Summary
在这里，我们提出了一种优化的方案，用于对整个卵巢进行成像，以使用全装载免疫染色，多光子显微镜以及3D可视化和分析进行定量和定性分析。该方案适用于高通量、可靠和可重复的处理，适用于毒理学、临床诊断和卵巢功能的基因组测定。
Abstract
女性的生育能力和生育寿命取决于卵巢卵母细胞储备的质量和数量。据估计，进入减数分裂前期I的女性生殖细胞中有80%在胎儿卵母细胞损耗（FOA）和产后第一周被消除。三种主要机制调节发育过程中存活的卵母细胞数量，并在进入青春期的女性中建立卵巢储备。在第一波卵母细胞丢失中，30-50%的卵母细胞在早期FOA期间被消除，这种现象归因于高长穿插核元素-1（LINE-1）表达。卵母细胞丢失的第二波是通过减数分裂质量检查点消除具有减数分裂缺陷的卵母细胞。第三波卵母细胞丢失发生在围产期，发生在原始卵泡形成期间，当时一些卵母细胞未能形成卵泡。目前尚不清楚是什么调节了这三波卵母细胞丢失中的每一波，以及它们如何塑造小鼠或人类的卵巢储备。
免疫荧光和3D可视化为在整个卵巢的背景下而不是在信息较少的2D部分中对卵母细胞发育进行成像和分析开辟了一条新的途径。本文为整个卵巢免疫染色和光学清除提供了全面的方案，产生了使用多光子显微镜成像和使用市售软件进行3D建模的准备工作。它展示了如何使用该方法来显示C57BL / 6J小鼠卵巢发育过程中卵母细胞损耗的动力学，并量化三波卵母细胞消除期间的卵母细胞丢失。该方案可应用于产前和产后早期卵巢，用于卵母细胞可视化和定量，以及其他定量方法。重要的是，该方案经过战略性开发，以适应高通量，可靠和可重复的处理，可以满足毒理学，临床诊断和卵巢功能基因组测定的需求。
Introduction
大多数哺乳动物雌性出生时就储存在原始卵泡内的微粒停滞卵母细胞数量有限，构成卵巢储备（OR）1，2。手术室决定了女性的总体生殖寿命和健康状况3.手术室通常随着年龄的增长而减小，并且在暴露于某些遗传毒性药物（放疗/化疗）和环境压力（营养不良）时可能会过早耗尽，从而导致不孕症4，5，6。特发性女性不育症通常可归因于从手术室发育的卵子的遗传和生理质量，并且仍然知之甚少7，8。由于女性卵泡禀赋在很大程度上是由出生预先确定的，因此了解手术室建立和维护所涉及的调节机制至关重要。
在小鼠中，OR的形成始于胚胎日（E）7.5 2左右原始生殖细胞（PGCs）的规格。PGCs迁移到生殖器脊，在那里它们将大约在E10.59之前居住。以下广泛的增殖发生在细胞分裂不完全的情况下，导致囊肿的形成，这些囊肿将在发育的后期被分解10，11。在大约E12.5时，确定性腺性别，卵巢中的PGC增殖停止。在女性中，PGC（现在是卵母细胞）以大约E13.512，13进入减数分裂前期I（MPI）。卵母细胞通过延长的MPI进展，并在出生时左右的口述阶段停止。在出生后的第一周，每个停滞的卵母细胞被颗粒细胞包围，从而形成原始卵泡。
女性手术室中原始卵泡的数量取决于有多少卵母细胞在MPI停滞之前和期间通过细胞凋亡，自噬或坏死发生的卵母细胞消除波中幸存下来14，15。第一波发生在胎儿发育过程中，被称为FOA。FOA是雌性（哺乳动物和非哺乳动物）的进化保守过程，估计有50-80%的卵母细胞被消除，这取决于雌性物种16，17，18，19。在小鼠中，FOA发生在E15.5至E18.5期间，并且已被归因于逆转录转座子LINE-1序列的再激活和表达导致卵母细胞死亡20，21。第二波卵母细胞消除通过减数分裂检查点发生，该检查点消除具有减数分裂缺陷的卵母细胞，例如未修复的DNA双链断裂（DSBs）22，23。下一波卵母细胞消除发生在囊肿分解期间，在原始卵泡形成过程中达到高潮，每个卵泡含有单个卵母细胞10，11，24，25。
在小鼠中，原始卵泡储备主要由青春期建立，之后随着原始卵泡在常规生殖周期中被激活而减少生长。OR大小因个体女性和小鼠的不同遗传菌株而异;然而，OR大小的遗传调控尚未得到很好的理解26，27，28，29。由于缺乏研究产前和产后发育过程中卵母细胞消除波的标准化方案，手术室调控的遗传学研究受到阻碍。已经在小鼠中开发了几种卵母细胞定量方法，其中最常见和最广泛使用的是组织学切片的组织形态学评估30，31。在这种技术中，卵母细胞在具有组织学染色的连续切片上被鉴定，例如苏木精和eosin（H&E）以及高碘酸 - 希夫（PAS）或荧光标记物。如果所有条件保持不变，包括切片厚度，整个卵巢所有切片的有效恢复以及各个实验室的计数方案，则该技术是可靠的。然而，不同实验室报告的数字往往有很大差异，因此不容易比较。
此外，鉴于遗传差异，使用不同的小鼠菌株也会影响卵母细胞计数。已经开发了用于组织形态学评估的其他计算方法，包括使用分馏器方法自动检测卵母细胞，使用计算算法自动计数和组织学图像的3D重建以防止同一卵母细胞的多个计数31，32，33，34，35，36.即使将这些改进添加到组织形态学评估中，该技术也是相对劳动密集型的，特别是对于大规模和高通量研究。由于计数方案，计算机算法和所用软件的差异，收集的数据在研究之间可能无法重复和可比。
最近，随着新型中分辨率多光子和光片显微镜和光学组织清除方法的发展，完整卵巢的3D建模和分析技术正在成为有效量化卵母细胞数量和研究蛋白质定位和动力学的首选方法37，38。与组织学方法相比，这些3D方法通常是有利的，因为组织和器官可以更好地保存并保持完整。此外，3D分析和建模提供了对细胞内和器官内细胞壁龛或亚结构内的功能和相互作用的额外见解，这些功能和相互作用在2D分析中可能会遗漏。
整个器官的 3D 分析需要优化单个器官（如卵巢）的固定、免疫染色和光学清除方案，而不会发生组织变形或损伤。高分辨率显微镜需要对成像样品安装进行额外优化，并且可能取决于可用的成像平台。最后，整个完整卵巢的成像为后续的计算分析生成了大量数据。因此，有必要开发标准化的3D方法来计数卵母细胞，以进行比较研究和跨发育阶段。
该协议使用标准的免疫染色和先前报告的清除协议，专注于简单，用户友好和高通量的方法38，39，40，41。该方案经过优化，可分析大量产前和产后卵巢，直至产后第28天（P28）以及来自不同小鼠遗传背景的不同大小的卵巢。免疫染色步骤对于所有阶段都是相似的;然而，青春期卵巢的清除方案不同，因为它们的大小较大，小卵巢和大卵巢的ScaleS4（0）和CUBIC分别为40，41。此外，在固定前在P28小鼠中进行全身灌注，以防止血细胞的自发荧光。在徕卡DIVE/4Tune平台上构建了一台多光子显微镜，作为光片显微镜的替代方案来获取图像，并且为该协议选择了带有各种分析工具的IMARIS 3D可视化和分析软件。该协议易于遵循，较少的动手操作，因此节省了时间。此外，卵母细胞定量相对较快，这取决于卵巢的大小和卵母细胞的排列。
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Protocol
所有使用的小鼠都是遗传菌株C57BL / 6J（见 材料表）。该菌株已经过完全测序，是许多卵巢结构和功能研究的标准。根据NIH指南饲养小鼠，并且执行的程序由杰克逊实验室的机构动物护理和使用委员会批准。该方案中使用的试剂和组合物分别列在 材料表 和 表1中。
1. 试剂的制备
- 固定剂：在1x PBS中制备4%多聚甲醛（PFA）。例如，对于 24 个样品（0.5 mL/样品 = 12 mL 总体积），将 3 mL 的 16% PFA 电子显微镜级加入 9 mL 的 1x PBS。
- 透化缓冲液
- 在需要透化缓冲液的前一天，将聚乙烯醇 （PVA） 测量到含有 1x PBS 的 250 mL 塑料烧杯中。搅拌溶液过夜，使PVA完全溶解。
- 将硼氢化钠加入溶解的PVA中，并使混合物均质化约3-5分钟。期待泡沫的解决方案。
- 将Triton X-100加入溶液中，并在Triton X-100溶解后使用缓冲液。
注意：PVA需要很长时间才能溶解（至少3小时），抗体的渗透取决于它的溶解程度。对于较大的卵巢，完全溶解PVA至关重要。
- 封闭缓冲液
- 将牛血清白蛋白（BSA）测量到具有1x PBS的烧杯中。搅拌溶液，直到BSA溶解。
- 加入甘氨酸，曲拉通X-100，青霉素 - 链霉素和叠氮化钠。搅拌直至溶液均质化。将缓冲液转移到瓶中并储存在4°C。 使用前添加正常的山羊血清。
- 洗涤缓冲液：将PVA测量到含有1x PBS的烧杯中。搅拌溶液过夜，使PVA溶解。加入曲拉通X-100和叠氮化钠。混合缓冲液后，将其储存在4°C。
- ScaleS4（0）溶液（pH 8.1）：将D-山梨糖醇溶解在PBS中，在烧杯中，在≤100°C下搅拌。 将尿素加入溶液中，一旦尿素溶解，关火，让溶液搅拌直至完全溶解。加入甘油和二甲基亚砜，搅拌直至溶液匀浆。将溶液在室温下储存在黑暗中。
注意：ScaleS4（0）溶液必须在清除卵巢的第一天新鲜。 - ScaleCUBIC-1 解决方案
- 将尿素溶解在含有PBS的烧杯中，在温度≤100°C下搅拌。 将 N，N，N′，N′-四（2-羟丙基）乙二胺测定到单独的烧杯中，然后加入溶解的尿素，并在≤100°C的温度下搅拌，直到试剂完全溶解。一旦所有试剂都进入溶液，关火，在室温下冷却。存放在黑暗中。
- 通过将溶液转移到过滤瓶中来脱气。将烧瓶连接到带有管道的真空上，盖上烧瓶，然后打开真空，直到溶液中的气泡消失。在此脱气后使用溶液。
注意：该溶液可以在黑暗中储存，最长可以使用一个月。
- 蔗糖溶液：将蔗糖溶解在1x PBS中;然后在使用前对溶液进行脱气。
注意：使用前新鲜准备溶液。 - ScaleCUBIC-2 解决方案
- 将蔗糖溶解在含有PBS的烧杯中，在≤100°C的温度下搅拌。 加入尿素并在≤100°C的温度下搅拌，直到尿素溶解。关火。
- 加入三乙醇胺和曲拉通X-100。搅拌直至溶液均质化。让溶液冷却至室温并存放在黑暗中。使用前对溶液进行脱气。
注意：该溶液可以在黑暗中储存，最长可以使用一个月。
2.产前卵巢的解剖和固定（图1A）
- 根据批准的机构方案，将成年雌性（≥8周）和雄配。每天早上检查阴道塞子。
注意：阴道栓塞的早晨被指定为后 0 . 5 天（ d . p . c ）或 E0 . 5 。 - 在解剖当天，准备4%多聚甲醛（PFA）并将约0.5mL等分试样放入微量离心管中，置于工作台侧（每个怀孕女性约4个）。
注意：PFA是一种有害物质，必须在化学罩下处理。 - 为每个怀孕的女性准备三个含有约10mL磷酸盐缓冲盐水（PBS）的100mm平板（用于收获子宫，用于解剖中胚层 - 卵巢复合物和分离卵巢）。
- 对携带首选发育阶段胚胎的怀孕女性实施安乐死，然后进行解剖。一次安乐死不超过1-2名女性。使用批准的方案对怀孕小鼠进行安乐死（例如，CO2 暴露后是宫颈脱位）。
- 一旦女性被安乐死，用70%乙醇喷洒腹部。使用镊子，抬起腹部皮肤，用剪刀通过腹部和体壁做一个V形切口。沿着切口的两侧切开，将皮肤剥离，露出子宫内的内脏和胎儿。
- 用镊子和剪刀，用胎儿切割子宫并将其与腹部脂肪和卵巢动脉和静脉分开。取出子宫并将其放入含有1x PBS的100毫米板中。通过切割子宫壁并刺穿卵黄囊将胎儿释放到PBS中。切断脐带。
注意：对于妊娠15天以下的胎儿，母亲安乐死和从子宫中取出可确保胎儿迅速死亡。妊娠至分娩超过15天的胎儿必须通过斩首实施安乐死。 - 将胎儿转移到带有新鲜1x PBS的新平板中。要将E15.5胎儿斩首，请用镊子将两个后肢小心地分开在板上，以固定胎儿。使用惯用手握住的第二对镊子，将脖子握在镊子叉之间，挤压以切断胎儿的头部，或使用剪刀切开颈部。
- 用惯用手镊子切开前肢下方，轻轻地将上半身拉开。接下来，将惯用手镊子的一个终点垂直插入腹膜腔，进入腹部区域的开口，而镊子的另一个终点保持在外面。关闭镊子，捏住体壁将其切开，并露出内脏。
- 使用相同的镊子，轻轻地去除器官，包括肠道和肝脏，直到肾脏和生殖器官变得可见。确定胎儿的性别：在E15.5时，卵巢具有细长的香肠状形状，而睾丸是椭圆形的。
注意：在早期阶段，可能需要基因分型来确定性别。 - 使用一对镊子，按住女性胎儿，并用其他镊子抓住每个中胚层 - 卵巢复合体，并将其与肾脏和Müllerian导管轻轻分开。将卵巢放在具有1x PBS的新平板中，保持中脑膜附着，但去除周围组织以确保卵巢暴露。将两个卵巢放入微量离心管中约0.5mL的4%PFA中，并在4°C下固定过夜。第二天，用70%乙醇代替PFA。
- 对于E18.5卵巢的解剖和固定，如上所述将胎儿与子宫分开，然后遵循第3节中描述的青春期前幼崽的方案（图1B）。
3. 青春期前卵巢的解剖和固定（图1B）
- 准备4%PFA并将约0.5 mL等分试样放入1.5 mL试管中，并将其放在工作台侧（约每只幼犬一管）。准备35毫米的板，含1x PBS（约每只幼犬一个）。使用批准的机构协议对幼崽实施安乐死。
注意：斩首是8天或以下小鼠安乐死的首选方法。新生小鼠可以使用3-4“解剖剪刀或5-7”梅奥剪刀斩首。 - 通过测量雄性比雌性更大的肛门生殖器距离来确定幼崽的性别。使用锋利的斩首剪刀将雌性幼崽斩首。将身体，开切面朝下，放在纸巾上以排出血液（约5-10秒）。
- 将小狗固定在每只脚的爪垫上，将别针固定在幼崽的背上。用70%乙醇喷洒腹部。使用镊子将幼犬的皮肤远离身体，并用剪刀在下腹部皮肤上做一个小的V形切口。
- 将剪刀插入皮肤下的切口，并沿着腹部两侧切开。使用镊子轻轻剥离皮肤并露出下腹部。轻轻地向上移动肠道，并将子宫角放在膀胱旁边。跟随每个子宫角朝向肾脏，并定位卵巢，每个肾脏下方有周围的脂肪组织。
- 要解剖卵巢，用一对镊子（镊子A， 图1B）将子宫角保持在卵巢和输卵管下方，然后轻轻地将其从身体上抬起。使用另一对镊子（镊子B），轻轻抓住第一对镊子下方，以便脂肪垫中的卵巢和输卵管在第二对镊子上方可见。然后，用剪刀切开第二对镊子下方或小心拉动以分离卵巢和附着的组织。
- 将分离的器官放在装有1x PBS的板中。修剪掉多余的脂肪组织、输卵管和子宫角，以清洁和隔离卵巢。小心地打开卵巢周围的滑囊，露出整个卵巢。
- 修剪滑囊膜而不损伤卵巢，并在肺门周围留下组织（卵巢和生殖道之间的韧带样结构）以处理卵巢，如图 1B，P5所示。一旦卵巢被修剪，将它们放在4%PFA中，并将卵巢固定在4°C过夜。第二天，用70%乙醇替换4%PFA并将卵巢储存在4°C，直到免疫染色方案步骤。
4.青春期卵巢的灌注、解剖和固定（图1C）
- 根据机构批准的方案将小鼠在化学通风橱中深度麻醉下灌注小鼠。准备灌注设备和试剂。请参阅 42 中的详细协议。
注意：灌注是一种终末安乐死手术，用组织固定剂代替整个血管系统的血液。 - 称量青春期雌性小鼠（P28）并记录小鼠的体重（通常在13g至15g之间）。计算要使用的批准的麻醉剂的量。
注意：此处，该方案每10克体重使用0.35毫升三溴乙醇。 - 使用10 mL一次性注射器和20G针头，用批准的麻醉剂填充注射器。将 20 G 针头更换为 26 G x 3/8 针头。
- 用一只手揉搓背颈皮肤，小心地约束小鼠。将鼠标翻转过来以露出腹部。将先前计算的麻醉剂量注射到腹膜腔中。将鼠标放在带盖的容器中，直到麻醉生效（即鼠标不再移动）。
- 一旦鼠标停止移动，轻轻捏住脚以检查是否有反应，并确保鼠标在开始灌注之前完全麻醉。将鼠标放在鼠标背上，轻轻地将四条腿通过爪垫固定在板上。确保双腿固定在放松的位置，不要过度伸展。
- 用70%乙醇从腹部喷洒小鼠到胸部区域。用镊子轻轻捏住腹部皮肤，然后用剪刀在皮肤和体壁上做一个小的V形切口。
- 将皮瓣从体腔中取出，然后将剪刀插入皮肤和体壁下方。将皮肤和体壁垂直向上切向头部，直到胸骨处胸腔边缘。
- 通过小心地将胸骨两侧的肋骨切开胸腔，直到肩胛骨正下方。注意不要刺穿肋骨笼下方的肺部。用镊子抓住皮肤/肋骨瓣并固定它们以暴露内脏器官。
- 轻轻修剪任何可能阻碍心脏进入心脏的组织，如胸腺。暴露所有器官，包括胃肠道，以便视觉确认整个身体都灌注，包括下腹部。
- 使用解剖剪刀剪断心脏的右心房，从系统中释放血液。用镊子轻轻握住心脏，并将灌注针（连接到蠕动泵控制器）插入左心室。
- 泵送约10毫升PBS，用温和但恒定的压力，直到肝脏，肾脏和生殖道等组织（图1E，F）从粉红色变为白色。接下来，用新鲜制作的1%PFA代替PBS，并继续用约10mL PFA灌注或直到小鼠下半身（例如尾巴）发生抽搐。
注意：这些固定性震颤表明灌注成功。 - 灌注完成后，将脂肪垫与肾脏下方的卵巢定位，并轻轻解剖整个生殖道，包括脂肪垫，卵巢和子宫角，并将该束放入具有4%PFA的小瓶中。在室温下固定卵巢过夜（约16-24小时）。然后，在开始免疫染色方案之前，用70%乙醇替换4%PFA至少一天并修剪卵巢（图1E，F），如上所述。
5.全位卵巢免疫染色（图2A）
注意：在免疫染色方案期间采用无菌技术，特别是在更换缓冲液时，以防止在延长的潜伏期内受到污染。
- 在24孔板中执行所有免疫染色步骤，如图 2A所示。调整其他格式的试剂量。仔细更换缓冲液，以避免丢失小的产前和青春期前卵巢。
注意：可以使用其他格式，例如48孔和96孔板，但是更深的孔和更窄的开口使得难以在不丢失或损坏卵巢的情况下吸入缓冲液。 - 第 1 天
- 将1 mL PBS/孔移液到干净的24孔板中所需的孔数中。切断200μL移液器吸头的尖端以形成宽开口，并使用它来轻轻地将1.5mL管中的70%乙醇转移到孔中。对于青春期卵巢，使用1000μL移液器吸头，尖端切下以进行转移。
注意：尖端的开口更宽，可防止转移过程中的组织损伤。 - 将所有样品转移到孔中后，使用新的吸头吸出PBS并用新鲜的0.8 mL PBS /孔替换它。将样品在室温下以〜100-150rpm的振荡器孵育过夜。开始制备透化缓冲液（见 表1 和1节）。
注意：新的尖端可防止卵巢粘附在尖端，PBS孵育步骤允许卵巢在PBS中平衡并在染色前补充水分。
- 将1 mL PBS/孔移液到干净的24孔板中所需的孔数中。切断200μL移液器吸头的尖端以形成宽开口，并使用它来轻轻地将1.5mL管中的70%乙醇转移到孔中。对于青春期卵巢，使用1000μL移液器吸头，尖端切下以进行转移。
- 第 2 天
- 完成透化缓冲液的制备。从孔中吸取PBS，并用每孔0.8 mL渗透缓冲液代替。将板放回摇床上，并将样品在室温下孵育4小时。
- 孵育4小时后，完全吸出透化缓冲液并用0.5mL封闭缓冲液替换（见 表1 和1节）。用parafilm密封板以防止蒸发，将样品置于摇摇杯上牢固覆盖的容器中，并在室温下在封闭缓冲液中轻轻搅拌孵育样品过夜（16-24小时）。
- 第 3 天
- 通过在封闭缓冲液中稀释来制备一抗。对于卵母细胞的可视化，使用卵母细胞标志物，例如，对于产前和青春期前卵巢的大鼠抗生殖细胞核酸性肽酶 （GCNA）/TRA98，对于青春期前和青春期前卵巢，使用兔抗死盒解旋酶 4 （DDX4）/小鼠血管同系物 （MVH）。为了量化LINE-1 ORF1p在产前卵巢中的表达，请使用兔抗LINE-1 ORF1p或其他可用的抗体。
注意：GCNA / TRA98信号在青春期卵巢中无法检测到。 - 从样品中吸出封闭缓冲液，并用0.5mL稀释的一抗代替。用石蜡膜密封板以防止蒸发。将板放在带盖的容器中，以防止样品在孵育过程中干燥。将容器放在摇摇杯上，并在室温下将样品孵育3-4天。
- 通过在封闭缓冲液中稀释来制备一抗。对于卵母细胞的可视化，使用卵母细胞标志物，例如，对于产前和青春期前卵巢的大鼠抗生殖细胞核酸性肽酶 （GCNA）/TRA98，对于青春期前和青春期前卵巢，使用兔抗死盒解旋酶 4 （DDX4）/小鼠血管同系物 （MVH）。为了量化LINE-1 ORF1p在产前卵巢中的表达，请使用兔抗LINE-1 ORF1p或其他可用的抗体。
- 第 7 天
- 轻轻地从平板上取出副膜，并从样品中吸取一抗混合物。将一抗混合物储存在4°C（长达一个月或三次使用），并通过补充新鲜抗体（例如，每5毫升先前使用的混合物中2μL新鲜抗体等分试样）来重复使用它们。
- 每孔向样品中加入1mL洗涤缓冲液（见 表 1和1节），并轻轻摇动板几秒钟以冲洗掉残留的抗体。小心地吸出并用0.8 mL新鲜洗涤缓冲液替换洗涤缓冲液，并在室温下摇动板过夜。
- 第 8 天
- 吸出过夜洗涤缓冲液，用0.8mL新鲜洗涤缓冲液代替，并在室温下摇动2小时。用新鲜的洗涤缓冲液重复洗涤步骤，再重复2小时。
- 最后一次洗涤后，用在封闭缓冲液中稀释的0.5mL二抗混合物替换洗涤缓冲液，例如，山羊抗鼠Alexa Fluor 555和山羊抗兔Alexa Fluor 647以1：1，000稀释。为每次免疫染色实验制备新鲜的二抗混合物。
- 用石蜡膜密封板，以防止在孵育过程中蒸发。将样品在室温下在黑暗中或在覆盖有铝箔的板中孵育3天，轻轻搅拌3天。
注意：此步骤和所有后续步骤在黑暗中或使用铝箔包装进行。
- 第11天
- 抽吸二抗混合物，并用1 mL洗涤缓冲液进行初始洗涤。轻轻摇动平板几秒钟，以冲洗掉残留的二抗。
- 吸出洗涤缓冲液，用0.8mL新鲜洗涤缓冲液代替，并将样品在室温下振荡孵育2小时，避光。重复洗涤步骤2次，共3次洗涤。第三次洗涤后，继续进行清除步骤（第6节）。
6.清除免疫染色的全胰卵巢（图2A）。
注：通过将板包裹在铝箔中或放置在不透明的容器中，在黑暗中执行所有清除步骤。青春期前和青春期卵巢的清除步骤不同。
- 第11天 [产前和青春期前卵巢以一步法清除]
- 最后一次洗涤后，吸出洗涤缓冲液，并用0.8 mL新鲜制作的ScaleS4（0）溶液代替（见 表1 和第1节）。用parafilm密封板，并在室温下摇动将样品在黑暗中孵育三到四天，然后成像。
- 如果需要，每天用新鲜的溶液替换ScaleS4（0）溶液;更换溶液时要小心，因为清除的卵巢变得透明且难以看到。清除后，继续进行样品设置和成像（第7节）。
注：更改解决方案并未显著提高图像质量。日常变化会增加丢失小样本且大部分透明样本的可能性。
- 第11-15天[以两步方案清除耻骨卵巢]
- 在最后一次免疫染色洗涤后，吸出洗涤缓冲液并用0.8 mL ScaleCUBIC-1替换（见 表1 和第1节）。用parafilm密封板，并在37°C下轻轻摇动样品3天。每天用新鲜的溶液替换ScaleCUBIC-1溶液。
- 在第15天，在室温下用0.8mL PBS洗涤样品3次，每次10分钟，轻轻摇动。用0.8毫升用PBS新鲜制备的脱气20%蔗糖代替PBS。在室温下轻轻摇匀1小时。
- 用0.8 mL ScaleCUBIC-2溶液替换20%蔗糖溶液（见 表1 和1节），用parafilm密封板，并在室温下轻轻摇动，每天更换ScaleCUBIC-2溶液。清除4-5天，然后继续成像。更换溶液时要小心，以避免样本丢失，因为清除的卵巢是透明的，难以看到。继续进行样品设置和成像（第 7 节）。
7. 使用多光子显微镜进行样品设置和成像
注：下面描述的所有步骤都是使用徕卡DIVE/4TUNE/FALCON执行的，该激光器带有两个可调锁模Ti：Sapphire多光子激光器，脉冲持续时间为120 fs，多浸入16x / NA0.6物镜（浸入液=甘油），最大工作距离为2.2 mm。有关图像采集软件的详细信息，请参阅 材料表 。 补充表 S1 和 补充图 S1 显示了用于此协议的设置。对于其他成像平台，请咨询显微镜核心或遵循制造商的规格/建议。
- 示例设置
- 准备用于装载示例的设置。例如，使用粘性和柔性硅胶垫圈来形成粘合井。将粘合剂孔放在一个25 mm x 25mm No. 1.5微盖玻片上，以形成一个将卵巢放置在其中的孔（图2B）。
注意：厚度为1 mm的垫圈可容纳所有尺寸的卵巢。建议进行此设置，因为它可以消除成像过程中的卵巢运动，当卵巢被放置在玻璃底培养皿中的安装剂中时，可能会发生这种情况。 - 使用切下吸头的移液器吸头（产前和青春期前为20μL），将卵巢与〜5-10μLScaleS4（0）溶液转移到粘合剂的中间，如图 2B所示。对于青春期卵巢，使用200μL移液器尖端，尖端切除足够远以转移卵巢。将~15-20μLScaleCUBIC-2溶液加入粘合剂孔的中间。
注意：过多的溶液可能会导致泄漏到显微镜载物台上，而过少的溶液会导致图像质量差。使用解剖显微镜转移样品，因为清除的卵巢变得透明且难以看到。 - 一旦卵巢用一滴清除溶液转移到单个孔中，轻轻地将另一个盖玻片放在粘合剂孔上，按压以形成密封，并将样品保持在夹在两个盖玻片之间的小清除溶液池中（图2B）。对于成像，将盖玻片“三明治”放置在3D打印的显微镜适配器载玻片中（例如，43 ）。
注意：在解构“三明治”并用水清洗后，粘合剂孔可重复使用。
- 准备用于装载示例的设置。例如，使用粘性和柔性硅胶垫圈来形成粘合井。将粘合剂孔放在一个25 mm x 25mm No. 1.5微盖玻片上，以形成一个将卵巢放置在其中的孔（图2B）。
- 影像学检查（补充表 S1 和 补充图 S1）
- 根据显微镜核心或制造商的指南打开显微镜和软件。将安装的样品放在显微镜载物台上，通过目镜观察，以定位用低功率LED荧光灯点亮的样品。
- 找到样品后，打开激光器并将每个检测器分配给特定的Alexa Fluor染料/标记物。对于多个激光器，允许顺序图像采集。在切换激光器之前获取整个堆栈。
注意：对于该方案，使用一个激光器进行555 nm和647 nm荧光团的图像采集。 - 根据显微镜核心或制造商的规格设置图像采集参数。使用双向图像采集（如果可用）可缩短扫描时间并提高效率。调整其他设置，包括 线条平均值 （1）、 帧平均值 （1） 和 帧累加 （1）。
注意：双向图像采集允许激光在X轴上移动时在两个方向上进行扫描。 - 通过识别开始（样品底部/底部玻璃盖）和结束位置（样品顶部/顶部玻璃盖）来设置Z-Stack。对于青春期前卵巢，选择 Z 步长为 2 μm，对于青春期卵巢，选择 5 μm 的 Z 步长 。
- 激活 Z 补偿功能，并在此功能中激活 激励增益。通过为底部（低强度）和顶部堆叠（高强度）选择 激光强度 ，为样品的底部和顶部设置Z补偿。参见 补充图S1，线性Z补偿，其中选择了激励增益框，底部（0）和顶部（347.75）的激光强度分别设置为10和12。
- 对于无法在单个视场中捕获的较大样本，请使用切片模式。激活图像导航器，并使用矩形标记工具指示捕获整个样品所需的切片数。
- 开始图像采集。对于具有多个切片的图像，请使用 导航器 启动图像采集以捕获所有切片。图像采集完成后，首先 保存 所有图像，如果采集了多个切片，则运行 镶嵌合并工具 将切片合并到单个图像中。
- 将合并的文件保存到单独的项目文件夹中，以便更轻松地处理千兆字节大小的图像。使用3D图像可视化和分析软件传输文件以进行图像处理。 图3 显示了使用两个标记（GCNA和DDX4）在不同阶段拍摄的代表性图像。
8. 图像处理
注：下面描述的所有步骤都是使用IMARIS 3D图像可视化和分析软件开发和执行的。
- 将图像导入3D图像可视化和分析软件，并在需要时将文件从原始格式（例如，.lif，.czi，.lsm，.lei，.oib，.oif，.nd2）转换为.ims格式。
- 如果需要，使用高斯滤波器处理图像以减少像素化（图4A）。使用 3D 视图 功能，定位图像并取消选择 帧选项 （以删除帧）。
注意：还有其他可选滤镜，也可用于减少像素化和降低背景强度。 - 将图像放大到特定比例并使用 “快照”功能。按如下方式设置首选项：选择 300 DPI、另存为 TIFF 图像和 透明背景。拍摄图像的快照并保存。 图 3 显示了完整的组装映像。
9. 卵母细胞定量
注意：整个卵巢免疫荧光和3D图像可视化和分析可用于使用Spot特征估计整个卵巢中的卵母细胞数量（图3和图4）。GCNA信号可用于定量产前和青春期前卵巢中的卵母细胞，如图4（P5）所示。在青春期卵巢中，使用DDX4信号量化非生长卵泡（“环状”结构，闭合箭头）和生长卵泡（大结构，开放箭头，图4，P28）中的两个卵母细胞群。
- 确定将用作参数的卵母细胞的大小，以在步骤9.2中使用 Spots 特征量化卵母细胞。
- 打开图像，然后选择“ 切片 ”选项以打开 Z 堆栈图像。
- 在“测量”面板中选择“线”选项，并通过绘制一条从卵母细胞/标记物的一条边缘到另一条最宽点边缘的线来测量距离，以确定要计数的卵母细胞类型/大小的XY直径。在堆栈中移动并获得相同类型的多个卵母细胞的直径范围。使用最短长度作为卵母细胞计数的大小选择标准。
-
点功能：选择 3D 视图选项，然后激活“场景”面板中的“添加新点”功能以打开“算法”面板。取消选择所有算法设置，因为将使用在步骤9.1中获得的卵母细胞大小的尺寸选择过滤器。
- 单击 单个向前箭头 移动到 源通道。选择带有首选标记的 通道 ，然后键入在步骤 9.1 中获得的 估计 XY 直径 。例如，对于产前卵母细胞使用估计的XY直径为7μm，对于P5卵母细胞使用11μm（GCNA =绿色信号; 图 3 和 图 4A）。
- 使用30μm的DDX4信号来估计P5卵巢中生长卵泡中的卵母细胞数量（DDX4 =洋红色信号; 图 3 和 图 4A）。对于青春期卵巢，使用DDX4信号进行卵母细胞定量。例如，分别使用15μm和80μm的XY直径来鉴定非生长卵泡和生长卵泡内的卵母细胞，如图 4A所示。
注意：所选尺寸可能因图像采集标准和所用显微镜类型而异。遗传菌株的选择也可能有所不同，因为具有更多卵母细胞的卵巢将需要更小尺寸的选择才能更好地自动检测卵母细胞。 - 选择尺寸后，激活自动确定的 模型 PSF 伸长率 和 背景减法。选择 单个前进箭头 以移动到 “滤波点” 面板。添加 质量 筛选器并确定阈值。为确保准确估计卵母细胞数量，请在调整阈值时放大图像以选择选择大多数卵母细胞的阈值。单击 双箭头 以完成自动计数。
- 使用“编辑”选项卡手动检查选定的卵母细胞，以选择遗漏的卵母细胞或取消选择由自动阈值选择的非卵母细胞颗粒。在总体选项卡下的统计选项卡中记录数据，以便进一步分析。
注意：用于计数斑点的参数可以保存并用于另一个样品集，但建议在运行批次分析之前进行手动检查。 - 要存储参数，请单击“ 创建 ”选项卡，然后单击“ 存储批处理参数”。
注意：核标志物（GCNA +卵母细胞， 图4A）很容易通过斑点特征识别，并且可能不需要太多的手动调整。然而，细胞质标志物（DDX4 +卵母细胞， 图3 （P28，闭合箭头）和 图4A）将需要更多的手动调整，以确保识别正确的卵母细胞大小/类型。
10. 卵巢中蛋白质表达的定量
注意：有几种方法可以使用 斑点 特征（第9节和步骤10.1）和表面特征（步骤10.2）来量化特定标记 物的 卵母细胞表达。 斑点 特征可用于具有不同定位模式的蛋白质，如核标记（GCNA）， 表面 特征可用于具有不均匀定位模式的蛋白质，如图5A所示，其中测量了 E15.5 和E18.5卵巢中的LINE-1 ORF1p强度。为了计算和比较两个样品（例如，时间点，处理或基因型）之间目标蛋白质的强度，收集具有相同性质的图像。使用具有更强烈信号的样品来确定可以存储并用于其他样品的参数。
- 为了获得具有 斑点 特征的蛋白质表达，首先将卵母细胞识别为突出显示的卵母细胞（第9节）。
- 然后在 “点” 功能下，选择“ 统计 ”选项卡，然后选择“ 详细信息 ”选项卡。单击 向下箭头 并选择“ 特定值”，这将在其下方打开另一个包含不同测量值的选项卡。选择用于表面生成通道的 “强度平均值 ”（或选择其他强度测量值，如“ 强度中位数”）。
- 要获取组合/平均统计信息，请选择 平均值 标准。完成后，导出并保存数据以供进一步分析。
- 要使用表面特征获取蛋白质表达，请打开图像，选择“3D 视图”选项，然后在“场景”面板中激活“添加新表面”功能以打开“算法”面板。如果不需要，请取消选择所有算法设置，然后单击单个向前箭头以移动到源通道。
- 选择具有要测量的抗体信号的通道。要选择的其他属性是特定于用户的选项。在这里，LINE-1信号被用作标记。“曲面细节”和“背景减法（局部对比度）”值分别保持为默认值 1.42 和 5.33。
- 单击 向前箭头 移动到 “阈值” 面板。选择两个样本中具有可比性的阈值（例如，此处使用 E18.5 中的 LINE-1 表达式来选择阈值）。选择 “启用 ”，默认 种子点直径 为 7.10（此值对于图像是最佳值，但可能取决于要素的预期像素大小）。
- 单击 向前箭头 移动到 “滤镜曲面” 面板。使用 质量 过滤器，并将该值与 阈值 一样基于两个卵巢样品中蛋白质的表达。选择过滤器属性后，单击 向前双箭头 以完成曲面的生成。
- 要获取强度值，请选择 统计 选项卡，然后选择 详细 选项卡。单击 向下箭头 并选择“ 特定值”，这将在其下方打开另一个包含不同测量值的选项卡。
- 选择用于表面生成通道的 “强度平均值 ”（或选择其他强度测量值，如 “强度中位数”）。
- 要获取组合/平均统计信息，请选择 平均值 标准。完成后，导出并保存数据以供进一步分析（图5C）。
11. 通过计算校正估计受损卵巢的总卵母细胞数量
注意：如果在解剖过程中发生轻微的卵巢损伤，则可以计算估计总卵母细胞计数。建议使用来自相同菌株和发育阶段的完整卵巢进行卵母细胞数量的估计，如图 6所示。在E15.5处对卵巢进行的模拟表明，纠正≥30%的损失会导致与实际数字的显着偏差（图6C）。
- 使用 IMARIS 打开完整卵巢的图像，然后选择“框架”功能。在“帧设置”下，选择“框”、“网格”、“刻度线”和“轴”标签。在位置 X/Y/Z 选项卡下，选择 200 μm 以在所有 X/Y/Z 位置生成具有 200 μm 空间的刻度线。
注意：刻度线在X，Y和Z平面中创建网格/标尺，以识别特定区域内的卵母细胞。 - 激活斑点特征以识别第9节中突出显示的卵母细胞（图4）。通过在“斑点”特征的“点样式/质量”选项卡下选择“球体”，使用用于模拟的所有完整卵巢中识别的卵母细胞创建 3D 模型。
注意：像素 宽度 也可以在 “点样式/质量 ”选项卡下进行更改。 - 使用步骤11.1中生成的框，以 与图6A所示相同的方向对齐完整卵巢的3D模型。
- 使用200μm刻度线（步骤11.1），选择落在每个卵巢体积的50%以内的卵母细胞。单击 “斑点 ”特征，然后选择 “编辑标签” ，按颜色对落在 50% 区域内的卵母细胞进行分类，如图 6A 所示。
注意：一旦卵母细胞在一个区域中分类，将提供属于每个类别的卵母细胞数量。 - 放大到50%区域，并将 刻度线 从 200μm 更改为 50μm ，以制作更小的尺子用于卵母细胞识别。保持所有图像的缩放百分比。以 50 μm 刻度线为指导，将 50% 区域分成五个相等的部分。
注意：每个部分内的卵母细胞将代表体积的10%，如图 6A所示，其中完整的卵巢显示卵巢上半部分的卵母细胞，按五种不同的颜色分类，每种颜色代表10%体积区域内的卵母细胞。 - 记录每个10%区域中的卵母细胞数量，如图 6A，B所示。计算 10%、20%、30%、40% 和 50% 增量的卵母细胞平均数量。
- 使用步骤11.1至11.6中突出显示的在受损的部分卵巢中获得卵母细胞数。将受损的卵巢定位在与完整卵巢相同的方向，并如上所述估计缺失的体积/百分比。
- 为了估计 整个 卵巢中的总卵母细胞数量，将计算的与从部分卵巢获得的数量相似的卵母细胞的平均数量相加（图6B）。
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Representative Results
整个卵巢的免疫染色和成像可以使用相同的技术和标记物对卵巢中不同发育阶段的卵母细胞或蛋白质表达进行可视化和定量（图3）。该协议是为一个大型项目开发的，该项目需要在多个阶段和多个小鼠品系中分析卵巢。在这里，我们介绍了为C57BL6 / J菌株收集的数据，C57BL6 / J菌株是用于遗传分析的标准菌株。这里介绍的技术很简单，可以在14-19天内获得结果（图2D），可用于产前，青春期前和青春期女性的卵巢（图1和图2A，B）。
这种方法用于研究卵巢卵母细胞储备形成过程中自然发生的卵母细胞丢失的动力学。在包括小鼠在内的许多生物体中，卵母细胞数量被认为在卵母细胞进入减数分裂~E13.5的胎儿生命期间达到峰值。由于胎儿卵母细胞损耗（FOA）（从~E15.5到E18.5）的尚未完全理解的过程，卵母细胞数量减少，这在机械上与反转座子LINE-120，21的表达有关。由于减数分裂质量检查点22，23消除了异常卵母细胞，因此在E18.5至P0之后消除了更多的卵母细胞。为了使用该协议研究这些过程，我们使用DDX4和GCNA作为卵母细胞标志物对不同发育阶段的卵巢进行免疫染色和成像 ，如图3所示。
表达GCNA和DDX4的小卵母细胞从E15.5开始可见，它们代表MPI期间的卵母细胞或在原始卵泡内的dictyate处停滞。在P2卵巢中已经检测到具有强DDX4表达的较大生长卵母细胞，它们最有可能代表第一波卵泡44。在 P5 和 P28 卵巢中可见越来越多的较大卵母细胞。使用IMARIS软件处理通过多光子显微镜获得的图像（图4A），并根据核GCNA信号和DDX4信号描绘的大小进行3D渲染以识别小的和较大的生长卵母细胞（图4A 和 视频1）。按照方案中所述对卵母细胞进行计数，结果总结在 图4B中。与以前的研究一致，我们观察到从E15.5到E18.5（~32%）和E18.5到P2（~24%）的显着卵母细胞丢失。当女性进入青春期（P28）时，只有约30%的卵母细胞在E15.5时存活下来。
这种方法也可用于观察诸如辐照之类的遗传毒性治疗的后果，这已被证明可以在一周内完全消除原始卵泡储备23，38，45。 图3 中，用辐射治疗的整个卵巢和未经治疗的对照之间有显着的视觉差异（比较来自治疗和未治疗的女性的P28卵巢）。在没有辐射暴露的P28卵巢中，我们观察到两个用DDX4标记的卵母细胞群;原始卵泡中丰富的小卵母细胞（闭合箭头）;和通常在生长中的卵泡（例如，原发性、继发性和前窦）中发现的各种大小的较大卵母细胞（图 3）。相比之下，暴露于P7处0.5Gy γ辐射的女性卵巢在原始卵泡中完全没有小卵母细胞，正如先前在2D切片中观察到的那样。有趣的是，只有大小相似的较大卵母细胞才能在辐射中幸存下来。这些可能是已经在P7卵巢中生长的第一波卵泡，因为它们已知对辐射46 具有抵抗力（图3，P28）。
除了卵母细胞数量的定量外，该方案还可用于参与卵母细胞发育的其他蛋白质的免疫染色和定量分析。例如，我们使用针对LINE-1ORF1p蛋白的抗体，LINE-1ORF1p蛋白是一种RNA结合伴侣蛋白，由LINE-1反转录转座子产生（图5）。LINE-1元素的丰度从E15.5增加到E18.5已被提出导致卵母细胞消除20，21。事实上，在IMARIS中使用多光子捕获的图像和信号强度分析，观察到在此期间卵母细胞中的LINE-1 ORF1p水平显着增加，这与卵母细胞数量的显着下降相关，如图 4B所示。
在卵巢的一部分受损或丢失的情况下，来自相同菌株和发育阶段的卵巢可用于计算估计缺失区域内的卵母细胞数量，如图 6所示。来自E15.5卵巢的数据用于模拟，以测试计算校正的准确性。在计算上可以估计，卵巢中组织损伤高达30%的卵母细胞与完整卵巢中的卵母细胞相比有≤10%的偏差，这表明3D卵巢染色和建模可以有效地用于从珍贵组织中挽救数据。在E15.5处对卵巢进行的模拟表明，纠正≥30%的损失会导致与实际数字的显着偏差（图6C）。
图1：产前和产后女性的卵巢解剖和灌注。（A-C）不同阶段的卵巢解剖需要不同的技术，这些技术以示意性的方式描述以补充视频中的描述。（D）产后第5天（P5）的卵巢比P28小得多，这需要不同的清除方案，如方案中所述。（英、华）卵巢的适当灌注对于消除红细胞的背景染色非常重要。非灌注生殖道和卵巢具有粉红色调，而灌注器官将变为白色。缩写：RI = 非灌注生殖道。图像A-C是用 BioRender.com 创建的。请点击此处查看此图的大图。
图2：整个小鼠卵巢的免疫染色，清除和成像。 （A）流程图描述了产前/青春期前和青春期卵巢的免疫染色和清除方案的共享和特定步骤。（B）清除的卵巢安装在夹在两个盖玻片之间的粘合剂中间的一滴清除溶液中。为了成像，将安装的样品放置在3D打印的适配器载玻片中。（C）非灌注卵巢与灌注卵巢的灰度多光子图像，用卵母细胞标记DDX4免疫染色，显示灌注后图像质量改善和非特异性染色降低。闭合箭头表示具有薄层细胞质DDX4染色的卵母细胞，典型的原始卵泡，而开放的箭头显示生长中的卵泡内较大的卵母细胞。星号表示血管自发荧光。（D）来自P5卵巢的共聚焦与多光子图像的3D渲染，用卵母细胞标记GCNA（绿色）和DDX4（洋红色）免疫染色，从共聚焦显微镜显示显着的球面像差，从多光子中几乎没有。比例尺 = 100 μm （C， D） 和 50 μm （ D 中的插图）。缩写：GCNA =生殖细胞核酸性肽酶;DDX4 = 死盒解旋酶 4。映像 A 是使用 BioRender.com 创建的。请点击此处查看此图的大图。
图3：不同发育阶段卵巢的代表性3D渲染图像。 分别在产前和产后卵巢中免疫染色有GCNA（绿色）和LINE-1 ORF1p（蓝色）或DDX4（洋红色）的整个坐骑卵巢的多光子图像的3D渲染。单个通道以灰度呈现以显示核和细胞质信号。白色框勾勒出左下角插图中放大的区域。P28显示了两个不同的卵巢。来自对照非辐照女性的卵巢（上图）在原始卵泡中含有大量小卵母细胞（见插图）。相反，在P7处照射有0.5 Gy γ辐射（IR）的女性卵巢在原始卵泡中完全没有小卵母细胞（见插图）。闭合箭头表示具有薄层细胞质DDX4染色的卵母细胞，典型的原始卵泡，而开放的箭头显示生长中的卵泡内较大的卵母细胞。比例尺 = 100 μm;30 μm，用于 P28 插入;10 μm，用于所有其他插图。插图包含在 IMARIS 中生成的 3D 渲染图像的放大视图，并且由于透视，可能与低放大倍率图像略有不同。缩写：非IR=控制非辐照;IR = 在P7处照射，γ辐射0.5 Gy;GCNA =生殖细胞核酸性肽酶;DDX4 = 死盒解旋酶 4;LINE-1 = 长散布的核元素-1。 请点击此处查看此图的大图。
图4：图像处理，卵母细胞的3D显示和定量结果。 （A）使用高斯滤光片（中）处理来自多光子图像的3D渲染（左），并使用斑点特征（右）鉴定出大小和大尺寸的卵母细胞。P5和P28卵巢如图例所示。比例尺 = 100 μm （P5）;10 μm （P5 插图）;300微米（P28）;50 μm（P28 插图）。（B）使用斑点特征在卵巢中定量GCNA阳性的小卵母细胞（上图）。为了说明发育过程中卵母细胞数量的减少，与E15.5（底部）计数的最早阶段存在的平均数量相比，在每个阶段计算了卵母细胞的平均百分比。请注意，卵母细胞数量从E15.5大幅下降到E18.5。使用GraphPad Prism软件进行统计分析，并通过单向方差分析进行统计学分析，并通过Bonferroni的 事后 多重比较检验确定显著性。 ±* P ≤ 0.05;P ≤ 0.0001;ns >0.05.简称：GCNA =生殖细胞核酸性肽酶;ns = 不显著。 请点击此处查看此图的大图。
图5：胎儿卵母细胞中LINE-1 ORF1p表达的检测和定量。 （A）来自多光子图像的3D渲染显示E15.5和E18.5胎儿卵母细胞（由绿色GCNA标记）中的LINE-1 ORF1p（蓝色）表达。（B） 使用面板 A 中的顶行图像在 IMARIS 中生成的 3D 表面。（C）LINE-1 ORF1p强度分析显示，E18.5时每颗卵母细胞的LINE-1 ORF1p表达高于E15.5。比例尺 = 100 μm;10 μm （面板 A 插图）;30 μm（面板 B 插图）。± 使用GraphPad Prism软件进行统计分析，并通过学生的 t检验进行分析，并通过曼-惠特尼 U 检验确定显著性。P ≤ 0.0001;ns >0.05.缩写：GCNA =生殖细胞核酸性肽酶;LINE-1 = 长散布的核元素-1。 请点击此处查看此图的大图。
图6：通过计算校正估计受损卵巢样本中总卵母细胞数量的方法。 （A）GCNA阳性（绿色）E15.5卵母细胞模型，其中5个10%区域在完整的卵巢中以红色，蓝色，灰色，品红色和棕色突出显示。在完整的卵巢之后，每个后续图像代表一个模拟卵巢，其中10%的增量区域缺失高达50%。（B）估计受损样品中卵母细胞数量的计算方法示意图。（C）将模拟卵巢中的总卵母细胞数量与原始完整卵巢中的数字（考虑为100%）进行比较，并将差异表示为%偏差。从六个单独的卵巢中模拟，缺少10-50%的体积。比例尺 = 80 μm。缩写：GCNA =生殖细胞核酸性肽酶。 请点击此处查看此图的大图。
视频 1：P5 卵巢中卵母细胞的 3D 渲染和 3D 建模。请单击此处下载此视频。
| 溶液和缓冲液 | 试剂 | 组成 |
| 固定 | 多聚甲醛 | 4% （v/v） |
| 透化缓冲液 | 聚乙烯醇 | 0.2% （无/v） |
| 硼氢化钠 | 0.1% （无/v） | |
| 曲拉通X-100 | 1.5% （v/v） | |
| 封闭缓冲液 | 牛血清白蛋白 | 3% （w/v） |
| 1 M 甘氨酸 （pH 7.4） | 2% （w/v） | |
| 曲拉通X-100 | 0.1% （v/v） | |
| 200x 青霉素-链霉素 | 1% （v/v） | |
| 10%叠氮化钠 | 0.2% （v/v） | |
| 山羊血清 | 10% （v/v） | |
| 洗涤缓冲液 | 断续器 | 0.2% （无/v） |
| 曲拉通X-100 | 0.15% （v/v） | |
| 10%叠氮化钠 | 0.1% （v/v） | |
| ScaleS4（0） 溶液 （pH 8.1） | D-山梨糖醇 | 40% （无/ v） |
| 尿素 | 24% （无/ v） | |
| 甘油 | 10% （v/v） | |
| 断续器 | 20% （v/v） | |
| ScaleCUBIC-1 解决方案 | 尿素 | 25% （无/ v） |
| N，N，N′，N′-四（2-羟丙基）乙二胺 | 25% （v/v） | |
| 曲拉通X-100 | 15% （v/v） | |
| 蔗糖溶液 | 蔗糖 | 20%（宽/伏） |
| ScaleCUBIC-2 解决方案 | 蔗糖 | 50% （无 v） |
| 尿素 | 25% （无/ v） | |
| 三乙醇胺 | 10% （无重） | |
| 曲拉通X-100 | 0.1% （v/v） |
表1：溶液和缓冲液。
补充图 S1：图像采集首选项。请点击此处下载此文件。
补充表S1：图像采集设置。请按此下载此表格。
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Discussion
本文介绍了产前和产后卵巢的详细3D免疫染色和成像方案，用于生殖细胞定量和蛋白质定位的高通量和比较研究。我们开发了这个方案来分析卵巢中10-16个不同菌株的六个发育时间点的卵巢中的卵母细胞数量（N = 6-12），其中2-4个24孔板通常一次处理。这种方法可以适用于其他器官或细胞标志物。例如，该协议可用于标记和可视化体细胞，例如卵巢中的颗粒细胞，使用适当的抗体，从而促进体细胞 - 生殖细胞相互作用的研究或其他卵巢细胞类型的发育。
该方案和抗体组合的一个局限性是确定不同卵泡分期。用于免疫荧光和2D成像的DNA染色剂通过颗粒细胞核层识别滤泡阶段对于3D方法是不够的。4'，6-二脒-2-苯基吲哚（DAPI）或Hoechst很少用于整个器官染色，因为光穿透有限，大组织中间的衰减信号。碘化丙啶（PI）是一种能够深入组织的小分子，但由于光谱重叠，很难在多光子成像系统上捕获。通过颗粒细胞特异性的其他标志物，如抗苗勒管激素（AMH）或FOXL247，48，可以更好地分化卵泡分期。然而，尽管这些标志物有助于区分较大生长的卵泡，但它们不会区分原始卵泡和原发性卵泡。在这些早期阶段的特定标志物可用之前，滴细胞标志物（如DDX4或GCNA）是卵泡发育的最佳指标。此外，该方案适用于产前男性性腺，但尚未在产后睾丸中进行测试，其大小可能是限制因素。下面列出了关键问题，以便更好地可视化和定量不同大小的卵巢中的生殖细胞，并强调了为确保下游分析的高质量免疫染色而采取的技术和步骤。
第一个关键步骤是防止固定前后对卵巢的损害。受损的卵巢可能缺乏器官结构的一部分，影响卵母细胞数量并扭曲实验结果。为了防止损伤，解剖后将额外的体细胞组织附着在较大的卵巢上，用镊子抓住以转移卵巢。此外，对于较小的卵巢，用足够宽的移液器尖端转移它们，使卵巢容易地安装在尖端内，以避免损坏。如果轻微的组织损伤导致卵巢的一部分缺失，则可以通过计算方法减轻，其中受损样品中的总卵母细胞数量可以使用相同类型的完整样品外推（图6）。
然而，计算模拟表明，预测的准确性随着受损区域尺寸的增加而降低（100.8%±0.2，97.2%±1.5，90.3%±10，20%和30%损伤， 图6C）。根据模拟，我们建议从分析中排除损失>30%的样品。使用来自相同样品类型的多个完整卵巢来计算与受损样品中缺失的卵母细胞相似的区域的平均卵母细胞数量。然后，该数字用于预测卵巢中受损的卵母细胞总数。在同一卵巢中使用相似大小的面积，毗邻缺失区域可以用作替代方案，但未经测试。
另一个问题是避免污染可能导致自发荧光的细胞。对于青春期卵巢，如上所述，必须进行1x PBS和1%PFA的灌注以消除会引起自体荧光的血细胞（图2C）。PBS灌注应持续，直到器官，特别是卵巢和肾脏，从血液中清除并变白，然后再切换到1%PFA（图1E，F）。PBS灌注效率低下将导致高背景，这可能会掩盖并使小卵母细胞的可视化变得困难。PFA百分比较低（1%）或更高（4%）百分比的灌注比单独使用PBS灌注具有更好的图像质量;因此，使用了较低百分比的PFA。
抗体染色的优化需要注意几个变量。对于透化步骤，发现4小时是该测定的理想选择，周期长于4小时（测试6-8小时），导致根本没有染色。由于用于大规模免疫染色实验的抗体的数量和成本可能很高，因此对该方案进行了测试和优化，以重复使用抗体混合物，而不会损失任何免疫染色质量。为了重复使用，抗体混合物必须补充方案中描述的新鲜抗体。洗涤步骤对于免疫染色的质量也至关重要，应进行更长时间，以便在成像过程中达到更好的信噪比，并应针对所选的每种抗体进行测定。为了获得最佳效果，我们建议每次使用时新鲜制备ScaleS4（0）清除溶液，而ScaleCUBIC-1和ScaleCUBIC-2可以在室温下在黑暗中储存约1-2个月。
ScaleCUBIC-1清除在37°C下进行;重要的是，应避免较高的温度，因为它们会导致试剂沉淀，从而影响免疫染色的质量。安装多个样品进行成像可能非常耗时。琼脂或其他方案中使用的包埋方法是劳动密集型的，可能需要对样品47，49，50进行额外的重新清除。可重复使用的硅垫片可用作粘合剂孔，易于与盖玻片一起使用，并提供不同的尺寸和深度，以适应其他样品尺寸。为了实现高质量的图像，必须使用足够数量的清除解决方案;太少会导致图像质量差，太多的溶液会泄漏到显微镜上。此步骤应根据其大小针对特定样品进行优化。可以使用玻璃底培养皿，但必须固定样品以进行成像，因为即使是最轻微的运动也会使图像失真。硅垫圈可以与玻璃底培养皿和顶部盖玻片结合使用，以固定样品以进行成像。然而，如果由于卵巢的大小而需要从两侧成像，这将限制翻转样品的能力。
这种大规模、高通量方法的另一个关键选择是在徕卡DIVE/4TUNE/FALCON平台上使用两个可调谐的光谱物理多光子（MP）激光器进行成像。使用DIVE平台的好处包括易于样品安装（如上所述），最小化光学失真（与共聚焦平台相比），最重要的是，成像速度和采集图像数据的管理。与使用类似设置进行LAS X图像采集的徕卡DIVE或SP8上的共聚焦激光器相比，使用更高放大倍率（16x）对多光子激光器进行成像的速度要快得多，并且产生的光损伤更少。MP光束低，其荧光团激发高度局限于焦点，并且在低放大倍率下实现更大的深度，而不会造成光损伤，尽管空间/轴向成像步骤更多（共聚焦：最大约300-400段，MP：>800段）。
16x/NA0.6物镜允许通过机械校正环校正样品和贴片剂沿光轴分布而引起的轻微折射率不匹配，机械校正环是针对最大信号的最佳设置，在样品的中间。此外，球形结构（如卵母细胞）可以通过共聚焦图像采集而失真，因为由于在给定针孔设置下，由于贴片剂和样品折射率不匹配，共聚焦平面（信号）的深度依赖性定位可能发生（图2D）。由于荧光信号通过仪器的内部针孔捕获以去除失焦信号，因此本征光学失真（球面像差）可能会在样品深处变得更糟，这对于较大的卵巢（即〜400-600微米厚度）来说是有问题的。
使用相同的匹配镜头校正设置，在具有不同发射波长的DIVE MP系统上几乎无法检测到球面像差，从而简化了定量和共定位研究（图2D）。最后，高功率脉冲激光器允许激发样品深处的较低荧光团浓度，特别是当它与Z深度激发校正一起使用时。此外，MP混合探测器（HyD-RLDs）也增强了对较弱信号的捕获，该探测器是常规光电倍增管和雪崩光子计数探测器的组合，允许在宽发射波长范围内进行30倍以上的信号检测。
光片（LS）多光子显微镜是3D组织成像的另一个新兴平台47。然而，LS需要更多的宏观样品的设置时间，包括琼脂包埋和成像设置。此外，在样品旋转时以较高放大倍率获取的图像可能会生成较大的>100 GB文件，这可能是消除光片阴影伪影所必需的（由于外部介质和样品内部的折射率不匹配，或样品表面失真）。所提出的将样品安装在粘合剂孔中的溶液中的方法简单快捷。
此外，这种方法允许在一个设置中对多个卵巢进行成像，而无需翻转或旋转。然而，对于较大的卵巢，可能需要翻转盖玻片“三明治”。DIVE系统成像比共聚焦和LS更快;在16倍放大镜下，在3-5分钟内成像（Z-步骤2μm）和在1小时内成像耻骨卵巢（Z-步骤5μm）。此外，在 LAS X 中生成的文件大小可管理 （2-20 GB），这对于用于下游分析的大量样本也至关重要。尽管该免疫染色方案已针对与DIVE平台结合使用进行了优化，但免疫染色样品可以使用其他MP / LS平台进行成像，并进行一些修改。
与2D分析中的手动数据采集相比，使用3D建模协议进行整个卵巢染色的优点是高效且相对容易的数据分析。之所以选择IMARIS 3D可视化和分析软件，是因为它市售并由许多显微镜核心提供，不需要编程技能，并且与许多图像采集软件平台兼容，例如徕卡的LAS X或蔡司的ZEN。使用IMARIS，标准参数的设置如实验方案部分突出显示的那样，这些参数可用于其他图像和样品，只需稍作更改，从而提高了再现性和效率。
图像分析和量化针对伊玛瑞斯软件进行了优化;但是，类似的分析可以按照类似的原则在其他商业或开源数据可视化软件上进行。总之，这里已经提出了一种优化的方案，用于对整个卵巢进行成像以进行定量和定性分析。这是有目的地适应了高通量处理的需求，这些处理将越来越多地用于毒理学测试，临床和诊断目的，以及对卵巢充足性和功能的调节因子的全基因组分析。
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Disclosures
作者没有利益冲突需要披露。
Acknowledgments
这项工作得到了美国国立卫生研究院的资助（R01 HD093778至E.B-F和T32 HD007065至R.B）。）。我们感谢Zachary Boucher对辐射实验的帮助。我们感谢玛丽·安·亨德尔（Mary Ann Handel）对手稿的批判性阅读。我们非常感谢Sonia Erattupuzha和杰克逊实验室的显微镜核心服务部门在本出版物中描述的显微镜工作方面的专家协助，以及杰克逊实验室科学仪器服务的Jarex Trapszo设计3D打印适配器载玻片。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Benchtop Incubator | Benchmark Scientific | H2200-H | 37 °C incubator |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | VWR | 97061-416 | |
| C57BL/6J | The Jackson Laboratory | 000664 | mouse inbred strain |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D1435 | Hazardous material |
| D-Sorbitol | Sigma-Aldrich | S6021 | |
| Dumont #5 Forceps | FST | 91150-20 | |
| FastWells Reagent Barriers | GraceBio | 664113 | Sticky and flexible silicone gasket (adhesive well) |
| Fine Scissors | FST | 91460-11 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G2025 | |
| Glycine | ThermoFisher Scientific | BP381-500 | |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 647 | Invitrogen | A-21246 | Dilution 1:1000 |
| Goat anti-Rat IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 555 | Invitrogen | A-21434 | Dilution 1:1000 |
| Goat serum | Sigma-Aldrich | G9023 | |
| IMARIS Software | Oxford Instruments | Version 9.7.0 | Image visualization and analysis software |
| Insight X3 | Spectra-Physics | InSight X3 Tunable Ultrafast Laser | Laser for Multiphoton Imaging |
| LASX software | Leica | Version 3.5.6 | Image acquisition software |
| Leica DIVE/4TUNE/FALCON | Leica | Leica Dmi8, 2P-M-ready: # 158005406 | Multiphoton Microscope |
| MaiTai HP | Spectra-Physics | Mai Tai DeepSee One Box Ultrafast Laser | Laser for Multiphoton Imaging |
| Masterflex Pump Controller | SPW Industrial | Model: 7553-50 | Peristaltic pump for perfusion |
| Mayo Scissors | FST | 14010-17 | 5” –7” blunt/blunt scissors for decapitation |
| Micro Cover Glasses, Square, No. 1.5 25x25mm | VWR | 48366-249 | |
| Mini BioMixer | Benchmark Scientific | B3D1020 | shaker/nutator for 37 °C incubator |
| Nikon Ergonomic SMZ1270 | Leica | SMZ1270 | stereomicroscope |
| Paraformaldehyde 16% (formaldehyde aqueous solution) | Electron Microscopy Sciences | 15710 | Hazardous material |
| PBS Tablets, Phosphate-buffered Saline | ThermoFisher Scientific | BP2944100 | Dissolve in Milli-Q water |
| Penicillin-Streptomycin, 200x, Dual Antibiotic Solution | ThermoFisher Scientific | ICN1670249 | |
| Polyvinyl alcohol (PVA) | Sigma-Aldrich | P8136 | |
| Quadrol (N,N,N′,N′-Tetrakis(2-Hydroxypropylethylenediamine) | Sigma-Aldrich | 122262 | |
| Rabbit anti-DDX4/MVH | Abcam | ab27591 | Dilution 1:500 |
| Rabbit anti-LINE-1 ORF1p | Abcam | ab216324 | Dilution 1:500 |
| Rat anti-TRA98/GCNA | Abcam | ab82527 | Dilution 1:500 |
| Sodium azide | Sigma-Aldrich | S2002 | Hazardous material |
| Sodium borohydride | Sigma-Aldrich | 452882 | Hazardous material |
| Sucrose | ThermoFisher Scientific | S0389 | |
| Tekmar Orbital Shaker | Bimedis | VXR-S10 | shaker for room temperature |
| Triethanolamine | Sigma-Aldrich | 90279 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100 | |
| UNOLOK Infusion Set | MYCO Medical | 7001-23 | needles for perfusion |
| Urea | Amresco | 97061-920 | |
| X-Cite 120LED | Excelitas | S/N XT640-W-0147 | low-power LED fluorescence lamp |
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