Summary
Этот протокол вводит этапы анализа метабаркодирования, нацеленного на гены 16S рРНК и 18S рРНК, для мониторинга вредного цветения водорослей и связанного с ним микробиома в образцах морской воды. Это мощный молекулярный инструмент, но требует нескольких процедур, которые визуально объясняются здесь шаг за шагом.
Abstract
Мониторинг вредного цветения водорослей (ВЦВ) был внедрен во всем мире, и Чили, страна, известная своим рыболовством и аквакультурой, на протяжении десятилетий интенсивно использовала микроскопические и токсинные анализы для этой цели. Молекулярно-биологические методы, такие как высокопроизводительное секвенирование ДНК и подходы, основанные на бактериальной сборке, только начинают внедряться в чилийский мониторинг ВЦВ, и процедуры еще не стандартизированы. Здесь анализы метабаркодирования 16S рРНК и 18S рРНК для мониторинга чилийских ВЦВ вводятся поэтапно. Согласно недавней гипотезе, водорослево-бактериальная мутуалистическая ассоциация играет критическую синергетическую или антагонистическую связь, объясняющую инициацию, поддержание и регрессию цветения. Таким образом, мониторинг ВЦВ с точки зрения водорослей и бактерий может обеспечить более широкое понимание механизмов ВЦВ и основу для раннего предупреждения. Анализ метабаркодирования является одним из наиболее подходящих молекулярных инструментов для этой цели, поскольку он может обнаруживать массивную таксономическую информацию о водорослях и бактериях в образце. Визуальные процедуры отбора проб для анализа метабаркодирования в настоящем документе содержат конкретные инструкции, направленные на уменьшение ошибок и сбор надежных данных.
Introduction
Известно, что многие виды морского фитопланктона производят эндогенные токсины, и когда эти виды накапливаются в достаточном количестве, они вредны для морской среды. Такое вредное цветение водорослей (ВЦВ) наблюдается сегодня на побережьях большинства континентов мира1. Токсичный фитопланктон сначала накапливается в тканях двустворчатых моллюсков, что приводит к болезням и смерти на более высоких трофических уровнях организмов, включая человека, при пищеварении. Впоследствии эти события влекут за собой серьезные последствия для местной экономики, социально-экономической политики и общественногоздравоохранения2. Ущерб мировой экономике, наносимый ВЦВ, оценивается в миллионы-миллиарды долларов каждый год3. Чили является одной из многих стран, страдающих от частых ВЦВ.
Чили - страна длинной земли, простирающаяся более чем на 4 300 км к северу и югу. Вытянутая западная земля обращена к Тихому океану, что, естественно, увеличивает шансы Чили испытать ВЦВ. Особенно на юге Чили есть много всемирно известных лососевых аквакультур, и каждый раз, когда ВЦВ происходит в регионе, водорослевые токсины приводят к тому, что массово выращиваемый лосось заболевает и умирает4,5,6. В Чили годом, когда ВЦВ ударил по экономике сильнее всего, был 2016 год, с предполагаемым ежегодным убытком в 800 миллионов долларов США7,8. Возбудители токсичных видов водорослей варьируются в зависимости от года и местоположения. Для случая 2016 года комплекс Alexandrium catanella и Pseudochattonella verruclosa вызвал широкое распространение ВЦВ на большей части южного чилийского побережья7,8. Самый последний HAB в Чили произошел с возбудительным видом водорослей Heterosigma Akashiwo в марте 2021 года в Каманчаке, расположенной на юге Чили, где в этом районе есть большая лососевая ферма.
Чили на протяжении многих лет осуществляет мониторинг прибрежных районов с использованием двух основных методов; наблюдение за морской водой с помощью микроскопов для регулярной идентификации токсичных видов водорослей и измерение уровня токсинов в моллюсках с помощью биохимических анализов9. Раннее выявление токсичных водорослей и уровней токсинов в моллюсках не предотвращает появление ВЦВ; однако этот анализ может привести к немедленным контрмерам и уменьшить ущерб местным общинам. Для дальнейшего повышения эффективности этой стратегии к нашей обычной чилийской программе мониторинга ВЦВ был недавно добавлен молекулярный аналитический метод для обнаружения водорослей и связанных с ними бактериальных сообществ в пробах морской воды. В частности, был выбран метод массивного параллельного секвенирования с использованием метабаркодирования, который нацелен на гены 16S рРНК и 18S рРНК. Хотя этот метод требует сложных процедур и дорогостоящего оборудования и реагентов, это передовая технология, которая может одновременно обнаруживать тысячи родов / видов водорослей и бактерий, присутствующих в образце морской воды.
Предполагается, что причины ВЦВ различны, такие как температура и сезон, но обобщить их невозможно. Это связано с тем, что виды и частоты ВЦВ зависят от региона и пространственно-временных условий, включая природные явления, такие как географическая уникальность, перемешивание питательных веществ апвеллинга и сток элементов с суши из-за ошибки2,10,11,12. Кроме того, искусственные факторы, такие как эвтрофикация, влияют на локальные ВЦВ12,13. Из-за сложной многофакторности нелегко сделать точный прогноз ВЦВ. В последние годы существует мнение, что конкретные бактериальные популяции могут быть связаны с развитием ВЦВ в качестве одного из факторов, и исследования в поддержку этой гипотезы становятся все болееочевидными 14,15,16,17,18. Методы молекулярной биологии обычно используются для изучения бактериальной сборки; однако такой стандартизированный метод еще не установлен в чилийском мониторинге ВЦВ9. Для изучения водорослево-бактериальной связи с ВЦВ необходимо одновременно выполнить анализ метабаркодирования для текущих чилийских программ мониторинга прибрежных районов. Таким образом, этот протокол визуально вводит нашу чилийскую программу мониторинга ВЦВ, фокусируясь на поэтапной процедуре анализа обнаружения видов водорослей и бактерий в пробах морской воды с использованием анализа метабаркодирования.
Полный протокол, описывающий нашу чилийскую программу мониторинга ВЦВ, доступен в Yarimizu et al.9. Он включает в себя процедуры отбора проб морской воды, микроскопического обнаружения видов водорослей, обнаружения генов водорослей и бактерий, анализа пигментов, сбора метеорологических данных и физических и химических анализов свойств воды. Поэтапный протокол анализа метабаркодирования 16S рРНК и 18S рРНК для обнаружения видов водорослей и бактерий доступен в виде препринта19. Этот протокол демонстрирует, в частности, этапы анализа метабаркодирования, поскольку это самая сложная часть и изюминка нашей программы мониторинга HAB. Этот протокол также включает в себя введение программы и микроскопическое обнаружение видов водорослей. При анализе видов водорослей методом метабаркодирования крайне важно одновременно выполнить микроскопию для проверки результатов двух методов. Этот протокол не включает в себя способ использования программного обеспечения для назначения таксономии, но рекомендации по базе данных кратко изложены в конце следующего раздела.
Protocol
1. Отбор проб и предварительная обработка
- Соберите примерно 3 л пробы воды из целевого места.
- Фильтруйте 1 л образца воды для анализа 16S рРНК через тандемную фильтрацию (мембрана размером с поры 1 мкм и 0,2 мкм) для разделения свободноживущих и прикрепленных бактерий.
- Отфильтруйте еще 1 л образца воды для анализа 18S-рРНК (обнаружение фитопланктона) через одну фильтрацию с мембраной 0,2 мкм.
ПРИМЕЧАНИЕ: Фильтрация пробы воды должна быть завершена в течение 12 ч после отбора проб. - Разрежьте фильтрованную мембрану пополам стерильными хирургическими ножницами и оберните ее алюминиевой фольгой. Хранить при -20 °C до 1 месяца или перейти к следующему шагу.
- Экстракция ДНК методом Chelex, как описано9. Хранить при -20 °C до 1 месяца.
2. Микроскопический анализ
- Переложите 1 мл пробы воды пипеткой на сетку-слайд объемом 1 мл.
- Понаблюдайте за образцом под микроскопом.
- Рекордные названия и количество видов фитопланктона.
3. Анализ метабаркодирования 16S рРНК и 18S рРНК
ПРИМЕЧАНИЕ: Этот процесс состоит из семи разделов: подготовка, генерация первого ампликона ПЦР, очистка первого ампликона, индексация второй ПЦР, проверка и очистка второго ампликона ПЦР, корректировка концентрации ДНК, а также денатурация и секвенирование ДНК. Весь процесс занимает не менее 5 дней (40 часов) опытного персонала лаборатории. Смотрите Таблицу материалов для номеров продуктов и производителей.
- Подготовка
- Очищайте пипетки и ламинарный шкаф с 70% этанолом с последующим воздействием ультрафиолета в течение 30 минут. Стерилизуйте используемые материалы.
- Разморозить образцы ДНК при комнатной температуре, центрифугировать при 100 х г в течение 2 мин и перенести 100 мкл каждого образца супернатанта в 8-пробирные полоски.
- Первое поколение ПЦР-ампликонов
ПРИМЕЧАНИЕ: Выполните следующие процедуры в ламинарной вытяжке. Всегда разбавляйте грунтовки от 1 мкМ до целевой концентрации водой класса ПЦР, чтобы избежать загрязнения грунтовки.- Готовят первую мастер-смесь ПЦР в стерильной пробирке объемом 1,5 мл для реакций(таблица 1, таблица 2).
- Aliquot 22,5 мкл мастер-микса в 8-пробирной полоске и добавляют 2,5 мкл образца ДНК. Используйте 2,5 мкл воды класса ПЦР для отрицательного контроля.
- Запустите первый цикл ПЦР(таблица 3).
- Приготовьте 100 мл 2% геля Агароза-ТБЭ, содержащего 10 мкл 1x гелевого пятна нуклеиновой кислоты.
- Загрузить смесь из 1,5 мкл 1x ДНК-нагрузочного красителя и 4 мкл продукта ПЦР на агарозный гель. Кроме того, загрузите лестницу ДНК 100 bp на гель.
- Выполняют электрофорез при 100 В в течение 30 мин.
- Убедитесь, что под захватом ультрафиолетового излучения есть полоса в диапазоне 500-600 bp. Грунтовочно-димерная полоса круглая 80 bp.
ПРИМЕЧАНИЕ: Образцы морской воды содержат ингибиторы ПЦР. Недостающие ампликоны иногда могут быть решены путем разбавления образцов 1:100 или 1:1000 водой класса ПЦР. - Храните первые продукты ПЦР при -20 °C до следующего шага.
ВНИМАНИЕ: Не превышайте одной недели хранения.
- Первая очистка ампликона ПЦР
ПРИМЕЧАНИЕ: Эта секция может быть выполнена вне ламинарного шкафа вытяжки.- Используйте систему очистки ДНК магнитных шариков для удаления остатков реакции ПЦР, включая праймерно-димерные продукты.
- Перенесите 20 мкл каждого очищенного первого продукта ПЦР на новую пластину из 96 скважин. Запечатайте пластину микрогерметичной пленкой. Хранить при -20 °C до следующего шага.
ВНИМАНИЕ: Не превышайте срок хранения более одной недели.
- Индексация по второй ПЦР
ПРИМЕЧАНИЕ: В этом разделе очищенные продукты первой ПЦР будут усилены различными комбинациями индексных праймеров.- Разбавить все праймеры Index 1 и Index 2(Таблица 4)до 1 мкМ водой класса ПЦР в 8 пробирках ПЦР-полосок, помещенных в ламинарный шкаф.
ПРИМЕЧАНИЕ: Шаги, описанные в данном разделе, могут быть выполнены вне ламинарного шкафа, так как индексные праймеры специфичны для первого адаптера навеса реакций ПЦР. - Положение Индекс 1 грунтовка в горизонтальной строке Индекс 2 грунтовки в вертикальной строке (Таблица 5).
- В новой плите из 96 скважин добавьте в каждую скважину 12,5 мкл готовой к горячему запуску рецептуры.
- Добавьте 2,5 мкл каждого индексного праймера (1 мкМ) к каждой скважине, как в таблице 4, используя многоканальную пипетку.
- Добавьте 7,5 мкл очищенного первого продукта ПЦР.
- Аккуратно перемешайте, пипеткой вверх и вниз 10 раз. Накройте пластину микрогерметичной пленкой.
- Запустите второй цикл ПЦР(таблица 3).
- Держите пластину при температуре -20 °C.
ВНИМАНИЕ: Не превышайте одной недели хранения.
- Разбавить все праймеры Index 1 и Index 2(Таблица 4)до 1 мкМ водой класса ПЦР в 8 пробирках ПЦР-полосок, помещенных в ламинарный шкаф.
- Проверка и очистка второго ампликона ПЦР
- Используйте анализатор фрагментов и связанный с ним реагент. Вихрь и реагент перед использованием.
- Позвольте буферу образца и ленте ДНК-экрана уравновеситься при комнатной температуре в течение 30 минут. Затем поместите экранную ленту ДНК в анализатор фрагментов.
- Смешайте 2 мкл буфера образца и 3 мкл второго ампликона ПЦР в новых 8 полосках пробирки. Вставьте 8 полосок трубки в анализатор фрагментов. Нажмите Выполнить, чтобы начать.
ВНИМАНИЕ: Следует избегать образования пузырьков воздуха. - Убедитесь, что вторые ампликоны ПЦР составляют приблизительно 613 bp (600 - 630 bp) для генов 16S и 18S рРНК.
- Очистите вторые продукты ПЦР с помощью магнитной системы очистки ДНК шариков.
- Регулировка концентрации ДНК
- Измерьте концентрацию ДНК в очищенных вторых продуктах ПЦР с помощью спектрофотометра количественной оценки нуклеиновых кислот.
- Рассчитайте концентрацию целевого гена в nM, учитывая средний конечный размер библиотеки как 613 bp для генов 16S и 18S рРНК:
- Разбавьте каждый очищенный второй продукт ПЦР стерильной ПЦР-водой до 4 нМ в новой 96-луночной пластине объемом 0,2 мл.
ПРИМЕЧАНИЕ: Пластина может храниться при -20 °C здесь. В противном случае остальные процедуры должны выполняться без остановки. - Aliquot 3 мкл каждого 4 нМ второго продукта ПЦР и смешайте все в новой стерильной трубке 1,5 мл в виде объединенной библиотеки. Держите трубку при температуре 4 °C или на ледяной ванне в любое время.
- Измерьте концентрацию объединенной библиотеки для подтверждения с помощью спектрофотометра количественной оценки нуклеиновых кислот. Отрегулируйте концентрацию до 4 нМ, если она выше 4 нМ.
ПРИМЕЧАНИЕ: Чрезмерно концентрированная ДНК приводит к завышенным цифрам считывания, затрудняя анализ.
- Денатурация и секвенирование ДНК
ПРИМЕЧАНИЕ: В этом разделе используется система Illumina MiSeq со специфическими реагентами. Смотрите номера продуктов в Таблице материалов.
ПРИМЕЧАНИЕ: Строго соблюдайте время. Разморозьте все реагенты, кроме картриджей, в день секвенирования.- За сутки до секвенирования извлеките предварительно заполненный готовый к использованию картридж с реагентами от -20 °C и храните при 4 °C для размораживания.
- Установите тепловой блок, подходящий для 1,5 мл центрифужных трубок до 96 °C.
- Поместите буфер гибридизации на лед.
- Разбавить молекулярный класс NaOH от 1 Н до 0,2 Н в новой пробирке водой класса ПЦР.
- Разбавьте готовую к использованию управляющую библиотеку буфером TE (pH 8.0) от 10 нМ до 4 нМ в новой трубке (т.е. 2 мкл управляющей библиотеки + 3 мкл буфера TE).
- Смешайте 16 мкл объединенной библиотеки образцов 4 нМ с контрольной библиотекой 4 мкл 4 нМ в новой трубке с маркировкой «1».
- Смешайте 10 мкл образца в пробирке "1" с 10 мкл 0,2 Н NaOH в новой пробирке с маркировкой "2".
- Вихрь трубки 2 в течение 5 с, ненадолго вращайтесь вниз и насиживайте при комнатной температуре в течение 5 мин.
- Добавьте 980 мкл буфера гибридизации в трубку 2.
- В новой пробирке с маркировкой «3» смешайте 260 мкл образца из пробирки 2 с 390 мкл буфера гибридизации. Перемешайте, перевернув трубку.
- Инкубировать трубку 3 при 96 °C в течение 2 мин и сразу же поместить на лед максимум на 2 мин.
- Извлеките картридж из холодильника с температурой 4 °C.
- Настройте образец-лист для виртуализации с каждым соответствующим адаптером индекса 1 и индекса 2, как показано в таблице 6.
- Извлеките проточную ячейку из комплекта MiSeq v3. Аккуратно очистите проточную клетку стерильной ПЦР-водой молекулярного класса.
ПРИМЕЧАНИЕ: Не выливайте воду на капиллярные точки проточной ячейки. Аккуратно вытрите воду из проточной ячейки неволокнистой бумагой. - Загрузите в картридж весь объем трубки 3 (650 мкл).
- В программном обеспечении для работы с прибором выберите последовательность и следуйте инструкциям. Вставьте проточную ячейку, буфер включения и картридж. Загрузить образец-лист. Нажмите кнопку Выполнить, чтобы начать реакцию.
ПРИМЕЧАНИЕ: Этот запуск последовательности займет 3-5 дней. Данные будут автоматически загружены на платформу Basespace. Необработанные данные будут храниться в двух папках на компьютере: папка Analysis, содержащая файлы fastq, и Output, содержащая файлы bcl и изображения jpeg.
4.Таксономическое присвоение данным секвенирования
- Обработка файлов FASTQ
ПРИМЕЧАНИЕ: Пакет DADA223 из R24 является одной из рекомендуемых баз данных для обработки файлов FASTQ. С руководящими принципами можно ознакомиться по адресу [https://github.com/mickeykawai/exec_dada2]. Это руководство было подготовлено путем принятия последней версии учебника по конвейеру DADA2 [https://benjjneb.github.io/dada2/tutorial.html].- Обрабатывайте необработанные парные конечные последовательности FASTQ для обрезки, фильтрации качества, дерепликации и подсчета уникальных последовательностей, вывода образцов, слияния в контиги и удаления химерных последовательностей.
- Используйте следующие параметры, заданные DADA2, как для фрагментов гена 16S рРНК, так и для фрагментов гена 18S рРНК; trimLefts=0, 0, truncLens=[Проверьте качество последовательности и установите для нее соответствующую длину].
ПРИМЕЧАНИЕ: Значения по умолчанию для других параметров: maxN=0, maxEE=2,2, trancQ=2.
- Назначение таксономии
ПРИМЕЧАНИЕ: База данных SILVA rRNA рекомендуется для назначения таксономии для DADA2 [silva_nr_v132_train_set.fa.gz установлена по умолчанию].- Удалите хлоропласт и митохондриальные ОТУ для анализа фрагмента гена 16S рРНК. Удалить синглтоны из анализа 16S рРНК и 18S рРНК.
- Сократите все образцы до равномерной глубины секвенирования на основе образца, имеющего самую низкую глубину секвенирования.
- Запишите количество считываний, назначенные OTT и на каком уровне, отфильтрованные чтения и количество исключенных синглтонов.
- Статистический анализ
- Выполните статистический анализ микробных данных с использованием R-пакетов phyloseq25 и vegan26.
Representative Results
Этот протокол использует анализ метабаркодирования гена 18S рРНК для идентификации видов водорослей в образцах морской воды. Репрезентативный результат показан на рисунке 1,в котором морская вода, собранная из Метри, Пуэрто-Монт, Чили (−41,597; −72,7056) 19 февраля 2019 года, была проанализирована с помощью этого протокола. Результат показал в общей сложности 13 750 считываний с более чем 30 видами водорослей в образце морской воды. Доминирующей водорослью в этом образце была Navicula spp. с относительной численностью 70,77%. Кроме того, достаточное изобилие наблюдалось для Micromonas (6,40%), Chaetoceros spp. (4,44%), Scripsiella spp. (2,44%) и Prorocentrum spp. (1.28%). Pseudochattonella spp.,один из самых токсичных водорослевых возбудителей чилийской ВЦВ, был обнаружен с 0,52% из этого образца морской воды.
Чтобы проверить достоверность данных, виды водорослей, идентифицированные анализом гена 18S рРНК, сравнивали с теми, которые были получены путем микроскопии в том же образце морскойводы (рисунок 2). В соответствии с анализом гена 18S рРНК, микроскопия показала, что доминирующим видом был Navicula spp. с относительной численностью 74,1% и Prorocentrum spp. (0,60%) как второстепенный вид. И наоборот, Heterocapsa spp. (9,04%), задокументированная из микроскопических наблюдений, не была идентифицирована анализом гена 18S рРНК в этом образце. Было 12,6% мелких клеток вокруг неидентифицируемого фитопланктона, зарегистрированных микроскопией. Это может быть Микромонаса,согласно результатам 18S рРНК.
Протокол использует анализ метабаркодирования гена 16S рРНК для идентификации видов бактерий в образцах морской воды. Репрезентативный результат показан на рисунке 3,в котором та же морская вода, которая использовалась для анализа гена 18S рРНК, была проанализирована с помощью анализа гена 16S рРНК. Результат показал в общей сложности 31 758 считываний с более чем 30 видами бактерий в образце морской воды. Следует отметить, что этот образец морской воды пропускался через тандемные фильтрующие мембраны (размеры пор 1 мкм и 0,2 мкм) для отделения свободноживущих бактерий от прикрепленных бактерий. Затем клетки, захваченные каждой фильтрующей мембраной, обрабатывали для экстракции ДНК, а затем анализ гена 16S рРНК. Репрезентативный результат на рисунке 3 показывает виды бактерий, идентифицированные из мембраны пор размером 0,2 мкм, которые определяются как свободноживущие бактерии. Доминирующими свободноживущими бактериями были Amylibacter spp. с относительной численностью 20,02%, за которыми следовали Clade Ia (13,53%) и Aligiphilus spp. (7.06%). Остальные виды бактерий, обнаруженные из этого образца морской воды, были относительно равномерно распределены. Такой же анализ может быть сделан для клеток, захваченных мембраной размером с пору размером 1 мкм, в качестве обнаружения видов прикрепленных бактерий.
Когда эти анализы метабаркодирования выполняются в запланированных временных точках в течение определенного периода исследования, результаты могут быть обобщены в виде анализа временных рядов. Один из способов сделать это - построить график относительного изобилия конкретных видов водорослей и бактерий в зависимости от времени, чтобы найти уникальную модель роста. На рисунке 4 показан репрезентативный график временных рядов Александриума и Псевдохаттонелла в Метри, Чили. Другим способом обобщения анализа метабаркодирования временных рядов является построение всех идентифицированных водорослей и бактерий как функции времени, представляющей изменение популяции определенных групп организмов. На рисунке 5 и рисунке 6 обобщена относительная численность всех бактериальных родов и отрядов, соответственно, которые обнаруживаются из морской воды Метри в течение пяти месяцев.
Таблица 1: Содержание первого мастер-микса ПЦР: В таблице показано содержание основной смеси на реакцию для анализа 16S рРНК и 18S рРНК. Последовательности праймеров перечислены в таблице 3. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эту таблицу.
Таблица 2: Последовательности праймеров: Праймеры для первой ПЦР перечислены для анализа 16S рРНК и 18S рРНК. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эту таблицу.
Таблица 3: Циклы ПЦР: Перечислены тепловые циклы для первой ПЦР и второй ПЦР. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эту таблицу.
Таблица 4: Индексные последовательности: Перечислены праймеры по индексу 1 (i7) и индексу 2 (i5), которые будут использоваться для второй ПЦР. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эту таблицу.
Таблица 5: Пример позиционирования Индекса 1 и Индекса 2: Для уменьшения погрешности индексные грунтовки необходимо сначала поместить в положение, а аликвоту каждой перенести на 96-луночную пластину с помощью многоканальной пипетки. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эту таблицу.
Таблица 6: Пример образца листа: Перед виртуализацией необходимо создать образец листа, соответствующий адаптерам индекса 1 и индекса 2. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эту таблицу.
Рисунок 1:Репрезентативный результат анализа метакоркодирования 18S рРНК: Виды водорослей, присутствующие в образце морской воды, собранном из Метри, Лос-Лагос, Чили 19 февраля 2019 года, были идентифицированы с помощью анализа метабаркодирования 18S рРНК. Последовательности, назначенные «неизвестными», были исключены, и было нанесено относительное изобилие каждого идентифицированного вида. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2:Репрезентативный результат микроскопического анализа: Виды водорослей были идентифицированы из образца воды из Метри, Лос-Лагос, Чили, 19 февраля 2019 года, с помощью микроскопии. Количество каждого вида подсчитывалось вручную и наносилось на график. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3:Репрезентативный результат анализа метабаркодирования 16S рРНК: Бактериальные виды, присутствующие в образце воды из Метри, Лос-Лагос, Чили 19 февраля 2019 года, были идентифицированы с помощью анализа метабаркодирования 16S рРНК. Относительное изобилие каждого идентифицированного вида было построено на графике. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4:Репрезентативный график временных рядов Alexandrium spp. и Pseudochattonella spp., полученный из метабаркодирования 18S рРНК Metri, Чили: Рисунок перепечатан из Yarimizu et al9. Два токсичных вида водорослей, Alexandrium и Pseudochattonella, выборочно контролировались анализом 18S рРНК с течением времени, и относительное изобилие было построено в зависимости от точки времени. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 5:Репрезентативный график временных рядов рода, полученный из метабаркодирования 16S рРНК и 18S рРНК: Все бактериальные и эукариотические роды, идентифицированные в воде Метри, Чили, контролируются в течение пяти месяцев. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 6:Репрезентативный график временных рядов порядка, полученный из метабаркодирования 16S рРНК и 18S рРНК: Все бактериальные и эукариотические порядки, идентифицированные в воде Метри, Чили, контролируются в течение пяти месяцев. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Таблица S1 и Таблица S2:
Таблица S1:Необработанные данные для рисунков 5 и 6. Таблица S2:Результат проверки качества на необработанных данных на рисунках 5 и 6. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эти таблицы.
Discussion
Этот протокол успешно выполнил анализ метабаркодирования гена 18S рРНК и 16S рРНК для идентификации видов водорослей и бактерий в образцах морской воды для мониторинга чилийских ВЦВ. Доминирующие водоросли и некоторые незначительные водоросли, обнаруженные по этому протоколу, соответствовали тем, которые были получены с помощью микроскопии, что подтверждает надежность протокола. Изюминкой протокола является то, что анализ обнаружил Alexandrium spp. и Pseudochattonella spp.,два наиболее проблемных вида, вызывающих ВЦВ на юге Чили, из морской воды Метри даже при низком изобилии. Особенно, Pseudochattonella spp. сложные виды для идентификации под микроскопом, потому что клетки малы и легко разрываются при свете или использовании фиксаторов27,28. Метабаркодирование может предоставить информацию о видах водорослей, которая едва присутствует в образцах морской воды, которые микроскопия не может идентифицировать. Протокол также обнаружил более 30 видов бактерий. Хотя на данный момент неизвестно, как эти бактерии связаны с ростом водорослей, массивный сбор данных о видах водорослей-бактерий в анализе временных рядов, возможно, обеспечит такие важные открытия. Таким образом, добавление анализа метабаркодирования к традиционным чилийским программам мониторинга ВЦВ, несомненно, повысит текущую эффективность мониторинга ВЦВ. Фактически, этот визуальный протокол для анализа метабаркодирования может быть полезен не только для мониторинга водорослей и бактерий чилийских вод, но и для программ мониторинга побережья в других районах, затронутых ВЦВ, во всем мире.
Хотя этот протокол обеспечивал вышеуказанные преимущества, недостатки метода должны быть обсуждены. Как видно из визуального протокола, метод метабаркодирования является трудоемким и сложным, требующим дорогостоящего оборудования и реагентов. Персонал лаборатории должен быть специально обучен, иначе он будет тратить материалы, труд и время. Кроме того, обнаружение водорослей методом метабаркодирования должно быть сопряжено с микроскопией, чтобы убедиться, что одни и те же доминирующие виды идентифицированы с помощью двух ортогональных методов29. Микроскопия является неинвазивным инструментом, по большей части, для идентификации видов водорослей, а это означает, что труднее ошибаться, когда виды водорослей имеют уникальные и кажущиеся формы. Конечно, человеческая ошибка может произойти, если виды имеют очень похожие формы друг на друга. С другой стороны, поскольку анализ метабаркодирования требует нескольких шагов, он, естественно, увеличивает количество ошибок. Это может быть перепутанный образец, неправильное добавление реагента или отсутствие некоторых процедур. Поэтому очень важно сравнивать результаты метабаркодирования с результатами, полученными с помощью микроскопии. Наконец, протокол применим только качественно, и результаты должны быть рассчитаны на относительное изобилие. Как заявили Lamb et al. в 2019 году, текущее метабаркодирование как количественная производительность по-прежнему ограничено, и необходимы дополнительные исследования, прежде чем метабаркодирование может быть уверенно использовано для количественных приложений30.
Этот протокол был оптимизирован для 140 - 170 образцов за прогон из руководства по подготовке библиотеки метагеномного секвенирования 16S, выпущенного Illumina Inc. Оптимизированный протокол был протестирован много раз и дополнительно модифицирован для выпуска этой окончательной версии. Поэтому настоятельно рекомендуется точно следовать каждому шагу. Наиболее важной частью протокола является то, что требуется дополнительная осторожность, чтобы избежать загрязнения образца. Пипетки и ламинарный вытяжка должны быть очищены 70% спиртом и воздействием ультрафиолета в любое время, а стерилизуемые материалы должны быть автоклавированы. Грунтовки и реагенты следует разбавлять непосредственно из запаса при каждом новом прогоне, иначе повторное использование реагентов и воздействие нескольких разбавлений могут быть причиной загрязнения образца. Протокол определяет, когда операция может быть выполнена вне ламинарной вытяжки. Если не указано иное, образцы должны обрабатываться в очищенной ламинарной вытяжке. При работе с несколькими 8-трубными полосами одновременно рекомендуется поработать над первой 8-трубной лентой и закрыть ее перед переходом на следующую 8-трубочную полосу. Оставление крышки открытой в течение длительного времени может привести к загрязнению образца, поскольку гены рРНК 16S и 18S очень распространены в окружающей среде. Указанное время, такое как время смешивания и время инкубации, должно соблюдаться так, как точно описано, потому что наилучшая продолжительность для каждого шага была выбрана на основе нескольких тестовых запусков. Избыточное или недостаточное время может, например, снизить выход пробы. Процесс должен быть остановлен только в той части, в которой протокол говорит, что он может остановиться. Крайне важно иметь отрицательный контроль, поскольку он подтверждает, что положительные результаты не являются искусственными ложными срабатываниями. Наконец, настоятельно рекомендуется планировать дни, потому что для обработки всех этапов требуется не менее пяти дней, а некоторые части не могут быть остановлены до следующего знака остановки.
Здесь кратко отмечается ограничение таксономического присвоения для секвенированных данных. Недавно обнаруженные нуклеотидные последовательности для бактериальных и водорослевых видов ежедневно обновляются в банке данных. В то время как хорошо изученные виды водорослей и бактерий зарегистрированы надежно, в банке данных также есть много последовательностей для неизвестных видов. Это указывает на то, что разрешение зарегистрированных нуклеотидных последовательностей не всегда достаточно для идентификации видов, а только для идентификации рода. Таким образом, микроскопическая идентификация видов должна быть выполнена ортогонально. Создание конвейера открытого доступа для этой работы имеет значительное преимущество в работе с большим набором последовательных данных одновременно и эффективном расследовании возникновения ошибки. Кроме того, выходные данные DADA2 находятся в текстовом или csv-файле, что упрощает дальнейший статистический анализ. С другой стороны, для выполнения таксономических назначений требуется большой сервер, особенно когда набор данных большой. Чтобы настроить конвейер, инженеры должны настроить конвейер, а профессионалы должны понимать параметры, работу, Linux и биоинформатику.
Помимо сферы применения в качестве инструмента мониторинга ВЦВ, использование этого протокола может быть расширено для целей следственных исследований. Например, продолжаются дебаты между чилийским правительством и местными рыбаками, а также ассоциациями по вопросам окружающей среды по вопросам мира по поводу увеличения числа местных ВЦВ31,32. Правительство утверждает, что это связано с природным явлением, таким как глобальное потепление и Эль-Ниньо, в то время как более поздние стороны утверждают, что причиной является аквакультура лосося. Лосось не является местным видом Чили и не был в чилийской воде полвека назад. Чилийское правительство в то время стремилось к росту экономики и созданию рабочих мест для бедных районов путем развития лососевого бизнеса33. Благодаря вмешательству из-за рубежа для получения прибыли от капитала Чили добилась больших успехов в развитии аквакультуры в стиле пера, и количество лосося значительно увеличилось за последние несколько десятилетий31,32,33. Впоследствии большое количество пищи для лосося было выброшено в море, что заставило местных жителей заподозрить, что аквакультура лосося является причиной частых местных ВЦВ31,32. Правда сейчас неизвестна, но в конечном итоге ее необходимо понять, чтобы можно было разработать стратегии защиты местной морской среды, экономики и здоровья человека от ВЦВ. Молекулярный анализ местной взаимосвязи водорослей и бактерий может способствовать дальнейшему прояснению для такого субъекта. Например, метод может искать водоросли и бактериальные виды, которые ранее не присутствовали в целевой океанической области, но резко возросли в последние годы, что несколько похоже на исследование, проведенное Sakai et al. для обнаружения незарегистрированной популяции саламандры Ямато(Hynobius vandenburghi)с помощью анализа ГИС и эДНК34. Таким образом, помимо инструмента мониторинга HAB, этот протокол метабаркодирования имеет потенциальное использование для других перспектив.
Disclosures
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов. Спонсоры не играли никакой роли в разработке исследования, в сборе, анализе или интерпретации данных; в написании рукописи или в решении о публикации результатов.
Acknowledgments
Это исследование было поддержано грантом (JPMJSA1705) для исследования Научно-технического исследовательского партнерства по устойчивому развитию и мониторингу водорослей в Чили (SATREPS-MACH). Мы благодарим д-ра Сандру Риос (Университет Лос-Лагоса) за то, что она позволила нам использовать видеоклип. Мы благодарим Нила Эндрю Холланда за его усердную корректуру рукописи. Мы выражаем нашу искреннюю признательность членам лабораторной группы CREAN-IFOP в Пуэрто-Монтте, Чили, за консультирование нас по вопросам идентификации фитопланктона.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL single tube | ThermoFisher | Q32856 | sterile |
| 1.5 mL tubes | ThermoFisher | 2150N | sterile |
| 8-strip 0.2 mL PCR tubes and flat cap | ThermoFisher | AB0451 & 4323032 | sterile |
| 96-well 0.2 mL PCR plate | ThermoFisher | N8010560 | |
| AccuRuler 100 bp DNA Ladder | MaestroGen | 02001-500 | |
| Chelex 100 Chelating Resin | Bio-Rad | 1432832 | |
| Chemical Duty Vacuum Pressure Pump | MilliporeSigma | WP6122050 | |
| D1000 Reagents | Agilent Technologies | 5067-5583 | |
| D1000 sample buffer | Agilent Technologies | 5067-5602 | |
| DNA loading dye (Blue/Orange Loading Dye 6X) | Promega | G1881 | |
| Ethanol Molecular Biology Grade | E7023 | Merck KGaA | |
| Filtration device | ThermoFisher | 09-740-36H, 09-740-23E | |
| Fluorescent DNA concentration measurement kit (Qubit dsDNA HS Assay kit) | Thermo Fisher Scientific | Q32851 | |
| Fluorometer (Qubit4 Fluorometer) | ThermoFisher | Q33238 | |
| Fragment analysis verification matrix (D1000 ScreenTape) | Agilent Technologies | 5067-5582 | |
| Fragment Analyzer (Agilent Tapestation 4150) | Agilent | G2992AA | |
| GelRed Nucleic Acid Gel Stain | Biotium | 41002 | |
| Generic bench vortexer (Vortex Genie 2) | Scientific Industries | SI-0236 | |
| Heat block | |||
| High performance sequencing-grade DNA polymerase (KAPA HiFi Hotstart ReadyMix), 2X | Roche | KK2602 | |
| HT1 Hybridization buffer | Illumina | 20015892 | |
| Illumina Nextera XT v2 Index Kit set A, B, C and D | Illumina | FC-131-2001, -2002, -2003, -2004 | |
| Laminar hood cabinet | Biobase Co. | Biobase PCR-800 PCR Cabinet | |
| Loading tips (Specific for Agilent TapeStation systems) | Agilent Technologies | 5067-5598 | |
| Magnetic beads DNA cleanup system (ProNex® Size-Selective Purification System) | Promega | NG2002 | |
| Magnetic stand for 96 wells (Magnetic Stand-96) | ThermoFisher | AM10027 | |
| Micro-seal film for 96-well plate | ThermoFisher | 4311971 | sterile |
| MiSeq Reagent Kit v3 | Illumina | MS-102-3003 | includes pre-filled, ready-to-use reagent cartridges. |
| MiSeq system | Illumina | SY-410-1003 | includes pre-installed software |
| Molecular grade nuclease-free water | Integrated DNA Technologies | 11-05-01-04 | |
| Molecular grade sodium hydroxide (NaOH) 1M | Merck KGaA | 1091371000 | |
| Multichannel pipettes | Not specified | Not specified | |
| Multi-Purpose Agarose | Cleaver Scientific | CSL-AG500 | |
| Ow D2 Wide-Gel Electrophoresis System | ThermoFisher | D2 | |
| Ow EC-105 Compact Power Supply | ThermoFisher | 105ECA-115 | |
| Pellet Pestle— Cordless Motor | ThermoFisher | K749540-0000 | |
| PhiX control Kit v3 | Illumina | FC-110-300 | ready-to-use control library for Illumina sequencing |
| Pipette tips | Not specified | Not specified | sterile |
| Pipettes | Not specified | Not specified | 2, 10, 20, 100, 1000 μL |
| SterivexTM GP 0.22 μm filter unit | MilliporeSigma | SVGP01050 | |
| Tabletop centrifuge | Eppendorf 5427R Centrifuge | Eppendorf AG | |
| TBE buffer | ThermoFisher | B52 | |
| TE buffer (pH 8.0) | ThermoFisher | AM9849 | |
| Terr PCR Direct FFPE Kit | Takara Bio USA | 639284 | includes 2X Terra PCR Direct Buffer |
| Terra PCR Direct Polymerase Mix, 1.25 U/μL | Takara Bio USA | 639271 | High performance Inhibitor-tolerant DNA polymerase |
| ThermalCycler (MiniAMP Plus Thermal Cycler) | ThermoFisher | A37835 | |
| TransIlluminator and image capture system | Analytik Jena, AG | GelDoc-ItTS2 Imager | |
| Whatman 1.0 m pore-sized membrane | MilliporeSigma | WHA111110 |
References
- Hallegraeff, G., Enevoldsen, H., Zingone, A. Global harmful algal bloom status reporting. Harmful Algae. 102, 101992 (2021).
- Anderson, D. M.
- Sanseverino, I., Conduto, A. D. S., Pozzoli, L., Dobricic, S., Lettieri, T. Algal Bloom and its Economic Impact. , Publications Office of the European Union. (2016).
- Molinet, C., Niklitschek, E., Seguel, M., Díaz, P. Trends of natural accumulation and detoxification of paralytic shellfish poison in two bivalves from the Norwest Patagonian inland sea. Revista de Biologia Marina Y Oceanografia. 45, 195-204 (2010).
- Mardones, J., Clement, A., Rojas, X., Aparicio, C. Alexandrium catenella during 2009 in Chilean waters, and recent expansion to coastal ocean. Harmful Algae News. 41, 8-9 (2010).
- Alvarez, G., et al. Paralytic shellfish toxins in surf clams Mesodesma donacium during a large bloom of Alexandrium catenella dinoflagellates associated to an intense shellfish mass mortality. Toxins (Basel). 11 (4), (2019).
- Clément, A., et al. Exceptional summer conditions and HABs of Pseudochattonella in Southern Chile create record impacts on salmon farms. Harmful Algae News. 53, 1-3 (2016).
- Trainer, V. L., et al. Pelagic harmful algal blooms and climate change: Lessons from nature's experiments with extremes. Harmful Algae. 91, 101591 (2020).
- Yarimizu, K., et al. Protocols for monitoring harmful algal blooms for sustainable aquaculture and coastal fisheries in Chile. International Journal of Environmental Research and Public Health. 17 (20), (2020).
- Roegner, G. C., Hickey, B. M., Newton, J. A., Shanks, A. L., Armstrong, D. A. Wind-induced plume and bloom intrusions into Willapa Bay, Washington. Limnology & Oceanography. 47 (4), 1033-1042 (2002).
- Tweddle, J. F., et al. Relationships among upwelling, phytoplankton blooms, and phycotoxins in coastal Oregon shellfish. Marine Ecology Progress Series. 405, 131-145 (2010).
- Glibert, P. M., Anderson, D. M., Gentien, P., Graneli, E., Sellner, K. G. The global complex phenomena of harmful algae blooms. Oceanography. 18 (2), 130-141 (2005).
- Paredes-Mella, J., Varela, D., Fernández, P., Espinoza-González, O. Growth performance of Alexandrium catenella from the Chilean fjords under different environmental drivers: Plasticity as a response to a highly variable environment. Journal of Plankton Research. 42 (2), 119-134 (2020).
- Azam, F., Malfatti, F.
- Amin, S. A., et al. Interaction and signaling between a cosmopolitan phytoplankton and associated bacteria. Nature. 522, 98-101 (2015).
- Berdalet, E., et al. Marine harmful algal blooms, human health, and wellbeing: Challenges and opportunities in the 21st century. Journal of Marine Biology Association. 2015, U. K. 1-31 (2015).
- Ramanan, R., Kim, B. -H., Cho, D. -H., Oh, H. -M., Kim, H. -S. Algae-bacteria interactions: Evolution, ecology, and emerging applications. Biotechnology Advances. 34 (1), 14-29 (2016).
- Seymour, J. R., Amin, S. A., Raina, J. B., Stocker, R. Zooming in on the phycosphere: The ecological interface for phytoplankton-bacteria relationships. Nature Reviews Microbiology. 2, 17065 (2017).
- Maruyama, F., et al. 16S and 18S Metabarcoding analysis for Chilean coastal waters harmful algal blooms. protocol.io. , (2020).
- Tanabe, A. S., et al. Comparative study of the validity of three regions of the 18S-rRNA gene for massively parallel sequencing-based monitoring of the planktonic eukaryote community. Molecular Ecology Resources. 16, 402-414 (2016).
- Nishitani, G., et al. Multiple plastids collected by the Dinoflagellate Dinophysis mitra through Kleptoplastidy. Applied and Environmental Microbiology. 78 (3), 813-821 (2012).
- Klindworth, A., et al. Evaluation of general 16S ribosomal RNA gene PCR primers for classical and next-generation sequencing-based diversity studies. Nucleic Acids Research. 41 (1), 1 (2013).
- Callahan, B. J., et al. DADA2: High-resolution sample inference from Illumina amplicon data. Nature Methods. 13 (7), 581-583 (2016).
- R, R Team DCore. R: A language and environment for statistical computing. R Foundation for Statistical Computing. , Vienna, Austria. Available from: http://www.R-project.org (2007).
- McMurdie, P. J., Holmes, S. phyloseq: An R Package for Reproducible Interactive Analysis and Graphics of Microbiome Census Data. PLoS One. 8 (4), 61217 (2013).
- Dixon, P. VEGAN, a package of R functions for community ecology. Journal of Vegetation Science. 14 (6), 927-930 (2003).
- Dittami, S. M., Riisberg, I., Edvardsen, B. Molecular probes for the detection and identification of ichthyotoxic marine microalgae of the genus Pseudochattonella (Dictyochophyceae, Ochrophyta). Environmental Science and Pollution Research. 20 (10), 6824-6837 (2013).
- Mardones, J. I., et al. Salinity-growth response and ichthyotoxic potency of the Chilean Pseudochattonella verruculosa. Frontiers in Marine Science. 6 (24), (2019).
- Santi, I., Kasapidis, P., Karakassis, I., Pitta, P. A comparison of DNA metabarcoding and microscopy methodologies for the study of aquatic microbial eukaryotes. Diversity. 13 (5), 180 (2021).
- Lamb, P. D., et al. How quantitative is metabarcoding: A meta-analytical approach. Molecular Ecology. 28 (2), 420-430 (2019).
- Mascareño, A., et al. Controversies in social-ecological systems: lessons from a major red tide crisis on Chiloe Island, Chile. Ecology and Society. 23, (2018).
- Armijo, J., Oerder, V., Auger, P. -A., Bravo, A., Molina, E. The 2016 red tide crisis in southern Chile: Possible influence of the mass oceanic dumping of dead salmons. Marine Pollution Bulletin. 150, 110603 (2020).
- Swanson, H. A. Caught in Comparisons: Japanese Salmon in an Uneven World. , University of California, Santa Cruz. Doctor of Phylosophy thesis (2013).
- Sakai, Y., et al. Discovery of an unrecorded population of Yamato salamander (Hynobius vandenburghi) by GIS and eDNA analysis. Environmental DNA. 1 (3), 281-289 (2019).
