation des réactifs et l’exposition à plusieurs dilutions peuvent être une cause de contamination de l’échantillon. Le protocole spécifie quand l’opération peut être effectuée à l’extérieur de la hotte à flux laminaire. Sauf indication contraire, les échantillons doivent être traités dans une hotte à écoulement laminaire nettoyée. Lorsqu’il s’agit de plusieurs bandes à 8 tubes simultanément, il est recommandé de travailler sur la première bande à 8 tubes et de la coiffer avant de passer à la bande suivante à 8 tubes. Laisser le couvercle ouvert pendant une longue période peut provoquer une contamination de l’échantillon, car les gènes de l’ARNr 16S et 18S sont très omniprésents dans l’environnement. Le temps indiqué, tel que le temps de mélange et le temps d’incubation, doit être suivi comme décrit exactement, car la meilleure durée pour chaque étape a été sélectionnée en fonction des multiples séries de tests. Un temps excessif ou insuffisant peut, par exemple, réduire le rendement de l’échantillon. Le processus ne doit être arrêté qu’à la partie où le protocole dit qu’il peut s’arrêter. Il est crucial d’avoir un contrôle négatif car il confirme que les résultats positifs ne sont pas des faux positifs artificiels. Enfin, il est fortement recommandé de planifier les jours car il faut au moins cinq jours pour traiter toutes les étapes, et certaines pièces ne peuvent pas être arrêtées jusqu’au prochain panneau d’arrêt.
Les limites de l’affectation taxonomique pour les données séquencées sont brièvement notées ici. Les séquences nucléotidiques nouvellement découvertes pour les espèces bactériennes et algales sont mises à jour quotidiennement dans la banque de données. Bien que les espèces d’algues et de bactéries bien étudiées soient enregistrées de manière fiable, il existe également de nombreuses séquences pour des espèces inconnues mises à jour dans la banque de données. Il indique que la résolution des séquences nucléotidiques enregistrées n’est pas toujours suffisante pour l’identification des espèces, mais seulement pour l’identification des genres. Ainsi, l’identification microscopique des espèces doit être effectuée orthogonalement. L’établissement d’un pipeline en libre accès pour ce travail présente un avantage significatif en traitant un grand ensemble de données séquencées à la fois et en enquêtant efficacement lorsqu’une erreur se produit. De plus, la sortie de DADA2 est dans un fichier texte ou csv, ce qui facilite l’analyse statistique ultérieure. D’autre part, un grand serveur est nécessaire pour effectuer des affectations taxonomiques, en particulier lorsqu’un jeu de données est volumineux. Pour configurer le pipeline, des ingénieurs sont nécessaires pour configurer le pipeline, et les professionnels doivent comprendre les paramètres, le fonctionnement, Linux et la bioinformatique.
Outre la portée en tant qu’outil de surveillance HAB, l’utilisation de ce protocole peut être étendue à des fins de recherche d’investigation. Par exemple, il y a des débats en cours entre le gouvernement chilien et les pêcheurs locaux ainsi que les associations de paix environnementale concernant l’augmentation du nombre de HAB31,32locaux . Le gouvernement affirme que cela est dû à un phénomène naturel tel que le réchauffement climatique et El Niño, tandis que les dernières parties affirment que la salmoniculture en est la cause. Le saumon n’est pas une espèce indigène du Chili et n’était pas dans l’eau chilienne il y a un demi-siècle. Le gouvernement chilien de l’époque visait à faire croître l’économie et à créer des emplois dans les zones pauvres en développant une entreprise de saumon33. Avec l’intervention de l’étranger pour le profit du capital, le Chili a fait un grand succès dans le développement de l’aquaculture de style enclos, et le nombre de saumons a remarquablement augmenté au cours des dernières décennies31,32,33. Par la suite, une grande quantité de nourriture pour le saumon a été jetée à la mer, ce qui a amené la population locale à soupçonner que la salmoniculture est la raison de la fréquence des HAB locaux31,32. La vérité est inconnue maintenant, mais elle doit être comprise à terme afin que des stratégies visant à protéger l’environnement marin local, l’économie et la santé humaine contre les HAB puissent être élaborées. L’analyse moléculaire de la relation algale-bactérienne locale peut contribuer à une clarification avancée pour un tel sujet. Par exemple, la technique permet de rechercher les espèces algales et bactériennes qui n’étaient pas présentes dans la zone océanique cible auparavant, mais qui ont considérablement augmenté ces dernières années, ce qui est quelque peu similaire à l’étude réalisée par Sakai et al. pour la découverte d’une population non enregistrée de salamandre Yamato (Hynobius vandenburghi) par analyse SIG et ADNe34. Par conséquent, au-delà de l’outil de surveillance HAB, ce protocole de métabarcoding a l’utilisation potentielle pour d’autres prospects.
Disclosures
Les auteurs ne déclarent aucun conflit d’intérêts. Les bailleurs de fonds n’ont joué aucun rôle dans la conception de l’étude, dans la collecte, l’analyse ou l’interprétation des données; dans la rédaction du manuscrit, ou dans la décision de publier les résultats.
Acknowledgments
Cette étude a été soutenue par la subvention (JPMJSA1705) pour une étude sur le Partenariat de recherche scientifique et technologique pour le développement durable-surveillance des algues au Chili (SATREPS-MACH). Nous remercions dr. Sandra Rios (Universidad de Los Lagos) de nous avoir permis d’utiliser un clip vidéo. Nous remercions Neal Andrew Holland pour sa relecture diligente du manuscrit. Nous exprimons notre sincère gratitude aux membres du groupe de laboratoire de CREAN-IFOP à Puerto Montt, au Chili, pour nous avoir conseillés sur l’identification du phytoplancton.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL single tube | ThermoFisher | Q32856 | sterile |
| 1.5 mL tubes | ThermoFisher | 2150N | sterile |
| 8-strip 0.2 mL PCR tubes and flat cap | ThermoFisher | AB0451 & 4323032 | sterile |
| 96-well 0.2 mL PCR plate | ThermoFisher | N8010560 | |
| AccuRuler 100 bp DNA Ladder | MaestroGen | 02001-500 | |
| Chelex 100 Chelating Resin | Bio-Rad | 1432832 | |
| Chemical Duty Vacuum Pressure Pump | MilliporeSigma | WP6122050 | |
| D1000 Reagents | Agilent Technologies | 5067-5583 | |
| D1000 sample buffer | Agilent Technologies | 5067-5602 | |
| DNA loading dye (Blue/Orange Loading Dye 6X) | Promega | G1881 | |
| Ethanol Molecular Biology Grade | E7023 | Merck KGaA | |
| Filtration device | ThermoFisher | 09-740-36H, 09-740-23E | |
| Fluorescent DNA concentration measurement kit (Qubit dsDNA HS Assay kit) | Thermo Fisher Scientific | Q32851 | |
| Fluorometer (Qubit4 Fluorometer) | ThermoFisher | Q33238 | |
| Fragment analysis verification matrix (D1000 ScreenTape) | Agilent Technologies | 5067-5582 | |
| Fragment Analyzer (Agilent Tapestation 4150) | Agilent | G2992AA | |
| GelRed Nucleic Acid Gel Stain | Biotium | 41002 | |
| Generic bench vortexer (Vortex Genie 2) | Scientific Industries | SI-0236 | |
| Heat block | |||
| High performance sequencing-grade DNA polymerase (KAPA HiFi Hotstart ReadyMix), 2X | Roche | KK2602 | |
| HT1 Hybridization buffer | Illumina | 20015892 | |
| Illumina Nextera XT v2 Index Kit set A, B, C and D | Illumina | FC-131-2001, -2002, -2003, -2004 | |
| Laminar hood cabinet | Biobase Co. | Biobase PCR-800 PCR Cabinet | |
| Loading tips (Specific for Agilent TapeStation systems) | Agilent Technologies | 5067-5598 | |
| Magnetic beads DNA cleanup system (ProNex® Size-Selective Purification System) | Promega | NG2002 | |
| Magnetic stand for 96 wells (Magnetic Stand-96) | ThermoFisher | AM10027 | |
| Micro-seal film for 96-well plate | ThermoFisher | 4311971 | sterile |
| MiSeq Reagent Kit v3 | Illumina | MS-102-3003 | includes pre-filled, ready-to-use reagent cartridges. |
| MiSeq system | Illumina | SY-410-1003 | includes pre-installed software |
| Molecular grade nuclease-free water | Integrated DNA Technologies | 11-05-01-04 | |
| Molecular grade sodium hydroxide (NaOH) 1M | Merck KGaA | 1091371000 | |
| Multichannel pipettes | Not specified | Not specified | |
| Multi-Purpose Agarose | Cleaver Scientific | CSL-AG500 | |
| Ow D2 Wide-Gel Electrophoresis System | ThermoFisher | D2 | |
| Ow EC-105 Compact Power Supply | ThermoFisher | 105ECA-115 | |
| Pellet Pestle— Cordless Motor | ThermoFisher | K749540-0000 | |
| PhiX control Kit v3 | Illumina | FC-110-300 | ready-to-use control library for Illumina sequencing |
| Pipette tips | Not specified | Not specified | sterile |
| Pipettes | Not specified | Not specified | 2, 10, 20, 100, 1000 μL |
| SterivexTM GP 0.22 μm filter unit | MilliporeSigma | SVGP01050 | |
| Tabletop centrifuge | Eppendorf 5427R Centrifuge | Eppendorf AG | |
| TBE buffer | ThermoFisher | B52 | |
| TE buffer (pH 8.0) | ThermoFisher | AM9849 | |
| Terr PCR Direct FFPE Kit | Takara Bio USA | 639284 | includes 2X Terra PCR Direct Buffer |
| Terra PCR Direct Polymerase Mix, 1.25 U/μL | Takara Bio USA | 639271 | High performance Inhibitor-tolerant DNA polymerase |
| ThermalCycler (MiniAMP Plus Thermal Cycler) | ThermoFisher | A37835 | |
| TransIlluminator and image capture system | Analytik Jena, AG | GelDoc-ItTS2 Imager | |
| Whatman 1.0 m pore-sized membrane | MilliporeSigma | WHA111110 |
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