Summary
Dit protocol introduceert stappen van metabarcoding-analyse, gericht op 16S rRNA- en 18S-rRNA-genen, voor het monitoren van schadelijke algenbloei en hun bijbehorende microbioom in zeewatermonsters. Het is een krachtig moleculair gebaseerd hulpmiddel, maar vereist verschillende procedures, die hier stap voor stap visueel worden uitgelegd.
Abstract
Monitoring van schadelijke algenbloei (HABs) is wereldwijd geïmplementeerd en Chili, een land dat bekend staat om zijn visserij en aquacultuur, gebruikt hiervoor al tientallen jaren intensief microscopische en toxineanalyses. Moleculair biologische methoden, zoals high-throughput DNA-sequencing en bacteriële assemblage-gebaseerde benaderingen, beginnen net te worden geïntroduceerd in Chileense HAB-monitoring en de procedures zijn nog niet gestandaardiseerd. Hier worden 16S rRNA en 18S rRNA metabarcoding analyses voor het monitoren van Chileense HABs stapsgewijs geïntroduceerd. Volgens een recente hypothese speelt algal-bacteriële mutualistische associatie een kritische synergetische of antagonistische relatie die verantwoordelijk is voor bloeiinitiatie, onderhoud en regressie. Het monitoren van HAB vanuit algenbacteriële perspectieven kan dus een breder begrip bieden van HAB-mechanismen en de basis voor vroegtijdige waarschuwing. Metabarcoding-analyse is een van de meest geschikte moleculaire hulpmiddelen voor dit doel, omdat het enorme algenbacteriële taxonomische informatie in een monster kan detecteren. De visuele procedures van bemonstering tot metabarcoding-analyse hierin bieden specifieke instructies, gericht op het verminderen van fouten en het verzamelen van betrouwbare gegevens.
Introduction
Van veel mariene fytoplanktonsoorten is bekend dat ze endogene toxines produceren en wanneer deze soorten zich in voldoende aantallen ophopen, zijn ze schadelijk voor het mariene milieu. Dergelijke schadelijke algenbloei (HABs) worden tegenwoordig waargenomen aan de kusten van de meeste continenten van de wereld1. Giftig fytoplankton hoopt zich eerst op in tweekleppige weefsels, wat leidt tot ziekte en dood in hogere trofische niveaus van organismen, waaronder mensen, bij de spijsvertering. Vervolgens hebben deze gebeurtenissen ernstige gevolgen voor de lokale economie, sociaal-economie en volksgezondheid2. De schade aan de wereldeconomie veroorzaakt door HABs wordt geschat op miljoenen tot miljarden dollars per jaar3. Chili is een van de vele landen die lijden aan frequente HABs.
Chili is een land van lang land, dat zich uitstrekt over 4.300 km ten noorden en zuiden. Het langgerekte westelijke land kijkt uit op de Stille Oceaan, wat natuurlijk de kans vergroot dat Chili HABs ervaart. Vooral in het zuiden van Chili zijn er veel wereldberoemde zalmaquaquatronica' s en elke keer dat een HAB in de regio optreedt, resulteren de algentoxines erin dat massale gekweekte zalm ziek wordt ensterft 4,5,6. In Chili was het jaar waarin de HAB de economie het hardst trof 2016, met een geschat jaarlijks verlies van US $ 800 miljoen7,8. De oorzakelijke giftige algensoorten variëren per jaar en locatie. Voor de zaak van 2016 veroorzaakte een complex van Alexandrium catanella en Pseudochattonella verruclosa een wijdverspreide HAB in het grootste deel van de zuidelijke Chileense kust7,8. De meest recente HAB in Chili vond plaats met de oorzakelijke algensoort Heterosigma Akashiwo in maart 2021 in Camanchaca, gelegen in het zuiden van Chili, waar het gebied een grote zalmkwekerij heeft.
Chili voert al vele jaren kustmonitoring uit met behulp van twee hoofdmethoden; het observeren van zeewater met microscopen om regelmatig giftige algensoorten te identificeren en het meten van toxineniveaus in schelpdieren door middel van biochemische testen9. Vroege detectie van toxische algen en toxineniveaus in schaaldieren voorkomen habs niet; deze analyses kunnen echter onmiddellijke tegenmaatregelen in gang zetten en de schade aan lokale gemeenschappen verminderen. Om de effectiviteit van deze strategie verder te versterken, is onlangs een moleculaire analysemethode toegevoegd aan ons conventionele Chileense HAB-monitoringprogramma om algen en gerelateerde bacteriële gemeenschappen in zeewatermonsters te detecteren. Specifiek werd gekozen voor een Massive Parallel Sequencing-methode met behulp van metabarcoding die zich richt op 16S rRNA- en 18S-rRNA-genen. Hoewel deze techniek ingewikkelde procedures en dure machines en reagentia vereist, is het een geavanceerde technologie die duizenden algen en bacteriegeslachten / soorten tegelijk in een zeewatermonster kan detecteren.
De oorzaken van HAB worden gespeculeerd om verschillende te zijn, zoals temperatuur en seizoen, maar het is onmogelijk om ze te generaliseren. Dit komt omdat HAB-soorten en -frequenties afhankelijk zijn van de regio en spatiotemporale omstandigheden, met natuurlijke fenomenen zoals geografische uniciteit, opwellende nutriëntenmenging en elementafvoer van het land als gevolg van errosie2,10,11,12. Bovendien beïnvloeden kunstmatige factoren zoals eutrofiëring lokale HABs12,13. Door de complexe multifactor is het niet eenvoudig om een nauwkeurige HAB voorspelling te doen. In de afgelopen jaren is er een opvatting dat specifieke bacteriepopulaties verband kunnen houden met de ontwikkeling van HABs als een van de factoren, en onderzoek om deze hypothese te ondersteunen is steeds duidelijker14,15,16,17,18. Moleculair biologische technieken worden over het algemeen gebruikt om bacteriële assemblage te bestuderen; een dergelijke gestandaardiseerde methode is echter nog niet vastgesteld in chileense HAB-monitoring9. Om algen-bacteriële associatie met HABs te bestuderen, is het noodzakelijk om tegelijkertijd metabarcoding-analyse uit te voeren voor de huidige Chileense kustmonitoringprogramma's. Zo introduceert dit protocol visueel ons Chileense HAB-monitoringprogramma, gericht op een stapsgewijze procedure voor het analyseren van de detectie van algen- en bacteriesoorten in zeewatermonsters met behulp van metabarcoding-analyse.
Het volledige protocol dat ons Chileense HAB-monitoringprogramma beschrijft, is beschikbaar in Yarimizu et al.9. Het omvat de procedures van zeewaterbemonstering, microscopische algensoortdetectie, algen-bacteriële gendetectie, pigmentanalyse, meteorologische gegevensverzameling en fysische en chemische watereigenschapstests. Het stapsgewijze protocol van 16S rRNA en 18S rRNA metabarcoding analyse voor algen- en bacteriesoorten detectie is beschikbaar als een preprint19. Dit protocol demonstreert met name metabarcoding-analysestappen, omdat dit het meest gecompliceerde deel en het hoogtepunt van ons HAB-monitoringprogramma is. Dit protocol omvat ook een introductie van het programma en microscopiedetectie van algensoorten. Bij het analyseren van algensoorten door metabarcoding is het cruciaal om tegelijkertijd microscopie uit te voeren om de resultaten van de twee methoden te verifiëren. Dit protocol bevat niet hoe software te gebruiken voor taxonomietoewijzing, maar databaseaanbeveling wordt kort vermeld aan het einde van de volgende sectie.
Protocol
1. Monsterverzameling en voorbehandeling
- Verzamel ongeveer 3 L watermonster van de doelplek.
- Filter 1 L watermonster voor 16S rRNA-analyse door middel van een tandemfiltratie (1 μm en 0,2 μm poriegroot membraan) om vrijlevende en gehechte bacteriën te scheiden.
- Filter nog eens 1 L watermonster voor 18S-rRNA-analyse (fytoplanktondetectie) door een enkele filtratie met een membraan van 0,2 μm.
OPMERKING: De filtratie van het watermonster moet binnen 12 uur na de bemonstering worden voltooid. - Knip het gefilterde membraan doormidden met een steriele chirurgische schaar en wikkel het met aluminiumfolie. Bewaren bij -20 °C gedurende maximaal 1 maand of doorgaan naar de volgende stap.
- Extract DNA met Chelex methode zoals beschreven9. Bewaren bij -20 °C gedurende maximaal 1 maand.
2. Microscoop analyse
- Breng 1 ml van het watermonster met een pipet over op een roosterschuif van 1 ml.
- Observeer het monster onder een microscoop.
- Record namen en hoeveelheid fytoplanktonsoorten.
3. 16S rRNA en 18S rRNA metabarcoding analyse
OPMERKING: Dit proces bestaat uit zeven secties: voorbereiding, eerste PCR-amplicongeneratie, eerste ampliconopruiming, indexatie door tweede PCR, tweede PCR-ampliconverificatie en -opschoning, DNA-concentratieaanpassing en DNA-denaturatie en sequencing. Het hele proces duurt minimaal 5 dagen (40 uur) door een ervaren laborant. Zie de tabel met materialen voor productnummers en fabrikanten.
- Voorbereiding
- Reinig pipetten en laminaire kapkast met 70% ethanol gevolgd door UV-blootstelling gedurende 30 minuten regelmatig. Steriliseer materialen die moeten worden gebruikt.
- Ontdooi DNA-monsters bij kamertemperatuur, centrifugeer bij 100 x g gedurende 2 minuten en breng 100 μL van elk monster supernatant over naar 8-buiss strips.
- Eerste PCR amplicon generatie
OPMERKING: Voer de volgende procedures uit in een laminaire kapkast. Verdun primers van 1 μM-voorraad altijd tot de doelconcentratie met water van PCR-kwaliteit om primerverontreiniging te voorkomen.- Bereid het eerste PCR-mastermengsel in een steriele buis van 1,5 ml voor reacties(tabel 1, tabel 2).
- Aliquot 22,5 μL van het mastermengsel in een 8-buisstrip en voeg 2,5 μL DNA-monster toe. Gebruik 2,5 μL water van PCR-kwaliteit voor negatieve controle.
- Voer de eerste PCR-cyclus uit(tabel 3).
- Bereid 100 ml 2% Agarose-TBE-gel met 10 μL 1x nucleïnezuurgelvlek.
- Laad een mengsel van 1,5 μL 1x DNA-ladende kleurstof en 4 μL PCR-product op de agarosegel. Laad ook 100 bp DNA-ladder op de gel.
- Voer elektroforese uit bij 100 V gedurende 30 minuten.
- Zorg ervoor dat er een band is met een bereik van 500-600 bp onder een UV-lichtbeeldopname. Primer-dimeer band is rond 80 bp.
OPMERKING: Zeewatermonsters bevatten PCR-remmers. Ontbrekende amplicons kunnen soms worden opgelost door monsters 1:100 of 1:1000 te verdunnen met water van PCR-kwaliteit. - Bewaar de eerste PCR-producten bij -20 °C tot de volgende stap.
LET OP: Niet langer dan een week bewaren.
- Eerste PCR amplicon opschoning
OPMERKING: Dit gedeelte kan buiten een laminaire kapkast worden uitgevoerd.- Gebruik het DNA-opruimsysteem van magnetische kralen om PCR-reactieresten te verwijderen, inclusief primer-dimeerproducten.
- Breng 20 μL van elk gereinigd eerste PCR-product over op een nieuwe 96-putplaat. Sluit de plaat af met een micro-afdichtingsfilm. Bewaren bij -20 °C tot de volgende stap verder gaat.
LET OP: Niet langer dan een week bewaren.
- Indexatie per tweede PCR
OPMERKING: In deze sectie worden gezuiverde eerste PCR-producten versterkt met verschillende indexprimercombinaties.- Verdun alle Index 1- en Index 2-primers(tabel 4)tot 1 μM met water van PCR-kwaliteit in 8 buis-PCR-strips die in een laminaire kapkast zijn geplaatst.
OPMERKING: De stappen voortaan in deze sectie kunnen buiten een laminaire kapkast worden uitgevoerd, omdat indexprimers specifiek zijn voor de eerste PCR-reacties overhangadapter. - Positie Index 1 primer in een horizontale rij Index 2 primers in een verticale rij (Tabel 5).
- Voeg in een nieuwe 96-well plaat 12,5 μL hot-start-ready formulering toe aan elke put.
- Voeg 2,5 μL van elke indexprimer (1 μM) toe aan elke put en in tabel 4 met behulp van een meerkanaalspipet.
- Voeg 7,5 μL gezuiverd eerste PCR-product toe.
- Meng zachtjes door 10 keer op en neer te pipetteren. Bedek de plaat met een micro-afdichtingsfilm.
- Voer de tweede PCR-cyclus uit(tabel 3).
- Houd de plaat op -20 °C.
LET OP: Niet langer dan een week bewaren.
- Verdun alle Index 1- en Index 2-primers(tabel 4)tot 1 μM met water van PCR-kwaliteit in 8 buis-PCR-strips die in een laminaire kapkast zijn geplaatst.
- Tweede PCR amplicon verificatie en opschoning
- Gebruik een fragmentanalysator en het bijbehorende reagens. Vortex en spin reagens voor gebruik.
- Laat de monsterbuffer en DNA-zeefband gedurende 30 minuten op kamertemperatuur in evenwicht brengen. Plaats vervolgens de DNA-schermtape in een fragmentanalysator.
- Meng 2 μL monsterbuffer en 3 μL tweede PCR-amplicon in nieuwe 8 buisstrips. Plaats de 8 buisstrips in de fragmentanalysator. Druk op Uitvoeren om te starten.
LET OP: De vorming van luchtbellen moet worden vermeden. - Zorg ervoor dat tweede PCR-ampliconen ongeveer 613 bp (600 - 630 bp) zijn voor zowel 16S- als 18S-rRNA-genen.
- Zuiver tweede PCR-producten met behulp van een DNA-opruimsysteem met magnetische kralen.
- Aanpassing van de DNA-concentratie
- Meet de DNA-concentratie in de gezuiverde tweede PCR-producten met behulp van een nucleïnezuurkwantificeringsspectrofotometer.
- Bereken de doelgenconcentratie in nM, rekening houdend met de gemiddelde uiteindelijke bibliotheekgrootte als 613 bp voor zowel 16S- als 18S-rRNA-genen:
- Verdun elk gezuiverd tweede PCR-product met steriel PCR-water tot 4 nM in een nieuwe 0,2 ml 96 putplaat.
OPMERKING: De plaat kan hier bij -20 °C worden bewaard. Anders moet de rest van de procedures worden uitgevoerd zonder te stoppen. - Aliquot 3 μL van elk 4 nM tweede PCR-product en meng alles in een nieuwe steriele 1,5 ml buis als een gepoolde bibliotheek. Houd de buis te allen tijde op 4 °C of op ijsbad.
- Meet de concentratie van de gepoolde bibliotheek ter bevestiging met behulp van een nucleïnezuurkwantificeringsspectrofotometer. Stel de concentratie in op 4 nM als deze hoger is dan 4 nM.
OPMERKING: Overgeconcentreerd DNA produceert overschatte leesgetallen, wat de analyse belemmert.
- DNA-denaturatie en sequencing
OPMERKING: Deze sectie maakt gebruik van het Illumina MiSeq-systeem met specifieke reagentia. Zie productnummers in Tabel met materialen.
OPMERKING: Strikt volg de tijd. Ontdooi alle reagentia behalve cartridges op de dag van sequencing.- Verwijder een dag voor de sequencing een voorgevulde gebruiksklare reagenspatroon van -20 °C en bewaar bij 4 °C om te ontdooien.
- Stel een warmteblok geschikt voor 1,5 ml centrifugebuizen in op 96 °C.
- Plaats de hybridisatiebuffer op ijs.
- Verdun moleculaire kwaliteit NaOH van 1 N tot 0,2 N in een nieuwe buis met pcr-water.
- Verdun een kant-en-klare controlebibliotheek met TE-buffer (pH 8,0) van 10 nM-voorraad tot 4 nM in een nieuwe buis (d.w.z. 2 μL controlebibliotheek + 3 μL TE-buffer).
- Meng 16 μL van 4 nM gepoolde monsterbibliotheek met 4 μL van 4 nM controlebibliotheek in een nieuwe buis met het label "1".
- Meng 10 μL monster in buis "1" met 10 μL van 0,2 N NaOH in een nieuwe buis met het label "2".
- Vortex de buis 2 voor 5 s, draai kort naar beneden en incubeer bij kamertemperatuur gedurende 5 minuten.
- Voeg 980 μL hybridisatiebuffer toe aan buis 2.
- Meng in een nieuwe buis met het label "3" 260 μL het monster uit buis 2 met 390 μL hybridisatiebuffer. Meng door de buis om te keren.
- Incubeer buis 3 bij 96 °C gedurende 2 min en leg deze onmiddellijk op ijs gedurende maximaal 2 minuten.
- Verwijder de patroon uit de koelkast bij 4 °C.
- Stel het monsterblad in voor sequencing met elke overeenkomstige index 1- en index 2-adapters zoals in tabel 6.
- Verwijder de flowcell uit de MiSeq v3-kit. Reinig de flowcell voorzichtig met steriel PCR-water van moleculaire kwaliteit.
OPMERKING: Giet geen water op de capillaire stippen van de flowcell. Veeg het water voorzichtig af uit de flowcell met niet-vezelig papier. - Laad het volledige volume van buis 3 (650 μL) in de patroon.
- Selecteer in de instrumentbewerkingssoftware sequencing en volg de instructies. Plaats flowcell, inbouwbuffer en patroon. Laad sample-sheet. Druk op Uitvoeren om de reactie te starten.
OPMERKING: Deze reeks duurt 3-5 dagen. De gegevens worden automatisch geüpload naar het Basespace-platform. Onbewerkte gegevens worden opgeslagen in twee mappen op de computer: analysemap met fastq-bestanden en uitvoer met bcl-bestanden en jpeg-afbeeldingen.
4.Taxonomische toewijzing aan het sequentiëren van gegevens
- FASTQ bestandsverwerking
OPMERKING: DADA2-pakket23 van R24 is een van de aanbevolen databases om FASTQ-bestanden te verwerken. De richtlijn is beschikbaar op [https://github.com/mickeykawai/exec_dada2]. Deze richtlijn is opgesteld door de recente versie van de zelfstudie over de DADA2-pijplijn [https://benjjneb.github.io/dada2/tutorial.html] over te nemen.- Verwerk onbewerkte FASTQ gepaarde eindsequenties voor bijsnijden, kwaliteitsfiltering, dereplicatie en tellen van unieke sequenties, monsterinferentie, samenvoegen in contigs en het verwijderen van chimere sequenties.
- Gebruik de volgende DADA2 gespecificeerde parameters voor zowel 16S rRNA als 18S rRNA genfragmenten; trimLefts=0, 0, truncLens=[Controleer de kwaliteit van de reeks en stel deze in op een geschikte lengte].
OPMERKING: Standaardwaarden voor de andere parameters zijn maxN=0, maxEE=2,2, trancQ=2.
- Taxonomie opdracht
OPMERKING: SILVA rRNA-database wordt aanbevolen voor taxonomietoewijzing voor DADA2 [silva_nr_v132_train_set.fa.gz is standaard ingesteld].- Verwijder chloroplast en mitochondriale OTU's voor 16S rRNA genfragment analyse. Verwijder singletons uit 16S rRNA en 18S rRNA analyse.
- Rarify alle monsters tot zelfs sequencing diepte op basis van het monster met de laagste sequencing diepte.
- Noteer het aantal reads, toegewezen OTUs en op welk niveau, gefilterde reads en het aantal uitgesloten singletons.
- Statistische analyse
- Voer statistische analyse uit op microbiële gegevens met behulp van R-pakketten van phyloseq25 en vegan26.
Representative Results
Dit protocol maakt gebruik van 18S rRNA-gen metabarcoding analyse om algensoorten in zeewatermonsters te identificeren. Een representatief resultaat wordt weergegeven in figuur 1, waarin het zeewater verzameld uit Metri, Puerto Montt, Chili (-41.597; −72.7056) op 19 februari 2019, werd geanalyseerd met dit protocol. Het resultaat toonde een totaal van 13.750 metingen met meer dan 30 algensoorten in het zeewatermonster. De dominante alg in dit monster was Navicula spp. met een relatieve abundantie van 70,77%. Ook werd voldoende abundantie waargenomen voor Micromonas (6,40%), Chaetoceros spp. (4,44%), Scripsiella spp. (2,44%) en Prorocentrum spp. (1.28%). Pseudochattonella spp.,een van de hoogste toxische algenveroorzakers van chileense HAB, werd gedetecteerd met 0,52% uit dit zeewatermonster.
Om de betrouwbaarheid van de gegevens te verifiëren, werden de algensoorten geïdentificeerd door 18S rRNA-genanalyse vergeleken met die verkregen door microscopie in hetzelfde zeewatermonster(figuur 2). In overeenstemming met 18S rRNA-genanalyse toonde de microscopie aan dat de dominante soort Navicula sppwas. met een relatieve abundantie van 74,1% en Prorocentrum spp. (0,60%) als minder belangrijke soort. Omgekeerd werd Heterocapsa spp. (9,04%) gedocumenteerd uit microscopische observatie niet geïdentificeerd door 18S rRNA-genanalyse in dit monster. Er was 12,6% van de kleine rond niet-identificeerbare fytoplanktoncellen geregistreerd door microscopie. Dit zou Micromonaskunnen zijn , volgens de 18S rRNA-resultaten.
Het protocol maakt gebruik van 16S rRNA-gen metabarcoding-analyse om bacteriesoorten in zeewatermonsters te identificeren. Een representatief resultaat is weergegeven in figuur 3, waarin hetzelfde zeewater dat werd gebruikt voor 18S rRNA-genanalyse werd geanalyseerd met 16S rRNA-genanalyse. Het resultaat toonde een totaal van 31.758 metingen met meer dan 30 bacteriesoorten in het zeewatermonster. Er moet worden geschetst dat dit zeewatermonster door tandemfiltermembranen (1 μm en 0,2 μm poriegroottes) werd geleid om vrijlevende bacteriën van aangehechte bacteriën te scheiden. Vervolgens werden cellen gevangen door elk filtermembraan behandeld voor DNA-extractie, gevolgd door de 16S rRNA-genanalyse. Het representatieve resultaat in figuur 3 toont bacteriesoorten geïdentificeerd uit een poriegroottemembraan van 0,2 μm, die worden gedefinieerd als vrijlevende bacteriën. De dominante vrijlevende bacterie was Amylibacter spp. met een relatieve abundantie van 20,02%, gevolgd door Clade Ia (13,53%) en Aligiphilus spp. (7.06%). De rest van de bacteriesoorten die uit dit zeewatermonster werden gedetecteerd, waren relatief gelijk verdeeld. Dezelfde analyse kan worden uitgevoerd voor cellen die worden gevangen door een membraan ter grootte van een porie van 1 μm als detectie van hechte bacteriën.
Wanneer deze metabarcoding-assays worden uitgevoerd op geplande tijdstippen gedurende een bepaalde onderzoeksperiode, kunnen de resultaten worden samengevat als tijdreeksanalyse. Een manier om dit te doen is om de relatieve overvloed van bepaalde algen- en bacteriesoorten uit te zetten als een functie van de tijd om een uniek groeipatroon te vinden. Figuur 4 toont een representatieve tijdreeksplot van Alexandrium en Pseudochattonella in Metri, Chili. Een andere manier om een tijdreeks metabarcoding-analyse samen te vatten, is door alle geïdentificeerde algen en bacteriën als een functie van de tijd uit te zetten, die de populatieverandering van bepaalde groepen organismen vertegenwoordigen. Figuur 5 en figuur 6 geven een overzicht van de relatieve abundantie van alle bacteriële geslachten en ordes, respectievelijk, die gedurende vijf maanden uit het zeewater van Metri worden gedetecteerd.
Tabel 1: Eerste PCR master mix inhoud: De tabel toont de mastermixinhoud per reactie voor 16S rRNA en 18S rRNA analyses. De primersequenties zijn weergegeven in tabel 3. Klik hier om deze tabel te downloaden.
Tabel 2: Primersequenties: De primers voor de eerste PCR zijn vermeld voor 16S rRNA en 18S rRNA analyses. Klik hier om deze tabel te downloaden.
Tabel 3: PCR-cycli: De thermische cycli voor de eerste PCR en de tweede PCR worden vermeld. Klik hier om deze tabel te downloaden.
Tabel 4: Indexsequenties: Index 1 (i7) en Index 2 (i5) primers die moeten worden gebruikt voor de tweede PCR worden vermeld. Klik hier om deze tabel te downloaden.
Tabel 5: Voorbeeld van index 1 en index 2 positionering: Om fouten te verminderen, moeten indexprimers eerst in de positie worden geplaatst en wordt aliquot van elk overgebracht naar een 96-well plaat met behulp van een meerkanaals pipet. Klik hier om deze tabel te downloaden.
Tabel 6: Voorbeeld van een monsterblad: Voorafgaand aan de sequencing moet een voorbeeldblad worden gemaakt dat overeenkomt met index 1- en index 2-adapters. Klik hier om deze tabel te downloaden.
Figuur 1: Representatief resultaat van 18S rRNA metabarcoding analyse: Algensoorten aanwezig in een zeewatermonster verzameld uit Metri, Los Lagos, Chili op 19 februari 2019, werden geïdentificeerd door 18S rRNA metabarcoding assay. De sequenties die "onbekend" werden toegewezen, werden geëlimineerd en de relatieve abundantie van elke geïdentificeerde soort werd uitgezet. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Representatief resultaat van microscopische analyse: De algensoorten werden geïdentificeerd uit een watermonster uit Metri, Los Lagos, Chili op 19 februari 2019, door microscopie. De hoeveelheid van elke soort werd handmatig geteld en uitgezet. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Representatief resultaat van 16S rRNA metabarcoding analyse: Bacteriesoorten aanwezig in een watermonster uit Metri, Los Lagos, Chili op 19 februari 2019, werden geïdentificeerd door 16S rRNA metabarcoding assay. De relatieve abundantie van elke geïdentificeerde soort werd uitgezet. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Representatieve tijdreeksplot van Alexandrium spp. en Pseudochattonella spp. verkregen uit 18S rRNA metabarcodingin Metri, Chili: Figuur herdrukt uit Yarimizu et al9. De twee toxische algensoorten, Alexandrium en Pseudochattonella, werden selectief gevolgd door 18S rRNA-analyse in de loop van de tijd, en de relatieve abundantie werd uitgezet als een functie van het tijdspunt. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5: Representatieve genus tijdreeksplot verkregen uit 16S rRNA en 18S rRNA metabarcoding: Alle bacteriële en eukaryote geslachten geïdentificeerd in het water van Metri, Chili, gemonitord gedurende vijf maanden. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 6: Representatieve volgorde tijdreeksplot verkregen uit 16S rRNA en 18S rRNA metabarcoding: Alle bacteriële en eukaryote orden geïdentificeerd in het water van Metri, Chili, gecontroleerd gedurende vijf maanden. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Tabel S1 en tabel S2:
Tabel S1: Ruwe gegevens voor figuur 5 en figuur 6. Tabel S2: Resultaat van de QC-controle op de ruwe gegevens van figuur 5 en figuur 6. Klik hier om deze tabellen te downloaden.
Discussion
Dit protocol heeft met succes 18S rRNA en 16S rRNA gen metabarcoding analyse uitgevoerd om algen- en bacteriesoorten in zeewatermonsters te identificeren voor het monitoren van Chileense HABs. De dominante algen en enkele kleine algen die door dit protocol werden gedetecteerd, waren consistent met die verkregen door microscopie, wat de betrouwbaarheid van het protocol bevestigde. Het hoogtepunt van het protocol is dat de analyse Alexandrium spp. en Pseudochattonella spp.,de twee meest problematische HAB-veroorzakende soorten in het zuiden van Chili, detecteerde uit het zeewater van Metri, zelfs bij een lage abundantie. Vooral Pseudochattonella spp. zijn uitdagende soorten om onder een microscoop te identificeren omdat de cellen klein zijn en gemakkelijk scheuren onder licht of gebruik van fixatieven27,28. Metabarcoding kan algensoortinformatie opleveren die nauwelijks aanwezig is in zeewatermonsters die microscopie niet kan identificeren. Het protocol detecteerde ook meer dan 30 bacteriesoorten. Hoewel het op dit moment onbekend is hoe deze bacteriën verband houden met algengroei, zal massale gegevensverzameling van algen-bacteriesoorten in de tijdreeksanalyse mogelijk dergelijke belangrijke ontdekkingen opleveren. Het toevoegen van metabarcoding-analyse aan de conventionele Chileense HAB-monitoringprogramma's zal dus ongetwijfeld de huidige HAB-monitoringefficiëntie versterken. In feite kan dit visuele protocol voor metabarcodinganalyse niet alleen gunstig zijn voor de algenbacteriële monitoring van Chileens water, maar ook voor de kustmonitoringprogramma's in andere door HAB getroffen gebieden wereldwijd.
Hoewel dit protocol de bovengenoemde voordelen bood, moeten de nadelen van de methode worden besproken. Zoals te zien is in het visuele protocol, is de metabarcodingmethode tijdrovend en complex, waarvoor dure machines en reagentia nodig zijn. Het laboratoriumpersoneel moet speciaal worden opgeleid, anders verspilt het materiaal, arbeid en tijd. Bovendien moet algendetectie door metabarcoding gepaard gaan met microscopie om te verifiëren dat dezelfde dominante soorten worden geïdentificeerd uit de twee orthogonale methoden29. Microscopie is voor het grootste deel een niet-invasief hulpmiddel om algensoorten te identificeren, wat betekent dat het moeilijker is om fouten te maken wanneer de algensoorten unieke en schijnbare vormen hebben. Natuurlijk kunnen menselijke fouten optreden als de soorten zeer vergelijkbare vormen hebben. Aan de andere kant, omdat metabarcoding-analyse meerdere stappen vereist, verhoogt het natuurlijk fouten. Het kan een monster zijn dat door elkaar is gehaald, een verkeerde toevoeging van reagens of het missen van enkele procedures. Daarom is het van cruciaal belang om de metabarcodingsresultaten te vergelijken met die verkregen door microscopie. Ten slotte is het protocol alleen kwalitatief van toepassing en moeten de resultaten worden berekend op relatieve abundantie. Zoals Lamb et al. in 2019 verklaarden, is de huidige metabarcoding omdat de kwantitatieve prestaties nog steeds beperkt zijn en aanvullend onderzoek vereist is voordat metabarcoding met vertrouwen kan worden gebruikt voor kwantitatieve toepassingen30.
Dit protocol is geoptimaliseerd voor 140 - 170 monsters per run uit de 16S Metagenomic Sequencing Library Preparation manual uitgegeven door Illumina Inc. Het geoptimaliseerde protocol is vele malen getest en verder aangepast om deze definitieve versie uit te geven. Daarom wordt het ten zeerste aanbevolen om elke stap nauwkeurig te volgen. Het meest kritische onderdeel van het protocol is dat extra zorg nodig is om monsterbesmetting te voorkomen. De pipetten en laminaire stromingskap moeten te allen tijde worden gereinigd met 70% alcohol en UV-blootstelling en steriliseerbare materialen moeten worden geautoclaveerd. De primers en reagentia moeten bij elke nieuwe run rechtstreeks uit de voorraad worden verdund, anders kan hergebruik van reagentia en blootstelling aan verschillende verdunningen een oorzaak van monsterverontreiniging zijn. Het protocol specificeert wanneer de bewerking buiten de laminaire stromingskap kan worden uitgevoerd. Tenzij anders, moeten monsters worden behandeld in een gereinigde laminaire stromingskap. Wanneer u te maken heeft met meerdere 8-buisstrips tegelijkertijd, wordt het aanbevolen om aan de eerste 8-buiss strip te werken en deze af te sluiten voordat u naar de volgende 8-buisstrip gaat. Het open laten van het deksel voor een lange tijd kan monsterbesmetting veroorzaken, omdat 16S- en 18S-rRNA-genen zeer alomtegenwoordig zijn in de omgeving. De aangegeven tijd, zoals mengtijd en incubatietijd, moet worden gevolgd zoals precies beschreven, omdat de beste duur voor elke stap is geselecteerd op basis van de meerdere testruns. Te veel of onvoldoende tijd kan bijvoorbeeld de monsteropbrengst verminderen. Het proces moet alleen worden gestopt bij het deel waarvan het protocol zegt dat het kan stoppen. Het is cruciaal om een negatieve controle te hebben, omdat het bevestigt dat de positieve uitkomsten geen kunstmatige valse positieven zijn. Ten slotte wordt het ten zeerste aanbevolen om de dagen te plannen, omdat het minstens vijf dagen duurt om alle stappen te verwerken en sommige delen kunnen niet worden gestopt tot het volgende stopteken.
De beperking van taxonomische toewijzing voor gesequentieerde gegevens wordt hier kort opgemerkt. Nieuw ontdekte nucleotidesequenties voor bacterie- en algensoorten worden dagelijks bijgewerkt in de databank. Hoewel goed bestudeerde algen- en bacteriesoorten betrouwbaar worden geregistreerd, zijn er ook veel sequenties voor onbekende soorten bijgewerkt in de databank. Het geeft aan dat de resolutie van geregistreerde nucleotidesequenties niet altijd voldoende is voor soortidentificatie, maar alleen voor geslachtsidentificatie. Microscopische soortidentificatie moet dus orthogonaal worden uitgevoerd. Het opzetten van een open-access pijplijn voor dit werk heeft een aanzienlijk voordeel bij het omgaan met een grote set gesequentieerde gegevens in één keer en het efficiënt onderzoeken wanneer een fout optreedt. Bovendien bevindt de uitvoer van DADA2 zich in een tekst- of csv-bestand, waardoor het gemakkelijk is om verdere statistische analyse uit te voeren. Aan de andere kant is een grote server vereist om taxonomische opdrachten uit te voeren, vooral wanneer een dataset groot is. Om de pijplijn op te zetten, zijn ingenieurs nodig om de pijplijn op te zetten en de professionals moeten parameters, werking, Linux en bio-informatica begrijpen.
Naast de scope als HAB-monitoringtool kan het gebruik van dit protocol worden uitgebreid voor onderzoeksdoeleinden. Er zijn bijvoorbeeld lopende debatten tussen de Chileense regering en lokale vissers, samen met milieuvredesverenigingen over het toegenomen aantal lokale HAB31,32. De regering beweert dat het te wijten is aan een natuurlijk fenomeen als de opwarming van de aarde en El Niño, terwijl de latere partijen beweren dat de zalmaquacultuur de oorzaak is. Zalm is geen inheemse soort van Chili en zat een halve eeuw geleden niet in Chileens water. De Chileense regering streefde destijds naar groei van de economie en het creëren van banen voor arme gebieden door het ontwikkelen van een zalmbedrijf33. Met de interventie uit het buitenland voor kapitaalwinst, chili maakte groot succes in pen-stijl aquacultuur ontwikkeling, en het aantal zalm is opmerkelijk toegenomen in de afgelopen decennia31,32,33. Vervolgens is een grote hoeveelheid voedsel voor zalm in zee gegooid, waardoor de lokale bevolking vermoedt dat zalmaquacultuur de reden is voor de frequente lokale HABs31,32. De waarheid is nu onbekend, maar het moet uiteindelijk worden begrepen, zodat strategieën kunnen worden bedacht om het lokale mariene milieu, de economie en de menselijke gezondheid tegen HABs te beschermen. De moleculaire analyse van de lokale algen-bacteriële relatie kan bijdragen aan een stap voorwaartse verduidelijking voor een dergelijk onderwerp. De techniek kan bijvoorbeeld de algen- en bacteriesoorten zoeken die eerder niet aanwezig waren in het doeloceanische gebied, maar de afgelopen jaren dramatisch zijn toegenomen, wat enigszins vergelijkbaar is met de studie van Sakai et al. voor de ontdekking van een niet-geregistreerde populatie Yamato salamander (Hynobius vandenburghi) door GIS- en eDNA-analyse34. Daarom heeft dit metabarcodingprotocol, naast de HAB-monitoringtool, het potentiële gebruik voor andere prospects.
Disclosures
De auteurs verklaren geen belangenverstrengeling te hebben. De financiers hadden geen rol in de opzet van de studie, in het verzamelen, analyseren of interpreteren van gegevens; bij het schrijven van het manuscript, of bij de beslissing om de resultaten te publiceren.
Acknowledgments
Deze studie werd ondersteund door de subsidie (JPMJSA1705) voor een studie over Science and Technology Research Partnership for Sustainable Development-Monitoring Algae in Chile (SATREPS-MACH). We bedanken Dr. Sandra Rios (Universidad de Los Lagos) voor het gebruik van een filmfragment. Wij danken Neal Andrew Holland voor zijn ijverige proeflezing van het manuscript. We spreken onze oprechte waardering uit voor de laboratoriumgroepsleden van CREAN-IFOP in Puerto Montt, Chili, voor het adviseren over fytoplanktonidentificatie.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL single tube | ThermoFisher | Q32856 | sterile |
| 1.5 mL tubes | ThermoFisher | 2150N | sterile |
| 8-strip 0.2 mL PCR tubes and flat cap | ThermoFisher | AB0451 & 4323032 | sterile |
| 96-well 0.2 mL PCR plate | ThermoFisher | N8010560 | |
| AccuRuler 100 bp DNA Ladder | MaestroGen | 02001-500 | |
| Chelex 100 Chelating Resin | Bio-Rad | 1432832 | |
| Chemical Duty Vacuum Pressure Pump | MilliporeSigma | WP6122050 | |
| D1000 Reagents | Agilent Technologies | 5067-5583 | |
| D1000 sample buffer | Agilent Technologies | 5067-5602 | |
| DNA loading dye (Blue/Orange Loading Dye 6X) | Promega | G1881 | |
| Ethanol Molecular Biology Grade | E7023 | Merck KGaA | |
| Filtration device | ThermoFisher | 09-740-36H, 09-740-23E | |
| Fluorescent DNA concentration measurement kit (Qubit dsDNA HS Assay kit) | Thermo Fisher Scientific | Q32851 | |
| Fluorometer (Qubit4 Fluorometer) | ThermoFisher | Q33238 | |
| Fragment analysis verification matrix (D1000 ScreenTape) | Agilent Technologies | 5067-5582 | |
| Fragment Analyzer (Agilent Tapestation 4150) | Agilent | G2992AA | |
| GelRed Nucleic Acid Gel Stain | Biotium | 41002 | |
| Generic bench vortexer (Vortex Genie 2) | Scientific Industries | SI-0236 | |
| Heat block | |||
| High performance sequencing-grade DNA polymerase (KAPA HiFi Hotstart ReadyMix), 2X | Roche | KK2602 | |
| HT1 Hybridization buffer | Illumina | 20015892 | |
| Illumina Nextera XT v2 Index Kit set A, B, C and D | Illumina | FC-131-2001, -2002, -2003, -2004 | |
| Laminar hood cabinet | Biobase Co. | Biobase PCR-800 PCR Cabinet | |
| Loading tips (Specific for Agilent TapeStation systems) | Agilent Technologies | 5067-5598 | |
| Magnetic beads DNA cleanup system (ProNex® Size-Selective Purification System) | Promega | NG2002 | |
| Magnetic stand for 96 wells (Magnetic Stand-96) | ThermoFisher | AM10027 | |
| Micro-seal film for 96-well plate | ThermoFisher | 4311971 | sterile |
| MiSeq Reagent Kit v3 | Illumina | MS-102-3003 | includes pre-filled, ready-to-use reagent cartridges. |
| MiSeq system | Illumina | SY-410-1003 | includes pre-installed software |
| Molecular grade nuclease-free water | Integrated DNA Technologies | 11-05-01-04 | |
| Molecular grade sodium hydroxide (NaOH) 1M | Merck KGaA | 1091371000 | |
| Multichannel pipettes | Not specified | Not specified | |
| Multi-Purpose Agarose | Cleaver Scientific | CSL-AG500 | |
| Ow D2 Wide-Gel Electrophoresis System | ThermoFisher | D2 | |
| Ow EC-105 Compact Power Supply | ThermoFisher | 105ECA-115 | |
| Pellet Pestle— Cordless Motor | ThermoFisher | K749540-0000 | |
| PhiX control Kit v3 | Illumina | FC-110-300 | ready-to-use control library for Illumina sequencing |
| Pipette tips | Not specified | Not specified | sterile |
| Pipettes | Not specified | Not specified | 2, 10, 20, 100, 1000 μL |
| SterivexTM GP 0.22 μm filter unit | MilliporeSigma | SVGP01050 | |
| Tabletop centrifuge | Eppendorf 5427R Centrifuge | Eppendorf AG | |
| TBE buffer | ThermoFisher | B52 | |
| TE buffer (pH 8.0) | ThermoFisher | AM9849 | |
| Terr PCR Direct FFPE Kit | Takara Bio USA | 639284 | includes 2X Terra PCR Direct Buffer |
| Terra PCR Direct Polymerase Mix, 1.25 U/μL | Takara Bio USA | 639271 | High performance Inhibitor-tolerant DNA polymerase |
| ThermalCycler (MiniAMP Plus Thermal Cycler) | ThermoFisher | A37835 | |
| TransIlluminator and image capture system | Analytik Jena, AG | GelDoc-ItTS2 Imager | |
| Whatman 1.0 m pore-sized membrane | MilliporeSigma | WHA111110 |
References
- Hallegraeff, G., Enevoldsen, H., Zingone, A. Global harmful algal bloom status reporting. Harmful Algae. 102, 101992 (2021).
- Anderson, D. M.
- Sanseverino, I., Conduto, A. D. S., Pozzoli, L., Dobricic, S., Lettieri, T. Algal Bloom and its Economic Impact. , Publications Office of the European Union. (2016).
- Molinet, C., Niklitschek, E., Seguel, M., Díaz, P. Trends of natural accumulation and detoxification of paralytic shellfish poison in two bivalves from the Norwest Patagonian inland sea. Revista de Biologia Marina Y Oceanografia. 45, 195-204 (2010).
- Mardones, J., Clement, A., Rojas, X., Aparicio, C. Alexandrium catenella during 2009 in Chilean waters, and recent expansion to coastal ocean. Harmful Algae News. 41, 8-9 (2010).
- Alvarez, G., et al. Paralytic shellfish toxins in surf clams Mesodesma donacium during a large bloom of Alexandrium catenella dinoflagellates associated to an intense shellfish mass mortality. Toxins (Basel). 11 (4), (2019).
- Clément, A., et al. Exceptional summer conditions and HABs of Pseudochattonella in Southern Chile create record impacts on salmon farms. Harmful Algae News. 53, 1-3 (2016).
- Trainer, V. L., et al. Pelagic harmful algal blooms and climate change: Lessons from nature's experiments with extremes. Harmful Algae. 91, 101591 (2020).
- Yarimizu, K., et al. Protocols for monitoring harmful algal blooms for sustainable aquaculture and coastal fisheries in Chile. International Journal of Environmental Research and Public Health. 17 (20), (2020).
- Roegner, G. C., Hickey, B. M., Newton, J. A., Shanks, A. L., Armstrong, D. A. Wind-induced plume and bloom intrusions into Willapa Bay, Washington. Limnology & Oceanography. 47 (4), 1033-1042 (2002).
- Tweddle, J. F., et al. Relationships among upwelling, phytoplankton blooms, and phycotoxins in coastal Oregon shellfish. Marine Ecology Progress Series. 405, 131-145 (2010).
- Glibert, P. M., Anderson, D. M., Gentien, P., Graneli, E., Sellner, K. G. The global complex phenomena of harmful algae blooms. Oceanography. 18 (2), 130-141 (2005).
- Paredes-Mella, J., Varela, D., Fernández, P., Espinoza-González, O. Growth performance of Alexandrium catenella from the Chilean fjords under different environmental drivers: Plasticity as a response to a highly variable environment. Journal of Plankton Research. 42 (2), 119-134 (2020).
- Azam, F., Malfatti, F.
- Amin, S. A., et al. Interaction and signaling between a cosmopolitan phytoplankton and associated bacteria. Nature. 522, 98-101 (2015).
- Berdalet, E., et al. Marine harmful algal blooms, human health, and wellbeing: Challenges and opportunities in the 21st century. Journal of Marine Biology Association. 2015, U. K. 1-31 (2015).
- Ramanan, R., Kim, B. -H., Cho, D. -H., Oh, H. -M., Kim, H. -S. Algae-bacteria interactions: Evolution, ecology, and emerging applications. Biotechnology Advances. 34 (1), 14-29 (2016).
- Seymour, J. R., Amin, S. A., Raina, J. B., Stocker, R. Zooming in on the phycosphere: The ecological interface for phytoplankton-bacteria relationships. Nature Reviews Microbiology. 2, 17065 (2017).
- Maruyama, F., et al. 16S and 18S Metabarcoding analysis for Chilean coastal waters harmful algal blooms. protocol.io. , (2020).
- Tanabe, A. S., et al. Comparative study of the validity of three regions of the 18S-rRNA gene for massively parallel sequencing-based monitoring of the planktonic eukaryote community. Molecular Ecology Resources. 16, 402-414 (2016).
- Nishitani, G., et al. Multiple plastids collected by the Dinoflagellate Dinophysis mitra through Kleptoplastidy. Applied and Environmental Microbiology. 78 (3), 813-821 (2012).
- Klindworth, A., et al. Evaluation of general 16S ribosomal RNA gene PCR primers for classical and next-generation sequencing-based diversity studies. Nucleic Acids Research. 41 (1), 1 (2013).
- Callahan, B. J., et al. DADA2: High-resolution sample inference from Illumina amplicon data. Nature Methods. 13 (7), 581-583 (2016).
- R, R Team DCore. R: A language and environment for statistical computing. R Foundation for Statistical Computing. , Vienna, Austria. Available from: http://www.R-project.org (2007).
- McMurdie, P. J., Holmes, S. phyloseq: An R Package for Reproducible Interactive Analysis and Graphics of Microbiome Census Data. PLoS One. 8 (4), 61217 (2013).
- Dixon, P. VEGAN, a package of R functions for community ecology. Journal of Vegetation Science. 14 (6), 927-930 (2003).
- Dittami, S. M., Riisberg, I., Edvardsen, B. Molecular probes for the detection and identification of ichthyotoxic marine microalgae of the genus Pseudochattonella (Dictyochophyceae, Ochrophyta). Environmental Science and Pollution Research. 20 (10), 6824-6837 (2013).
- Mardones, J. I., et al. Salinity-growth response and ichthyotoxic potency of the Chilean Pseudochattonella verruculosa. Frontiers in Marine Science. 6 (24), (2019).
- Santi, I., Kasapidis, P., Karakassis, I., Pitta, P. A comparison of DNA metabarcoding and microscopy methodologies for the study of aquatic microbial eukaryotes. Diversity. 13 (5), 180 (2021).
- Lamb, P. D., et al. How quantitative is metabarcoding: A meta-analytical approach. Molecular Ecology. 28 (2), 420-430 (2019).
- Mascareño, A., et al. Controversies in social-ecological systems: lessons from a major red tide crisis on Chiloe Island, Chile. Ecology and Society. 23, (2018).
- Armijo, J., Oerder, V., Auger, P. -A., Bravo, A., Molina, E. The 2016 red tide crisis in southern Chile: Possible influence of the mass oceanic dumping of dead salmons. Marine Pollution Bulletin. 150, 110603 (2020).
- Swanson, H. A. Caught in Comparisons: Japanese Salmon in an Uneven World. , University of California, Santa Cruz. Doctor of Phylosophy thesis (2013).
- Sakai, Y., et al. Discovery of an unrecorded population of Yamato salamander (Hynobius vandenburghi) by GIS and eDNA analysis. Environmental DNA. 1 (3), 281-289 (2019).
