Иммунофлуоресценция, очистка и многофотонная микроскопия цельных яичников для количественного 3D-анализа развивающегося овариального резерва у мышей

Summary

Здесь мы представляем оптимизированный протокол для визуализации целых яичников для количественного и качественного анализа с использованием полноразмерного иммуноокрашивания, многофотонной микроскопии и 3D-визуализации и анализа. Этот протокол обеспечивает высокопроизводительную, надежную и повторяемую обработку, которая применима для токсикологии, клинической диагностики и геномных анализов функции яичников.

Abstract

Женская фертильность и репродуктивная продолжительность жизни зависят от качества и количества ооцитарного резерва яичников. По оценкам, 80% женских половых клеток, входящих в мейотическую профазу I, устраняются во время истощения ооцитов плода (FOA) и первой недели послеродовой жизни. Три основных механизма регулируют количество ооцитов, которые выживают во время развития и устанавливают овариальный резерв у самок, вступающих в период полового созревания. В первой волне потери ооцитов 30-50% ооцитов элиминируются во время ранней FOA, явление, которое объясняется высокой экспрессией long interspersed nuclear element-1 (LINE-1). Второй волной потери ооцитов является устранение ооцитов с мейотическими дефектами контрольной точкой мейотического качества. Третья волна потери ооцитов происходит перинатально во время формирования первичного фолликула, когда некоторые ооциты не образуют фолликулов. Остается неясным, что регулирует каждую из этих трех волн потери ооцитов и как они формируют овариальный резерв у мышей или людей.

Иммунофлуоресценция и 3D-визуализация открыли новый путь для изображения и анализа развития ооцитов в контексте всего яичника, а не в менее информативных 2D-разделах. В этой статье представлен комплексный протокол для иммуноокрашивания и оптической очистки всего яичника, дающий подготовку к визуализации с использованием многофотонной микроскопии и 3D-моделирования с использованием коммерчески доступного программного обеспечения. Он показывает, как этот метод может быть использован для отображения динамики истощения ооцитов во время развития яичников у мышей C57BL/6J и количественной оценки потери ооцитов во время трех волн элиминации ооцитов. Этот протокол может быть применен к пренатальным и ранним постнатальным яичникам для визуализации и количественной оценки ооцитов, а также к другим количественным подходам. Важно отметить, что протокол был стратегически разработан для обеспечения высокопроизводительной, надежной и повторяемой обработки, которая может удовлетворить потребности в токсикологии, клинической диагностике и геномных анализах функции яичников.

Introduction

Большинство самок млекопитающих рождаются с конечным числом мейотически остановленных ооцитов, хранящихся в первичных фолликулах, составляющих овариальный резерв (OR)^1,2. ОПЕРАЦИОНН определяет общую продолжительность репродуктивной жизни и здоровье женщин³. ОПЕРАЦИОНН обычно уменьшается в размерах со старением и может быть преждевременно истощена при воздействии определенных генотоксических агентов (лучевая / химиотерапия) и экологических стрессов (недоедание), что приводит к бесплодию ^4,5,6. Идиопатическое женское бесплодие часто можно отнести к генетическому и физиологическому качеству яйцеклеток, развивающихся из ОПЕРАЦИОННОЙ и остающихся плохо изученными ^7,8. Поскольку эндаумент женских фолликулов в значительной степени предопределен рождением, важно понимать регуляторные механизмы, участвующие в создании и поддержании ОПЕРАЦИОННОЙ.

У мышей образование ОР начинается со спецификации первичных половых клеток (ПГК) вокруг эмбрионального дня (E) 7,5². PGC мигрируют в генитальные гребни, где они будут проживать примерно по E10.5⁹. Следующая обширная пролиферация происходит с неполным цитокинезом, что приводит к образованию кист, которые будут разрушены позже в развитии^10,11. Примерно при Е12,5 определяется пол гонад, и пролиферация PGC останавливается в яичниках. У женщин ПГК, в настоящее время ооциты, вводят мейотическую профазу I (MPI) примерно по E13,5^12,13. Ооциты прогрессируют через расширенный MPI и остановку на стадии диктиата во время рождения. В течение первой недели после рождения каждая арестованная яйцеклетка окружена гранулезными клетками, тем самым образуя примордиальный фолликул.

Количество первичных фолликулов в ОШ самки зависит от того, сколько ооцитов пережило волны элиминации ооцитов, возникающие до и во время остановки MPI через апоптоз, аутофагию или некроз^14,15. Первая волна возникает во время внутриутробного развития и известна как FOA. FOA - это эволюционно сохраненный процесс у самок (млекопитающих и немлекопитающих), в результате которого, по оценкам, 50-80% ооцитов удаляются в зависимости от женских видов 16,17,18,19. У мышей FOA происходит во время E15.5 до E18.5 и приписывается реактивации и экспрессии ретротранспозонных последовательностей LINE-1, вызывающих гибель ооцитов ^20,21. Вторая волна элиминации ооцитов происходит через мейотическую контрольную точку, которая устраняет ооциты с мейотическими дефектами, такими как невосстановленные двухцепочечные разрывы ДНК (DSBs)^22,23. Следующая волна элиминации ооцитов происходит во время распада кисты, кульминацией которой является образование примордиальных фолликулов, каждый из которых содержит единую яйцеклетку 10,11,24,25.

У мышей резерв примордиальных фолликулов в значительной степени устанавливается половым созреванием, после чего он уменьшается по мере активации первичных фолликулов для роста во время регулярных репродуктивных циклов. Размер ОПЕРАЦИОННОЙ варьируется среди отдельных женщин и среди различных генетических штаммов мышей; тем не менее, генетическая регуляция размера ОР не совсем понятна ^26,27,28,29. Генетическим исследованиям регуляции ОР препятствует отсутствие стандартизированных протоколов изучения волн элиминации ооцитов во время пренатального и постнатального развития. На мышах было разработано несколько методологий количественной оценки ооцитов, наиболее распространенной и широко используемой из которых является гистоморфометрическая оценка гистологических срезов^30,31. В этом методе ооциты идентифицируются на последовательных участках с гистологическими пятнами, такими как гематоксилин и эозин (H & E) и периодические кислоты-Шиффа (PAS) или флуоресцентные маркеры. Этот метод надежен, если все условия остаются постоянными, включая толщину сечения, эффективное восстановление всех участков по всему яичнику и схемы подсчета отдельных лабораторий. Однако цифры, сообщаемые различными лабораториями, часто значительно различаются и, следовательно, их нелегко сопоставить.

Кроме того, учитывая генетические различия, использование различных штаммов мышей также может влиять на количество ооцитов. Для гистоморфометрической оценки были разработаны дополнительные вычислительные подходы, включающие автоматическое обнаружение ооцитов с использованием фракционаторного подхода, автоматический подсчет с использованием вычислительных алгоритмов и 3D-реконструкцию гистологических изображений для предотвращения многократного подсчета одного и того же ооцита 31,32,33,34,35,36 . Даже с учетом этих улучшений, добавленных к гистоморфометрической оценке, метод является относительно трудоемким, особенно для крупномасштабных и высокопроизводительных исследований. Собранные данные могут быть невоспроизводимыми и сопоставимыми между исследованиями из-за различий в схемах подсчета, компьютерных алгоритмах и используемом программном обеспечении.

В последнее время, ускоренные разработкой новых методов многофотонной и световой листовой микроскопии среднего разрешения и оптического очищения тканей, методы 3D-моделирования и анализа интактных яичников становятся методом выбора для эффективной количественной оценки числа ооцитов и изучения локализации и динамики белка^37,38. Эти 3D-методы, как правило, выгодны по сравнению с гистологическими методами, поскольку ткани и органы лучше сохраняются и сохраняются нетронутыми. Кроме того, 3D-анализ и моделирование дают дополнительное представление о функциях и взаимодействиях внутри и между клеточными нишами или подструктурами в органе, которые могут быть пропущены в 2D-анализе.

3D-анализ целых органов требует оптимизации протоколов фиксации, иммуноокрашивания и оптического очищения для отдельных органов, таких как яичники, без искажения или повреждения тканей. Дополнительная оптимизация монтажа образца для визуализации требуется для микроскопии с высоким разрешением и может зависеть от доступной платформы визуализации. Наконец, визуализация всего неповрежденного яичника генерирует большое количество данных для последующего вычислительного анализа. Поэтому необходимо разработать стандартизированные 3D-методы подсчета ооцитов для сравнительных исследований и на разных стадиях развития.

Этот протокол использует стандартное иммуноокрашивание и ранее сообщенные протоколы очистки, ориентируясь на простой, удобный для пользователя и высокопроизводительный подход 38,39,40,41. Протокол оптимизирован для анализа большого количества пренатальных и постнатальных яичников до постнатального дня 28 (P28) и различных размеров яичников из разных генетических фонов мышей. Этапы иммуноразрашивания сходны для всех стадий; однако протоколы очистки различаются для пубертатных яичников из-за их большего размера, ScaleS4(0) и CUBIC для малых и больших яичников, соответственно^40,41. Кроме того, перфузия всего тела выполняется у мышей P28 перед фиксацией, чтобы предотвратить аутофлуоресценцию клеток крови. Многофотонный микроскоп был построен на платформе Leica DIVE/4Tune в качестве альтернативы световой листовой микроскопии для получения изображений, и для этого протокола было выбрано программное обеспечение IMARIS 3D Visualization and Analysis с различными аналитическими инструментами. Этот протокол прост в использовании и менее практичен, что экономит время. Кроме того, количественное определение ооцитов происходит относительно быстро, в зависимости от размера яичника и расположения ооцитов.

Protocol

Все использованные мыши принадлежали к генетическому штамму C57BL/6J (см. Таблицу материалов). Этот штамм был полностью секвенирован и является стандартным для многих исследований структуры и функции яичников. Мыши были размещены в соответствии с руководящими принципами NIH, а выполненные процедуры были одобрены Институциональным комитетом по уходу за животными и их использованию Лаборатории Джексона. Реагенты и композиции, используемые в настоящем протоколе, перечислены в Таблице материалов и Таблице 1 соответственно.

1. Подготовка реагентов

1. Фиксирующее средство: Приготовьте 4% параформальдегида (PFA) в 1x PBS. Например, для 24 образцов (0,5 мл/ образец = 12 мл общего объема) добавьте 3 мл 16% электронной микроскопии PFA к 9 мл 1x PBS.
2. Буфер пермеабилизации
   1. Измерьте поливиниловый спирт (ПВА) в пластиковом стакане объемом 250 мл, содержащем 1x PBS, за день до того, как потребуется буфер пермеабилизации. Перемешайте раствор в течение ночи, чтобы ПВА полностью растворился.
   2. Добавьте боргидрид натрия к растворенному ПВА и дайте смеси гомогенизироваться в течение приблизительно 3-5 мин. Ожидайте, что раствор вспенится.
   3. Добавьте Тритон X-100 в раствор и используйте буфер после растворения Тритона X-100.
      ПРИМЕЧАНИЕ: ПВА долго растворяется (не менее 3 ч), а проникновение антитела зависит от того, насколько хорошо оно растворяется. Для больших яичников крайне важно полностью растворить ПВА.
3. Блокировка буфера
   1. Измерьте бычий сывороточный альбумин (BSA) в стакан с 1x PBS. Перемешайте раствор до растворения BSA.
   2. Добавьте глицин, тритон X-100, пенициллин-стрептомицин и азид натрия. Перемешивать до однородности раствора. Переложите буфер в бутылку и храните при температуре 4 °C. Перед употреблением добавьте обычную козью сыворотку.
4. Буфер для стирки: Измерьте ПВА в стакан, содержащий 1x PBS. Перемешайте раствор в течение ночи, чтобы ПВА растворился. Добавьте тритон X-100 и азид натрия. Как только буфер будет перемешан, храните его при 4 °C.
5. Раствор ScaleS4(0) (рН 8,1): Растворить D-сорбитол в PBS в стакане с перемешиванием при ≤100 °C. Добавьте мочевину в раствор, и как только мочевина растворится, выключите огонь и дайте раствору перемешиваться до полного растворения. Добавьте глицерин и диметилсульфоксид и перемешивайте до тех пор, пока раствор не гомогенизируется. Хранить раствор при комнатной температуре в темное время суток.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Раствор ScaleS4(0) необходимо сделать свежим в первый день очистки яичников.
6. Решение ScaleCUBIC-1
   1. Растворить мочевину в стакане, содержащем PBS, с перемешиванием при температуре ≤100 °C. Измерьте N,N,N',N'-тетракис(2-гидроксипропил)этилендиамин в отдельный стакан, затем добавьте растворенную мочевину и перемешайте при температуре ≤100 °C до полного растворения реагентов. Как только все реагенты окажутся в растворе, выключите огонь и охладите при комнатной температуре. Хранить в темноте.
   2. Дегазация раствора путем переноса его в фильтрующую колбу. Прикрепите колбу к вакууму с трубкой, накройте колбу и включите вакуум, пока пузырьки в растворе не исчезнут. Используйте раствор после этой дегазации.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Раствор можно хранить в темноте для использования до месяца.
7. Раствор сахарозы: Растворить сахарозу в 1x PBS; затем дегазировать раствор перед использованием.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Приготовьте раствор заново перед использованием.
8. Решение ScaleCUBIC-2
   1. Сахарозу растворить в стакане, содержащем PBS, перемешив при температуре ≤100 °C. Добавить мочевину и перемешивать при температуре ≤100 °C до тех пор, пока мочевина не растворится. Выключите огонь.
   2. Добавьте триэтаноламин и тритон Х-100. Перемешивать до однородности раствора. Дайте раствору остыть до комнатной температуры и хранить в темноте. Дегазируйте раствор перед использованием.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Раствор можно хранить в темноте для использования до месяца.

2. Рассечение и фиксация пренатальных яичников (рисунок 1А)

1. Спаривайте взрослых самок (≥8 недель) и самцов в соответствии с утвержденным институциональным протоколом. Проверяйте наличие вагинальных пробок каждое утро.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Утро вагинальной пробки обозначается как 0,5 дня после койтума (d.p.c) или E0.5.
2. В день рассечения приготовьте 4% параформальдегида (PFA) и аликвоту ~0,5 мл в микроцентрифужные трубки, размещенные на стороне скамейки (~4 на беременную женщину).
   ПРИМЕЧАНИЕ: ПФА является опасным веществом и должна обрабатываться под химическим капотом.
3. Подготовьте три 100 мм пластины, содержащие ~10 мл 1x фосфатно-буферного физиологического раствора (PBS) для каждой беременной женщины (для сбора матки, для рассечения комплекса мезонефрос-яичников и выделения яичников).
4. Усыпляют беременных самок, которые вынашивают эмбрионы предпочтительной стадии развития и приступают к рассечению. Усыпляйте не более 1-2 самок одновременно. Используйте утвержденный протокол эвтаназии беременных мышей (например, воздействие CO₂ с последующим вывихом шейки матки).
5. После того, как самка усыплена, опрыскайте брюшную полость 70% этанолом. Используя щипцы, поднимите кожу живота и с помощью ножниц сделайте V-образный разрез через брюшную полость и стенку тела. Разрежьте вдоль двух сторон разреза и очистите кожу обратно, чтобы обнажить внутренние органы и плоды в матке.
6. Щипцами и ножницами разрезают и отделяют матку с плодами от брюшного жира и яичниковых артерий и вен. Извлеките матку и поместите ее в 100-миллиметровую пластину, содержащую 1x PBS. Отпустите плоды в PBS, разрезав стенку матки и проколов желточный мешок. Перережьте пуповину.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Для плодов моложе 15 дней в период беременности эвтаназия матери и удаление из матки обеспечивает быструю гибель плода. Плоды старше 15 дней в период беременности до рождения должны быть усыплены путем обезглавливания.
7. Перенесите плод в новую тарелку со свежим 1x PBS. Чтобы обезглавить плод E15.5, деликатно прижмите две задние конечности друг к другу на пластине щипцами, чтобы обездвижить плод. Используя вторую пару щипцов, удерживаемых в доминирующей руке, держите шею между зубцами щипцов и сожмите, чтобы отрезать головку плода, или используйте ножницы, чтобы разрезать шею.
8. Доминирующими ручными щипцами обрежьте ниже передних конечностей и аккуратно оттяните верхнюю часть тела. Затем вставьте одну конечную точку доминирующих щипцов руки в брюшную полость вертикально в отверстие брюшной области, в то время как другая конечная точка щипцов остается снаружи. Закройте щипцы, зажмите стенку тела, чтобы разрезать ее, и обнажите внутренние органы.
9. С помощью тех же щипцов аккуратно удалите органы, включая кишечник и печень, пока почки и репродуктивные органы не станут видимыми. Определите пол плода: при Е15,5 яичники имеют вытянутую колбасообразную форму, а яички овальные.
   ПРИМЕЧАНИЕ: На более ранних стадиях генотипирование может потребоваться для определения пола.
10. Используя одну пару щипцов, удерживайте плод женского пола и используйте другие щипцы, чтобы захватить каждый комплекс мезонефрос-яичник и осторожно отделить его от почек и мюллеровы протоков. Поместите яичники в новую пластину с 1x PBS, оставьте прикрепленные мезонефры, но удалите окружающие ткани, чтобы убедиться, что яичники открыты. Поместите оба яичника в ~0,5 мл 4% PFA в микроцентрифужных трубках и зафиксируйте при 4 °C на ночь. На следующий день замените PFA 70% этанолом.
11. Для рассечения и фиксации яичников E18.5 отделите плоды от матки, как описано выше, а затем следуйте протоколу для препубертатных щенков, описанному в разделе 3 (рисунок 1B).

3. Рассечение и фиксация препубертатных яичников (рисунок 1В)

1. Подготовьте 4% PFA и аликвоту ~ 0,5 мл в трубки 1,5 мл и поместите их на сторону скамейки (~ одна трубка на щенка). Подготовьте тарелки толщиной 35 мм с 1 PBS (~по одной на щенка). Усыплите детенышей, используя утвержденный институциональный протокол.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Обезглавливание является предпочтительным методом эвтаназии для мышей в возрасте 8 дней или младше. Неонатальные мыши могут быть обезглавлены с помощью 3-4-дюймовых рассекающих ножниц или 5-7-дюймовых ножниц Майо.
2. Определите пол детенышей путем измерения аногенитального расстояния, которое больше у самцов, чем у самок. Используйте острые обезглавливающие ножницы, чтобы обезглавить детенышей самок. Поместите тело, открыто вырезанное стороной вниз, на бумажное полотенце, чтобы слить кровь (~ 5-10 с).
3. Закрепите щенка на спине, поместив булавку в подушечку лапы каждой ноги. Опрыскивайте брюшную полость 70% этанолом. Используйте щипцы, чтобы держать кожу щенка подальше от тела и используйте ножницы, чтобы сделать небольшой V-образный разрез в коже нижней части живота.
4. Вставьте ножницы в разрез под кожей и разрежьте по обеим сторонам живота. Используйте щипцы, чтобы аккуратно отшелушить кожу и раскрыть нижнюю часть живота. Осторожно переместите кишечник вверх и расположите рога матки рядом с мочевым пузырем. Следуйте за каждым рогом матки к почке и найдите яичник с окружающей жировой тканью под каждой почкой.
5. Чтобы рассечь яичники, держите маточный рог ниже завязи и яйцевода одной парой щипцов (щипцы А, рисунок 1В) и осторожно поднимите его от тела. Используя другую пару щипцов (щипцов B), осторожно захватите под первой парой щипцов так, чтобы завязь и яйцевод в жировой подушке были видны над второй парой щипцов. Затем срежьте ниже вторую пару щипцов ножницами или осторожно потяните, чтобы отсоединить яичники и прикрепленные ткани.
6. Поместите изолированные органы в пластину с 1x PBS. Обрежьте лишнюю жировую ткань, яйцевод и рог матки, чтобы очистить и изолировать яичник. Деликатно откройте бурсу, окружающую яичник, и обнажите весь яичник.
7. Обрежьте мембрану бурсы, не повреждая яичник, и оставьте ткань вокруг хилума (связочная структура между яичником и репродуктивным трактом) для обработки яичника, как показано на рисунке 1B, P5. Как только яичники будут обрезаны, поместите их в 4% PFA и зафиксируйте яичники при 4 ° C на ночь. На следующий день замените 4% PFA на 70% этанолом и храните яичники при 4 °C до стадии протокола иммуноокрашения.

4. Перфузия, рассечение и фиксация пубертатных яичников (рисунок 1С)

1. Перфьюзируйте мышей в соответствии с институционально утвержденными протоколами с мышью под глубокой анестезией в химическом вытяжном капюшоне. Подготовьте перфузионное оборудование и реагенты. Смотрите подробный протокол по адресу ⁴².
   ПРИМЕЧАНИЕ: Перфузия - это терминальная процедура эвтаназии, которая заменяет кровь по всей сосудистой системе тканевым фиксатором.
2. Взвесьте пубертатную самку мыши (P28) и запишите вес мыши (обычно от 13 г до 15 г). Рассчитайте количество одобренного анестезиологического средства, которое будет использоваться.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Здесь в этом протоколе использовалось 0,35 мл трибромэтанола на 10 г массы тела.
3. Используйте одноразовый шприц объемом 10 мл с иглой 20 г, чтобы заполнить шприц одобренным анестетиком. Замените иглу 20 г иглой 26 г x 3/8.
4. Осторожно удерживайте мышь, сжимая кожу спинной шеи одной рукой. Переверните мышь, чтобы обнажить брюшную полость. Вводите заранее рассчитанное количество анестетика в брюшинную полость. Поместите мышь в контейнер с крышкой до тех пор, пока анестезия не вступит в силу (т.е. мышь больше не будет двигаться).
5. Как только мышь перестанет двигаться, осторожно ущипните ее ноги, чтобы проверить, что нет ответа, и убедитесь, что мышь полностью обезболена, прежде чем начать перфузию. Поместите и закрепите мышь на спине, осторожно прижав все четыре ноги через подушечки лап к доске. Следите за тем, чтобы ноги были закреплены в расслабленном положении, не перерастянуты.
6. Распылите на мышь 70% этанола от брюшной полости до грудной клетки. Используйте щипцы, чтобы аккуратно защемить и поднять кожу живота, а затем используйте ножницы, чтобы сделать небольшой V-образный разрез через кожу и стенку тела.
7. Снимите кожный лоскут с полости тела и вставьте ножницы под кожу и стенку тела. Вырежьте кожу и стенку тела прямо вверх к голове до края грудной полости на грудине.
8. Откройте грудную полость, аккуратно разрезав ребра с обеих сторон грудины чуть ниже лопатки. Позаботьтесь о том, чтобы не проколоть легкие ниже грудной клетки. Захватите кожу / реберные лоскуты щипцами и приколите их, чтобы обнажить внутренние органы.
9. Осторожно обрежьте любую ткань, такую как тимус, которая может препятствовать чистому доступу к сердцу. Обнажите все органы, включая желудочно-кишечный тракт, чтобы обеспечить визуальное подтверждение того, что все тело перфузировано, включая нижнюю часть живота.
10. Используйте ножницы для рассечения, чтобы разрезать правое предсердие сердца и выпустить кровь из системы. Осторожно удерживайте сердце щипцами и вставьте перфузионную иглу (подключенную к контроллеру перистальтического насоса) в левый желудочек.
11. Накачайте ~ 10 мл PBS, с мягким, но постоянным давлением, пока ткани, такие как печень, почки и репродуктивный тракт (рисунок 1E, F), не превратятся из розового в белый. Затем замените PBS на свежеприготовленный 1% PFA и продолжайте перфузию примерно с 10 мл PFA или до тех пор, пока не произойдет подергивание в нижней части тела мыши (например, хвост).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Эти фиксационные толчки указывают на успешную перфузию.
12. Как только перфузия будет завершена, расположите жировую подушку с яичниками ниже почки и аккуратно рассекните весь репродуктивный тракт, включая жировую подушку, яичники и рога матки, и поместите тракт во флакон с 4% PFA. Зафиксируйте яичники при комнатной температуре на ночь (~16-24 ч). Затем замените 4% PFA на 70% этанол в течение по крайней мере одного дня и обрежьте яичники (рисунок 1E, F), как описано выше, перед началом протокола иммуноокрашения.

5. Иммуноподдерживание цельных яичников (Рисунок 2А)

ПРИМЕЧАНИЕ: Практикуйте стерильные методы во время протокола иммуноокрашения, особенно при смене буферов, для предотвращения загрязнения в течение длительных инкубационных периодов.

1. Выполните все этапы иммуноокрашивания в 24-луночной пластине, как показано на рисунке 2А. Отрегулируйте объемы реагентов для других форматов. Тщательно меняйте буферы, чтобы избежать потери небольших пренатальных и препубертатных яичников.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Можно использовать другие форматы, такие как плиты из 48 и 96 скважин, но более глубокие скважины и более узкие отверстия затрудняют аспирацию буферов без потери или повреждения яичников.
2. День 1
   1. Пипетка 1 мл PBS/скважина в количество скважин, необходимых в чистой 24-луночной плите. Отрежьте кончик кончика пипетки объемом 200 мкл, чтобы сделать широкое отверстие, и используйте его для осторожного переноса препубертатных яичников из трубок объемом 1,5 мл с 70% этанолом в колодцы. Для пубертатных яичников используйте наконечник пипетки объемом 1000 мкл с отрезанным наконечником для переноса.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Более широкое отверстие наконечника предотвращает повреждение тканей во время переноса.
   2. После того, как все образцы будут перенесены в скважины, используйте новый наконечник для аспирации PBS и замените его свежими 0,8 мл PBS / скважина. Инкубируйте образцы при комнатной температуре на шейкере при ~100-150 об/мин в течение ночи. Начинают подготовку буфера пермеабилизации (см. таблицу 1 и раздел 1).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Новый наконечник предотвращает прилипание яичников к кончику, а этап инкубации PBS позволяет яичникам уравновешиваться в PBS и регидратироваться перед окрашиванием.
3. День 2
   1. Закончите подготовку буфера пермеабилизации. Аспирировать PBS из скважин и заменить его 0,8 мл буфера пермеабилизации на скважину. Поместите пластины обратно на шейкер и инкубируйте образцы при комнатной температуре в течение 4 ч.
   2. После 4 ч инкубации полностью аспирировать буфер пермеабилизации и заменить его 0,5 мл блокирующего буфера (см. Таблицу 1 и раздел 1). Запечатайте пластину парапленкой для предотвращения испарения, поместите в надежно закрытый контейнер на шейкере и инкубируйте образцы с мягким перемешиванием в блокирующем буфере в течение ночи (16-24 ч) при комнатной температуре.
4. День 3
   1. Получают первичные антитела путем разведения в блокирующий буфер. Для визуализации ооцитов используйте маркеры ооцитов, например, анти-зародышевую клетку крысиную ядерную кислотную пептидазу (GCNA)/TRA98 как для пренатальных, так и для препубертатных яичников и геликазу против МЕРТВОЙ коробки 4 (DDX4)/гомолог мышиной вазы (MVH) как для препубертатных, так и для пубертатных яичников. Для количественной оценки экспрессии LINE-1 ORF1p в пренатальных яичниках используйте анти-LINE-1 ORF1p или другое доступное антитело.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Сигнал GCNA/TRA98 не обнаруживается в пубертатных яичниках.
   2. Аспирировать блокирующий буфер из образцов и заменить его 0,5 мл разбавленных первичных антител. Запечатайте пластину парапленкой, чтобы предотвратить испарение. Поместите пластины в контейнер с крышкой, чтобы предотвратить высыхание образцов во время инкубации. Поместите емкость на шейкер и инкубируйте образцы в течение 3-4 дней при комнатной температуре.
5. День 7
   1. Осторожно удалите парапленку с пластин и аспирируйте первичную смесь антител из образцов. Храните первичные смеси антител при 4 °C (в течение месяца или трех применений) и повторно используйте их позже, добавляя свежие антитела (например, 2 мкл свежей аликвоты антител на 5 мл ранее использованной смеси).
   2. Добавьте к образцам 1 мл промывочного буфера (см. Таблицу 1 и раздел 1) на каждую лунку и осторожно качайте пластины в течение нескольких секунд, чтобы смыть остаточные антитела. Тщательно аспирируйте и замените буфер для стирки 0,8 мл свежего промывочного буфера и встряхните пластины при комнатной температуре в течение ночи.
6. День 8
   1. Аспирируйте буфер для ночной стирки, замените его 0,8 мл свежего промывочного буфера и встряхните при комнатной температуре в течение 2 ч. Повторите этап стирки со свежим буфером для стирки еще 2 ч.
   2. После последней промывки замените буфер промывки 0,5 мл вторичных смесей антител, разведенных в блокирующем буфере, например, козий анти-крысиный Alexa Fluor 555 и козий анти-кролик Alexa Fluor 647 в разведении 1:1000. Приготовьте смесь вторичных антител свежей для каждого эксперимента с иммуноокрашиванием.
   3. Запечатайте пластину парапленкой, чтобы предотвратить испарение во время инкубации. Инкубировать образцы при комнатной температуре в темноте или в пластинах, покрытых алюминиевой фольгой, с мягким перемешиванием в течение 3 дней.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Этот этап и все последующие шаги проходят в темноте или с алюминиевой фольгой.
7. День 11
   1. Аспирировать вторичную смесь антител и выполнить начальную промывку 1 мл промывочного буфера. Аккуратно раскачивайте пластины в течение нескольких секунд, чтобы смыть остаточные вторичные антитела.
   2. Аспирировать промывочный буфер, заменить его 0,8 мл свежего промывочного буфера и инкубировать образцы при комнатной температуре в течение 2 ч с встряхиванием, защищенным от света. Повторите этап стирки 2 раза, в общей сложности 3 стирки. После третьей промывки переходите к этапу очистки (раздел 6).

6. Очистка иммуноокрашенных цельномонтных яичников (рисунок 2А).

ПРИМЕЧАНИЕ: Выполните все этапы очистки в темноте, завернув пластины в алюминиевую фольгу или разместив в непрозрачных контейнерах. Этапы очистки различаются для препубертатных и пубертатных яичников.

1. День 11 [Пренатальные и препубертатные яичники очищаются по одноэтапному протоколу]
   1. После последней промывки аспирируйте моющий буфер и замените его 0,8 мл свежеприготовленного раствора ScaleS4(0) (см. Таблицу 1 и раздел 1). Запечатайте пластину парапленкой и инкубируйте образцы в темноте с встряхиванием при комнатной температуре в течение трех-четырех дней перед визуализацией.
   2. При необходимости заменяйте раствор ScaleS4(0) свежим раствором ежедневно; Будьте осторожны при замене растворов, так как очищенные яичники становятся прозрачными и их трудно увидеть. После очистки приступайте к настройке образца и визуализации (раздел 7).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Изменение решений существенно не улучшило качество изображения. Ежедневные изменения увеличивают вероятность потери небольших и в основном прозрачных образцов.
2. Дни 11-15 [Пубертатные яичники очищаются в двухэтапном протоколе]
   1. После последней иммуноокрашающей промывки аспирировать промывочный буфер и заменить его 0,8 мл ScaleCUBIC-1 (см. Таблицу 1 и раздел 1). Запечатайте пластину парапленкой и осторожно встряхните образцы при 37 °C в течение 3 дней в темноте. Заменяйте раствор ScaleCUBIC-1 свежим раствором ежедневно.
   2. На 15 день промыть образцы 3 раза по 10 мин каждый раз в 0,8 мл PBS при комнатной температуре с легким встряхиванием. Замените PBS 0,8 мл дегазированной 20% сахарозы, приготовленной только что с PBS. Осторожно встряхните при комнатной температуре в течение 1 ч.
   3. Замените 20% раствор сахарозы 0,8 мл раствора ScaleCUBIC-2 (см. Таблицу 1 и раздел 1), запечатайте пластину парапленкой и осторожно встряхните при комнатной температуре с ежедневными изменениями раствора ScaleCUBIC-2. Очистите в течение 4-5 дней и приступайте к изображению. Будьте осторожны при обмене растворами, чтобы избежать потери образцов, так как очищенные яичники прозрачны и их трудно увидеть. Перейдите к настройке образца и визуализации (раздел 7).

7. Настройка образца и визуализация с помощью многофотонного микроскопа

ПРИМЕЧАНИЕ: Все описанные ниже этапы были выполнены с помощью Leica DIVE/4TUNE/FALCON с двумя перестраиваемыми многофотонными лазерами Ti:Sapphire с длительностью импульса 120 fs с многокомпонентным объективом 16x/NA0.6 (иммерсионная жидкость = глицерин) с максимальным рабочим расстоянием 2,2 мм. Подробную информацию о программном обеспечении для получения изображений см. в Таблице материалов. В дополнительной таблице S1 и дополнительном рисунке S1 показаны настройки, используемые для этого протокола. Для других платформ визуализации проконсультируйтесь с ядром микроскопии или следуйте спецификациям / рекомендациям производителей.

1. Пример настройки
   1. Подготовьте установку для подключения образцов. Например, используйте липкую и гибкую силиконовую прокладку для создания клеевого колодца. Поместите клеевой колодец на одну крышку размером 25 мм х 25 мм No 1,5, чтобы создать колодец, в который будут помещены яичники (рисунок 2B).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Прокладка толщиной 1 мм вмещает все размеры яичников. Эта установка рекомендуется, так как она устраняет движение яичников во время визуализации, которое может произойти, когда яичники помещаются в маунтант в стеклянной тарелке.
   2. Используя наконечник пипетки с отрезанным наконечником (20 мкл для пренатального и препубертатального периода), перенесите яичники с ~5-10 мкл раствора ScaleS4(0) в середину клеевого колодца, как показано на рисунке 2B. Для пубертатных яичников используйте кончик пипетки объемом 200 мкл с отрезанным наконечником достаточно далеко, чтобы перенести яичники. Добавьте ~15-20 мкл раствора ScaleCUBIC-2 в середину клеевого колодца.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Слишком много раствора может привести к утечке на ступень микроскопа, а слишком мало раствора приведет к ухудшению качества изображения. Используйте рассеченный микроскоп для переноса образцов, поскольку очищенные яичники становятся прозрачными и их трудно увидеть.
   3. После того, как яичники перенесены в отдельные лунки с каплей очищающего раствора, аккуратно поместите еще одно покровное стекло на клеевой колодец, нажмите, чтобы создать уплотнение, и держите образцы на месте в небольшом бассейне с очищающим раствором, зажатым между двумя крышками (рисунок 2B). Для получения изображения поместите «сэндвич» крышки в 3D-печатный слайд адаптера микроскопа (например, ⁴³ ).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Клеевые колодцы можно использовать повторно после деконструкции «сэндвича» и промывки водой.
2. Визуализация (дополнительная таблица S1 и дополнительный рисунок S1)
   1. Включите микроскоп и программное обеспечение в соответствии с рекомендациями ядра микроскопии или производителя. Поместите установленные образцы на ступень микроскопа и посмотрите через окуляр, чтобы найти образец, освещенный маломощной светодиодной люминесцентной лампой.
   2. Как только образцы будут найдены, включите лазер (лазеры) и назначьте каждому детектору определенный краситель / маркер Alexa Fluor. Для нескольких лазеров обеспечивается последовательное получение изображения. Приобретите весь стек перед переключением лазеров.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для этого протокола один лазер использовался для получения изображений флуорофоров 555 нм и 647 нм.
   3. Настройте параметры для получения изображения в соответствии с сердечником микроскопии или спецификациями производителя. Используйте двунаправленную съемку изображений, если таковая имеется, чтобы сократить время сканирования и повысить эффективность. Настройте другие параметры, включая среднее значение строки (1), среднее значение кадра (1 ) и накопление кадров (1).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Двунаправленное получение изображения позволяет лазерам сканировать в обоих направлениях, когда они движутся по оси X.
   4. Настройте Z-Stack, определив начало (нижняя часть образца/нижняя стеклянная крышка) и конечное положение (верхняя часть образца/верхняя стеклянная крышка). Выберите Z-образный размер 2 мкм для препубертатных яичников и 5 мкм для пубертатных яичников.
   5. Активируйте функцию Z-компенсации и в рамках этой функции активируйте усиление возбуждения. Установите Z-компенсацию для нижней и верхней части образца, выбрав интенсивность лазера как для нижнего (низкая интенсивность), так и для верхнего стека (высокая интенсивность). См. Дополнительный рисунок S1, Линейная Z-компенсация, где выбрана коробка усиления возбуждения, а интенсивность лазера для нижнего (0) и верхнего (347,75) установлена как 10 и 12 соответственно.
   6. Используйте режим разбиения мозаики для больших образцов, которые не могут быть захвачены в одном поле зрения. Активируйте навигатор изображений и укажите количество плиток, необходимых для захвата всего образца с помощью инструмента прямоугольной маркировки.
   7. Запустите получение изображения. Для изображений с несколькими плитками начните сбор изображений с помощью навигатора , чтобы захватить все плитки. После завершения получения изображения сначала сохраните все изображения, а если было получено несколько плиток, запустите инструмент слияния мозаики , чтобы объединить плитки в одно изображение.
   8. Сохраните объединенные файлы в отдельную папку проекта, чтобы упростить работу с изображениями размером в гигабайт. Передача файлов для обработки изображений с помощью программного обеспечения для визуализации и анализа 3D-изображений. На рисунке 3 показаны репрезентативные изображения, сделанные на разных этапах с двумя маркерами (GCNA и DDX4).

8. Обработка изображений

ПРИМЕЧАНИЕ: Все шаги, описанные ниже, были разработаны и выполнены с использованием программного обеспечения для визуализации и анализа 3D-изображений IMARIS.

1. Импортируйте изображения в программное обеспечение для визуализации и анализа 3D-изображений и, при необходимости, преобразуйте файлы из исходного формата (например, .lif, .czi, .lsm, .lei, .oib, .oif, .nd2) в формат .ims.
2. При необходимости обработайте изображения с помощью гауссовского фильтра, чтобы уменьшить пикселизацию (рисунок 4A). С помощью функции 3D-просмотра расположите изображение и отмените выбор параметра фрейма (чтобы удалить кадр).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Существуют и другие дополнительные фильтры, которые также можно использовать для уменьшения пикселизации и уменьшения интенсивности фона.
3. Увеличьте изображение до определенного масштаба и используйте функцию «Снимок». Установите настройки следующим образом: выберите 300 DPI, сохранить как TIFF Image и Прозрачный фон. Сделайте снимок изображения и сохраните его. На рисунке 3 показаны полные собранные изображения.

9. Количественная оценка ооцитов

ПРИМЕЧАНИЕ: Иммунофлуоресценция всего яичника и визуализация и анализ 3D-изображений могут быть использованы для оценки количества ооцитов в целых яичниках (рисунок 3 и рисунок 4) с использованием функции Spot. Сигнал GCNA может быть использован для количественной оценки ооцитов в пренатальных и препубертатных яичниках, как показано на рисунке 4 (P5). В пубертатных яичниках используйте сигнал DDX4 для количественной оценки двух популяций ооцитов в нерастающих фолликулах («кольцеобразная» структура, закрытая стрелка) и растущих фолликулах (крупные структуры, открытая стрелка, рисунок 4, P28).

1. Определите размер ооцитов, которые будут использоваться в качестве параметра для количественной оценки ооцитов с функцией Spots на шаге 9.2.
   1. Откройте изображение и выберите параметр «Фрагмент», чтобы открыть изображение Z-стека.
   2. Выберите параметр « Линия » на панели « Измерение» и измерьте расстояние, проведя линию от одного края ооцита/маркера до другого края в самой широкой точке, чтобы определить диаметр XY типа/размера ооцита, подлежащего подсчету. Пройдитесь по стеку и получите диапазон диаметров для нескольких ооцитов одного типа. Используйте самую короткую длину в качестве критерия выбора размера для количества ооцитов.
2. Функция «Пятна»: выберите опцию «3D-вид» и активируйте функцию «Добавить новые пятна» на панели «Сцена», чтобы открыть панель «Алгоритм». Отмените выбор всех настроек алгоритма, так как будет использоваться фильтр выбора размера с размером ооцита, полученным на шаге 9.1.
   1. Щелкните одну стрелку вперед , чтобы перейти к исходному каналу. Выберите канал с предпочтительным маркером и введите расчетный диаметр XY, полученный на шаге 9.1. Например, используйте расчетный диаметр XY 7 мкм для пренатальных ооцитов и 11 мкм для ооцитов P5 (GCNA = зеленый сигнал; Рисунок 3 и Рисунок 4А).
   2. Используйте 30 мкм для сигнала DDX4 для оценки количества ооцитов в растущих фолликулах в яичниках P5 (DDX4 = пурпурный сигнал; Рисунок 3 и Рисунок 4А). Для пубертатных яичников используйте сигнал DDX4 для количественной оценки ооцитов. Например, используйте диаметры XY 15 мкм и 80 мкм для идентификации ооцитов в нерастущих фолликулах и растущих фолликулах соответственно, как показано на рисунке 4A.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Выбранный размер может варьироваться в зависимости от критериев получения изображения и типа используемого микроскопа. Отбор также может варьироваться среди генетических штаммов, поскольку яичники с большим количеством ооцитов потребуют выбора меньшего размера для лучшего автоматизированного обнаружения ооцитов.
   3. После выбора размера активируйте автоматическое определение удлинения PSF модели и фонового вычитания. Щелкните одну стрелку вперед , чтобы перейти на панель «Пятна фильтра ». Добавьте фильтр Качество и определите пороговое значение. Чтобы обеспечить точную оценку числа ооцитов, увеличьте изображение, поскольку порог корректируется, чтобы выбрать пороговое значение, которое выбирает большинство ооцитов. Нажмите на двойную стрелку , чтобы завершить автоматические подсчеты.
   4. Вручную проверьте выбранные ооциты с помощью вкладки «Редактирование», чтобы выбрать пропущенные ооциты, или отмените отбор частиц, не являющихся ооцитами, выбранных автоматическим порогом. Запишите данные на вкладке Статистика на вкладке Общие для дальнейшего анализа.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Параметры, используемые для подсчета пятен, могут быть сохранены и использованы для другого набора образцов, но рекомендуется выполнить ручную проверку перед запуском пакетного анализа.
   5. Чтобы сохранить параметры, перейдите на вкладку «Создание» и нажмите « Сохранить параметры для пакетной обработки».
      ПРИМЕЧАНИЕ: Ядерные маркеры (ооциты GCNA+, рисунок 4A) легко идентифицируются по точечному признаку и могут не требовать значительной ручной настройки. Однако цитоплазматический маркер (ооцит DDX4+, рисунок 3 (P28, закрытая стрелка) и рисунок 4A) потребует дополнительной ручной настройки для обеспечения идентификации правильного размера/типа ооцитов.

10. Количественная оценка экспрессии белка в яичниках

ПРИМЕЧАНИЕ: Существует несколько способов количественной оценки экспрессии ооцитов специфических маркеров с использованием как функции Spots (раздел 9 и шаг 10.1), так и функции Surfaces (шаг 10.2). Функция Spots может быть использована для белков с различными паттернами локализации, такими как ядерные маркеры (GCNA), а функция Surfaces может быть использована для белков с неравномерными моделями локализации, как показано на рисунке 5A , где были измерены интенсивности LINE-1 ORF1p в яичниках E15.5 и E18.5. Чтобы рассчитать и сравнить интенсивность интересующего белка между двумя образцами (например, временными точками, методами лечения или генотипами), соберите изображения с одинаковыми свойствами. Используйте образцы с более интенсивным сигналом для определения параметров, которые могут быть сохранены и использованы для других образцов.

1. Чтобы получить экспрессию белка с функцией Spots , сначала идентифицируйте ооциты, как выделено (раздел 9).
   1. Затем в разделе «Пятна» выберите вкладку «Статистика », а затем вкладку «Подробно ». Нажмите на стрелку вниз и выберите «Конкретные значения», которая откроет другую вкладку под ней, содержащую различные измерения. Выберите среднее значение интенсивности канала, используемого для генерации поверхности (или выберите другие измерения интенсивности, такие как медиана интенсивности).
   2. Чтобы получить комбинированную/среднюю статистическую информацию, выберите критерий Средние значения . После этого экспортируйте и сохраняйте данные для дальнейшего анализа.
2. Чтобы получить выражение белка с помощью функции «Поверхности », откройте изображение, выберите параметр «3D-вид» и активируйте функцию «Добавить новые поверхности» на панели « Сцена », чтобы открыть панель « Алгоритм ». Отмените выбор всех настроек алгоритма, если это не нужно, и нажмите на одну стрелку вперед , чтобы перейти к исходному каналу.
   1. Выберите канал с сигналом антитела для измерения. Другие свойства, которые необходимо выбрать, являются пользовательскими параметрами. Здесь в качестве маркера использовался сигнал LINE-1. Значения Surfaces Detail и Background Sub Subtraction (Local Contrast) были сохранены при значениях по умолчанию 1,42 и 5,33 соответственно.
   2. Щелкните стрелку вперед , чтобы перейти на панель «Порог ». Выберите пороговое значение, сопоставимое в обоих примерах (например, здесь для выбора порогового значения использовалось выражение LINE-1 в E18.5). Выберите Включить с диаметром начальных точек по умолчанию 7,10 (это значение было сочтено оптимальным для изображений, но может зависеть от ожидаемого размера пикселя объектов).
   3. Щелкните стрелку вперед , чтобы перейти на панель «Поверхности фильтра ». Было использовано фильтр «Качество» и основано значение, как и в случае с пороговым значением, на экспрессии белков в обоих образцах яичников. После выбора свойства фильтра щелкните двойную стрелку вперед , чтобы завершить генерацию поверхности.
   4. Чтобы получить значения интенсивности, выберите вкладку Статистика , а затем вкладку Подробно . Нажмите на стрелку вниз и выберите «Конкретные значения», которая откроет другую вкладку под ней, содержащую различные измерения.
   5. Выберите среднее значение интенсивности канала, используемого для генерации поверхности (или выберите другие измерения интенсивности, такие как медиана интенсивности).
   6. Чтобы получить комбинированную/среднюю статистическую информацию, выберите критерий Средние значения . После этого экспортируйте и сохраните данные для дальнейшего анализа (рисунок 5C).

11. Оценка общего количества ооцитов в поврежденном яичнике с вычислительной коррекцией

ПРИМЕЧАНИЕ: Если незначительное повреждение яичников происходит во время рассечения, может быть возможно вычислительно оценить общее количество ооцитов. Рекомендуется использовать интактные яичники из того же штамма и стадии развития для оценки числа ооцитов, как показано на рисунке 6. Моделирование, выполненное с яичниками на E15.5, показывает, что коррекция потерь ≥30% приводит к значительному отклонению от фактических чисел (рисунок 6C).

1. Откройте изображения неповрежденных яичников с помощью IMARIS и выберите функцию «Кадр». В разделе Параметры фрейма выберите метки Поле, Сетка, Галочки и Оси. На вкладке Положение X/Y/Z выберите 200 мкм, чтобы создать галочки с пробелами 200 мкм во всех позициях X/Y/Z.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Метки создают сетку/линейку в плоскостях X, Y и Z для идентификации ооцитов в определенной области.
2. Активируйте функцию Spots для идентификации ооцитов, как показано в разделе 9 (рисунок 4). Создайте 3D-модель, используя ооциты, идентифицированные во всех неповрежденных яичниках, используемых для моделирования, выбрав «Сфера » на вкладке «Стиль точек/Качество » в функции «Пятна ».
   ПРИМЕЧАНИЕ: Ширину пикселя также можно изменить на вкладке Стиль/Качество очков .
3. С помощью коробки, сгенерированной на шаге 11.1, выровняйте 3D-модели неповрежденных яичников в той же ориентации, что показано на рисунке 6A.
4. Используя тикмарки 200 мкм (шаг 11.1), выбирайте ооциты, которые попадают в пределах 50% объема каждого яичника. Нажмите на функцию «Пятна» и выберите «Редактировать метки», чтобы классифицировать ооциты, которые попадают в область 50% по цвету, как показано на рисунке 6A.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Как только ооциты классифицируются в области, будет указано количество ооцитов, которые попадают в каждый класс.
5. Увеличьте масштаб области 50% и измените метки с 200 мкм до 50 мкм , чтобы сделать меньшую линейку для идентификации ооцитов. Поддерживайте % увеличения во всех изображениях. С тиками 50 мкм в качестве ориентира разделите область 50% на пять равных частей.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Ооциты в каждой части будут составлять 10% объема, как показано на рисунке 6A, где неповрежденный яичник показывает ооциты в верхней половине яичника, классифицированные пятью различными цветами, причем каждый цвет представляет ооциты в пределах 10% объемной области.
6. Запишите количество ооцитов в каждой области 10%, как показано на рисунке 6A, B. Рассчитайте среднее количество ооцитов для 10, 20, 30, 40 и 50% приращений.
7. Используйте выделенные на шагах с 11.1 по 11.6 для получения количества ооцитов в поврежденном частичном яичнике. Расположите поврежденный яичник в той же ориентации, что и неповрежденные яичники, и оцените недостающий объем/процент, как описано выше.
8. Чтобы оценить общее число ооцитов во всем яичнике, сложите среднее число ооцитов, рассчитанное для аналогичного объема, к числу, полученному из частичного яичника (рисунок 6B).

Representative Results

Иммуноокрашивание и визуализация всего яичника позволяет визуализировать и количественно оценивать ооциты или экспрессию белка в яичниках на разных стадиях развития с использованием одной и той же техники и маркеров (рисунок 3). Этот протокол был разработан для масштабного проекта, в котором требовался анализ яичников на нескольких стадиях и от нескольких штаммов мышей. Здесь мы представляем данные, собранные для штамма C57BL6/J, стандартного штамма для генетического анализа. Метод, представленный здесь, прост, результаты могут быть получены в течение 14-19 дней (рисунок 2D) и могут быть использованы для яичников пренатальных, препубертатных и пубертатных женщин (рисунок 1 и рисунок 2A, B).

Этот подход был использован для изучения динамики потери ооцитов, которая происходит естественным образом во время формирования ооцитарного резерва яичников. Считается, что во многих организмах, включая мышей, количество ооцитов достигает пика во время жизни плода примерно в то время, когда ооциты входят в мейоз ~ E13,5. Количество ооцитов снижается из-за еще не до конца изученного процесса истощения фетальных ооцитов (FOA) (от ~E15.5 до E18.5), который был механистически связан с экспрессией ретротранспозона LINE-1^20,21. Больше ооцитов выводится после E18.5 до P0 из-за устранения аномальных ооцитов контрольной точкой мейотического качества^22,23. Чтобы исследовать эти процессы с использованием этого протокола, мы иммуноокрашили и визуализировали яичники на разных стадиях развития, используя DDX4 и GCNA в качестве маркеров ооцитов, как показано на рисунке 3.

Малые ооциты, экспрессирующие GCNA и DDX4, видны начиная с E15.5 и далее, и они представляют собой ооциты во время MPI или арестованные при диктиате в примордиальных фолликулах. Более крупные растущие ооциты с сильной экспрессией DDX4 обнаруживаются уже в Яичниках Р2, где они, скорее всего, представляют собой первую волну фолликулов⁴⁴. Увеличение числа более крупных ооцитов наблюдается в Яичниках P5 и P28. Изображения, полученные с помощью многофотонной микроскопии (рисунок 4A), обрабатывали с использованием программного обеспечения IMARIS и выполняли 3D-рендеринг для идентификации малых и крупных растущих ооцитов на основе ядерного сигнала GCNA и размера, очерченного сигналом DDX4 (Рисунок 4A и Видео 1). Ооциты были подсчитаны, как описано в протоколе, и результаты обобщены на рисунке 4B. В соответствии с предыдущими исследованиями мы наблюдали значительную потерю ооцитов от E15,5 до E18,5 (~ 32%) и E18,5 до P2 (~ 24%). К тому времени, когда самки достигают половой зрелости (P28), только ~ 30% ооцитов, присутствующих в E15.5, выжили.

Этот метод также может быть использован для наблюдения за последствиями генотоксического лечения, такого как облучение, которое, как было показано, полностью устраняет резерв первичного фолликула в течение одной недели 23,38,45. Очевидна значительная визуальная разница между всем яичником, обработанным радиацией, и необработанным контролем на рисунке 3 (сравнение яичников P28 у обработанных и необработанных женщин). В яичнике P28 без радиационного облучения мы наблюдали две популяции ооцитов, помеченных DDX4; обильные мелкие ооциты в первичных фолликулах (замкнутая стрелка); и более крупные ооциты различных размеров, обычно встречающиеся в растущих фолликулах (например, первичные, вторичные и преантральные) (рисунок 3). Напротив, завязь самки, подвергшейся воздействию 0,5Гр γ излучения при Р7, полностью лишена мелких ооцитов в первичных фолликулах, как это ранее наблюдалось в 2D-участках. Интересно, что только более крупные ооциты аналогичного размера пережили излучение; это могут быть первые волновые фолликулы, уже растущие в яичнике P7, поскольку они, как известно, устойчивы к излучению⁴⁶ (рисунок 3, P28).

В дополнение к количественной оценке числа ооцитов, этот протокол может быть использован для иммуноокрашения и количественного анализа других белков, участвующих в развитии ооцитов. Например, мы использовали антитела против белка LINE-1ORF1p, РНК-связывающего шаперонового белка, продуцируемого ретротранспозонами LINE-1 (рисунок 5). Увеличение обилия элементов LINE-1 с E15.5 до E18.5 было предложено вызвать элиминацию ооцитов^20,21. Действительно, используя многофотонные снимки и анализ интенсивности сигнала в IMARIS, уровни LINE-1 ORF1p значительно увеличились в ооцитах за это время, что коррелирует со значительным снижением числа ооцитов, как показано на рисунке 4B.

В обстоятельствах, когда часть яичника повреждена или потеряна, яичники из той же деформации и стадии развития могут быть использованы для расчетной оценки количества ооцитов в отсутствующей области, как показано на рисунке 6. Данные яичников E15.5 были использованы для моделирования для проверки точности вычислительных поправок. Можно вычислительно оценить, что ооциты в яичниках с повреждением тканей до 30% имеют отклонение ≤10% по сравнению с ооцитами в интактном яичнике, предполагая, что 3D-окрашивание и моделирование яичников может быть эффективно использовано для спасения данных из драгоценных тканей. Моделирование, выполненное с яичниками на E15.5, показывает, что коррекция потерь ≥30% приводит к значительному отклонению от фактических чисел (рисунок 6C).

Рисунок 1: Рассечение яичников и перфузия у женщин с пренатальной и постнатальной стадий. (A-C) Рассечение яичников из разных стадий требует разных техник, которые изображены схематично, чтобы дополнить описания в видео. (D) Яичники на постнатальный день 5 (P5) намного меньше, чем на P28, что требует другого протокола очистки, как описано в протоколе. (Э,Ф) Правильная перфузия яичников важна для устранения фонового окрашивания эритроцитами. Неперфузированные репродуктивные пути и яичники имеют розовый оттенок, в то время как перфузированные органы станут белыми. Аббревиатура: RI = неперфузированные репродуктивные пути. Изображения A-C были созданы с BioRender.com. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 2: Иммуноокрашивание, очистка и визуализация целых яичников мыши. (A) Блок-схема изображает общие и конкретные шаги для протокола иммуноокрашения и очистки пренатальных/препубертатных и пубертатных яичников. (B) Очищенные яичники монтируются в капле очищающего раствора в середине клеевого колодца, зажатого между двумя скользящими скольжениями крышки. Для получения изображений смонтированные образцы помещаются в 3D-печатный слайд адаптера. (C) Многофотонные изображения неперфузированных и перфузированных яичников в оттенках серого, иммуноокрашенных маркером ооцитов DDX4, показывающие улучшенное качество изображения и более низкое неспецифическое окрашивание после перфузии. Замкнутая стрелка указывает на ооцит с тонким слоем цитоплазматического окрашивания DDX4, характерным для первичных фолликулов, а открытые стрелки показывают более крупные ооциты внутри растущих фолликулов. Звездочка указывает на аутофлуоресценцию из кровеносных сосудов. (D) 3D-рендеры из конфокальных и многофотонных изображений яичников P5, иммуноокрашенных маркерами ооцитов GCNA (зеленый) и DDX4 (пурпурный), показывающие значительную сферическую аберрацию от конфокальной микроскопии и практически не от многофотонной. Шкала стержней = 100 мкм (C, D) и 50 мкм (вставки в D). Сокращения: GCNA = ядерная кислотная пептидаза зародышевых клеток; DDX4 = Геликаза МЕРТВОЙ КОРОБКИ 4. Образ А был создан с помощью BioRender.com. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 3: Репрезентативные 3D-визуализации яичников различных стадий развития. 3D-визуализация из многофотонных изображений целых яичников, ослабленных GCNA (зеленый) и LINE-1 ORF1p (синий) или DDX4 (пурпурный), в пренатальных и постнатальных яичниках соответственно. Отдельные каналы представлены в оттенках серого, чтобы показать ядерные и цитоплазматические сигналы. Белые поля обозначают области, увеличенные в левых нижних вставках. Два разных яичника показаны для P28. Яичник от контрольной необлученной самки (сверху) содержит большую популяцию мелких ооцитов в примордиальных фолликулах (см. вставку). Напротив, яичник у самки, облученной при Р7 с 0,5 Гр γ излучения (ИК), полностью лишен мелких ооцитов в примордиальных фолликулах (см. вставку). Закрытая стрелка указывает на ооцит с тонким слоем цитоплазматического окрашивания DDX4, характерным для первичных фолликулов, а открытые стрелки показывают более крупные ооциты внутри растущих фолликулов. Шкала стержней = 100 мкм; 30 мкм для врезок P28; 10 мкм для всех остальных врезок. Вставки содержат увеличенные виды 3D-визуализированных изображений, сгенерированных в IMARIS, и могут немного отличаться от изображений с низким увеличением из-за перспективы. Сокращения: Non-IR = контрольный необлученный; ИК = облученный при Р7 0,5 Гр γ-излучения; GCNA = ядерная кислотная пептидаза зародышевых клеток; DDX4 = геликаза МЕРТВОЙ коробки 4; LINE-1 = длинный перемежающийся ядерный элемент-1. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 4: Обработка изображений, 3D-отображение ооцитов и результаты количественной оценки. (A) 3D-рендеры из многофотонных изображений (слева) были обработаны в IMARIS с использованием фильтра Гаусса (средний), а ооциты малых и больших размеров были идентифицированы с использованием точечного признака (справа). В качестве примера показаны яичники P5 и P28. Шкала стержней = 100 мкм (P5); 10 мкм (вставки P5); 300 мкм (P28); 50 мкм (вставки P28). (B) Малые ооциты, положительные на GCNA, были количественно определены в яичниках с разных стадий с использованием точечных признаков (вверху). Чтобы проиллюстрировать уменьшение числа ооцитов во время развития, средний процент ооцитов был рассчитан на каждой стадии по сравнению со средним числом, присутствующим на самой ранней стадии, подсчитанным на E15,5 (дно). Обратите внимание на большое падение числа ооцитов с E15.5 до E18.5. Данные представлены в виде средств ± SD. Статистический анализ проводился с использованием программного обеспечения GraphPad Prism и анализировался односторонним ANOVA, а значимость была определена пост-специальным множественным сравнительным тестом Бонферрони. * P ≤ 0,05; P ≤ 0,0001; ns >0.05. Аббревиатура: GCNA = ядерная кислотная пептидаза зародышевых клеток; ns = незначимый. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 5: Обнаружение и количественная оценка экспрессии LINE-1 ORF1p в ооцитах плода. (A) 3D-визуализации из многофотонных изображений показывают экспрессию LINE-1 ORF1p (синий) в ооцитах плода E15.5 и E18.5 (отмеченных зеленым GCNA). (B) 3D-поверхности, сгенерированные в IMARIS с использованием изображений верхнего ряда в панели A. (C) Анализ интенсивности LINE-1 ORF1p показывает более высокую экспрессию LINE-1 ORF1p на ооцит при E18.5, чем E15.5. Шкала стержней = 100 мкм; 10 мкм (вставки панели А ); 30 мкм (вставки панели B ). Статистический анализ проводил ±ся с использованием программного обеспечения GraphPad Prism и анализировался t-тестом Стьюдента, а значимость определялась тестом Манна-Уитни U . P ≤ 0,0001; ns >0.05. Сокращения: GCNA = ядерная кислотная пептидаза зародышевых клеток; LINE-1 = длинный перемежающийся ядерный элемент-1. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 6: Метод оценки общего количества ооцитов в поврежденных образцах яичников с вычислительной коррекцией. (A) Модель GCNA-положительных (зеленых) ооцитов E15.5 с пятью 10% областями, выделенными красным, синим, серым, пурпурным и коричневым цветом в интактном яичнике. Каждое последующее изображение, после интактного яичника, представляет собой смоделированный яичник с 10% добавочными областями, отсутствующими до 50%. (B) Схема вычислительного метода оценки количества ооцитов в поврежденном образце. (C) Общее количество ооцитов в моделируемых яичниках сравнивалось с числами в исходных интактных яичниках (считается 100%), и разница представлена в виде % отклонения. Моделирование из шести отдельных яичников с отсутствующим объемом 10-50%. Шкала стержней = 80 мкм. Аббревиатура: GCNA = ядерная кислотная пептидаза зародышевых клеток. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Видео 1: 3D-рендеринг и 3D-моделирование ооцитов в Яичниках P5. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить это видео.

Решения и буферы	Реагент(ы)	Состав
Фиксирующий	Параформальдегид	4% (об/об)
Буфер пермеабилизации	Поливиниловый спирт (ПВА)	0,2% (мас./об.)
	Боргидрид натрия	0,1% (масс./об.)
	Тритон Х-100	1,5% (об/об)
Блокировка буфера	Бычий сывороточный альбумин (BSA)	3% (мас./об.)
	1 М Глицин (рН 7,4)	2% (мас./об.)
	Тритон Х-100	0,1% (об/об)
	200x Пенициллин-Стрептомицин	1% (об/об)
	10% азид натрия	0,2% (об/об)
	козья сыворотка	10% (об/об)
Буфер для стирки	ПВА	0,2% (мас./об.)
	Тритон Х-100	0,15% (об/об)
	10% азид натрия	0,1% (об/об)
Весы4(0) раствор (рН 8,1)	D-сорбит	40% (об/д)
	Мочевина	24% (мас./об.)
	Глицерин	10% (об/об)
	ДМСО	20% (об/об)
Решение ScaleCUBIC-1	Мочевина	25% (с об.)
	N,N,N',N'-Тетракис(2-гидроксипропил)этилендиамин	25% (об/об)
	Тритон Х-100	15% (об/об)
Раствор сахарозы	Сахароза	20% (мас./об.)
Решение ScaleCUBIC-2	Сахароза	50% (с об.)
	Мочевина	25% (с об.)
	Триэтаноламин	10% (с об.)
	Тритон Х-100	0,1% (об/об)

Таблица 1: Растворы и буферы.

Дополнительный рисунок S1: Настройки получения изображений. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Дополнительная таблица S1: Параметры получения изображений. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эту таблицу.

Discussion

В этой статье представлен подробный протокол 3D-иммуноокрашения и визуализации для пренатальных и постнатальных яичников для высокопроизводительных и сравнительных исследований для количественной оценки зародышевых клеток и локализации белка. Мы разработали этот протокол для анализа количества ооцитов в яичниках (N = 6-12) в шести точках времени развития в 10-16 различных штаммах, где 2-4 пластины 24 лунки обычно обрабатываются одновременно. Этот метод может быть адаптирован для других органов или клеточных маркеров. Например, этот протокол может быть использован для маркировки и визуализации соматических клеток, таких как клетки гранулезы в яичнике, с использованием соответствующих антител, что облегчает исследования взаимодействий соматико-половых клеток или развитие других типов клеток яичников.

Одним из ограничений этого протокола и комбинации антител является окончательная идентификация различных фолликулярных стадий. Пятна ДНК, используемые в иммунофлуоресценции и 2D-визуализации для идентификации фолликулярных стадий по слоям ядер гранулезных клеток, недостаточны для 3D-подходов. 4',6-диамидино-2-фенилиндол (DAPI) или Hoechst редко используются для окрашивания всего органа из-за ограниченного проникновения света и распада сигнала в середине большой ткани. Йодид пропидия (PI) представляет собой небольшую молекулу, способную проникать глубоко в ткань, но ее трудно захватить в многофотонной системе визуализации из-за спектрального перекрытия. Лучшее разрешение фолликулярных стадий может быть достигнуто дополнительными маркерами, специфичными для клеток гранулезы, такими как антимюллеров гормон (AMH) или FOXL2^47,48. Однако, хотя эти маркеры полезны для дифференциации более крупных растущих фолликулов, они не будут отличать первичные фолликулы от первичных. До тех пор, пока не станут доступны специфические маркеры для этих ранних стадий, маркеры ооцитов, такие как DDX4 или GCNA, предлагают лучший показатель развития фолликулов. Кроме того, этот протокол работает для пренатальных мужских половых желез, но еще не был протестирован в постнатальном яичке, где его размер может быть ограничивающим фактором. Ниже перечислены критические вопросы для лучшей визуализации и количественной оценки половых клеток в яичниках различных размеров, а также методы и шаги, предпринятые для обеспечения хорошего качества иммуноокрашивания для последующего анализа.

Первым критическим шагом является предотвращение повреждения яичников до и после фиксации. Поврежденные яичники могут не иметь частей структуры органа, что влияет на количество ооцитов и искажает результаты экспериментов. Чтобы предотвратить повреждение, дополнительную соматическую ткань оставляют прикрепленной к большему яичнику после рассечения, чтобы захватить щипцами для переноса яичников. Кроме того, для небольших яичников перенос их с помощью кончика пипетки, разрезанного достаточно широко, чтобы яичники легко помещались в кончике, позволяет избежать повреждения. Если незначительное повреждение тканей приводит к отсутствию части яичника, это может быть смягчено вычислительным методом, где общее количество ооцитов в поврежденном образце может быть экстраполировано с использованием неповрежденных образцов того же типа (рисунок 6).

Однако компьютерное моделирование показало, что точность прогнозирования уменьшается с увеличением размера поврежденной области (100,8% ± 0,2, 97,2% ± 1,5 и 90,3% ± 1 для 10, 20 и 30% повреждений, соответственно Рисунок 6C). Основываясь на моделировании, мы рекомендуем исключить из анализа образцы с потерей >30%. Несколько интактных яичников из одного и того же типа образца были использованы для расчета среднего количества ооцитов в области, аналогичной той, которая отсутствует в поврежденном образце. Это число затем использовалось для прогнозирования общего количества ооцитов в яичнике с повреждением. Использование площади аналогичного размера в том же яичнике, примыкающем к отсутствующей области, может быть использовано в качестве альтернативы, но не было протестировано.

Другая проблема заключается в том, чтобы избежать загрязнения клеток, которые могут вызвать автофлуоресценцию. Для пубертатных яичников перфузия, как описано выше, с 1x PBS и 1% PFA должна быть выполнена для устранения клеток крови, которые вызовут аутофлуоресценцию (рисунок 2C). Перфузия с PBS должна продолжаться до тех пор, пока органы, особенно яичники и почки, не очистятся от крови и не станут белыми до перехода на 1% PFA (Рисунок 1E,F). Неэффективная перфузия с PBS приведет к высокому фону, который может замаскировать и затруднить визуализацию малых ооцитов. Перфузия с более низким (1%) или более высоким (4%) процентом PFA приводит к лучшему качеству изображения, чем перфузия только с PBS; следовательно, был использован более низкий процент ПФА.

Оптимизация окрашивания антител требует внимания к нескольким переменным. Для стадии пермеабилизации было обнаружено, что 4 ч идеально подходит для этого анализа, с периодами более 4 ч (6-8 ч тестирования), что приводит к отсутствию окрашивания вообще. Поскольку количество и стоимость антител, используемых для крупномасштабных экспериментов по иммуноокрашиванию, могут быть высокими, этот протокол был протестирован и оптимизирован для повторного использования смесей антител без потери качества иммуноокрашивания. Для повторного использования смесь антител должна быть дополнена свежим антителом, как описано в протоколе. Этапы промывки также имеют решающее значение для качества иммуноокрашивания и должны выполняться дольше для достижения лучшего соотношения сигнал/шум во время визуализации и должны определяться для каждого выбранного антитела. Для достижения наилучших результатов мы рекомендуем готовить очищающий раствор ScaleS4(0) свежим для каждого использования, в то время как ScaleCUBIC-1 и ScaleCUBIC-2 можно хранить при комнатной температуре в темноте в течение ~ 1-2 месяцев.

Очистка ScaleCUBIC-1 выполняется при 37 °C; Важно отметить, что следует избегать более высоких температур, поскольку они приведут к осаждению реагентов, что может повлиять на качество иммуноокрашивания. Монтаж нескольких образцов для получения изображений может занять много времени. Агар или другие методы встраивания, используемые в других протоколах, являются трудоемкими и могут потребовать дополнительной повторной очистки образцов 47,49,50. Многоразовые силиконовые прокладки могут использоваться в качестве клеевых колодцев, которые просты в использовании с крышками и предлагаются в разных размерах и глубинах для размещения других размеров образцов. Для достижения высокого качества изображения необходимо использовать достаточный объем клирингового раствора; слишком мало приведет к ухудшению качества изображения, и слишком много раствора может просочиться в микроскоп. Этот шаг должен быть оптимизирован для конкретных образцов в зависимости от их размеров. Можно использовать посуду со стеклянным дном, но образцы должны быть обездвижены для визуализации, так как даже малейшие движения будут искажать изображение. Силиконовые прокладки могут использоваться в сочетании со стеклянной нижней тарелкой и верхним чехлом для иммобилизации образцов для визуализации. Однако это ограничит возможность перевернуть образец, если требуется визуализация с обеих сторон из-за размера яичника.

Другим важным выбором для этого крупномасштабного высокопроизводительного подхода была визуализация на платформе Leica DIVE/4TUNE/FALCON с двумя перестраиваемыми многофотонными (MP) лазерами Spectra-Physics. Преимущества использования платформы DIVE включают простоту монтажа образца (описанную выше), минимизацию оптических искажений (по сравнению с конфокальными платформами) и, самое главное, скорость обработки изображений и управление полученными данными изображения. Визуализация образцов с помощью многофотонных лазеров с более высоким увеличением (16x) намного быстрее и вызывает меньше фотоповреждений, чем конфокальные лазеры на Leica DIVE или SP8 с аналогичными настройками для получения изображений с помощью программного обеспечения LAS X. Пучок MP низкий, его флуорофорное возбуждение сильно локализовано в фокусной точке и достигает большей глубины при низком увеличении, не вызывая фотоповреждений, несмотря на большее количество пространственных / осевых этапов визуализации (конфокальные: ~ 300-400 секций максимум, MP: >800 секций).

Объектив 16x/NA0.6 позволяет корректировать незначительные несоответствия показателей преломления из-за распределения образца и крепления вдоль оптической оси с помощью механического корректирующего ошейника, который оптимально настроен для максимального сигнала на полпути к образцу. Кроме того, сферические структуры, такие как ооциты, могут быть искажены конфокальным получением изображения, поскольку может произойти глубинно-зависимая локализация конфокальной плоскости (сигнала) из-за несоответствия показателя преломления монтажа и образца при заданной настройке точечного отверстия (рисунок 2D). Поскольку флуоресцентный сигнал захватывается через внутреннее отверстие прибора для удаления нефокусированного сигнала, внутреннее оптическое искажение (сферическая аберрация) может ухудшиться глубже в образец, что проблематично для больших яичников (т. Е. ~ 400-600 микрометров толщины).

При одинаковых настройках коррекции объектива практически не может быть обнаружена сферическая аберрация в системе DIVE MP с изменяющимися длинами волн излучения, что упрощает исследования количественной оценки и совместной локализации (рисунок 2D). Наконец, мощный импульсный лазер позволяет возбуждать более низкую концентрацию флуорофора глубоко внутри образца, в частности, при его использовании с коррекцией возбуждения Z-глубины. Кроме того, захват более слабых сигналов также улучшается гибридным детектором MP (HyD-RLD), который представляет собой комбинацию обычных фотоумноживающих трубок и детекторов подсчета фотонов лавин, что позволяет более чем в 30 раз более высоко обнаруживать сигнал в широком диапазоне длин волн излучения.

Многофотонная микроскопия светового листа (LS) является еще одной новой платформой для 3D-визуализации тканей⁴⁷. Тем не менее, LS требует больше времени на настройку макроскопических образцов, включая встраивание агара и настройку для визуализации. Кроме того, изображения, полученные при более высоком увеличении при вращении образца, могут генерировать большие файлы >100 ГБ, которые могут потребоваться для удаления артефактов затенения светового листа (из-за несоответствия показателей преломления внешней среды и внутренней части образца или искажений поверхности образца). Представленный способ монтажа образцов в растворе в клеевых колодцах прост и быстр.

Кроме того, такой подход позволяет визуализировать несколько яичников в одной скважине с одной установкой и без переворачивания или вращения. Тем не менее, переворачивание «сэндвича» с крышкой может потребоваться для больших яичников. Система визуализации DIVE быстрее, чем конфокальная и LS; при 16-кратном увеличении препубертатный яичник визуализируется через 3-5 мин (Z-стадия 2 мкм), а пубертатный яичник через 1 ч (Z-шаг 5 мкм). Кроме того, файлы, генерируемые в LAS X, имеют управляемый размер (2-20 ГБ), что также имеет решающее значение для большого количества образцов для последующего анализа. Хотя этот протокол иммуноокрашения был оптимизирован для использования в сочетании с платформой DIVE, иммуноокрашенные образцы могут быть визуализированы с использованием других платформ MP / LS с некоторыми модификациями.

Преимуществом окрашивания всего яичника с помощью протокола 3D-моделирования является эффективный и относительно простой анализ данных по сравнению с ручным сбором данных в 2D-анализе. Программное обеспечение для 3D-визуализации и анализа IMARIS было выбрано потому, что оно коммерчески доступно и предлагается многими ядрами микроскопии, не требует навыков программирования и совместимо со многими программными платформами для сбора изображений, такими как LAS X от Leica или ZEN от ZEISS. С помощью IMARIS стандартные параметры настраиваются так, как указано в разделе протокола, и эти параметры могут использоваться для других изображений и образцов с незначительными изменениями, тем самым улучшая воспроизводимость и эффективность.

Анализ и количественная оценка изображений оптимизированы для программного обеспечения IMARIS; однако аналогичный анализ может быть выполнен на другом коммерческом программном обеспечении или программном обеспечении визуализации данных с открытым исходным кодом в соответствии с аналогичными принципами. В заключение, здесь был представлен оптимизированный протокол для визуализации целых яичников для количественного и качественного анализа. Это было целенаправленно адаптировано к требованиям высокопроизводительной обработки, которая будет все больше требоваться для токсикологического тестирования, клинических и диагностических целей и общегеномного анализа регуляторов достаточности и функции яичников.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Benchtop Incubator	Benchmark Scientific	H2200-H	37 °C incubator
Bovine Serum Albumin (BSA)	VWR	97061-416
C57BL/6J	The Jackson Laboratory	000664	mouse inbred strain
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Sigma-Aldrich	D1435	Hazardous material
D-Sorbitol	Sigma-Aldrich	S6021
Dumont #5 Forceps	FST	91150-20
FastWells Reagent Barriers	GraceBio	664113	Sticky and flexible silicone gasket (adhesive well)
Fine Scissors	FST	91460-11
Glycerol	Sigma-Aldrich	G2025
Glycine	ThermoFisher Scientific	BP381-500
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 647	Invitrogen	A-21246	Dilution 1:1000
Goat anti-Rat IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 555	Invitrogen	A-21434	Dilution 1:1000
Goat serum	Sigma-Aldrich	G9023
IMARIS Software	Oxford Instruments	Version 9.7.0	Image visualization and analysis software
Insight X3	Spectra-Physics	InSight X3 Tunable Ultrafast Laser	Laser for Multiphoton Imaging
LASX software	Leica	Version 3.5.6	Image acquisition software
Leica DIVE/4TUNE/FALCON	Leica	Leica Dmi8, 2P-M-ready: # 158005406	Multiphoton Microscope
MaiTai HP	Spectra-Physics	Mai Tai DeepSee One Box Ultrafast Laser	Laser for Multiphoton Imaging
Masterflex Pump Controller	SPW Industrial	Model: 7553-50	Peristaltic pump for perfusion
Mayo Scissors	FST	14010-17	5” –7” blunt/blunt scissors for decapitation
Micro Cover Glasses, Square, No. 1.5 25x25mm	VWR	48366-249
Mini BioMixer	Benchmark Scientific	B3D1020	shaker/nutator for 37 °C incubator
Nikon Ergonomic SMZ1270	Leica	SMZ1270	stereomicroscope
Paraformaldehyde 16% (formaldehyde aqueous solution)	Electron Microscopy Sciences	15710	Hazardous material
PBS Tablets, Phosphate-buffered Saline	ThermoFisher Scientific	BP2944100	Dissolve in Milli-Q water
Penicillin-Streptomycin, 200x, Dual Antibiotic Solution	ThermoFisher Scientific	ICN1670249
Polyvinyl alcohol (PVA)	Sigma-Aldrich	P8136
Quadrol (N,N,N′,N′-Tetrakis(2-Hydroxypropylethylenediamine)	Sigma-Aldrich	122262
Rabbit anti-DDX4/MVH	Abcam	ab27591	Dilution 1:500
Rabbit anti-LINE-1 ORF1p	Abcam	ab216324	Dilution 1:500
Rat anti-TRA98/GCNA	Abcam	ab82527	Dilution 1:500
Sodium azide	Sigma-Aldrich	S2002	Hazardous material
Sodium borohydride	Sigma-Aldrich	452882	Hazardous material
Sucrose	ThermoFisher Scientific	S0389
Tekmar Orbital Shaker	Bimedis	VXR-S10	shaker for room temperature
Triethanolamine	Sigma-Aldrich	90279
Triton X-100	Sigma-Aldrich	X100
UNOLOK Infusion Set	MYCO Medical	7001-23	needles for perfusion
Urea	Amresco	97061-920
X-Cite 120LED	Excelitas	S/N XT640-W-0147	low-power LED fluorescence lamp