Summary
פרוטוקול זה מציג שלבים של ניתוח metabarcoding, מיקוד 16S rRNA ו 18S rRNA גנים, לניטור פריחות אצות מזיקות ואת המיקרוביום הקשורים שלהם בדגימות מי ים. זהו כלי רב עוצמה המבוסס על מולקולות אך דורש מספר הליכים, אשר מוסברים חזותית כאן צעד אחר צעד.
Abstract
ניטור פריחת אצות מזיקות (HABs) יושם ברחבי העולם, וצ'ילה, מדינה המפורסמת בדיג ובחקלאות הימית שלה, השתמשה באופן אינטנסיבי במיקרוסקופיה ובניתוח רעלים במשך עשרות שנים למטרה זו. שיטות ביולוגיות מולקולריות, כגון ריצוף דנ"א בעל תפוקה גבוהה וגישות מבוססות הרכבה חיידקית, רק מתחילות להיות מוצגות בניטור HAB הצ'יליאני, וההליכים טרם הוקרכו. כאן, 16S rRNA 18S rRNA ניתוחי metabarcoding לניטור HABs צ'יליאני מוצגים צעד אחד. על פי השערה עדכנית, אסוציאציה הדדית אצות-בקטריאלית משחקת מערכת יחסים סינרגטית או עוינת קריטית המהווה חניכה, תחזוקה ורגרסיה. לפיכך, ניטור HAB מנקודת מבט אצות-חיידקים עשוי לספק הבנה רחבה יותר של מנגנוני HAB ואת הבסיס לאזהרה מוקדמת. ניתוח Metabarcoding הוא אחד הכלים מבוססי מולקולות המתאימים ביותר למטרה זו כי זה יכול לזהות מידע טקסונומי אצות-חיידקי מסיבי במדגם. ההליכים החזותיים של דגימה לניתוח metabarcoding להלן מספקים הוראות ספציפיות, במטרה להפחית שגיאות ואיסוף נתונים אמינים.
Introduction
מינים רבים של פיטופלנקטון ימי ידועים כמי שמייצרים רעלנים אנדוגניים, וכאשר מינים אלה מצטברים במספרים מספיקים, הם מזיקים לסביבה הימית. פריחות אצות מזיקות כאלה (HABs) נצפות היום בחופי רוב יבשות העולם1. פיטופלנקטון רעיל מצטבר לראשונה ברקמות דו-שנתיות, מה שמוביל למחלות ומוות ברמות טרופיות גבוהות יותר של אורגניזמים, כולל בני אדם, על העיכול. לאחר מכן, אירועים אלה מביאים השלכות חמורות על הכלכלה המקומית, חברתית-כלכלה, ובריאות הציבור2. הנזק לכלכלה העולמית שנגרם על ידי HABs מוערך במיליוני עד מיליארדי דולרים מדי שנה3. צ'ילה היא אחת מהמדינות הרבות הסובלות מ- HABs תכופים.
צ'ילה היא מדינה ארוכה, המשתרעת על פני 4,300 ק"מ מצפון ומדרום. האדמה המערבית המוארכת פונה לאוקיינוס השקט, מה שמגדיל באופן טבעי את הסיכויים שצ'ילה תחווה HABs. במיוחד בדרום צ'ילה יש הרבה חקלאות ימית סלמון מפורסמת בעולם, ובכל פעם HAB מתרחש באזור, אצות-רעלים לגרום סלמון חקלאי מסיבי לחלות למות4,5,6. בצ'ילה, השנה שבה ה-HAB פגע בכלכלה בצורה הקשה ביותר הייתה 2016, עם הפסד שנתי מוערך של 800 מיליון דולר7,8. מינים אצות רעילים סיבתיים משתנים לפי שנה ומיקום. במקרה של 2016, קומפלקס של אלכסנדריום קטנלה ופסאודוצ'אטלונלה וורוקלוזה גרם ל-HAB נרחב ברוב חופידרום צ'ילה 7,8. HAB האחרון בצ'ילה התרחש עם מינים אצות סיבתיים של Heterosigma Akashiwo במרץ 2021 בקמנג'קה, הממוקם בדרום צ'ילה, שם באזור יש חוות סלמון גדולה.
צ'ילה מנהלת ניטור חופים כבר שנים רבות בשתי שיטות עיקריות; התבוננות במי ים עם מיקרוסקופים כדי לזהות מינים רעילים של אצות באופן קבוע ומדידת רמות הרעלן ברכיכות על ידי בדיקות ביוכימיות9. גילוי מוקדם של אצות רעילות ורמות רעלן ברכיכות אינם מונעים HABs; עם זאת, ניתוחים אלה יכולים להפעיל אמצעי נגד מיידיים ולהפחית את הנזקים לקהילות מקומיות. כדי לחזק עוד יותר את האפקטיביות של אסטרטגיה זו, שיטה אנליטית מבוססת מולקולרית נוספה לאחרונה לתוכנית ניטור HAB הצ'יליאנית הקונבנציונלית שלנו כדי לזהות אצות וקהילות חיידקים קשורות בדגימות מי ים. באופן ספציפי, נבחרה שיטת רצף מקבילי מסיבית באמצעות מטא-ברקודינג המתמקדת בגנים 16S rRNA ו- 18S rRNA. למרות שטכניקה זו דורשת הליכים מסובכים ומכונות יקרות וריאגנטים, זוהי טכנולוגיה מתקדמת שיכולה לזהות אלפי אצות וחיידקים genera / מינים נוכחים בדגימת מי ים בבת אחת.
הסיבות של HAB הם העריך להיות שונים, כגון טמפרטורה ועונה, אבל זה בלתי אפשרי להכליל אותם. הסיבה לכך היא שמינים HAB ותדרים תלויים באזור ובתנאים spatiotemporal, מעורבים תופעות טבע כגון ייחודיות גיאוגרפית, ערבוב חומרים מזינים upwelling, ו נגר אלמנטים מהיבשה עקב לטעות2,10,11,12. בנוסף, גורמים מלאכותיים כגון eutrophication להשפיע על HABs המקומי12,13. בשל הרב-גורמי המורכבים, לא קל לבצע חיזוי מדויק של HAB. בשנים האחרונות, יש השקפה כי אוכלוסיות חיידקים ספציפיות עשויות להיות קשורות להתפתחות HABs כאחד הגורמים, ומחקר לתמיכה בהשערה זו ניכר יותר ויותר14,15,16,17,18. טכניקות ביולוגיה מולקולרית משמשות בדרך כלל לחקר הרכבה חיידקית; עם זאת, שיטה מתוקננת כזו טרם הוקמה ניטור HAB צ'יליאני9. כדי לחקור את הקשר האצות-חיידקי עם HABs, זה הכרחי לבצע במקביל ניתוח metabarcoding עבור תוכניות ניטור החוף הנוכחי צ'ילה. לפיכך, פרוטוקול זה מציג חזותית את תוכנית ניטור HAB הצ'יליאנית שלנו, תוך התמקדות בהליך צעד לניתוח מינים של אצות וחיידקים בדגימות מי ים באמצעות ניתוח metabarcoding.
הפרוטוקול המלא המתאר את תוכנית הניטור של HAB הצ'יליאנית שלנו זמין בירימיזו ואח'9. הוא כולל את הנהלים של דגימת מי ים, זיהוי מינים אצות מיקרוסקופיים, זיהוי גנים אצות-חיידקיים, ניתוח פיגמנטים, איסוף נתונים מטאורולוגיים, ובוחות תכונות מים פיזיות וכימיות. פרוטוקול הצעד של 16S rRNA וניתוח מטא-בר-רנ"א 18S לזיהוי מינים אצות וחיידקיים זמין כהדפסה מוקדמת19. פרוטוקול זה מדגים במיוחד metabarcoding צעדי ניתוח שכן הוא החלק המורכב ביותר ואת גולת הכותרת של תוכנית ניטור HAB שלנו. פרוטוקול זה כולל גם הקדמה של התוכנית וגילוי מיקרוסקופיה של מינים אצות. בעת ניתוח מינים אצות על ידי metabarcoding, זה חיוני לבצע בו זמנית מיקרוסקופיה כדי לאמת את התוצאות משתי השיטות. פרוטוקול זה אינו כולל כיצד להשתמש בתוכנה להקצאת טקסונומיה, אך המלצת מסד הנתונים נאמרת בקצרה בסוף הסעיף הבא.
Protocol
1. איסוף דוגמה ו טיפול מקדים
- לאסוף כ 3 L של דגימת מים מנקודת היעד.
- סנן 1 ליטר של דגימת מים לניתוח 16S rRNA באמצעות סינון דו-מושבי (1 מיקרומטר ו-0.2 מיקרומטר בגודל נקבובית) כדי להפריד חיידקים חופשיים ומחוברים.
- סנן עוד 1 ליטר של דגימת מים לניתוח 18S-rRNA (זיהוי פיטופלנקטון) באמצעות סינון יחיד עם קרום 0.2 מיקרומטר.
הערה: סינון דגימת המים חייב להסתיים בתוך 12 שעות של דגימה. - חותכים קרום מסונן לשניים עם מספריים כירורגיים סטריליים ועוטפים אותו בנייר אלומיניום. יש לאחסן ב- -20 °C (70 °F) למשך עד חודש אחד או להמשיך לשלב הבא.
- לחלץ DNA עם שיטת Chelex כמתואר9. יש לאחסן ב-20 °C (70 °F) למשך עד חודש אחד.
2. ניתוח מיקרוסקופ
- העבר 1 מ"ל של דגימת המים על ידי pipette על שקופית רשת 1 מ"ל.
- שים לב לדגימה מתחת למיקרוסקופ.
- תרשמו שמות וכמות של מיני פיטופלנקטון.
3. 16S rRNA וניתוח מטא-בר-רנ"א 18S
הערה: תהליך זה מורכב משבעה חלקים: הכנה, דור אמפלייקון PCR ראשון, ניקוי אמפליסון ראשון, אינדקס על ידי PCR שני, אימות וניקוי אמפליסון PCR שני, התאמת ריכוז DNA, דנאטורציה DNA ורצף. התהליך כולו לוקח מינימום של 5 ימים (40 שעות) על ידי אנשי מעבדה מנוסים. עיין בטבלת החומרים לקבלת מספרי מוצרים וייצורים.
- הכנה
- פיפטות נקיות וארון מכסה המנוע למינאר עם 70% אתנול ואחריו חשיפה לקרינת UV במשך 30 דקות לעתים קרובות. לחטא חומרים לשימוש.
- להפשיר דגימות DNA בטמפרטורת החדר, צנטריפוגה ב 100 x g במשך 2 דקות, ולהעביר 100 μL של כל דגימה supernatant לרצועות 8-tube.
- ייצור אמפלייקון PCR ראשון
הערה: בצע את ההליכים הבאים בארון מכסה המנוע למינאר. תמיד לדלל פריימרים מ 1 μM מלאי לריכוז היעד עם מים כיתה PCR כדי למנוע זיהום פריימר.- הכן את תערובת המאסטר הראשונה של PCR בצינור סטרילי של 1.5 מ"ל לתגובות(טבלה 1, טבלה 2).
- Aliquot 22.5 μL של תערובת מאסטר ברצועת 8 צינור ולהוסיף 2.5 μL של דגימת DNA. השתמש 2.5 μL של מים כיתה PCR לשליטה שלילית.
- הפעל את מחזור ה- PCR הראשון (טבלה 3).
- הכן 100 מ"ל של 2% ג'ל אגרוז-TBE המכיל 10 μL של כתם ג'ל חומצה גרעין 1x.
- לטעון תערובת של 1.5 μL של 1x DNA טעינת צבע ו 4 μL של מוצר PCR על ג'ל אגרוז. כמו כן, לטעון סולם DNA 100 bp על הג'ל.
- בצע אלקטרופורזה ב 100 V במשך 30 דקות.
- ודא שיש רצועה בטווח של 500-600 bp תחת לכידת תמונת אור UV. הלהקה פריימר-dimer הוא סיבוב 80 bp.
הערה: דגימות מים ימיות מכילות מעכבי PCR. אמפליקונים חסרים לפעמים ניתן לפתור על ידי דילול דגימות 1:100 או 1:1000 עם מים כיתה PCR. - אחסן את מוצרי ה- PCR הראשונים ב- -20 °C (70 °F) עד לשלב הבא.
אזהרה: אל תחרוג משבוע אחסון אחד.
- ניקוי אמפליקולון PCR ראשון
הערה: ניתן לבצע סעיף זה מחוץ לארון מכסה המנוע למינאר.- השתמש במערכת ניקוי DNA של חרוזים מגנטיים כדי להסיר שאריות תגובת PCR, כולל מוצרים פריימר-dimer.
- העבר 20 μL של כל מוצר PCR הראשון ניקה לצלחת חדשה 96 באר. לאטום את הצלחת עם סרט מיקרו-חותם. יש לאחסן ב- -20 °C (70 °F) עד להמשך השלב הבא.
שים לב: אין לחרוג מיותר משבוע אחסון אחד.
- יצירת אינדקס לפי PCR שני
הערה: בסעיף זה, מוצרי PCR ראשונים מטוהרים יוגברו עם שילובי פריימר אינדקס שונים.- לדלל את כל אינדקס 1 ומדד 2 פריימרים (טבלה 4) כדי 1 μM עם מים כיתה PCR ב 8 רצועות PCR צינור להציב בארון מכסה המנוע למינאר.
הערה: השלבים מעתה ואילך בסעיף זה יכולים להתבצע מחוץ לארון מכסה המנוע למינאר, כמו פריימרים אינדקס ספציפיים למתאם הראשון תגובות PCR overhang. - מקם פריימר אינדקס 1 בשורה אופקית אינדקס 2 פריימרים בשורה אנכית (טבלה 5).
- בצלחת חדשה של 96 באר, הוסיפו 12.5 מיקרו-אל של ניסוח מוכן להתחלה חמה לכל באר.
- הוסף 2.5 μL של כל פריימר אינדקס (1 μM) לכל טוב, כמו בטבלה 4 באמצעות pipette רב ערוצי.
- הוסף 7.5 μL של מוצר PCR הראשון המטוהר.
- מערבבים בעדינות על ידי צנרת למעלה ולמטה 10 פעמים. מכסים את הצלחת בסרט מיקרו-חותם.
- הפעל את מחזור ה- PCR השני (טבלה 3).
- שמור את הצלחת ב -20 מעלות צלזיוס.
אזהרה: אל תחרוג משבוע אחסון אחד.
- לדלל את כל אינדקס 1 ומדד 2 פריימרים (טבלה 4) כדי 1 μM עם מים כיתה PCR ב 8 רצועות PCR צינור להציב בארון מכסה המנוע למינאר.
- אימות וניקוי אמפליסון PCR שני
- השתמש במנתח קטעים ובריגנט משויך. מערבולת ולסובב למטה ריאגנט לפני השימוש.
- אפשר למאגר הדגימה ולקלטת מסך ה- DNA להתמזג בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות. לאחר מכן, מקם את קלטת מסך ה- DNA במנתח שברים.
- לערבב 2 μL של חוצץ מדגם ו 3 μL של אמפליסון PCR השני ברצועות צינור 8 חדש. הכנס את 8 רצועות הצינור לתוך מנתח הרסיסים. לחץ על הפעל כדי להתחיל.
זהירות: יש להימנע מהיווצרות בועות אוויר. - ודא כי אמפליקולים PCR השני הם כ 613 bp (600 - 630 bp) עבור גנים 16S ו 18S rRNA.
- טהרו את מוצרי ה-PCR השניים באמצעות מערכת ניקוי DNA של חרוזים מגנטיים.
- התאמת ריכוז DNA
- מדוד ריכוז DNA במוצרי PCR השני המטוהרים באמצעות ספקטרופוטומטר כימות חומצת גרעין.
- חשב ריכוז גן יעד ב- nM, תוך התחשבות בגודל הספרייה הסופי הממוצע כ- 613 bp עבור גנים של 16S ו- 18S rRNA:
- לדלל כל מוצר PCR שני מטוהר עם מי PCR סטריליים ל 4 ננומטריות בצלחת חדשה 0.2 מ"ל 96 היטב.
הערה: ניתן לאחסן את הצלחת ב -20 מעלות צלזיוס כאן. אחרת, יש לבצע את שאר ההליכים ללא עצירה. - Aliquot 3 μL של כל מוצר PCR 4 ננומטרי השני ולערבב את כל בצינור סטרילי חדש 1.5 מ"ל כספרייה מ ומאובגרת. שמור את הצינור ב 4 °C (75 °F) או על אמבט קרח בכל עת.
- מדוד את הריכוז של הספרייה המאוגדת לאישור באמצעות ספקטרופוטומטר כימות חומצת גרעין. התאם את הריכוז ל 4 ננומטר אם הוא גבוה מ 4 ננומטר.
הערה: DNA מרוכז יתר על המידה מייצר מספרי קריאה מוערכים יתר על המידה, מה שמעכב ניתוחים.
- דנ"א דנטורציה ורצף
הערה: סעיף זה משתמש במערכת Illumina MiSeq עם ריאגנטים ספציפיים. ראה מספרי מוצרים בטבלת חומרים.
הערה: עקוב אחר הזמן בקפדנות. להפשיר את כל הריאגנטים מלבד מחסניות ביום הרצף.- יום לפני הרצף, הסר מחסנית ריאגנט מוכנה לשימוש ממולאת מראש מ- -20 °C (70 °F) ואחסן ב- 4 °C (70 °F) להפשרה.
- הגדר בלוק חום מתאים צינורות צנטריפוגות 1.5 מ"ל ל 96 °C (70 °F).
- הנח את חיץ ההכלאה על קרח.
- לדלל מולקולרית כיתה NaOH מ 1 N ל 0.2 N בצינור חדש עם מים כיתה PCR.
- דלל ספריית בקרה מוכנה לשימוש עם מאגר TE (pH 8.0) ממלאי של 10 ננומטר ל- 4 ננומטר בצינור חדש (כלומר, 2 μL של ספריית בקרה + 3 μL של מאגר TE).
- לערבב 16 μL של 4 nM דוגמה מאוחסן עם 4 μL של 4 nM בקרה הספרייה בצינור חדש שכותרתו "1".
- לערבב 10 μL של מדגם בצינור "1" עם 10 μL של 0.2 N NaOH בצינור חדש שכותרתו "2".
- מערבולת את הצינור 2 עבור 5 s, להסתובב למטה לזמן קצר, ודגור בטמפרטורת החדר במשך 5 דקות.
- הוסף 980 μL של חוצץ הכלאה לצינור 2.
- בצינור חדש שכותרתו "3", לערבב 260 μL המדגם מצינור 2 עם 390 μL של חוצץ הכלאה. מערבבים על ידי היפוך הצינור.
- צינור דגירה 3 ב 96 °C (70 °F) במשך 2 דקות ומיד למקם אותו על קרח לכל היותר 2 דקות.
- הסר את המחסנית ממקרר 4 °C (4 °F).
- הגדר את גליון הדוגמה לרצף עם כל מתאמי אינדקס 1 ואינדקס 2 תואמים כמו בטבלה 6.
- הסר את מד הזרימה מערכת ה- MiSeq v3. נקה בעדינות את צ'ף הזרימה עם מי PCR סטריליים ברמה מולקולרית.
הערה: אין לשפוך מים על הנקודות הנימיות של צן הזרימה. יש לנגב בעדינות מים משדה הזרימה בנייר לא סיבי. - לטעון את מלוא הנפח של צינור 3 (650 μL) לתוך המחסנית.
- בתוכנת פעולת מכשיר, בחר רצף ובצע את ההוראות. הכנס את זרם, מאגר ההתאגדות והמחסנית. טען גיליון לדוגמה. לחץ על הפעל כדי להתחיל את התגובה.
הערה: ריצת רצף זו תיתקל 3-5 ימים. הנתונים יועלו באופן אוטומטי לפלטפורמת Basespace. נתונים גולמיים יאוחסנו בשתי תיקיות במחשב: תיקיית ניתוח המכילה קבצי fastq ופלט המכיל קבצי bcl ותמונות jpeg.
4.הקצאה טקסונומית לנתונים רצפים
- עיבוד קבצים של FASTQ
הערה: חבילת DADA223 של R24 הוא אחד ממסדי הנתונים המומלצים לעיבוד קבצי FASTQ. ההנחיה זמינה ב- [https://github.com/mickeykawai/exec_dada2]. הנחיה זו הוכנה על ידי אימוץ הגירסה האחרונה של ערכת הלימוד של צינור DADA2 [https://benjjneb.github.io/dada2/tutorial.html].- עבד רצפי FASTQ משויכים גולמיים לגיזום, סינון איכות, הסרת דרגה וספירה של רצפים ייחודיים, הסקת דגימה, מיזוג לקונטיגות והסרת רצפים כימריים.
- השתמש בעקבות הפרמטרים שצוינו ב- DADA2 עבור שברי גנים של 16S rRNA ו- 18S rRNA; trimLefts=0, 0, truncLens=[בדוק את איכות הרצף והגדר אותה לאורך המתאים].
הערה: ערכי ברירת המחדל עבור הפרמטרים האחרים הם maxN = 0, maxEE = 2,2, trancQ = 2.
- הקצאת טקסונומיה
הערה: מסד הנתונים rRNA SILVA מומלץ עבור הקצאת טקסונומיה עבור DADA2 [silva_nr_v132_train_set.fa.gz מוגדר כברירת מחדל].- הסר כלורופלסט ו- OTUs מיטוכונדריאלי לניתוח שברי גנים 16S rRNA. הסר סינגלטון מניתוח rRNA של 16S ו- 18S rRNA.
- תגביר את כל הדגימות אפילו לעומק רצף בהתבסס על המדגם בעל עומק הריצוף הנמוך ביותר.
- הקלט את מספר הקריאות, ה- OTUs שהוקצה ובאיזו רמה, קריאות מסוננות ומספר הסינגלטון שלא נכללו.
- ניתוח סטטיסטי
- בצע ניתוח סטטיסטי על נתונים מיקרוביאליים באמצעות חבילות R של phyloseq25 וטבעוני26.
Representative Results
פרוטוקול זה משתמש בניתוח מטא-ברקודינג של גנים rRNA 18S כדי לזהות מינים אצות בדגימות מי ים. תוצאה מייצגת מוצגת באיור 1, שבו נותחו מי הים שנאספו ממטרי, פוארטו מונט, צ'ילה (−41.597; −72.7056) ב-19 בפברואר 2019. התוצאה הראתה בסך הכל 13,750 קריאות עם מעל 30 מינים אצות בדגימת מי הים. האצה הדומיננטית במדגם זה הייתה Navicula spp. עם שפע יחסי של 70.77%. כמו כן, שפע מספיק נצפה עבור Micromonas (6.40%), Chaetoceros spp. (4.44%), Scripsiella spp. (2.44%), ו Prorocentrum spp. (1.28%). Pseudochattonella spp., אחד הסיבתיות האצות הרעילות הגבוהות ביותר של HAB הצ'יליאני, זוהה עם 0.52% מדגם מי ים זה.
כדי לאמת את אמינות הנתונים, המינים האצות שזוהו על ידי ניתוח גנים rRNA 18S הושוו לאלה שהתקבלו על ידי מיקרוסקופיה באותה דגימת מיים (איור 2). בהתאם לניתוח גנים 18S rRNA, המיקרוסקופיה הראתה כי המין הדומיננטי היה Navicula spp. עם שפע יחסי של 74.1% ופרורוצטרום spp. (0.60%) כמין קטין. לעומת זאת, Heterocapsa spp. (9.04%) שתועד מתצפית מיקרוסקופית לא זוהה על ידי ניתוח גנים rRNA 18S במדגם זה. היו 12.6% מתאי פיטופלנקטון קטנים ובלתי מזוהים שתועדו על ידי מיקרוסקופיה. זה יכול להיות מיקרומונים, על פי תוצאות rRNA 18S.
הפרוטוקול משתמש בניתוח מטא-ברקודינג של גנים rRNA 16S כדי לזהות מינים חיידקיים בדגימות מי ים. תוצאה מייצגת מוצגת באיור 3, שבו נותחו אותם מי ים המשמשים לניתוח גנים של 18S rRNA בניתוח גנים של 16S rRNA. התוצאה הראתה בסך הכל 31,758 קריאות עם מעל 30 מינים חיידקיים בדגימת מי הים. יש לתאר כי דגימת מי ים זו הועברה דרך ממברנות מסנן דו-מושביות (1 מיקרומטר ו 0.2 מיקרומטר נקבוביות גדלים) כדי להפריד חיידקים חיים חופשיים מחיידקים מחוברים. לאחר מכן, תאים שנתפסו על ידי כל קרום מסנן טופלו עבור מיצוי DNA, ואחריו ניתוח גנים rRNA 16S. התוצאה הייצוגית באיור 3 מראה מינים של חיידקים שזוהו מקרום בגודל 0.2 מיקרומטר נקבוביות, המוגדרים כחיידקים בעלי חיים חופשיים. החיידק הדומיננטי החופשי היה Amylibacter spp. עם שפע יחסי של 20.02%, ואחריו קלייד Ia (13.53%) ואליג'יפילוס spp. (7.06%). שאר מיני החיידקים שזוהו מדגם מי הים הזה חולקו באופן יחסי שווה. אותו ניתוח יכול להיעשות עבור תאים שנתפסו על ידי קרום בגודל נקבובית 1 מיקרומטר כמו זיהוי מינים של חיידקי צירוף.
כאשר הבדיקות המטוברקודיות האלה מבוצעות בנקודות זמן מתוזמנות על פני תקופת מחקר מסוימת, ניתן לסכם את התוצאות כניתוח סדרות זמן. אחת הדרך לעשות זאת היא לתכנן את השפע היחסי של מינים אצות וחיידקיים מסוימים כפונקציה של זמן למצוא דפוס צמיחה ייחודי. איור 4 מציג עלילה מייצגת של אלכסנדריום ופסאודוצ'אטלונלה במטרי, צ'ילה. דרך נוספת לסכם ניתוח מטא-ברקודינג של סדרת זמן היא להתוות את כל האצות והחיידקים המזוהים כפונקציה של הזמן, המייצגים את שינוי האוכלוסייה של קבוצות מסוימות של אורגניזמים. איור 5 ואיור 6 מסכמים את השפע היחסי של כל הסוגים והסדר החיידקיים, בהתאמה, אשר מזוהים ממי הים של מטרי במשך חמישה חודשים.
טבלה 1: תוכן ערבוב ראשי ראשון של PCR: הטבלה מציגה תוכן מיקס ראשי לכל תגובה עבור ניתוחי rRNA של 16S ו- 18S rRNA. רצפי הפריימר מפורטים בטבלה 3. נא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.
טבלה 2: רצפי פריימר: הפריימרים עבור PCR הראשון רשומים עבור ניתוחי rRNA של 16S ו- 18S rRNA. נא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.
טבלה 3: מחזורי PCR: המחזורים התרמיים עבור PCR הראשון ו- PCR השני מפורטים. נא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.
טבלה 4: רצפי אינדקס: מופיעים פריימרים של אינדקס 1 (i7) ומדד 2 (i5) לשימוש עבור PCR שני. נא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.
טבלה 5: דוגמה למיקום מדד 1 ומדד 2: כדי להפחית את השגיאה, יש למקם תחילה פריימרים לאינדקס, ו- aliquot של כל אחד מהם מועבר לצלחת של 96 בארות באמצעות pipette רב ערוצי. נא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.
טבלה 6: דוגמה לגיליון לדוגמה: לפני הרצף, יש ליצור גיליון לדוגמה המתאים למתאמי אינדקס 1 ואינדקס 2. נא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.
איור 1: תוצאה מייצגת של ניתוח מטא-בר-נקה של 18S rRNA: מינים אצות הנמצאים בדגימת מי ים שנאספו ממטרי, לוס לאגוס, צ'ילה ב-19 בפברואר 2019, זוהו על ידי 18S rRNA metabarcoding assay. הרצפים שהוקצו "לא ידוע" בוטלו, והשפע היחסי של כל מין מזוהה זוהה זומם. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: תוצאה מייצגת של ניתוח מיקרוסקופי: מיני האצות זוהו מדגימת מים ממטרי, לוס לאגוס, צ'ילה ב-19 בפברואר 2019 באמצעות מיקרוסקופיה. הכמות של כל מין נספרה ידנית והתוותה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: תוצאה מייצגת של ניתוח מטא-בר-ברדציה של 16S rRNA: מינים חיידקיים הנמצאים בדגימת מים ממטרי, לוס לאגוס, צ'ילה ב-19 בפברואר 2019, זוהו על ידי בדיקת מטא-בר-ברד 16S rRNA. השפע היחסי של כל מין מזוהה זוהה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4: עלילת סדרת הזמן הייצוגית של אלכסנדריום spp. ו Pseudochattonella spp. שהתקבלה מ 18S rRNA metabarcodingin מטרי, צ'ילה: איור מודפס מחדש מיארימזו ואח'9. . שני מיני האצות הרעילים, אלכסנדריום ופסאודוצ'אטלונלה היו במעקב סלקטיבי על ידי ניתוח rRNA 18S לאורך זמן, והשפע היחסי זומם כפונקציה של נקודת זמן. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 5: עלילת סדרת זמן מייצגת מסוג 16S המתקבלת ממטא-בר-רנ"א 16S ו-18S rRNA metabarcoding: כל הסוג החיידקי והאאוקריוטי שזוהה במים של מטרי, צ'ילה, במעקב של יותר מחמישה חודשים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 6: עלילת סדרות זמן מסדרה מייצגת המתקבלת מ-16S rRNA ומטא-ברנה 18S rRNA: כל ההזמנות החיידקיות והאאוקריוטיות שזוהו במים של מטרי, צ'ילה, במעקב במשך חמישה חודשים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
טבלה S1 וטבלה S2:
טבלה S1: נתונים גולמיים עבור איור 5 ואיור 6. טבלה S2: תוצאה של בדיקת QC על נתונים גולמיים של איור 5 ואיור 6. נא לחץ כאן כדי להוריד טבלאות אלה.
Discussion
פרוטוקול זה ביצע בהצלחה ניתוח מטא-בר-קודינג של גנים 18S rRNA ו-16S rRNA לזיהוי מינים אצות וחיידקיים בדגימות מי ים לניטור HABs צ'יליאני. האצות הדומיננטיות וכמה אצות קלות שזוהו על ידי פרוטוקול זה היו עקביות עם אלה שהושגו על ידי מיקרוסקופיה, המאשר את אמינות הפרוטוקול. גולת הכותרת של הפרוטוקול היא כי הניתוח זיהה אלכסנדריום spp. ו Pseudochattonella spp., שני HAB הבעייתי ביותר גרימת מינים בדרום צ'ילה, ממי הים של מטרי אפילו בשפע נמוך. במיוחד, פסאודוצ'אטלונלה סאפ. הם מינים מאתגרים לזהות תחת מיקרוסקופ כי התאים הם קטנים בקלות נקרע תחת אור או שימוש של מתקנים27,28. מטא-ברקודינג יכול לספק למינים אצות מידע שבקושי קיים בדגימות מי ים שמיקרוסקופיה אינה יכולה לזהות. הפרוטוקול גם זיהה מעל 30 מינים חיידקיים. למרות כיצד חיידקים אלה קשורים לצמיחת האצות אינו ידוע בשלב זה, איסוף נתונים מסיבי של מינים אצות-חיידקים בניתוח סדרת הזמן עשוי לספק תגליות חשובות כאלה. לכן, הוספת ניתוח metabarcoding לתוכניות ניטור HAB צ'יליאני קונבנציונאלי יהיה ללא ספק לחזק את יעילות ניטור HAB הנוכחי. למעשה, פרוטוקול חזותי זה לניתוח metabarcoding יכול להיות מועיל לא רק עבור ניטור אצות-חיידקים של מים צ'יליאניים, אלא גם עבור תוכניות ניטור החוף באזורים אחרים מושפעים HAB ברחבי העולם.
למרות פרוטוקול זה סיפק את היתרונות הנ"ל, יש לדון בחסרונות של השיטה. כפי שניתן לראות בפרוטוקול החזותי, שיטת המטא-ברקודינג גוזלת זמן ומורכבת, ודורשת מכונות יקרות וריאגנטים. יש להכשיר את אנשי המעבדה באופן מיוחד, או שהם יבזבזו חומר, עבודה וזמן. בנוסף, זיהוי אצות על ידי metabarcoding חייב להיות מזווג עם מיקרוסקופיה כדי לוודא כי אותם מינים דומיננטיים מזוהים משתי שיטות אורתוגונל29. מיקרוסקופיה היא כלי לא פולשני, על פי רוב, לזיהוי מינים אצות, כלומר קשה יותר לעשות טעויות כאשר למינים האצות יש צורות ייחודיות לכאורה. כמובן, טעות אנוש יכולה להתרחש אם למין יש צורות דומות מאוד זו לזו. מצד שני, מאז ניתוח metabarcoding דורש צעדים מרובים, זה באופן טבעי מגביר שגיאות. זה יכול להיות מדגם מעורבב, תוספת ריאגנט שגויה, או חסר כמה הליכים. לכן, זה קריטי להשוות את תוצאות metabarcoding עם אלה שהושגו על ידי מיקרוסקופיה. לבסוף, הפרוטוקול ישים רק מבחינה איכותית, ויש לחשב את התוצאות עבור שפע יחסי. כפי שציין Lamb et al. בשנת 2019, המטא-ברקוד הנוכחי מכיוון שהביצועים הכמותיים עדיין מוגבלים, ונדרשים מחקרים נוספים לפני שניתן להשתמש בביטחון במטה-ברקודינג עבור יישומים כמותיים30.
פרוטוקול זה עבר אופטימיזציה עבור 140 - 170 דוגמאות לריצה ממדריך הכנת ספריית הרצף המטגנומי 16S שהונפק על ידי Illumina Inc. הפרוטוקול הממוטב נבדק פעמים רבות ושונה עוד יותר כדי להנפיק גירסה סופית זו. לכן, מומלץ מאוד לעקוב אחר כל צעד בדיוק. החלק הקריטי ביותר בפרוטוקול הוא שנדרש טיפול נוסף כדי למנוע זיהום מדגם. יש לנקות את הפיפטות ואת מכסה המנוע לזרם למינאר עם חשיפה של 70% לאלכוהול ול-UV בכל עת, ויש לעקר חומרים הניתנים לחיטוי אוטומטי. פריימרים ריאגנטים צריך להיות מדולל ישירות מהמלאי בכל ריצה חדשה, או שימוש חוזר של ריאגנטים וחשיפה למספר דילולים יכול להיות גורם זיהום מדגם. הפרוטוקול מציין מתי ניתן לבצע את הפעולה מחוץ למכסה המנוע של זרימת למינאר. אלא אם כן אחרת, יש לטפל בדגימות במכסה זרימה למינארי נקי. כאשר מתמודדים עם רצועות 8-tube מרובות בו זמנית, מומלץ לעבוד על הרצועה הראשונה 8-tube וכובע זה לפני המעבר לרצועת 8 הצינור הבאה. השארת המכסה פתוח במשך זמן רב עלולה לגרום לזיהום מדגם שכן גנים rRNA 16S ו- 18S נמצאים בכל מקום בסביבה. יש לעקוב אחר הזמן האמור, כגון זמן ערבוב וזמן הדגירה, כמתואר בדיוק מכיוון שאורך הזמן הטוב ביותר עבור כל שלב נבחר בהתבסס על ריצות הבדיקה המרובות. עודף או זמן לא מספיק יכול, למשל, להפחית את התפוקה לדוגמה. יש לעצור את התהליך רק בחלק שהפרוטוקול אומר שהוא יכול להיפסק. זה חיוני כדי לקבל שליטה שלילית כפי שהוא מאשר כי התוצאות החיוביות אינן חיוביות שווא מלאכותיות. לבסוף, מומלץ מאוד לתכנן את הימים כי זה דורש לפחות חמישה ימים כדי לעבד את כל השלבים, וחלקים מסוימים לא ניתן לעצור עד סימן העצירה הבאה.
המגבלה של הקצאה טקסונומית עבור נתונים רצפים נרשמת כאן בקצרה. רצפי נוקלאוטידים שהתגלו לאחרונה עבור מינים חיידקיים ואצות מתעדכנים במאגר הנתונים מדי יום. בעוד מינים אצות וחיידקים שנחקרו היטב רשומים באופן אמין, ישנם גם רצפים רבים עבור מינים לא ידועים המתעדכנים במאגר הנתונים. הוא מציין כי הפתרון של רצפי נוקלאוטידים רשומים אינו תמיד מספיק לזיהוי מינים אלא רק לזיהוי סוג. לכן, זיהוי מינים מיקרוסקופיים חייב להתבצע אורתוגונית. ליצירת צינור גישה פתוחה לעבודה זו יש יתרון משמעותי בהתמודדות עם קבוצה גדולה של נתונים רצפים בבת אחת ובחקירה יעילה כאשר מתרחשת שגיאה. בנוסף, הפלט של DADA2 הוא בקובץ טקסט או csv, מה שמקל על ניתוח סטטיסטי נוסף. מצד שני, שרת גדול נדרש לבצע הקצאות טקסונומיות, במיוחד כאשר ערכת נתונים גדולה. כדי להקים את הצינור, מהנדסים נדרשים כדי להגדיר את הצינור, ואנשי המקצוע חייבים להבין פרמטרים, פעולה, לינוקס וביואינפורמטיקה.
מלבד ההיקף ככלי ניטור HAB, ניתן להרחיב את השימוש בפרוטוקול זה למטרות מחקר חקירה. לדוגמה, מתנהלים ויכוחים מתמשכים בין ממשלת צ'ילה לדייגים מקומיים, יחד עם עמותות לשלום סביבתי בנוגע לעלייה במספרם שלHAB 31,32. הממשלה טוענת כי הסיבה לכך היא תופעת טבע כמו התחממות כדור הארץ ואל ניניו, בעוד הצדדים המאוחרים יותר טוענים כי חקלאות ימית סלמון היא הגורם. סלמון אינו מין ילידי צ'ילה ולא היה במים צ'יליאניים לפני חצי מאה. ממשלת צ'ילה באותה תקופה שמה לה למטרה להצמיח את הכלכלה וליצור מקומות עבודה לאזורים עניים על ידי פיתוח עסק סלמון33. עם התערבות בחו"ל לרווח ההון, צ'ילה הצליחה מאוד בפיתוח חקלאות ימית בסגנון עט, ומספר הסלמון גדל להפליא בעשורים האחרונים31,32,33. לאחר מכן, כמות גדולה של מזון לסלמון נזרקה לים, מה שמוביל את המקומיים לחשוד כי חקלאות ימית סלמון היא הסיבה HABs המקומי התכוף31,32. האמת אינה ידועה כעת, אך יש להבין אותה בסופו של דבר, כך שניתן יהיה לתכנן אסטרטגיות להגנה על הסביבה הימית המקומית, הכלכלה ובריאות האדם מפני HABs. הניתוח המולקולרי על מערכת היחסים האצות-חיידקית המקומית עשוי לתרום להבהרה צעד קדימה לנושא כזה. לדוגמה, הטכניקה יכולה לחפש את מיני האצות והחיידקים שלא היו נוכחים באזור הימי היעד לפני כן אך גדלו באופן דרמטי בשנים האחרונות, וזה דומה במקצת למחקר שנעשה על ידי Sakai et al. לגילוי אוכלוסייה לא מתועדת של סלמנדרה יאמאטו (Hynobius vandenburghi) על ידי GIS וניתוח eDNA34. לכן, מעבר לכלי ניטור HAB, פרוטוקול metabarcoding זה יש את השימוש הפוטנציאלי עבור לקוחות פוטנציאליים אחרים.
Disclosures
המחברים מצהירים שאין ניגוד אינטרסים. למממנים לא היה כל תפקיד בעיצוב המחקר, באיסוף, ניתוחים או פרשנות של נתונים; בכתיבת כתב היד, או בהחלטה לפרסם את התוצאות.
Acknowledgments
מחקר זה נתמך על ידי המענק (JPMJSA1705) למחקר על שותפות מחקר מדע וטכנולוגיה עבור אצות ניטור פיתוח בר קיימא בצ'ילה (SATREPS-MACH). אנו מודים לד"ר סנדרה ריוס (תוני לוס לאגוס) על שאפשרה לנו להשתמש בקליפ. אנו מודים לניל אנדרו הולנד על הגהתו החרוצה של כתב היד. אנו מביעים את הערכתנו הכנה לחברי קבוצת המעבדה ב- CREAN-IFOP בפוארטו מונט, צ'ילה, על כך שייעצו לנו על זיהוי פיטופלנקטון.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL single tube | ThermoFisher | Q32856 | sterile |
| 1.5 mL tubes | ThermoFisher | 2150N | sterile |
| 8-strip 0.2 mL PCR tubes and flat cap | ThermoFisher | AB0451 & 4323032 | sterile |
| 96-well 0.2 mL PCR plate | ThermoFisher | N8010560 | |
| AccuRuler 100 bp DNA Ladder | MaestroGen | 02001-500 | |
| Chelex 100 Chelating Resin | Bio-Rad | 1432832 | |
| Chemical Duty Vacuum Pressure Pump | MilliporeSigma | WP6122050 | |
| D1000 Reagents | Agilent Technologies | 5067-5583 | |
| D1000 sample buffer | Agilent Technologies | 5067-5602 | |
| DNA loading dye (Blue/Orange Loading Dye 6X) | Promega | G1881 | |
| Ethanol Molecular Biology Grade | E7023 | Merck KGaA | |
| Filtration device | ThermoFisher | 09-740-36H, 09-740-23E | |
| Fluorescent DNA concentration measurement kit (Qubit dsDNA HS Assay kit) | Thermo Fisher Scientific | Q32851 | |
| Fluorometer (Qubit4 Fluorometer) | ThermoFisher | Q33238 | |
| Fragment analysis verification matrix (D1000 ScreenTape) | Agilent Technologies | 5067-5582 | |
| Fragment Analyzer (Agilent Tapestation 4150) | Agilent | G2992AA | |
| GelRed Nucleic Acid Gel Stain | Biotium | 41002 | |
| Generic bench vortexer (Vortex Genie 2) | Scientific Industries | SI-0236 | |
| Heat block | |||
| High performance sequencing-grade DNA polymerase (KAPA HiFi Hotstart ReadyMix), 2X | Roche | KK2602 | |
| HT1 Hybridization buffer | Illumina | 20015892 | |
| Illumina Nextera XT v2 Index Kit set A, B, C and D | Illumina | FC-131-2001, -2002, -2003, -2004 | |
| Laminar hood cabinet | Biobase Co. | Biobase PCR-800 PCR Cabinet | |
| Loading tips (Specific for Agilent TapeStation systems) | Agilent Technologies | 5067-5598 | |
| Magnetic beads DNA cleanup system (ProNex® Size-Selective Purification System) | Promega | NG2002 | |
| Magnetic stand for 96 wells (Magnetic Stand-96) | ThermoFisher | AM10027 | |
| Micro-seal film for 96-well plate | ThermoFisher | 4311971 | sterile |
| MiSeq Reagent Kit v3 | Illumina | MS-102-3003 | includes pre-filled, ready-to-use reagent cartridges. |
| MiSeq system | Illumina | SY-410-1003 | includes pre-installed software |
| Molecular grade nuclease-free water | Integrated DNA Technologies | 11-05-01-04 | |
| Molecular grade sodium hydroxide (NaOH) 1M | Merck KGaA | 1091371000 | |
| Multichannel pipettes | Not specified | Not specified | |
| Multi-Purpose Agarose | Cleaver Scientific | CSL-AG500 | |
| Ow D2 Wide-Gel Electrophoresis System | ThermoFisher | D2 | |
| Ow EC-105 Compact Power Supply | ThermoFisher | 105ECA-115 | |
| Pellet Pestle— Cordless Motor | ThermoFisher | K749540-0000 | |
| PhiX control Kit v3 | Illumina | FC-110-300 | ready-to-use control library for Illumina sequencing |
| Pipette tips | Not specified | Not specified | sterile |
| Pipettes | Not specified | Not specified | 2, 10, 20, 100, 1000 μL |
| SterivexTM GP 0.22 μm filter unit | MilliporeSigma | SVGP01050 | |
| Tabletop centrifuge | Eppendorf 5427R Centrifuge | Eppendorf AG | |
| TBE buffer | ThermoFisher | B52 | |
| TE buffer (pH 8.0) | ThermoFisher | AM9849 | |
| Terr PCR Direct FFPE Kit | Takara Bio USA | 639284 | includes 2X Terra PCR Direct Buffer |
| Terra PCR Direct Polymerase Mix, 1.25 U/μL | Takara Bio USA | 639271 | High performance Inhibitor-tolerant DNA polymerase |
| ThermalCycler (MiniAMP Plus Thermal Cycler) | ThermoFisher | A37835 | |
| TransIlluminator and image capture system | Analytik Jena, AG | GelDoc-ItTS2 Imager | |
| Whatman 1.0 m pore-sized membrane | MilliporeSigma | WHA111110 |
References
- Hallegraeff, G., Enevoldsen, H., Zingone, A. Global harmful algal bloom status reporting. Harmful Algae. 102, 101992 (2021).
- Anderson, D. M.
- Sanseverino, I., Conduto, A. D. S., Pozzoli, L., Dobricic, S., Lettieri, T. Algal Bloom and its Economic Impact. , Publications Office of the European Union. (2016).
- Molinet, C., Niklitschek, E., Seguel, M., Díaz, P. Trends of natural accumulation and detoxification of paralytic shellfish poison in two bivalves from the Norwest Patagonian inland sea. Revista de Biologia Marina Y Oceanografia. 45, 195-204 (2010).
- Mardones, J., Clement, A., Rojas, X., Aparicio, C. Alexandrium catenella during 2009 in Chilean waters, and recent expansion to coastal ocean. Harmful Algae News. 41, 8-9 (2010).
- Alvarez, G., et al. Paralytic shellfish toxins in surf clams Mesodesma donacium during a large bloom of Alexandrium catenella dinoflagellates associated to an intense shellfish mass mortality. Toxins (Basel). 11 (4), (2019).
- Clément, A., et al. Exceptional summer conditions and HABs of Pseudochattonella in Southern Chile create record impacts on salmon farms. Harmful Algae News. 53, 1-3 (2016).
- Trainer, V. L., et al. Pelagic harmful algal blooms and climate change: Lessons from nature's experiments with extremes. Harmful Algae. 91, 101591 (2020).
- Yarimizu, K., et al. Protocols for monitoring harmful algal blooms for sustainable aquaculture and coastal fisheries in Chile. International Journal of Environmental Research and Public Health. 17 (20), (2020).
- Roegner, G. C., Hickey, B. M., Newton, J. A., Shanks, A. L., Armstrong, D. A. Wind-induced plume and bloom intrusions into Willapa Bay, Washington. Limnology & Oceanography. 47 (4), 1033-1042 (2002).
- Tweddle, J. F., et al. Relationships among upwelling, phytoplankton blooms, and phycotoxins in coastal Oregon shellfish. Marine Ecology Progress Series. 405, 131-145 (2010).
- Glibert, P. M., Anderson, D. M., Gentien, P., Graneli, E., Sellner, K. G. The global complex phenomena of harmful algae blooms. Oceanography. 18 (2), 130-141 (2005).
- Paredes-Mella, J., Varela, D., Fernández, P., Espinoza-González, O. Growth performance of Alexandrium catenella from the Chilean fjords under different environmental drivers: Plasticity as a response to a highly variable environment. Journal of Plankton Research. 42 (2), 119-134 (2020).
- Azam, F., Malfatti, F.
- Amin, S. A., et al. Interaction and signaling between a cosmopolitan phytoplankton and associated bacteria. Nature. 522, 98-101 (2015).
- Berdalet, E., et al. Marine harmful algal blooms, human health, and wellbeing: Challenges and opportunities in the 21st century. Journal of Marine Biology Association. 2015, U. K. 1-31 (2015).
- Ramanan, R., Kim, B. -H., Cho, D. -H., Oh, H. -M., Kim, H. -S. Algae-bacteria interactions: Evolution, ecology, and emerging applications. Biotechnology Advances. 34 (1), 14-29 (2016).
- Seymour, J. R., Amin, S. A., Raina, J. B., Stocker, R. Zooming in on the phycosphere: The ecological interface for phytoplankton-bacteria relationships. Nature Reviews Microbiology. 2, 17065 (2017).
- Maruyama, F., et al. 16S and 18S Metabarcoding analysis for Chilean coastal waters harmful algal blooms. protocol.io. , (2020).
- Tanabe, A. S., et al. Comparative study of the validity of three regions of the 18S-rRNA gene for massively parallel sequencing-based monitoring of the planktonic eukaryote community. Molecular Ecology Resources. 16, 402-414 (2016).
- Nishitani, G., et al. Multiple plastids collected by the Dinoflagellate Dinophysis mitra through Kleptoplastidy. Applied and Environmental Microbiology. 78 (3), 813-821 (2012).
- Klindworth, A., et al. Evaluation of general 16S ribosomal RNA gene PCR primers for classical and next-generation sequencing-based diversity studies. Nucleic Acids Research. 41 (1), 1 (2013).
- Callahan, B. J., et al. DADA2: High-resolution sample inference from Illumina amplicon data. Nature Methods. 13 (7), 581-583 (2016).
- R, R Team DCore. R: A language and environment for statistical computing. R Foundation for Statistical Computing. , Vienna, Austria. Available from: http://www.R-project.org (2007).
- McMurdie, P. J., Holmes, S. phyloseq: An R Package for Reproducible Interactive Analysis and Graphics of Microbiome Census Data. PLoS One. 8 (4), 61217 (2013).
- Dixon, P. VEGAN, a package of R functions for community ecology. Journal of Vegetation Science. 14 (6), 927-930 (2003).
- Dittami, S. M., Riisberg, I., Edvardsen, B. Molecular probes for the detection and identification of ichthyotoxic marine microalgae of the genus Pseudochattonella (Dictyochophyceae, Ochrophyta). Environmental Science and Pollution Research. 20 (10), 6824-6837 (2013).
- Mardones, J. I., et al. Salinity-growth response and ichthyotoxic potency of the Chilean Pseudochattonella verruculosa. Frontiers in Marine Science. 6 (24), (2019).
- Santi, I., Kasapidis, P., Karakassis, I., Pitta, P. A comparison of DNA metabarcoding and microscopy methodologies for the study of aquatic microbial eukaryotes. Diversity. 13 (5), 180 (2021).
- Lamb, P. D., et al. How quantitative is metabarcoding: A meta-analytical approach. Molecular Ecology. 28 (2), 420-430 (2019).
- Mascareño, A., et al. Controversies in social-ecological systems: lessons from a major red tide crisis on Chiloe Island, Chile. Ecology and Society. 23, (2018).
- Armijo, J., Oerder, V., Auger, P. -A., Bravo, A., Molina, E. The 2016 red tide crisis in southern Chile: Possible influence of the mass oceanic dumping of dead salmons. Marine Pollution Bulletin. 150, 110603 (2020).
- Swanson, H. A. Caught in Comparisons: Japanese Salmon in an Uneven World. , University of California, Santa Cruz. Doctor of Phylosophy thesis (2013).
- Sakai, Y., et al. Discovery of an unrecorded population of Yamato salamander (Hynobius vandenburghi) by GIS and eDNA analysis. Environmental DNA. 1 (3), 281-289 (2019).
