Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

אימונופלואורסצנציה של השחלה כולה, ניקוי ומיקרוסקופיה מרובת פוטון לניתוח תלת-ממדי כמותי של עתודת השחלות המתפתחות בעכבר

Published: September 3, 2021 doi: 10.3791/62972
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1The Jackson Laboratory

Summary

כאן אנו מציגים פרוטוקול מותאם להדמיית שחלות שלמות לניתוחים כמותיים ואיכותיים באמצעות שמירה חיסונית בהרכבה מלאה, מיקרוסקופיית מולטי-פוטון והדמיה וניתוח תלת-ממדיים. פרוטוקול זה מתאים לעיבוד בעל תפוקה גבוהה, אמין וניתן לחזרה, החל על טוקסיקולוגיה, אבחון קליני ובדיקות גנומיות של תפקוד השחלות.

Abstract

פוריות הנקבה ותוחלת חיי הרבייה תלויים באיכות ובכמות של עתודת הביציות השחלתית. על פי הערכות, כ-80% מתאי הנבט הנקביים הנכנסים לפרופאזה מיוטית אני מסולקים במהלך התשה של ביציות עובריות (FOA) ובשבוע הראשון לחיים שלאחר הלידה. שלושה מנגנונים עיקריים מווסתים את מספר הביציות ששורדות במהלך ההתפתחות ומבססות את עתודת השחלות אצל נקבות הנכנסות לגיל ההתבגרות. בגל הראשון של אובדן ביציות, 30-50% מהביציות מסולקות במהלך FOA מוקדם, תופעה המיוחסת לביטוי גבוה של יסוד גרעיני משולב ארוך-1 (LINE-1). הגל השני של אובדן ביציות הוא חיסול ביציות עם פגמים מיוטיים על ידי מחסום איכות מיוטי. הגל השלישי של אובדן ביציות מתרחש באופן פרינטלי במהלך היווצרות זקיקים קדמוניים כאשר חלק מהביציות אינן מצליחות ליצור זקיקים. עדיין לא ברור מה מווסת כל אחד משלושת הגלים האלה של אובדן ביציות וכיצד הם מעצבים את שמורת השחלות בעכברים או בבני אדם.

אימונופלואורסצנציה והדמיה תלת-ממדית פתחו אפיק חדש לדימוי ולניתוח התפתחות הביציות בהקשר של השחלה כולה ולא בקטעים דו-ממדיים פחות אינפורמטיביים. מאמר זה מספק פרוטוקול מקיף לחיסון שחלות שלם וסליקה אופטית, המניב הכנות להדמיה באמצעות מיקרוסקופיית מולטיפוטונים ומידול תלת-ממדי באמצעות תוכנה זמינה מסחרית. הוא מראה כיצד ניתן להשתמש בשיטה זו כדי להראות את הדינמיקה של התשה של ביציות במהלך התפתחות השחלות בעכברי C57BL/6J ולכמת את אובדן הביציות במהלך שלושת הגלים של חיסול הביציות. פרוטוקול זה יכול להיות מיושם על שחלות טרום לידתיות ומוקדם לאחר הלידה עבור הדמיה וכימות של ביציות, כמו גם גישות כמותיות אחרות. חשוב לציין שהפרוטוקול פותח באופן אסטרטגי כדי להתאים לעיבוד בעל תפוקה גבוהה, אמין וניתן לחזרה שיכול לענות על הצרכים בטוקסיקולוגיה, אבחון קליני ובדיקות גנומיות של תפקוד השחלות.

Introduction

רוב נקבות היונקים נולדות עם מספר סופי של ביציות שנעצרו במיוטיות המאוחסנות בתוך זקיקים ראשוניים, המהוות את שמורת השחלות (OR)1,2. ה- OR קובע את תוחלת החיים הכוללת של הרבייה הנשית ואתבריאותה 3. ה-OR בדרך כלל יורד בגודלו עם ההזדקנות וניתן לרוקן אותו בטרם עת עם חשיפה לחומרים גנוטוקסיים מסוימים (הקרנות/כימותרפיה) ולחצים סביבתיים (תת-תזונה), מה שמוביל לאי פוריות 4,5,6. לעתים קרובות ניתן לייחס אי פוריות נשית אידיופטית לאיכות הגנטית והפיזיולוגית של ביציות המתפתחות מה-OR ונשארות לא מובנות היטב 7,8. מכיוון שהקדשת זקיק נקבה נקבעת במידה רבה מראש על ידי לידה, חיוני להבין את מנגנוני הרגולציה המעורבים בהקמה ובתחזוקה של OR.

בעכברים, היווצרות OR מתחילה במפרט של תאי נבט ראשוניים (PGCs) סביב היום העוברי (E) 7.52. המחשבים נודדים לרכסי איברי המין, שם הם ישכנו על ידי כ- E10.59. ההתרבות הנרחבת הבאה מתרחשת עם ציטוקינזיזה לא שלמה וכתוצאה מכך נוצרות ציסטות שיתפרקו בהמשך ההתפתחות10,11. בסביבות E12.5, נקבע מין גונדלי, והתפשטות PGC נעצרת בשחלות. אצל נקבות, מחשבים אישיים, כיום ביציות, נכנסים לפרופאזה מיוטית I (MPI) בסביבות E13.512,13. ביציות מתקדמות דרך MPI ממושך ונעצרות בשלב ההכתבה סביב זמן הלידה. במהלך השבוע הראשון לאחר הלידה, כל ביצית שנעצרה מוקפת בתאי גרנולוזה, ובכך יוצרת זקיק קדמוני.

מספר הזקיקים הבראשיתיים ב-OR של נקבה תלוי בכמה ביציות שרדו את גלי סילוק הביציות המתרחשים לפני ובמהלך מעצר MPI באמצעות אפופטוזיס, אוטופגיה או נמק14,15. הגל הראשון מתרחש במהלך התפתחות העובר וידוע בשם FOA. FOA הוא תהליך שמור מבחינה אבולוציונית אצל נקבות (יונקים ולא יונקים), לפיו כ-50-80% מהביציות מסולקות בהתאם למין הנקבה 16,17,18,19. בעכברים, FOA מתרחש במהלך E15.5 עד E18.5 ויוחס להפעלה מחדש ולביטוי של רצפי LINE-1 רטרו-טרנספוזונים הגורמים למוות של ביציות20,21. הגל השני של חיסול ביציות מתרחש דרך מחסום מיוטי שמחסל ביציות עם פגמים מיוטיים כמו שברים דו-גדיליים של דנ"א שלא תוקן (DSBs)22,23. הגל הבא של חיסול ביציות מתרחש במהלך התמוטטות ציסטה, ומגיע לשיאו במהלך היווצרות של זקיקים ראשוניים, שכל אחד מהם מכיל ביצית אחת 10,11,24,25.

בעכברים, עתודת הזקיקים הבראשיתית הוקמה במידה רבה על ידי גיל ההתבגרות, ולאחר מכן היא פוחתת כאשר זקיקים ראשוניים מופעלים לצמיחה במהלך מחזורי רבייה רגילים. גודל OR משתנה בין נשים בודדות ובין זנים גנטיים שונים של עכברים; עם זאת, הוויסות הגנטי של גודל OR אינו מובן היטב 26,27,28,29. מחקרים גנטיים של ויסות OR נפגעים על ידי היעדר פרוטוקולים סטנדרטיים לחקור את גלי חיסול הביציות במהלך התפתחות טרום לידתית ואחרי לידה. מספר מתודולוגיות לכימות ביציות פותחו בעכברים, כאשר הנפוצה והנפוצה ביותר היא הערכה היסטומורפיתמטרית של חלקים היסטולוגיים30,31. בטכניקה זו, ביציות מזוהות בקטעים סדרתיים עם כתמים היסטולוגיים, כגון המטוקסילין ואוזין (H&E) וחומצה מחזורית-שיף (PAS) או סמנים פלואורסצנטיים. טכניקה זו אמינה אם כל התנאים נשארים קבועים, כולל עובי חתך, התאוששות יעילה של כל החלקים לאורך השחלה, ואת תוכניות הספירה של מעבדות בודדות. עם זאת, המספרים המדווחים על ידי מעבדות שונות לעתים קרובות שונים באופן משמעותי ולכן אינם ניתנים להשוואה בקלות.

יתר על כן, בהינתן הבדלים גנטיים, השימוש בזני עכברים שונים יכול גם להשפיע על ספירת הביציות. גישות חישוביות נוספות פותחו להערכה היסטומורפיתמטרית וכוללות זיהוי אוטומטי של ביציות באמצעות גישת השבר, ספירה אוטומטית באמצעות אלגוריתמים חישוביים ושחזור תלת-ממדי של תמונות היסטולוגיות כדי למנוע ספירות מרובות של אותה ביציה 31,32,33,34,35,36 . גם כאשר שיפורים אלה מתווספים להערכה היסטומומורפומטרית, הטכניקה היא יחסית עתירת עבודה, במיוחד עבור מחקרים בקנה מידה גדול ותפוקה גבוהה. ייתכן שהנתונים שנאספו לא יהיו ניתנים לשחזור ולהשוואה בין מחקרים בשל הבדלים בסכמות הספירה, באלגוריתמים הממוחשבים ובתוכנות שבהן נעשה שימוש.

לאחרונה, מואצת על ידי פיתוח של מיקרוסקופיית מולטיפוטונים ויריעות אור חדשות ברזולוציה בינונית ושיטות ניקוי רקמות אופטיות, טכניקות מידול וניתוח תלת-ממדיות לשחלות שלמות הופכות לשיטה המועדפת לכימות יעיל של מספרי ביציות וחקר לוקליזציה ודינמיקה של חלבונים37,38. שיטות תלת-ממדיות אלה הן בדרך כלל יתרון בהשוואה לשיטות היסטולוגיות, שכן רקמות ואיברים נשמרים טוב יותר ונשמרים ללא פגע. יתר על כן, ניתוח ומידול תלת-ממדיים מספקים תובנות נוספות לגבי תפקוד ואינטראקציות בתוך ובין נישות תאים או תת-מבנים בתוך האיבר שעלולים להחמיץ בניתוח דו-ממדי.

ניתוח תלת-ממדי של איברים שלמים דורש אופטימיזציה של קיבוע, חיסון ופרוטוקולי ניקוי אופטיים עבור איברים בודדים, כגון שחלות, ללא עיוות או נזק לרקמות. אופטימיזציה נוספת של הרכבה לדוגמה להדמיה נדרשת למיקרוסקופיה ברזולוציה גבוהה ועשויה להיות תלויה בפלטפורמת ההדמיה הזמינה. לבסוף, הדמיה של השחלה השלמה כולה מייצרת כמות גדולה של נתונים עבור ניתוחים חישוביים מאוחרים יותר. לכן, יש צורך לפתח שיטות תלת-ממדיות סטנדרטיות לספירת ביציות למחקרים השוואתיים ולשלבים התפתחותיים שונים.

פרוטוקול זה משתמש בפרוטוקולי סילוק חיסוני סטנדרטיים ודווחו בעבר, תוך התמקדות בגישה פשוטה, ידידותית למשתמש ותפוקה גבוהה 38,39,40,41. הפרוטוקול מותאם לניתוח מספר גדול של שחלות טרום לידתיות ואחרי לידה עד ליום 28 שלאחר הלידה (P28) וגדלים משתנים של שחלות מרקע גנטי שונה של עכברים. הצעדים החיסוניים דומים לכל השלבים; עם זאת, פרוטוקולי הסליקה שונים עבור שחלות ההתבגרות בשל גודלן הגדול יותר, ScaleS4(0) ו- CUBIC עבור שחלות קטנות וגדולות, בהתאמה40,41. יתר על כן, זלוף של כל הגוף מבוצע בעכברי P28 לפני הקיבוע כדי למנוע אוטופלואורסצנציה מתאי הדם. מיקרוסקופ מולטי-פוטון נבנה על פלטפורמת Leica DIVE/4Tune כחלופה למיקרוסקופ יריעות אור כדי להשיג תמונות, ותוכנת ההדמיה והניתוח התלת-ממדית של IMARIS עם כלים אנליטיים שונים נבחרה לפרוטוקול זה. פרוטוקול זה פשוט למעקב ופחות מעשי, ומכאן חיסכון בזמן. יתר על כן, כימות הביציות הוא מהיר יחסית, בהתאם לגודל השחלה וסידור הביציות.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

כל העכברים שבהם נעשה שימוש היו מהזן הגנטי C57BL/6J (ראו טבלת החומרים). זן זה רוצף באופן מלא והוא סטנדרטי למחקרים רבים על מבנה ותפקוד השחלות. עכברים שוכנו על פי הנחיות NIH, והנהלים שבוצעו אושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים במעבדת ג'קסון. ריאגנטים וקומפוזיציות המשמשים בפרוטוקול זה מפורטים בטבלת החומרים ובטבלה 1, בהתאמה.

1. הכנת ריאגנטים

  1. מקבע: הכן 4% paraformaldehyde (PFA) ב 1x PBS. לדוגמה, עבור 24 דגימות (0.5 מ"ל/דגימה = נפח כולל של 12 מ"ל), הוסף 3 מ"ל של 16% PFA ברמת מיקרוסקופיית אלקטרונים בדרגה ל-9 מ"ל של 1x PBS.
  2. מאגר Permeabilization
    1. יש למדוד אלכוהול פוליוויניל (PVA) לכוס פלסטיק בגודל 250 מ"ל המכילה 1x PBS יום לפני שיש צורך במאגר חדירה. מערבבים את התמיסה למשך הלילה כדי לאפשר ל-PVA להתמוסס לחלוטין.
    2. מוסיפים נתרן בורוהידריד ל-PVA המומס ומאפשרים לתערובת להומוגניות במשך כ-3-5 דקות. מצפה שהפתרון יהיה מוקצף.
    3. הוסף את Triton X-100 לפתרון והשתמש במאגר לאחר שהטריטון X-100 מומס.
      הערה: PVA לוקח זמן רב להתמוסס (לפחות 3 שעות), ואת החדירה של הנוגדן תלוי כמה טוב הוא מתמוסס. עבור שחלות גדולות יותר, חיוני להמיס את PVA לחלוטין.
  3. חסימת מאגר
    1. מודדים אלבומין בסרום בקר (BSA) לכוס עם 1x PBS. מערבבים את התמיסה עד שה-BSA מתמוסס.
    2. הוסיפו גליצין, טריטון X-100, פניצילין-סטרפטומיצין ונתרן אזיד. מערבבים עד שהתמיסה הופכת להומוגנית. מעבירים את החיץ לבקבוק ומאחסנים בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס. יש להוסיף סרום עיזים רגיל לפני השימוש.
  4. חיץ כביסה: יש למדוד PVA לכוס המכילה 1x PBS. מערבבים את התמיסה למשך הלילה כדי לאפשר ל-PVA להתמוסס. הוסיפו את טריטון X-100 ונתרן אזיד. לאחר שהמאגר מעורבב, אחסן אותו בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
  5. תמיסת ScaleS4(0) (pH 8.1): ממיסים D-סורביטול ב-PBS בכוס עם ערבוב ב-≤100 מעלות צלזיוס. מוסיפים אוריאה לתמיסה, וברגע שהאוריאה מתמוססת, מכבים את החום ומאפשרים לתמיסה לערבב עד שהיא מומסת לחלוטין. מוסיפים גליצרול ודימתיל סולפוקסיד, ומערבבים עד שהתמיסה מתהפכת להומוגניזציה. אחסנו את התמיסה בטמפרטורת החדר בחושך.
    הערה: יש להכין תמיסת ScaleS4(0) טרייה ביום הראשון של ניקוי השחלות.
  6. פתרון ScaleCUBIC-1
    1. ממיסים אוריאה בכוס המכילה PBS עם ערבוב בטמפרטורה ≤100 מעלות צלזיוס. מודדים N,N,N′,N′-tetrakis(2-הידרוקסיפרופיל)אתילנדיאמין לכוס נפרדת, ואז מוסיפים את האוריאה המומסת, ומערבבים בטמפרטורה של ≤100 מעלות צלזיוס עד שהריאגנטים מתמוססים לחלוטין. לאחר שכל הריאגנטים נמצאים בתמיסה, כבו את החום ותקררו בטמפרטורת החדר. יש לאחסן בחושך.
    2. Degas את הפתרון על ידי העברתו לתוך בקבוק סינון. חברו את הבקבוקון לוואקום באמצעות צינורות, כסו את הבקבוקון והפעילו את הוואקום עד שהבועות בתמיסה ייעלמו. השתמש בפתרון לאחר נטרול זה.
      הערה: ניתן לאחסן את הפתרון בחושך לשימוש למשך עד חודש.
  7. תמיסת סוכרוז: להמיס סוכרוז ב-1x PBS; ולאחר מכן degas את הפתרון לפני השימוש.
    הערה: הכן את הפתרון טרי לפני השימוש.
  8. פתרון ScaleCUBIC-2
    1. ממיסים סוכרוז בכוס המכילה PBS עם ערבוב בטמפרטורה ≤100 מעלות צלזיוס. מוסיפים אוריאה ומערבבים בטמפרטורה של ≤100 מעלות צלזיוס עד שהאוריאה מתמוססת. כבו את החום.
    2. הוסף טריאתנולמין וטריטון X-100. מערבבים עד שהתמיסה הופכת להומוגנית. אפשרו לפתרון להתקרר לטמפרטורת החדר ולאחסן בחושך. Degas את הפתרון לפני השימוש.
      הערה: ניתן לאחסן את הפתרון בחושך לשימוש למשך עד חודש.

2. ניתוח וקיבוע של השחלות הטרום לידתיות (איור 1A)

  1. הזדווג נקבות בוגרות (≥8 שבועות) וזכרים על פי הפרוטוקול המוסדי המאושר. בדוק אם יש פקקי נרתיק כל בוקר.
    הערה: הבוקר של פקק נרתיקי מוגדר כ-0.5 ימים לאחר קויטום (d.p.c) או E0.5.
  2. ביום הנתיחה, מכינים 4% פרפורמלדהיד (PFA) ואליקווט ~0.5 מ"ל לתוך צינורות microcentrifuge, המונחים בצד הספסל (~ 4 לכל נקבה בהריון).
    הערה: PFA הוא חומר מסוכן ויש לטפל בו תחת מכסה מנוע כימי.
  3. הכינו שלוש צלחות 100 מ"מ המכילות כ-10 מ"ל של 1x מי מלח עם חיץ פוספט (PBS) עבור כל נקבה הרה (לקטיף רחם, לניתוח קומפלקס מזונפרוס-שחלות, ובידוד השחלות).
  4. המתת חסד נקבות הרות הנושאות עוברים מהשלב ההתפתחותי המועדף והמשיכו לנתיחה. המתת חסד לא יותר מ-1-2 נקבות בכל פעם. השתמש בפרוטוקול מאושר להמתת חסד של עכברים הרות (למשל, חשיפה ל-CO2 ואחריה פריקה של צוואר הרחם).
  5. לאחר המתת נקבה, יש לרסס את הבטן ב-70% אתנול. בעזרת מלקחיים, הרימו את עור הבטן והשתמשו במספריים כדי לבצע חתך בצורת V דרך דופן הבטן והגוף. חותכים לאורך שני צידי החתך ומקלפים את העור בחזרה כדי לחשוף את האיברים והעוברים הפנימיים ברחם.
  6. עם מלקחיים ומספריים, לחתוך ולהפריד את הרחם עם העוברים מן השומן הבטן ואת העורקים והוורידים השחלות. הסר את הרחם והכניס אותו לצלחת 100 מ"מ המכילה 1x PBS. שחררו את העוברים ל-PBS על ידי חיתוך דופן הרחם וניקוב שק החלמון. חותכים את חבל הטבור.
    הערה: עבור עוברים מתחת לגיל 15 יום בהיריון, המתת חסד של האם והסרת הרחם מבטיחה מוות מהיר של העובר. עוברים מעל גיל 15 יום בהיריון עד הלידה חייבים להיות מורדמים על ידי עריפה.
  7. מעבירים עובר לצלחת חדשה עם PBS 1x טרי. כדי לערוף עובר E15.5, הצמד בעדינות את שני האחוריים זה מזה על הצלחת עם מלקחיים כדי לשתק את העובר. באמצעות זוג מלקחיים שני המוחזקים ביד הדומיננטית, החזיקו את הצוואר בין המלקחיים ולוחצים כדי לחתוך את ראש העובר, או השתמשו במספריים כדי לחתוך את הצוואר.
  8. עם מלקחיים היד הדומיננטיים, חותכים מתחת למצח ומושכים בעדינות את פלג הגוף העליון. לאחר מכן, הכנס נקודת קצה אחת של מלקחיים היד הדומיננטיים לתוך חלל הצפק בצורה אנכית לתוך פתח אזור הבטן בעוד שנקודת הקצה השנייה של המלקחיים נשארת בחוץ. סגור את המלקחיים, צובט את דופן הגוף כדי לחתוך אותו, וחושף את האיברים הפנימיים.
  9. עם אותם מלקחיים, להסיר בעדינות את האיברים, כולל המעיים והכבד, עד הכליה ואת איברי הרבייה להיות גלוי. לקבוע את מין העובר: ב E15.5, השחלות יש צורה מוארכת דמוית נקניק בעוד האשכים הם סגלגלים.
    הערה: בשלבים מוקדמים יותר, ייתכן שיהיה צורך בגנוטיפ כדי לקבוע את המין.
  10. באמצעות זוג מלקחיים אחד, החזיקו את העובר הנקבי והשתמשו במלקחיים האחרים כדי לתפוס כל תסביך מזונפרוס-שחלתי ולהפריד אותו בעדינות מהכליות ומהתעלות המולריות. מניחים את השחלות בצלחת חדשה עם 1x PBS, משאירים את המזונפרוס מחוברים, אך מסירים את הרקמות שמסביב כדי לוודא שהשחלות חשופות. מקם את שתי השחלות לתוך ~ 0.5 מ"ל של 4% PFA בצינורות microcentrifuge ולתקן ב 4 ° C לילה. למחרת, החליפו את ה-PFA ב-70% אתנול.
  11. לצורך ניתוח וקיבוע של שחלות E18.5, הפרד את העוברים מהרחם כמתואר לעיל ולאחר מכן פעל לפי הפרוטוקול של גורים פרה-פוברטליים המתואר בסעיף 3 (איור 1B).

3. כריתה וקיבוע של שחלות פרה-פוברטליות (איור 1B)

  1. מכינים 4% PFA ו-aliquot ~0.5 מ"ל לתוך צינורות 1.5 מ"ל ומניחים אותם בצד הספסל (~צינור אחד לכל גור). הכינו לוחות 35 מ"מ עם 1x PBS (~אחד לכל גור). המתת החסד את הגורים באמצעות הפרוטוקול המוסדי המאושר.
    הערה: עריפת ראשים היא השיטה המועדפת להמתת חסד לעכברים בני 8 ימים ומטה. ניתן לערוף עכברים יילודים באמצעות מספריים מנתחים בגודל 3-4 אינץ' או מספריים של מאיו בגודל 5-7 אינץ'.
  2. לקבוע את מין הגורים על ידי מדידת המרחק האנוגניטלי, שהוא גדול יותר אצל זכרים מאשר אצל נקבות. השתמשו במספריים חדים של עריפת ראשים כדי לערוף את הגורים הנקביים. מניחים את הגוף, פתוח-חתוך בצד כלפי מטה, על מגבת נייר כדי לנקז את הדם (~5-10 שניות).
  3. אבטחו את הגור על גבו על ידי הנחת סיכה בכרית הכפות של כל רגל. מרססים את הבטן ב-70% אתנול. השתמשו במלקחיים כדי להחזיק את עור הגור הרחק מהגוף והשתמשו במספריים כדי לבצע חתך קטן בצורת V בעור הבטן התחתונה.
  4. מכניסים את המספריים לתוך החתך מתחת לעור וחותכים לאורך שני צידי הבטן. השתמשו במלקחיים כדי לקלף בעדינות את העור ולחשוף את הבטן התחתונה. הזיזו בעדינות את המעי למעלה ואתרו את קרני הרחם שליד שלפוחית השתן. עקוב אחר כל קרן רחם לכיוון הכליה ואתר את השחלה עם רקמת השומן הסובבת מתחת לכל כליה.
  5. כדי לנתח את השחלות, החזיקו את קרן הרחם מתחת לשחלה ולאובידוקט עם זוג מלקחיים אחד (מלקחיים A, איור 1B) והרימו אותה בעדינות הרחק מהגוף. באמצעות זוג מלקחיים נוסף (מלקחיים B), תפסו בעדינות מתחת לזוג המלקחיים הראשון, כך שהשחלה והאובידוקט בפנקס השומן ייראו מעל זוג המלקחיים השני. לאחר מכן, לחתוך מתחת לזוג השני של מלקחיים עם מספריים או למשוך בזהירות כדי לנתק את השחלות ואת הרקמות המצורפות.
  6. מניחים את האיברים המבודדים בצלחת עם 1x PBS. גזור את רקמת השומן הנוספת, האובידוקט וקרן הרחם כדי לנקות ולבודד את השחלה. פותחים בעדינות את הבורסה המקיפה את השחלה וחושפים את כל השחלה.
  7. קצצו את קרום הבורסה מבלי לפגוע בשחלה והשאירו את הרקמה סביב ההילום (מבנה דמוי רצועה בין השחלה למערכת הרבייה) כדי לטפל בשחלה, כפי שמוצג באיור 1B, P5. לאחר שהשחלות נחתכו, הניחו אותן ב-4% PFA ותיקנו את השחלות ב-4 מעלות צלזיוס למשך הלילה. למחרת, החליפו 4% PFA ב-70% אתנול ואחסנו את השחלות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס עד לשלב הפרוטוקול החיסוני.

4. זלוף, כריתה וקיבוע של השחלות המתבגרות (איור 1C)

  1. להחדיר עכברים על פי פרוטוקולים שאושרו על ידי המוסד עם העכבר תחת הרדמה עמוקה במכסה אדים כימי. הכן את ציוד הזלוף והריאגנטים. ראה את הפרוטוקול המפורט ב 42.
    הערה: פרפוזיה היא הליך המתת חסד סופני המחליף את הדם בכל מערכת כלי הדם ברקמות מקבעות.
  2. שקלו עכבר נקבה מתבגרת (P28) ותעדו את משקל העכבר (בדרך כלל בין 13 גרם ל-15 גרם). חשב את כמות חומר ההרדמה המאושר לשימוש.
    הערה: כאן, 0.35 מ"ל של tribromoethanol לכל 10 גרם של משקל הגוף שימש בפרוטוקול זה.
  3. השתמש במזרק חד פעמי של 10 מ"ל עם מחט של 20 גרם כדי למלא את המזרק בחומר ההרדמה המאושר. החלף את מחט 20 G במחט 26 G x 3/8.
  4. לרסן בזהירות את העכבר על ידי שפשוף עור הצוואר הגבי ביד אחת. הפוך את העכבר כדי לחשוף את הבטן. להזריק את כמות ההרדמה המחושבת בעבר לתוך חלל הצפק. מניחים את העכבר במיכל עם כיסוי עד שההרדמה נכנסת לתוקף (כלומר, העכבר כבר לא זז).
  5. ברגע שהעכבר מפסיק לזוז, צבטו בעדינות את רגליו כדי לבדוק שאין תגובה ולוודא שהעכבר מורדם לחלוטין לפני הפעלת הזלוף. מניחים את העכבר על גבו ומצמידים אותו בעדינות על ידי הצמדה עדינה של כל ארבע הרגליים דרך כריות הכפות אל לוח. יש לוודא שהרגליים נעוצות בתנוחה נינוחה, ולא מתוחות יתר על המידה.
  6. רססו את העכבר ב-70% אתנול מהבטן לאזור החזה. השתמשו במלקחיים כדי לצבוט ולהרים בעדינות את עור הבטן ולאחר מכן השתמשו במספריים כדי ליצור חתך קטן בצורת V דרך העור וקיר הגוף.
  7. הרימו את דש העור מחלל הגוף והכניסו את המספריים מתחת לעור ולדופן הגוף. חותכים את העור ואת דופן הגוף היישר לכיוון הראש עד לקצה חלל בית החזה בעצם החזה.
  8. פתח את חלל בית החזה על ידי חיתוך קפדני של הצלעות משני צידי עצם החזה עד ממש מתחת לעצם השכמה. היזהרו לא לנקב את הריאות מתחת לכלוב הצלעות. קחו את דשי העור/צלעות עם מלקחיים והצמידו אותם כדי לחשוף את האיברים הפנימיים.
  9. יש לקצץ בעדינות כל רקמה, כגון התימוס, שעלולה לחסום גישה ברורה ללב. חשוף את כל האיברים, כולל מערכת העיכול, כדי לאפשר אישור חזותי כי כל הגוף הוא perfused, כולל הבטן התחתונה.
  10. השתמש במספריים של דיסקציה כדי לחתוך את האטריום הימני של הלב ולשחרר דם מהמערכת. החזיקו בעדינות את הלב עם מלקחיים והכניסו מחט פרפוזיה (המחוברת לבקר משאבה פריסטלטי) לחדר השמאלי.
  11. משאבה של כ-10 מ"ל של PBS, בלחץ עדין אך קבוע, עד שרקמות כמו הכבד, הכליות ומערכת הרבייה (איור 1E,F) הופכות מוורוד ללבן. לאחר מכן, החליפו את ה-PBS ב-1% PFA שזה עתה יוצרו והמשיכו בזלוף בכ-10 מ"ל של PFA או עד שמתרחשת עוויתות בפלג הגוף התחתון של העכבר (למשל, זנב).
    הערה: רעידות קיבוע אלה מצביעות על זלוף מוצלח.
  12. לאחר השלמת ההדבקה, אתרו את כרית השומן עם השחלות שמתחת לכליה ונתחו בעדינות את כל מערכת הרבייה, כולל כרית השומן, השחלות וקרני הרחם, והניחו את המערכת בבקבוקון עם 4% PFA. תקן את השחלות בטמפרטורת החדר במשך הלילה (~ 16-24 שעות). לאחר מכן, החליפו את ה-4% PFA ב-70% אתנול למשך יום אחד לפחות וקצו את השחלות (איור 1E,F), כפי שתואר לעיל, לפני שתתחילו בפרוטוקול ה-immunostaining.

5. חיסון שחלתי בהרכבה מלאה (איור 2A)

הערה: תרגלו טכניקות סטריליות במהלך פרוטוקול השמירה החיסונית, במיוחד בעת החלפת מאגרים, כדי למנוע זיהום במהלך תקופות דגירה ממושכות.

  1. בצעו את כל שלבי השמירה החיסונית בצלחת של 24 בארות, כפי שמוצג באיור 2A. התאם אמצעי אחסון של ריאגנטים לפורמטים אחרים. החליפו את המאגרים בזהירות כדי למנוע אובדן שחלות קטנות לפני הלידה והטרום-לידתיות.
    הערה: ניתן להשתמש בפורמטים אחרים, כגון לוחות של 48 ו-96 בארות, אך הבארות העמוקות יותר והפתחים הצרים יותר מקשים על שאיפת מאגרים מבלי לאבד או לפגוע בשחלות.
  2. יום 1
    1. פיפטה 1 מ"ל של PBS / באר לתוך מספר הבארות הדרושות בצלחת נקייה של 24 בארות. חותכים את קצהו של קצה פיפטה של 200 μL כדי ליצור פתח רחב ומשתמשים בו כדי להעביר בעדינות שחלות פרה-פוברטליות מצינורות של 1.5 מ"ל עם 70% אתנול לתוך הבארות. עבור שחלות גיל ההתבגרות, השתמשי בקצה פיפטה של 1000 μL כאשר הקצה נחתך לצורך ההעברה.
      הערה: הפתיחה הרחבה יותר של הקצה מונעת נזק לרקמות במהלך ההעברה.
    2. לאחר שכל הדגימות מועברות לבארות, השתמש בקצה חדש כדי לשאוף ל- PBS ולהחליף אותו ב- 0.8 מ"ל טריים של PBS / באר. דגירו את הדגימות בטמפרטורת החדר על שייקר במהירות של כ-100-150 סל"ד למשך הלילה. התחל בהכנת מאגר החדירה (ראה טבלה 1 וסעיף 1).
      הערה: הקצה החדש מונע מהשחלות להידבק לקצה, ושלב הדגירה של PBS מאפשר לשחלות להתאזן ב-PBS ולהתייבש מחדש לפני ההכתמה.
  3. יום 2
    1. סיימו את הכנת מאגר החדירה. לשאוף PBS מן הבארות ולהחליף אותו עם 0.8 מ"ל של מאגר permeabilization לכל באר. מניחים את הצלחות בחזרה על השייקר ומדגרים את הדגימות בטמפרטורת החדר במשך 4 שעות.
    2. לאחר 4 שעות של דגירה, שאפו לחלוטין את מאגר החדירה והחליפו אותו ב-0.5 מ"ל של מאגר חוסם (ראו טבלה 1 וסעיף 1). אטמו את הצלחת בפרפילם כדי למנוע אידוי, הניחו במיכל מכוסה היטב על שייקר, ודגרו את הדגימות בתסיסה עדינה בחסימת חיץ למשך הלילה (16-24 שעות) בטמפרטורת החדר.
  4. יום 3
    1. הכן את הנוגדנים העיקריים על ידי דילול במאגר חסימה. להדמיה של ביציות, השתמשו בסמני ביציות, למשל, פפטידאז חומצי גרעיני נגד תאי נבט של חולדה (GCNA)/TRA98 הן עבור השחלות הטרום-לידתיות והן עבור השחלות הקדם-פוברטליות וההליקאז הארנב נגד תיבת DEAD 4 (DDX4)/עכבר ואסה הומולוג (MVH) עבור השחלות הקדם-פובירטליות והתרבותיות. לכימות ביטוי LINE-1 ORF1p בשחלות טרום לידתיות, השתמש בארנב נגד LINE-1 ORF1p או בנוגדן זמין אחר.
      הערה: אות GCNA/TRA98 אינו ניתן לזיהוי בשחלות ההתבגרות.
    2. שאפו את המאגר החוסם מהדגימות והחליפו אותו ב-0.5 מ"ל של נוגדנים ראשוניים מדוללים. אוטמים את הצלחת בפרפילם כדי למנוע אידוי. מניחים את הצלחות במיכל עם כיסוי כדי למנוע התייבשות של דגימות במהלך הדגירה. מניחים את המיכל על השייקר ומדגרים את הדגימות למשך 3-4 ימים בטמפרטורת החדר.
  5. יום 7
    1. הסר בעדינות את הפרפילם מהצלחות ושאף את תערובת הנוגדנים העיקרית מהדגימות. אחסנו את תערובות הנוגדנים העיקריות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס (למשך עד חודש או שלושה שימושים) והשתמשו בהן שוב מאוחר יותר על ידי נטילת תוסף עם נוגדנים טריים (למשל, 2 μL של נוגדנים טריים aliquot לכל 5 מ"ל של התערובת ששימשה בעבר).
    2. הוסיפו 1 מ"ל של מאגר כביסה (ראו טבלה 1 וסעיף 1) לדגימות וטלטלו בעדינות את הצלחות למשך מספר שניות כדי לשטוף את שאריות הנוגדנים. יש לשאוף בזהירות ולהחליף את מאגר הכביסה ב-0.8 מ"ל של חיץ כביסה טרי ולנער את הצלחות בטמפרטורת החדר למשך הלילה.
  6. יום 8
    1. שאפו למאגר הכביסה למשך הלילה, החליפו אותו ב-0.8 מ"ל של מאגר כביסה טרי, וטלטלו בטמפרטורת החדר למשך שעתיים. חזור על שלב הכביסה עם חיץ כביסה טרי במשך 2 שעות נוספות.
    2. לאחר ההדחה האחרונה, החליפו את מאגר הכביסה ב-0.5 מ"ל של תערובות נוגדנים משניות המדוללות במאגר חוסם, למשל, אלקסה פלואור 555 נגד עכברוש עזים ונגד ארנב עזים אלקסה פלואור 647 בדילול של 1:1,000. הכינו את תערובת הנוגדנים המשנית טרייה לכל ניסוי בתחום החיסונים.
    3. אטמו את הצלחת בפרפילם כדי למנוע אידוי במהלך הדגירה. דגירה של הדגימות בטמפרטורת החדר בחושך או בצלחות מכוסות בנייר אלומיניום עם תסיסה עדינה במשך 3 ימים.
      הערה: שלב זה וכל הצעדים הבאים מתרחשים בחושך או עם עטיפת רדיד אלומיניום.
  7. יום 11
    1. לשאוף את תערובת הנוגדנים המשנית ולבצע שטיפה ראשונית עם 1 מ"ל של חיץ כביסה. נדנדו בעדינות את הצלחות למשך מספר שניות כדי לשטוף את שאריות הנוגדנים המשניים.
    2. לשאוף את חיץ הכביסה, להחליף אותו עם 0.8 מ"ל של חיץ כביסה טרי, ולדגום את הדגימות בטמפרטורת החדר במשך 2 שעות עם רעידות, מוגן מפני אור. חזרו על שלב הכביסה 2 פעמים ובסך הכל 3 שטיפות. לאחר הכביסה השלישית, המשך לשלב הסליקה (סעיף 6).

6. ניקוי של שחלות מוכתמות במערכת החיסון (איור 2A).

הערה: בצע את כל שלבי הניקוי בחושך על-ידי עטיפת הלוחות בנייר אלומיניום או מיקום במיכלים אטומים. שלבי הפינוי נבדלים זה מזה עבור השחלות הקדם-פוברטליות וההתבגרות המינית.

  1. יום 11 [השחלות הטרום-לידתיות והקדם-פוברטליות מנוקות בפרוטוקול חד-שלבי]
    1. לאחר הכביסה האחרונה, שאפו למאגר הכביסה והחליפו אותו ב-0.8 מ"ל של תמיסת ScaleS4(0) טרייה (ראו טבלה 1 וסעיף 1). אטמו את הצלחת בפרפילם ודגרו את הדגימות בחושך עם רעד בטמפרטורת החדר במשך שלושה עד ארבעה ימים לפני ההדמיה.
    2. החלף את פתרון ScaleS4(0) בפתרון חדש מדי יום במידת הצורך; יש להקפיד על החלפת הפתרונות, שכן השחלות המנוקות הופכות שקופות וקשה לראותן. לאחר הניקוי, המשך להגדרת דגימה והדמיה (סעיף 7).
      הערה: שינוי הפתרונות לא שיפר באופן משמעותי את איכות התמונה. שינויים יומיים מגדילים את הסבירות לאבד דגימות קטנות ובעיקר שקופות.
  2. ימים 11-15 [שחלות ההתבגרות מנוקות בפרוטוקול דו-שלבי]
    1. לאחר שטיפת החיסון האחרונה, שאפו את מאגר הכביסה והחליפו אותו ב-0.8 מ"ל של ScaleCUBIC-1 (ראו טבלה 1 וסעיף 1). אטמו את הצלחת בפרפילם ונערו בעדינות דגימות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 3 ימים בחושך. החלף את פתרון ScaleCUBIC-1 בפתרון הטרי מדי יום.
    2. ביום ה-15, שטפו את הדגימות 3 פעמים במשך 10 דקות בכל פעם ב-0.8 מ"ל של PBS בטמפרטורת החדר עם טלטולים עדינים. החלף את ה- PBS ב- 0.8 מ"ל של 20% סוכרוז מעוות שהוכן טרי עם PBS. יש לנער בעדינות בטמפרטורת החדר למשך שעה אחת.
    3. החלף את תמיסת הסוכרוז של 20% ב- 0.8 מ"ל של תמיסת ScaleCUBIC-2 (ראה טבלה 1 וסעיף 1), אטום את הצלחת בפרפילם ורעד בעדינות בטמפרטורת החדר עם שינויים יומיים של פתרון ScaleCUBIC-2. נקה במשך 4-5 ימים והמשך לתמונה. היזהר בעת החלפת פתרונות כדי למנוע אובדן דגימה כמו שחלות מנוקות שקופות וקשה לראות. המשך להגדרת דגימה והדמיה (סעיף 7).

7. הגדרת דגימה והדמיה עם מיקרוסקופ מולטיפוטונים

הערה: כל השלבים המתוארים להלן בוצעו עם לייזר Leica DIVE/4TUNE/FALCON עם שני לייזרי Ti:Sapphire multiphoton נעולים במצב כוונון עם משך פולס של 120 fs עם מטרה מרובת טבילות 16x/NA0.6 (נוזל טבילה = גליצרול) עם מרחק עבודה מקסימלי של 2.2 מ"מ. עיין בטבלת החומרים לקבלת פרטים אודות התוכנה לרכישת תמונות. טבלה משלימה S1 ואיור משלים S1 מציגים את ההגדרות המשמשות לפרוטוקול זה. לפלטפורמות הדמיה אחרות, התייעצו עם ליבת המיקרוסקופיה או עקבו אחר מפרטי/המלצות היצרנים.

  1. הגדרה לדוגמה
    1. הכן את ההגדרה להרכבה של הדוגמאות. לדוגמה, השתמש באטם סיליקון דביק וגמיש כדי ליצור באר דבק. הניחו את באר ההדבקה על מיקרו-כיסוי אחד בגודל 25 מ"מ x 25 מ"מ X 25 מ"מ מס' 1.5 כדי ליצור באר שבה יוצבו השחלות (איור 2B).
      הערה: אטם בעובי של 1 מ"מ מתאים לכל הגדלים של השחלות. הגדרה זו מומלצת מכיוון שהיא מבטלת את תנועת השחלה במהלך ההדמיה, אשר יכולה להתרחש כאשר השחלות ממוקמות בהרכבה בצלחת תחתית זכוכית.
    2. באמצעות קצה פיפטה עם קצה מנותק (20 μL עבור טרום לידתי ופרה-פוברטלי), מעבירים את השחלות עם ~5-10 μL של תמיסת ScaleS4(0) לאמצע ההדבקה היטב, כפי שמוצג באיור 2B. עבור שחלות התבגרות, השתמשי בקצה פיפטה של 200 μL כאשר הקצה נחתך מספיק רחוק כדי להעביר את השחלות. הוסף ~15-20 μL של תמיסת ScaleCUBIC-2 לאמצע באר הדבק.
      הערה: פתרון רב מדי עלול לגרום לדליפה על במת המיקרוסקופ, ופתרון קטן מדי יגרום לאיכות תמונה ירודה. השתמש במיקרוסקופ דיסקציה כדי להעביר דגימות כאשר השחלות המנוקות הופכות שקופות וקשה לראות אותן.
    3. לאחר שהשחלות מועברות לבארות בודדות עם טיפה של תמיסת ניקוי, הניחו בעדינות כיסוי נוספת על באר ההדבקה, לחצו כדי ליצור אטימה ושמרו את הדגימות במקומן בבריכה קטנה של תמיסת ניקוי דחוקה בין שני הכיסויים (איור 2B). לצורך הדמיה, מקם את "כריך" הכיסוי בשקופית מתאם מיקרוסקופ מודפס בתלת-ממד (לדוגמה, 43 ).
      הערה: בארות דבק ניתנות לשימוש חוזר לאחר פירוק "הכריך" ושטיפת מים.
  2. הדמיה (טבלה משלימה S1 ואיור משלים S1)
    1. הפעל את המיקרוסקופ והתוכנה על פי הנחיות ליבת המיקרוסקופיה או היצרן. הניחו את הדגימות המותקנות על במת המיקרוסקופ והסתכלו דרך העינית כדי לאתר את הדגימה המוארת במנורת פלואורסצנציה LED בהספק נמוך.
    2. לאחר איתור הדגימות, הפעילו את הלייזר(ים) והקצו כל גלאי לצבע/סמן ספציפי של Alexa Fluor. עבור לייזרים מרובים, אפשר רכישת תמונה רציפה. רכוש את כל הערימה לפני החלפת לייזרים.
      הערה: עבור פרוטוקול זה, לייזר אחד שימש לרכישת תמונה של פלואורופורים של 555 ננומטר ו-647 ננומטר.
    3. הגדר את הפרמטרים לרכישת תמונה בהתאם לליבת המיקרוסקופיה או למפרט היצרן. השתמש ברכישת תמונה דו-כיוונית, אם היא זמינה, כדי לקצר את זמן הסריקה ולשפר את היעילות. התאם הגדרות אחרות, כולל ממוצע הקו (1), ממוצע המסגרות (1) וצבירת המסגרות (1).
      הערה: רכישת תמונה דו-כיוונית מאפשרת ללייזרים לסרוק בשני הכיוונים כשהם נעים על ציר ה-X.
    4. הגדר את Z-Stack על ידי זיהוי ההתחלה (החלק התחתון של כיסוי הזכוכית לדוגמה/התחתון) ומיקום הקצה (החלק העליון של המדגם/כיסוי הזכוכית העליון). בחר גודל שלב Z של 2 מיקרומטר עבור שחלות פרה-פוברטליות ו-5 מיקרומטר עבור השחלות המתבגרות.
    5. הפעל את תכונת Z-compensation, ובתוך תכונה זו, הפעל את רווח העירור. הגדר את פיצוי ה- Z עבור החלק התחתון והחלק העליון של הדגימה על ידי בחירת עוצמת לייזר הן עבור החלק התחתון (בעוצמה נמוכה) והן עבור הערימה העליונה (בעוצמה גבוהה). ראו איור משלים S1, פיצוי Z ליניארי, שבו נבחרת תיבת רווח עירור, ועוצמת לייזר עבור החלק התחתון (0) והחלק העליון (347.75) מוגדרת כ- 10 ו- 12, בהתאמה.
    6. השתמש במצב ריצוף עבור דגימות גדולות יותר שלא ניתן ללכוד בשדה ראייה יחיד. הפעל את נווט התמונה וציין את מספר האריחים הדרושים כדי ללכוד את הדגימה כולה באמצעות כלי הסימון המלבני.
    7. התחל את רכישת התמונה. עבור תמונות עם אריחים מרובים, התחל ברכישת תמונה עם הנווט כדי ללכוד את כל האריחים. לאחר השלמת רכישת התמונה, שמור תחילה את כל התמונות, ואם נרכשו אריחים מרובים, הפעל את הכלי מיזוג פסיפס כדי למזג את האריחים לתמונה אחת.
    8. שמור את הקבצים הממוזגים בתיקיית פרוייקט נפרדת כדי להקל על העבודה עם התמונות בגודל של Gigabyte. העבר את הקבצים לעיבוד תמונה באמצעות תוכנת הדמיה וניתוח תמונה תלת-ממדית. איור 3 מציג תמונות מייצגות שצולמו בשלבים שונים עם שני סמנים (GCNA ו-DDX4).

8. עיבוד תמונה

הערה: כל השלבים המתוארים להלן פותחו ובוצעו באמצעות תוכנת ההדמיה והניתוח של תמונה בתלת-ממד של IMARIS.

  1. ייבא את התמונות לתוכנת ההדמיה והניתוח של תמונות תלת-ממדיות, ובמידת הצורך, המר את הקבצים מהתבנית המקורית (לדוגמה, .lif, .czi, .lsm, .lei, .oib, .oif, .nd2) לתבנית .ims.
  2. במידת הצורך, עיבד את התמונות באמצעות מסנן הגאוס כדי להפחית את הפיקסלציה (איור 4A). באמצעות התכונה 'תצוגה תלת-ממדית' , מקם את התמונה ובטל את הבחירה באפשרות המסגרת (כדי להסיר את המסגרת).
    הערה: ישנם מסננים אופציונליים אחרים, שניתן להשתמש בהם גם כדי להפחית את הפיקסלים ולהפחית את עוצמת הרקע.
  3. הגדל את התמונה לקנה מידה מסוים והשתמש בתכונה Snapshot. הגדר את ההעדפות באופן הבא: בחר 300 DPI, שמור כתמונת TIFF ורקע שקוף. צלם תמונה של התמונה ושמור אותה. איור 3 מציג תמונות שלמות שהורכבו.

9. כימות ביציות

הערה: ניתן להשתמש בהדמיה וניתוח של תמונות תלת-ממדיות ושל תמונה תלת-ממדית להערכת מספרי הביציות בשחלות שלמות (איור 3 ואיור 4) באמצעות תכונת ה-Spot. ניתן להשתמש באות ה-GCNA כדי לכמת ביציות בשחלות טרום-לידתיות ופרה-פוברטליות, כפי שמוצג באיור 4 (P5). בשחלות ההתבגרות, השתמש באות DDX4 כדי לכמת שתי אוכלוסיות ביציות בזקיקים שאינם גדלים (מבנה "דמוי טבעת", חץ סגור) וזקיקים גדלים (מבנים גדולים, חץ פתוח, איור 4, P28).

  1. קבע את גודל הביציות שישמשו כפרמטר לכימות ביציות באמצעות תכונת כתמים בשלב 9.2.
    1. פתחו את התמונה ובחרו באפשרות פרוסה כדי לפתוח את תמונת מחסנית Z.
    2. בחר באפשרות קו בחלונית מדידה ומדוד את המרחק על ידי ציור קו מקצה אחד של ביצית/סמן לקצה השני בנקודה הרחבה ביותר כדי לקבוע את קוטר ה-XY של סוג/גודל הביצית שיש לספור. לעבור דרך הערימה ולקבל את טווח הקטרים עבור מספר ביציות מאותו סוג. השתמש באורך הקצר ביותר כקריטריון בחירת הגודל לספירת ביציות.
  2. תכונת ספוטים: בחר באפשרות 'תצוגה תלת-ממדית' והפעל את הפונקציה 'הוסף ספוטים חדשים' בחלונית 'סצנה' כדי לפתוח את החלונית 'אלגוריתם'. בטל את הבחירה בכל הגדרות האלגוריתם כאשר ייעשה שימוש במסנן בחירת הגודל עם גודל הביצית המתקבל בשלב 9.1.
    1. לחץ על החץ הבודד קדימה כדי לעבור לערוץ המקור. בחר את הערוץ עם הסמן המועדף והקלד בקוטר XY המשוער המתקבל בשלב 9.1. לדוגמה, השתמש בקוטר XY משוער של 7 מיקרומטר עבור ביציות טרום לידתיות ו-11 מיקרומטר עבור ביציות P5 (GCNA = אות ירוק; איור 3 ואיור 4A).
    2. השתמש ב- 30 μm עבור אות DDX4 כדי להעריך את מספר הביציות בזקיקים הגדלים בשחלות P5 (DDX4 = אות מג'נטה; איור 3 ואיור 4A). עבור שחלות גיל ההתבגרות, השתמש באות DDX4 לכימות ביציות. לדוגמה, השתמש בקטרים XY של 15 מיקרומטר ו-80 מיקרומטר כדי לזהות ביציות בתוך זקיקים שאינם גדלים וזקיקים גדלים, בהתאמה, כפי שמוצג באיור 4A.
      הערה: הגודל שנבחר עשוי להשתנות בהתאם לקריטריונים לרכישת תמונה וסוג המיקרוסקופ שבו נעשה שימוש. הברירה עשויה להשתנות גם בין זנים גנטיים מכיוון ששחלות עם יותר ביציות ידרשו בחירות בגודל קטן יותר לזיהוי אוטומטי טוב יותר של ביציות.
    3. לאחר בחירת הגודל, הפעל את התארכות ה-PSF של הדגם ואת חיסור הרקע, הנקבעים באופן אוטומטי. בחר את החץ הבודד קדימה כדי לעבור לחלונית 'נקודות סינון '. הוסף את מסנן האיכות וקבע סף. כדי להבטיח הערכה מדויקת של מספרי הביציות, הגדל את התמונה כאשר הסף מותאם כדי לבחור ערך סף שבוחר את רוב הביציות. לחץ על החץ הכפול כדי לסיים ספירות אוטומטיות.
    4. בדוק באופן ידני את הביציות שנבחרו באמצעות הכרטיסייה Edit כדי לבחור ביציות שהוחמצו או לבטל את הבחירה בחלקיקים שאינם ביציות שנבחרו על ידי הסף האוטומטי. תעד את הנתונים בכרטיסיה סטטיסטיקה תחת הכרטיסייה 'כולל' לניתוח נוסף.
      הערה: ניתן לשמור את הפרמטרים המשמשים לספירת הכתמים ולהשתמש בהם עבור ערכת דגימות אחרת, אך מומלץ לבצע בדיקה ידנית לפני הפעלת ניתוח אצווה.
    5. כדי לאחסן את הפרמטרים, לחץ על הכרטיסיה יצירה ולחץ על פרמטרים של חנות עבור אצווה.
      הערה: סמנים גרעיניים (ביציות GCNA+, איור 4A) מזוהים בקלות על-ידי תכונת הנקודה וייתכן שהם לא דורשים כוונון ידני רב. עם זאת, הסמן הציטופלסמי (ביצית DDX4+, איור 3 (P28, חץ סגור) ואיור 4A) ידרוש כוונון ידני יותר כדי להבטיח זיהוי של הגודל/סוג הנכון של הביציות.

10. כימות ביטוי חלבונים בשחלות

הערה: קיימות מספר דרכים לכמת את ביטוי הביציות של סמנים ספציפיים באמצעות תכונת הכתמים (סעיף 9 ושלב 10.1) והן באמצעות תכונת המשטחים (שלב 10.2). ניתן להשתמש בתכונת הכתמים עבור חלבונים עם תבניות לוקליזציה שונות כגון סמנים גרעיניים (GCNA), וניתן להשתמש בתכונת Surfaces עבור חלבונים עם תבניות לוקליזציה לא אחידות כפי שמוצג באיור 5A שבו נמדדו עוצמות LINE-1 ORF1p בשחלות E15.5 ו-E18.5. כדי לחשב ולהשוות את עוצמת החלבון המעניין בין שתי דגימות (למשל, נקודות זמן, טיפולים או גנוטיפים), אסוף תמונות עם אותן תכונות. השתמש בדגימות עם אות אינטנסיבי יותר כדי לקבוע את הפרמטרים שניתן לאחסן ולהשתמש בהם עבור הדגימות האחרות.

  1. כדי לקבל את ביטוי החלבון עם התכונה כתמים , תחילה זהה את הביציות כמודגשות (סעיף 9).
    1. לאחר מכן, תחת התכונה 'ספוטים ', בחרו בכרטיסיה 'סטטיסטיקה ', ולאחר מכן בכרטיסיה 'מפורט '. לחץ על החץ למטה ובחר ערכים ספציפיים, אשר יפתח לשונית נוספת מתחתיו המכילה מדידות שונות. בחר את ממוצע העוצמה של הערוץ המשמש ליצירת פני השטח (או בחר מדידות עוצמה אחרות כגון חציון העוצמה).
    2. לקבלת המידע הסטטיסטי המשולב/ממוצע, בחר בקריטריון הערכים הממוצעים . לאחר שתסיים, ייצא ושמור נתונים לניתוח נוסף.
  2. כדי לקבל את ביטוי החלבון עם התכונה Surfaces , פתח את התמונה, בחר באפשרות תצוגה תלת-ממדית והפעל את הפונקציה הוסף משטחים חדשים בחלונית Scene כדי לפתוח את החלונית אלגוריתם . בטל את הבחירה בכל הגדרות האלגוריתם אם אין צורך בכך ולחץ על החץ היחיד קדימה כדי לעבור לערוץ המקור.
    1. בחר את הערוץ עם אות הנוגדן למדידה. מאפיינים אחרים שיש לבחור הם אפשרויות ספציפיות למשתמש. כאן, אות LINE-1 שימש כסמן. ערכי פירוט המשטחים וחיסור הרקע (ניגודיות מקומית) נשמרו בערכי ברירת המחדל של 1.42 ו- 5.33, בהתאמה.
    2. לחץ על החץ קדימה כדי לעבור לחלונית 'סף '. בחר ערך סף הדומה בשתי הדגימות (לדוגמה, כאן, ביטוי LINE-1 ב- E18.5 שימש לבחירת סף). בחר אפשר עם קוטר נקודות זרע ברירת מחדל של 7.10 (ערך זה נמצא אופטימלי עבור התמונות, אך עשוי להיות תלוי בגודל הפיקסל הצפוי של התכונות).
    3. לחץ על החץ קדימה כדי לעבור לחלונית 'משטחי סינון '. נעשה שימוש במסנן איכות , וביססו את הערך, כמו בערך הסף , על הביטוי של החלבונים בשתי דגימות השחלה. לאחר בחירת מאפיין המסנן, לחץ על החץ הכפול קדימה כדי להשלים את יצירת המשטח.
    4. כדי לקבל את ערכי העוצמה, בחר בכרטיסייה סטטיסטיקה ולאחר מכן בכרטיסיה מפורט . לחץ על החץ למטה ובחר ערכים ספציפיים, אשר יפתח לשונית נוספת מתחתיו המכילה מדידות שונות.
    5. בחר את ממוצע העוצמה של הערוץ המשמש ליצירת פני השטח (או בחר מדידות עוצמה אחרות כגון חציון העוצמה).
    6. לקבלת המידע הסטטיסטי המשולב/ממוצע, בחר בקריטריון הערכים הממוצעים . לאחר שתסיים, ייצא ושמור את הנתונים לניתוח נוסף (איור 5C).

11. הערכה של מספרי הביציות הכוללים בשחלה פגומה באמצעות תיקון חישובי

הערה: אם מתרחש נזק קל בשחלה במהלך הנתיחה, ייתכן שניתן יהיה להעריך באופן חישובי את ספירת הביציות הכוללת. מומלץ להשתמש בשחלות שלמות מאותו זן ומשלב התפתחותי להערכת מספר הביציות כפי שמוצג באיור 6. סימולציות המבוצעות עם שחלות ב-E15.5 מצביעות על כך שתיקון להפסד של ≥30% גורם לסטייה משמעותית מהמספרים בפועל (איור 6C).

  1. פתחו תמונות של שחלות שלמות עם IMARIS ובחרו בתכונת המסגרת . תחת הגדרות המסגרת, בחר את התוויות תיבה, רשת, סימני סימון וציר . תחת הכרטיסיה מיקום X/Y/Z , בחר 200 מיקרומטר כדי ליצור סימני סימון עם רווחים של 200 מיקרומטר בכל מיקומי X/Y/Z.
    הערה: סימני הסימון יוצרים רשת/סרגל במישורי X, Y ו-Z כדי לזהות ביציות באזור מסוים.
  2. הפעילו את תכונת הכתמים כדי לזהות את הביציות כפי שהן מודגשות בסעיף 9 (איור 4). צור מודל תלת-ממדי באמצעות הביציות שזוהו בכל השחלות השלמות המשמשות לסימולציה על-ידי בחירת כדור תחת הלשונית 'סגנון/איכות נקודות ' בתכונה 'כתמים' .
    הערה: ניתן לשנות את רוחב הפיקסלים גם תחת הכרטיסיה 'סגנון/איכות של נקודות '.
  3. כאשר התיבה נוצרת בשלב 11.1, יישרו את המודלים התלת-ממדיים של השחלות השלמות באותו כיוון כפי שמוצג באיור 6A.
  4. באמצעות סימני הסימון של 200 מיקרומטר (שלב 11.1), בחר ביציות שנמצאות בטווח של 50% מהנפח של כל שחלה. לחצו על התכונה 'ספוטים' ובחרו ' ערוך תוויות' כדי לסווג את הביציות שנמצאות באזור 50% לפי צבע, כפי שמוצג באיור 6A.
    הערה: ברגע שביציות מסווגות באזור מסוים, יסופק מספר הביציות שנכללות בכל מחלקה.
  5. התקרב לאזור 50% ושנה את סימני הסימון מ-200 מיקרומטר ל-50 מיקרומטר כדי ליצור סרגל קטן יותר לזיהוי ביציות. שמור על אחוז הזום בכל התמונות. עם סימני הסימון של 50 מיקרומטר כמדריך, חלקו את אזור ה-50% לחמישה חלקים שווים.
    הערה: ביציות בתוך כל חלק ייצגו 10% מהנפח כפי שמודגש באיור 6A, שם שחלה שלמה מראה ביציות בחצי העליון של השחלה המסווגות בחמישה צבעים שונים כאשר כל צבע מייצג ביציות בתוך אזור נפחי של 10%.
  6. רשמו את מספרי הביציות בכל אזור של 10% כפי שמוצג באיור 6A,B. חשב את המספר הממוצע של ביציות במרווחים של 10, 20, 30, 40 ו-50%.
  7. השתמש בדגש בשלבים 11.1 עד 11.6 כדי לקבל מספרי ביציות בשחלה החלקית הפגועה. מקם את השחלה הפגועה באותו כיוון כמו השחלות השלמות והערך נפח/ אחוז חסרים כמתואר לעיל.
  8. כדי להעריך את מספר הביציות הכולל בשחלה כולה , הוסיפו את המספר הממוצע של הביציות המחושבות בנפח דומה למספר המתקבל מהשחלה החלקית (איור 6B).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

חיסון והדמיה של השחלה כולה מאפשרים הדמיה וכימות של ביציות או ביטוי חלבונים בשחלות בשלבים התפתחותיים שונים באמצעות אותה טכניקה וסמנים (איור 3). פרוטוקול זה פותח עבור פרויקט בקנה מידה גדול שבו נדרש ניתוח של שחלות בשלבים מרובים ומזני עכברים מרובים. כאן אנו מציגים נתונים שנאספו עבור זן C57BL6/J, זן סטנדרטי לניתוח גנטי. הטכניקה המוצגת כאן היא פשוטה, ניתן להשיג תוצאות תוך 14-19 יום (איור 2D) וניתן להשתמש בהן עבור שחלות מנקבות טרום לידתיות, פרה-פוברטליות ונקבות התבגרות (איור 1 ואיור 2A,B).

גישה זו שימשה לחקר הדינמיקה של אובדן הביציות המתרחשת באופן טבעי במהלך היווצרות שמורת הביציות השחלתית. באורגניזמים רבים, כולל העכבר, מעריכים שמספרי הביציות מגיעים לשיאם במהלך חיי העובר בערך בזמן שבו ביציות נכנסות למיוזה ~E13.5. מספר הביציות יורד עקב התהליך שעדיין לא הובן במלואו של התשה של ביציות עובריות (FOA) (מ-~E15.5 ל-E18.5), אשר נקשר באופן מכניסטי לביטוי של ה-RETROTRANSposon LINE-120,21. יותר ביציות מסולקות לאחר E18.5 עד P0 עקב חיסול של ביציות לא תקינות על ידי מחסום איכות מיוטי22,23. כדי לחקור את התהליכים האלה באמצעות פרוטוקול זה, עשינו אימונוסטיזציה וצילמנו שחלות בשלבי התפתחות שונים באמצעות DDX4 ו-GCNA כסמני ביציות כפי שמוצג באיור 3.

ביציות קטנות המבטאות GCNA ו- DDX4 נראות מ- E15.5 ואילך והן מייצגות ביציות במהלך MPI או נעצרות בדיקטט בתוך זקיקים ראשוניים. ביציות גדלות וגדולות יותר עם ביטוי חזק של DDX4 מזוהות כבר בשחלות P2, שם הן ככל הנראה מייצגות את הגל הראשון של זקיקים44. מספר גדל והולך של ביציות גדולות יותר נצפה בשחלות P5 ו- P28. תמונות שהתקבלו על ידי מיקרוסקופיית מולטי-פוטון (איור 4A) עובדו באמצעות תוכנת IMARIS, והעיבוד התלת-ממדי בוצע כדי לזהות ביציות קטנות וגדולות יותר המבוססות על אות ה-GCNA הגרעיני ועל הגודל המסומן על-ידי אות ה-DDX4 (איור 4A ווידאו 1). ביציות נספרו כמתואר בפרוטוקול והתוצאות מסוכמות באיור 4B. בהסכמה עם מחקרים קודמים, ראינו אובדן משמעותי של ביציות מ-E15.5 ל-E18.5 (כ-32%) ומ-E18.5 ל-P2 (כ-24%). עד שהנקבות מגיעות לגיל ההתבגרות (P28), רק כ-30% מהביציות שנמצאות ב-E15.5 שרדו.

שיטה זו יכולה לשמש גם כדי לבחון את ההשלכות של טיפולים גנוטוקסיים כגון הקרנה, אשר הוכח לחסל לחלוטין את עתודת הזקיקים הראשונית בתוך שבוע אחד 23,38,45. הבדל חזותי משמעותי ניכר בין כל השחלה שטופלה בקרינה לבין השליטה הלא מטופלת באיור 3 (בהשוואה בין שחלות P28 מנקבות מטופלות ולא מטופלות). בשחלת P28 ללא חשיפה לקרינה, צפינו בשתי אוכלוסיות ביציות המסומנות ב-DDX4; שפע של ביציות קטנות בזקיקים קדמוניים (חץ סגור); וביציות גדולות יותר בגדלים שונים שנמצאות בדרך כלל בזקיקים הגדלים (למשל, ראשוניים, משניים וטרום-אנטרליים) (איור 3). לעומת זאת, השחלה של נקבה שנחשפה ל-0.5Gy של קרינת γ ב-P7 נטולת ביציות קטנות לחלוטין בזקיקים ראשוניים כפי שנצפה בעבר בקטעים דו-ממדיים. מעניין שרק ביציות גדולות יותר בגודל דומה שרדו קרינה; אלה עשויים להיות זקיקי הגל הראשון שכבר גדלו בשחלת P7, מכיוון שהם ידועים כעמידים בפני קרינה46 (איור 3, P28).

בנוסף לכימות מספרי הביציות, פרוטוקול זה יכול לשמש לצורך חיסון וניתוחים כמותיים של חלבונים אחרים המעורבים בפיתוח ביציות. לדוגמה, השתמשנו בנוגדנים נגד חלבון LINE-1ORF1p, חלבון מלווה קושר RNA, המיוצר על-ידי רטרו-טרנספוזונים של LINE-1 (איור 5). עלייה בשפע של רכיבי LINE-1 מ- E15.5 ל- E18.5 הוצעה לגרום לחיסול ביציות20,21. ואכן, באמצעות תמונות שצולמו על-ידי ריבוי-פוטונים וניתוח עוצמת אותות ב-IMARIS, רמות LINE-1 ORF1p נצפו כעליות משמעותיות בביציות במהלך תקופה זו, מה שמתואם עם ירידה משמעותית במספרי הביציות כפי שמוצג באיור 4B.

בנסיבות שבהן חלק מהשחלה ניזוק או הולך לאיבוד, ניתן להשתמש בשחלות מאותו זן ובאותו שלב התפתחותי כדי להעריך באופן חישובי את מספר הביציות באזור החסר כפי שמוצג באיור 6. נתונים משחלות E15.5 שימשו לסימולציות כדי לבחון את הדיוק של תיקונים חישוביים. ניתן להעריך באופן חישובי כי ביציות בשחלות עם נזק לרקמות של עד 30% יש סטייה ≤10% בהשוואה לביציות בשחלה שלמה, מה שמרמז על כך שניתן להשתמש ביעילות בכתמים ומידול שחלתיים תלת-ממדיים כדי להציל נתונים מרקמות יקרות. סימולציות המבוצעות עם שחלות ב-E15.5 מצביעות על כך שתיקון להפסד של ≥30% גורם לסטייה משמעותית מהמספרים בפועל (איור 6C).

Figure 1
איור 1: כריתה וזלוף שחלתיים מנקבות משלבים טרום לידתיים ופוסט-לידתיים. (A-C) כריתת שחלה משלבים שונים דורשת טכניקות שונות, המתוארות באופן סכמטי כדי להשלים את התיאורים בסרטון. (D) השחלות ביום 5 שלאחר הלידה (P5) קטנות בהרבה מאשר ב-P28, מה שמחייב פרוטוקול סליקה שונה כפי שמתואר בפרוטוקול. (ה,ו) זלוף נכון של השחלות חשוב כדי למנוע צביעת רקע מתאי דם אדומים. דרכי הרבייה והשחלות שאינן מחוררות הן בעלות גוון ורוד ואילו איברים מחוררים יהפכו ללבנים. קיצור: RI = דרכי רבייה שאינן מופרעות. תמונות A-C נוצרו עם BioRender.com. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 2
איור 2: סימון חיסוני, ניקוי והדמיה של שחלות של עכברים שלמים. (A) תרשים זרימה מתאר שלבים משותפים וספציפיים לפרוטוקול חיסון וניקוי של שחלות טרום לידתיות/פרה-פוברטליות וערווה. (B) שחלות מנוקות מורכבות בטיפה של תמיסת ניקוי באמצע באר דבק דחוקה בין שני תלושי כיסוי. לצורך הדמיה, הדגימות המותקנות ממוקמות בשקופית מתאם מודפסת בתלת-ממד. (C) תמונות מולטיפוטונים בגווני אפור של שחלות שאינן מחוררות לעומת שחלות מחוררות, מוכתמות באופן חיסוני עם סמן הביציות DDX4, המציגות איכות תמונה משופרת והורדת כתמים לא ספציפיים לאחר זלוף. החץ הסגור מציין ביצית עם שכבה דקה של כתמי DDX4 ציטופלסמיים האופייניים לזקיקים קדמוניים, והחצים הפתוחים מראים ביציות גדולות יותר בתוך זקיקים גדלים. כוכבית מציינת השפעה אוטומטית מכלי הדם. (D) עיבודים תלת-ממדיים מתמונות קונפוקליות לעומת מולטי-פוטון של שחלות P5, מוכתמות במערכת החיסון עם סמני ביציות GCNA (ירוק) ו-DDX4 (magenta), המראה סטייה כדורית משמעותית ממיקרוסקופיה קונפוקלית וכמעט אף אחד מהם אינו ממולטי-פוטון. סרגלי קנה מידה = 100 מיקרומטר (C, D) ו- 50 מיקרומטר (כניסות ב- D). קיצורים: GCNA = פפטידאז חומצי גרעיני של תא נבט; DDX4 = הליקאז מת תיבה 4. תמונה A נוצרה עם BioRender.com. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 3
איור 3: תמונות מייצגות של שחלות בשלבי התפתחות שונים המעובדות בתלת-ממד. עיבודים תלת-ממדיים מתמונות מולטי-פוטון של שחלות הר שלמות עם חיסון עם GCNA (ירוק) ו- LINE-1 ORF1p (כחול) או DDX4 (מגנטה), בשחלות טרום לידתיות ואחרי לידתיות, בהתאמה. ערוצים בודדים מוצגים בגווני אפור כדי להראות אותות גרעיניים וציטופלסמיים. אזורי המתאר של התיבות הלבנות מוגדלים בערכות התחתונות השמאליות. שתי שחלות שונות מוצגות עבור P28. השחלה מהנקבה שאינה מוקרנת (למעלה) מכילה אוכלוסייה גדולה של ביציות קטנות בזקיקים קדמוניים (ראו כניסה). לעומת זאת, השחלה מהנקבה המוקרנת ב-P7 עם 0.5 Gy של קרינת γ (IR) נטולת לחלוטין ביציות קטנות בזקיקים ראשוניים (ראו כניסה). החץ הסגור מציין ביצית עם שכבה דקה של צביעת DDX4 ציטופלסמית האופיינית לזקיקים קדמוניים, וחצים פתוחים מראים ביציות גדולות יותר בתוך זקיקים גדלים. סרגלי קנה מידה = 100 מיקרומטר; 30 מיקרומטר עבור ערכות P28; 10 מיקרומטר עבור כל שאר הסטים. ערכות Inset מכילות תצוגות מוגדלות של תמונות מעובדות בתלת-ממד שנוצרו ב-IMARIS ועשויות להיות שונות במקצת מתמונות בהגדלה נמוכה עקב פרספקטיבה. קיצורים: Non-IR = שליטה לא מוקרנת; IR = מוקרן ב- P7 עם 0.5 Gy של קרינת γ; GCNA = פפטידאז חומצי גרעיני של תא נבט; DDX4 = הליקאז תיבת מת 4; LINE-1 = יסוד גרעיני ארוך משולב-1. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 4
איור 4: עיבוד תמונה, תצוגה תלת-ממדית של ביציות ותוצאות כימות. (A) עיבודים תלת-ממדיים מתמונות מרובות-פוטון (משמאל) עובדו ב-IMARIS באמצעות מסנן גאוס (באמצע) וביציות בגדלים קטנים וגדולים זוהו באמצעות תכונת הספוט (מימין). שחלות P5 ו- P28 מוצגות כדוגמה. סרגלי קנה מידה = 100 מיקרומטר (P5); 10 מיקרומטר (כניסות P5); 300 מיקרומטר (P28); 50 מיקרומטר (ערכות P28). (B) ביציות קטנות חיוביות ל-GCNA כומתו בשחלות משלבים שונים באמצעות תכונות נקודתיות (למעלה). כדי להמחיש את הירידה במספר הביציות במהלך ההתפתחות, האחוז הממוצע של הביציות חושב בכל שלב בהשוואה למספר הממוצע הקיים בשלב המוקדם ביותר שנספר ב-E15.5 (למטה). שימו לב לירידה הגדולה במספרי הביציות מ-E15.5 ל-E18.5. הנתונים מוצגים כאמצעים ± SD. ניתוחים סטטיסטיים בוצעו באמצעות תוכנת GraphPad Prism ונותחו על ידי ANOVA חד-כיוונית, והמובהקות נקבעה על ידי מבחן ההשוואה המרובה שלאחר ההוק של Bonferroni. * עמ' ≤ 0.05; עמ' ≤ 0.0001; ns >0.05. קיצור: GCNA = פפטידאז חומצי גרעיני של תא נבט; ns = לא משמעותי. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 5
איור 5: זיהוי וכימות של ביטוי ה-ORF1p שלLINE-1 אצל ביציות עובריות. (A) עיבודים תלת-ממדיים מתמונות מרובות-פוטון מראים ביטוי LINE-1 ORF1p (כחול) בביציות עובריות E15.5 ו-E18.5 (המסומנות על-ידי GCNA ירוק). (B) משטחים תלת-ממדיים שנוצרו ב-IMARIS באמצעות תמונות בשורה העליונה בלוח A. (C) ניתוח עוצמת LINE-1 ORF1p מראה ביטוי גבוה יותר של LINE-1 ORF1p לביצית ב-E18.5 מאשר E15.5. סרגלי קנה מידה = 100 מיקרומטר; 10 מיקרומטר (לוח A insets); 30 מיקרומטר (לוח B כניסות). הנתונים מוצגים כאמצעים ± SD. ניתוחים סטטיסטיים בוצעו באמצעות תוכנת GraphPad Prism ונותחו על ידי מבחן t של סטודנט, והמובהקות נקבעה על ידי מבחן Mann-Whitney U . עמ' ≤ 0.0001; ns >0.05. קיצורים: GCNA = פפטידאז חומצי גרעיני של תא נבט; LINE-1 = יסוד גרעיני ארוך משולב-1. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 6
איור 6: שיטה להערכת סך כל מספרי הביציות בדגימות שחלה פגומות באמצעות תיקון חישובי. (A) מודל של ביציות E15.5 חיוביות ל-GCNA (ירוק) עם חמישה אזורים של 10% המודגשים באדום, כחול, אפור, מגנטה וחום בשחלה שלמה. כל תמונה עוקבת, אחרי השחלה השלמה, מייצגת שחלה מדומה עם 10% אזורים מצטברים שחסרים עד 50%. (B) סכמות של השיטה החישובית להערכת מספר הביציות במדגם פגום. (C) סך כל מספרי הביציות בשחלות מדומות הושוו למספרים בשחלות השלמות המקוריות (הנחשבות ל-100%) וההפרש מוצג כסטייה באחוזים. סימולציה משש שחלות בודדות עם 10-50% נפח חסר. סרגלי קנה מידה = 80 מיקרומטר. קיצור: GCNA = פפטידאז חומצי גרעיני של תא נבט. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

סרטון 1: עיבוד תלת-ממדי ומידול תלת-ממדי של ביציות בשחלות P5. אנא לחץ כאן כדי להוריד סרטון זה.

פתרונות ובופרים ריאגנט(ים) הרכב
מקבע Paraformaldehyde 4% (v/v)
מאגר Permeabilization אלכוהול פוליוויניל (PVA) 0.2% (w/v)
נתרן בורוהידריד 0.1% (w/v)
טריטון X-100 1.5% (v/v)
חסימת מאגר אלבומין סרום בקר (BSA) 3% (w/v)
1 M גליצין (pH 7.4) 2% (w/v)
טריטון X-100 0.1% (v/v)
200x פניצילין-סטרפטומיצין 1% (v/v)
10% נתרן אזיד 0.2% (v/v)
סרום עיזים 10% (v/v)
חיץ כביסה PVA 0.2% (w/v)
טריטון X-100 0.15% (v/v)
10% נתרן אזיד 0.1% (v/v)
תמיסת ScaleS4(0) (pH 8.1) די-סורביטול 40% (w/v)
אוריאה 24% (w/v)
גליצרול 10% (v/v)
DMSO 20% (v/v)
פתרון ScaleCUBIC-1 אוריאה 25% (w/v)
N,N,N′,N′-Tetrakis(2-הידרוקסיפרופיל)אתילנדיאמין 25% (v/v)
טריטון X-100 15% (v/v)
תמיסת סוכרוז סוכרוז 20%(w/v)
פתרון ScaleCUBIC-2 סוכרוז 50% (w/v)
אוריאה 25% (w/v)
טריאתנולמין 10% (w/v)
טריטון X-100 0.1% (v/v)

טבלה 1: פתרונות ומאגרים.

איור S1 משלים: העדפות רכישת תמונות. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

טבלה משלימה S1: הגדרות רכישת תמונה. אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

מאמר זה מציג פרוטוקול חיסון והדמיה תלת-ממדי מפורט לשחלות טרום לידתיות ואחרי לידתיות למחקרים בתפוקה גבוהה והשוואתיות לכימות תאי נבט ולוקליזציה של חלבונים. פיתחנו את הפרוטוקול הזה כדי לנתח את מספרי הביציות בשחלות (N=6-12) בשש נקודות זמן התפתחותיות ב-10-16 זנים שונים, כאשר 2-4 לוחות 24-well מעובדים בדרך כלל בו-זמנית. שיטה זו יכולה להיות מותאמת לאיברים אחרים או סמנים תאיים. לדוגמה, פרוטוקול זה יכול לשמש כדי לתייג ולדמיין תאים סומטיים, כגון תאי גרנולוזה בשחלה, באמצעות נוגדנים מתאימים, ובכך להקל על מחקרים של אינטראקציות בין תאי נבט סומטיים או התפתחות של סוגי תאים שחלתיים אחרים.

מגבלה אחת של פרוטוקול זה ושילוב נוגדנים היא זיהוי סופי של שלבים זקיקים שונים. כתמי דנ"א המשמשים באימונופלואורסצנציה ובהדמיה דו-ממדית לזיהוי שלבים זקיקים על ידי שכבות של גרעיני תאי גרנולוזה אינם מספיקים לגישות תלת-ממדיות. 4′,6-diamidino-2-Phenylindole (DAPI) או Hoechst משמשים לעתים רחוקות עבור כתמים איברים שלמים עקב חדירת אור מוגבלת ואות דעיכה באמצע רקמה גדולה. פרופידיום יודיד (PI) היא מולקולה קטנה המסוגלת לחדור עמוק לתוך הרקמה, אך קשה ללכוד אותה במערכת ההדמיה מרובת הפוטונים בשל חפיפה ספקטרלית. רזולוציה טובה יותר של שלבי הזקיקים יכולה להיות מושגת על ידי סמנים נוספים ספציפיים לתאי גרנולוזה כגון הורמון אנטי-מולריאן (AMH) או FOXL247,48. עם זאת, למרות שסמנים אלה מועילים בהבחנה בין זקיקי גידול גדולים יותר, הם לא יבחינו בין זקיקים ראשוניים לזקיקים ראשוניים. עד שסמנים ספציפיים לשלבים מוקדמים אלה הופכים לזמינים, סמני ביציות כגון DDX4 או GCNA מציעים את האינדיקטור הטוב ביותר להתפתחות זקיקים. יתר על כן, פרוטוקול זה עובד עבור גונדות זכרים טרום לידתיים, אך עדיין לא נבדק באשכים שלאחר הלידה, שם גודלו עשוי להיות הגורם המגביל. סוגיות קריטיות מפורטות להלן להדמיה וכימות טובים יותר של תאי נבט בשחלות בגדלים שונים ומודגשות הטכניקות והצעדים שננקטו כדי להבטיח שמירה חיסונית באיכות טובה לניתוח במורד הזרם.

הצעד הקריטי הראשון הוא למנוע נזק לשחלות לפני ואחרי הקיבעון. שחלות פגומות עלולות להיות חסרות חלקים ממבנה האיברים, מה שמשפיע על מספרי הביציות ומטה את תוצאות הניסוי. כדי למנוע נזק, רקמה סומטית נוספת נותרת מחוברת לשחלה הגדולה יותר לאחר הנתיחה כדי לתפוס עם מלקחיים להעברת השחלות. יתר על כן, עבור שחלות קטנות יותר, העברתן עם קצה פיפטה חתוך רחב מספיק כדי שהשחלות יתאימו בקלות לקצה מונעת נזק. אם נזק קל לרקמות גורם לכך שחלק מהשחלה חסר, ניתן למתן אותו על ידי שיטה חישובית שבה ניתן לבצע אקסטרפולציה של מספרי הביציות הכוללים בדגימה הפגועה באמצעות דגימות שלמות מאותו סוג (איור 6).

עם זאת, סימולציות חישוביות גילו כי דיוק החיזוי פוחת עם הגדלת גודל השטח הפגוע (100.8% ± 0.2, 97.2% ± 1.5, ו-90.3% ± 1 לנזק של 10, 20 ו-30%, בהתאמה איור 6C). בהתבסס על סימולציות, אנו ממליצים כי דגימות עם הפסד >30% לא ייכללו בניתוח. מספר שחלות שלמות מאותו סוג דגימה שימשו לחישוב המספר הממוצע של ביציות באזור הדומה לזה שחסר בדגימה הפגועה. מספר זה שימש אז כדי לחזות את המספר הכולל של הביציות בשחלה עם נזק. שימוש בשטח בגודל דומה באותה שחלה הסמוכה לאזור החסר עשוי לשמש כחלופה אך לא נבדק.

בעיה נוספת היא להימנע מזיהום תאים שעלול לגרום לפלואורסצנציה אוטומטית. עבור שחלות גיל ההתבגרות, יש לבצע פרפוזיה, כפי שתואר לעיל, הן עם 1x PBS והן עם 1% PFA כדי לחסל תאי דם שיגרמו לאוטו-פלואורסצנציה (איור 2C). זלוף עם PBS צריך להימשך עד שהאיברים, במיוחד השחלות והכליות, מנוקים מדם והופכים ללבנים לפני שהם עוברים ל-1% PFA (איור 1E,F). זלוף לא יעיל עם PBS יגרום לרקע גבוה שעלול להסוות ולהקשות על הדמיה של ביציות קטנות. זלוף עם אחוזי PFA נמוכים יותר (1%) או גבוהים יותר (4%) מביא לאיכות תמונה טובה יותר מאשר זלוף עם PBS בלבד; לפיכך, נעשה שימוש באחוז הנמוך יותר של PFA.

אופטימיזציה של צביעת נוגדנים דורשת תשומת לב למספר משתנים. עבור שלב החדירה, 4 שעות נמצאו אידיאליות לבדיקה זו, עם תקופות ארוכות יותר מ-4 שעות (6-8 שעות נבדקו) וכתוצאה מכך לא הכתימו כלל. מכיוון שהכמות והעלות של נוגדנים המשמשים לניסויים גדולים בתחום החיסונים יכולים להיות גבוהים, פרוטוקול זה נבדק והותאם לשימוש חוזר בתערובות נוגדנים ללא כל אובדן איכות של כימיקלים חיסוניים. לשימוש חוזר, יש להשלים את תערובת הנוגדנים בנוגדן טרי כמתואר בפרוטוקול. שלבי שטיפה הם גם קריטיים לאיכות ההדבקה החיסונית ויש לבצעם זמן רב יותר כדי להשיג יחס אות לרעש טוב יותר במהלך ההדמיה ויש לקבוע אותם עבור כל נוגדן המועדף. לקבלת התוצאות הטובות ביותר, אנו ממליצים להכין את פתרון הניקוי ScaleS4(0) טרי לכל שימוש, בעוד שניתן לאחסן את ScaleCUBIC-1 ו- ScaleCUBIC-2 בטמפרטורת החדר בחושך למשך כחודש-חודשיים.

ניקוי ScaleCUBIC-1 מבוצע ב 37 °C (64 °F); חשוב לציין, יש להימנע מטמפרטורות גבוהות יותר מכיוון שהן יגרמו למשקעים ריאגנטיים, אשר יכולים להשפיע על איכות החיסון. הרכבת דגימות מרובות להדמיה יכולה לגזול זמן רב. אגר או שיטות הטבעה אחרות המשמשות בפרוטוקולים אחרים הן עתירות עבודה וייתכן שיהיה צורך בפינוי מחדש נוסף של דגימות 47,49,50. אטמי סיליקון רב-פעמיים יכולים לשמש כבארות דבק שקל להשתמש בהן עם כיסויים ומוצעות בגדלים ובעומקים שונים כדי להתאים לגדלים אחרים של דגימות. כדי להשיג תמונות באיכות גבוהה, יש להשתמש בנפח מספיק של פתרון ניקוי; מעט מדי יגרום לאיכות תמונה ירודה, ופתרון רב מדי עלול לדלוף למיקרוסקופ. שלב זה צריך להיות מותאם עבור דגימות ספציפיות בהתאם לגדלים שלהם. ניתן להשתמש בכלים עם תחתית זכוכית, אך יש לשתק את הדגימות לצורך הדמיה, שכן אפילו התנועות הקלות ביותר יעוותו את התמונה. ניתן להשתמש באטמי סיליקון בשילוב עם צלחת תחתית זכוכית וכיסוי עליון כדי לשתק את הדגימות להדמיה. עם זאת, זה יגביל את היכולת להפוך את הדגימה אם יש צורך בהדמיה משני הצדדים בשל גודל השחלה.

בחירה קריטית נוספת עבור גישה זו בקנה מידה גדול ותפוקה גבוהה הייתה הדמיה בפלטפורמת Leica DIVE/4TUNE/FALCON עם שני לייזרים מולטי-פוטון (MP) הניתנים לכוונון מסוג Spectra-Physics. היתרונות של שימוש בפלטפורמת DIVE כוללים קלות הרכבה של דגימה (שתוארו לעיל), מזעור עיוות אופטי (בהשוואה לפלטפורמות קונפוקליות), והכי חשוב, מהירות הדמיה וניהול של נתוני תמונה שנרכשו. הדמיה של דגימות עם לייזרים מולטי-פוטון בהגדלה גבוהה יותר (16x) היא הרבה יותר מהירה וגורמת לפחות פוטו-דאמג' מאשר הלייזרים הקונפוקליים ב-Leica DIVE או SP8 באמצעות הגדרות דומות לרכישת תמונה עם תוכנת LAS X. קרן ה-MP נמוכה, עירור הפלואורופור שלה מותאם מאוד לנקודת המוקד ומשיג עומק רב יותר בהגדלה נמוכה מבלי לגרום לפוטודמאג' למרות מספר גבוה יותר של שלבי הדמיה מרחביים/ציריים (קונפוקלי: ~300-400 קטעים באופן מקסימלי, MP: >800 מקטעים).

מטרת 16x/NA0.6 מאפשרת תיקון לאי-התאמות קלות במקדם השבירה עקב התפלגות הדגימה וההרכבה לאורך הציר האופטי באמצעות קולר תיקון מכני, המוגדר בצורה אופטימלית לאות מקסימלי, באמצע הדרך לתוך הדגימה. יתר על כן, מבנים כדוריים, כגון ביציות, יכולים להיות מעוותים על ידי רכישת תמונה קונפוקלית, שכן לוקליזציה תלוית עומק של המישור הקונפוקלי (אות) עקב אי-התאמות של מקדם שבירה של הרכבה ודגימה בהגדרת חור סיכה נתונה יכולה להתרחש (איור 2D). כאשר האות הפלואורסצנטי נלכד דרך חור הסיכה הפנימי של המכשיר כדי להסיר אות מחוץ למיקוד, העיוות האופטי הפנימי (סטייה כדורית) עלול להחמיר עמוק יותר לתוך הדגימה, וזה בעייתי עבור שחלות גדולות יותר (כלומר, עובי של כ-400-600 מיקרומטר).

עם אותן הגדרות תואמות לתיקון עדשות, כמעט ולא ניתן לזהות סטייה כדורית במערכת DIVE MP עם אורכי גל פליטה משתנים, ובכך לפשט את מחקרי הכימות והלוקליזציה המשותפת (איור 2D). לבסוף, הלייזר בעל ההספק הגבוה מאפשר ריכוז פלואורופור נמוך ומלהיב עמוק בתוך הדגימה, בפרט, כאשר הוא משמש עם תיקון עירור בעומק Z. יתר על כן, לכידת אותות חלשים יותר משופרת גם על ידי גלאי MP היברידי (HyD-RLDs), שהוא שילוב של צינורות פוטומולטיפליירים רגילים וגלאי ספירת פוטונים של מפולות שלגים, המאפשרים גילוי אותות גבוה יותר מפי 30 על פני מגוון רחב של אורכי גל פליטה.

מיקרוסקופיית יריעות אור (LS) מולטי-פוטון היא פלטפורמה מתפתחת נוספת להדמיית רקמות תלת-ממדית47. עם זאת, LS דורש זמן התקנה גדול יותר עבור דגימות מקרוסקופיות, כולל הטבעת אגר והגדרה להדמיה. יתר על כן, תמונות שנרכשו בהגדלה גבוהה יותר עם סיבוב דגימה יכולות ליצור קבצים גדולים >100 GB, אשר עשויים להיות נחוצים כדי להסיר ממצאי הצללה של גיליון אור (עקב אי התאמות של מקדם שבירה של המדיום החיצוני ופנים המדגם, או עיוותים של משטח הדגימה). השיטה המוצגת של הרכבת דגימות בתמיסה בבארות דבק היא פשוטה ומהירה.

יתר על כן, גישה זו מאפשרת הדמיה של שחלות מרובות בבאר אחת עם הגדרה אחת וללא היפוך או סיבוב. עם זאת, ייתכן שיהיה צורך בהיפוך הכיסוי "כריך" עבור שחלות גדולות יותר. הדמיית מערכת ה-DIVE מהירה יותר מקונפוקל ו-LS; בהגדלה של פי 16, השחלה הפרה-פוברטלית מצולמת ב-3-5 דקות (Z-שלב 2 מיקרומטר) והשחלה המתבגרת ב-1 שעות (Z-step 5 μm). יתר על כן, קבצים שנוצרו ב- LAS X הם בגודל הניתן לניהול (2-20 GB), וזה גם קריטי עבור מספר רב של דגימות לניתוח במורד הזרם. למרות שפרוטוקול זה של חיסון הותאם לשימוש בשילוב עם פלטפורמת DIVE, ניתן לצלם דגימות מוכתמות חיסון באמצעות פלטפורמות MP/LS אחרות עם כמה שינויים.

היתרון של כל צביעת השחלה בפרוטוקול מידול תלת-ממדי הוא ניתוח הנתונים היעיל והקל יחסית בהשוואה לרכישת נתונים ידנית בניתוח דו-ממדי. תוכנת ההדמיה והניתוח התלת-ממדית של IMARIS נבחרה מכיוון שהיא זמינה מסחרית ומוצעת על ידי ליבות מיקרוסקופיה רבות, אינה דורשת כישורי תכנות ותואמת לפלטפורמות רבות של תוכנות לרכישת תמונות כגון LAS X מבית Leica או ZEN מ-ZEISS. עם IMARIS, הפרמטרים הסטנדרטיים מוגדרים כפי שמודגש בסעיף הפרוטוקול, ופרמטרים אלה יכולים לשמש לתמונות ודוגמאות אחרות עם שינויים קלים, ובכך לשפר את יכולת השחזור והיעילות.

ניתוח תמונה וכימות מותאמים לתוכנת IMARIS; עם זאת, ניתוחים דומים יכולים להיעשות בתוכנות אחרות להדמיית נתונים מסחריים או בקוד פתוח בהתאם לעקרונות דומים. לסיכום, הוצג כאן פרוטוקול אופטימלי להדמיית שחלות שלמות לניתוחים כמותיים ואיכותיים. זה הותאם בכוונה לדרישות של עיבוד התפוקה הגבוהה שיידרש יותר ויותר לבדיקות טוקסיקולוגיה, למטרות קליניות ואבחון, ולניתוחים כלל-גנומיים של רגולטורים של יעילות ותפקוד שחלתיים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

למחברים אין ניגודי עניינים לחשוף.

Acknowledgments

עבודה זו נתמכה על ידי מענקי המכונים הלאומיים לבריאות (R01 HD093778 ל- E.B-F ו- T32 HD007065 ל- R.B). אנו מודים לזאכרי בוצ'ר על עזרתו בניסוי הקרינה. אנו מודים למרי אן הנדל על הקריאה הביקורתית בכתב היד. אנו מודים תודה על תרומתם של סוניה ארטופוזה ושירות הליבה של המיקרוסקופיה במעבדת ג'קסון על סיוע מומחה בעבודת המיקרוסקופיה המתוארת בפרסום זה וג'ארק טרפסו משירותי המכשירים המדעיים במעבדת ג'קסון לתכנון שקופית המתאם המודפסת בתלת-ממד.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Benchtop Incubator Benchmark Scientific H2200-H 37 °C incubator
Bovine Serum Albumin (BSA) VWR 97061-416
C57BL/6J The Jackson Laboratory 000664 mouse inbred strain
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Sigma-Aldrich D1435 Hazardous material
D-Sorbitol Sigma-Aldrich S6021
Dumont #5 Forceps FST 91150-20
FastWells Reagent Barriers GraceBio 664113 Sticky and flexible silicone gasket (adhesive well)
Fine Scissors FST 91460-11
Glycerol Sigma-Aldrich G2025
Glycine ThermoFisher Scientific BP381-500
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 647 Invitrogen A-21246 Dilution 1:1000
Goat anti-Rat IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 555 Invitrogen A-21434 Dilution 1:1000
Goat serum Sigma-Aldrich G9023
IMARIS Software Oxford Instruments Version 9.7.0 Image visualization and analysis software
Insight X3 Spectra-Physics InSight X3 Tunable Ultrafast Laser Laser for Multiphoton Imaging
LASX software Leica Version 3.5.6 Image acquisition software
Leica DIVE/4TUNE/FALCON Leica Leica Dmi8, 2P-M-ready: # 158005406 Multiphoton Microscope
MaiTai HP Spectra-Physics Mai Tai DeepSee One Box Ultrafast Laser Laser for Multiphoton Imaging
Masterflex Pump Controller SPW Industrial Model: 7553-50 Peristaltic pump for perfusion
Mayo Scissors FST 14010-17 5” –7” blunt/blunt scissors for decapitation
Micro Cover Glasses, Square, No. 1.5 25x25mm VWR 48366-249
Mini BioMixer Benchmark Scientific B3D1020 shaker/nutator for 37 °C incubator
Nikon Ergonomic SMZ1270 Leica  SMZ1270 stereomicroscope
Paraformaldehyde 16% (formaldehyde aqueous solution) Electron Microscopy Sciences 15710 Hazardous material
PBS Tablets, Phosphate-buffered Saline ThermoFisher Scientific BP2944100 Dissolve in Milli-Q water
Penicillin-Streptomycin, 200x, Dual Antibiotic Solution ThermoFisher Scientific ICN1670249
Polyvinyl alcohol (PVA) Sigma-Aldrich P8136
Quadrol (N,N,N′,N′-Tetrakis(2-Hydroxypropylethylenediamine) Sigma-Aldrich 122262
Rabbit anti-DDX4/MVH Abcam ab27591 Dilution 1:500
Rabbit anti-LINE-1 ORF1p Abcam ab216324 Dilution 1:500
Rat anti-TRA98/GCNA Abcam ab82527 Dilution 1:500
Sodium azide Sigma-Aldrich S2002 Hazardous material
Sodium borohydride Sigma-Aldrich 452882 Hazardous material
Sucrose ThermoFisher Scientific S0389
Tekmar Orbital Shaker Bimedis VXR-S10 shaker for room temperature
Triethanolamine Sigma-Aldrich 90279
Triton X-100 Sigma-Aldrich X100
UNOLOK Infusion Set MYCO Medical 7001-23 needles for perfusion
Urea Amresco 97061-920
X-Cite 120LED Excelitas S/N XT640-W-0147 low-power LED fluorescence lamp

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Pelosi, E., Forabosco, A., Schlessinger, D. Genetics of the ovarian reserve. Frontiers in Genetics. 6, 308 (2015).
  2. Pepling, M. E. From primordial germ cell to primordial follicle: mammalian female germ cell development. Genesis. 44 (12), 622-632 (2006).
  3. Wilkosz, P., Greggains, G. D., Tanbo, T. G., Fedorcsak, P. Female reproductive decline is determined by remaining ovarian reserve and age. PLoS One. 9 (10), 108343 (2014).
  4. Richardson, M. C., Guo, M., Fauser, B. C. J. M., Macklon, N. S. Environmental and developmental origins of ovarian reserve. Human Reproduction Update. 20 (3), 353-369 (2014).
  5. Spears, N., et al. Ovarian damage from chemotherapy and current approaches to its protection. Human Reproduction Update. 25 (6), 673-693 (2019).
  6. Morgan, S., Anderson, R. A., Gourley, C., Wallace, W. H., Spears, N. How do chemotherapeutic agents damage the ovary. Human Reproduction Update. 18 (5), 525-535 (2012).
  7. Wesevich, V., Kellen, A. N., Pal, L. Recent advances in understanding primary ovarian insufficiency. F1000Research. 9, (2020).
  8. Biswas, L., et al. Meiosis interrupted: the genetics of female infertility via meiotic failure. Reproduction. 161 (2), 13-35 (2021).
  9. Tam, P. P., Snow, M. H. Proliferation and migration of primordial germ cells during compensatory growth in mouse embryos. Journal of Embryology and Experimental Morphology. 64, 133-147 (1981).
  10. Pepling, M. E., Spradling, A. C. Female mouse germ cells form synchronously dividing cysts. Development. 125 (17), 3323-3328 (1998).
  11. Pepling, M. E., Spradling, A. C. Mouse ovarian germ cell cysts undergo programmed breakdown to form primordial follicles. Developmental Biology. 234 (2), 339-351 (2001).
  12. Adams, I. R., McLaren, A. Sexually dimorphic development of mouse primordial germ cells: switching from oogenesis to spermatogenesis. Development. 129 (5), 1155-1164 (2002).
  13. McLaren, A., Southee, D. Entry of mouse embryonic germ cells into meiosis. Developmental Biology. 187 (1), 107-113 (1997).
  14. Findlay, J. K., Hutt, K. J., Hickey, M., Anderson, R. A. How is the number of primordial follicles in the ovarian reserve established. Biology of Reproduction. 93 (5), 111 (2015).
  15. Tilly, J. L. Commuting the death sentence: how oocytes strive to survive. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 2 (11), 838-848 (2001).
  16. Baker, T. G. A quantitative and cytological study of germ cells in human ovaries. Proceedings of the Royal Society of London. Series B, Biological Sciences. 158, 417-433 (1963).
  17. Baker, T. G. A quantitative and cytological study of oogenesis in the rhesus monkey. Journal of Anatomy. 100, Pt 4 761-776 (1966).
  18. Kurilo, L. F. Oogenesis in antenatal development in man. Human Genetics. 57 (1), 86-92 (1981).
  19. Matova, N., Cooley, L. Comparative aspects of animal oogenesis. Developmental Biology. 231 (2), 291-320 (2001).
  20. Malki, S., vander Heijden, G. W., O'Donnell, K. A., Martin, S. L., Bortvin, A. A role for retrotransposon LINE-1 in fetal oocyte attrition in mice. Developmental Cell. 29 (5), 521-533 (2014).
  21. Tharp, M. E., Malki, S., Bortvin, A. Maximizing the ovarian reserve in mice by evading LINE-1 genotoxicity. Nature Communications. 11 (1), 330 (2020).
  22. Rinaldi, V. D., Bolcun-Filas, E., Kogo, H., Kurahashi, H., Schimenti, J. C. The DNA damage checkpoint eliminates mouse oocytes with chromosome synapsis failure. Molecular Cell. 67 (6), 1026-1036 (2017).
  23. Bolcun-Filas, E., Rinaldi, V. D., White, M. E., Schimenti, J. C. Reversal of female infertility by Chk2 ablation reveals the oocyte DNA damage checkpoint pathway. Science. 343 (6170), 533-536 (2014).
  24. Pepling, M. E. Follicular assembly: mechanisms of action. Reproduction. 143 (2), 139-149 (2012).
  25. Tingen, C., Kim, A., Woodruff, T. K. The primordial pool of follicles and nest breakdown in mammalian ovaries. Molecular Human Reproduction. 15 (12), 795-803 (2009).
  26. Wallace, W. H. B., Kelsey, T. W. Human ovarian reserve from conception to the menopause. PLoS One. 5 (1), 8772 (2010).
  27. Pepling, M. E., et al. Differences in oocyte development and estradiol sensitivity among mouse strains. Reproduction. 139 (2), 349-357 (2010).
  28. Nelson, S. M., Anderson, R. A. Prediction of premature ovarian insufficiency: foolish fallacy or feasible foresight. Climacteric. , 1-10 (2021).
  29. Wood, M. A., Rajkovic, A. Genomic markers of ovarian reserve. Seminars in Reproductive Medicine. 31 (6), 399-415 (2013).
  30. Tilly, J. L. Ovarian follicle counts--not as simple as 1, 2, 3. Reproductive Biology and Endocrinology. 1, 11 (2003).
  31. Winship, A. L., Sarma, U. C., Alesi, L. R., Hutt, K. J. Accurate follicle enumeration in adult mouse ovaries. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (164), e61782 (2020).
  32. Fiorentino, G., Parrilli, A., Garagna, S., Zuccotti, M. Three-dimensional imaging and reconstruction of the whole ovary and testis: a new frontier for the reproductive scientist. Molecular Human Reproduction. 27 (3), 007 (2021).
  33. Sarma, U. C., Winship, A. L., Hutt, K. J. Comparison of methods for quantifying primordial follicles in the mouse ovary. Journal of Ovarian Research. 13 (1), 121 (2020).
  34. Skodras, A., Marcelli, G. Computer-generated ovaries to assist follicle counting experiments. PLoS One. 10 (3), 0120242 (2015).
  35. Sonigo, C., et al. High-throughput ovarian follicle counting by an innovative deep learning approach. Scientific Reports. 8 (1), 13499 (2018).
  36. Myers, M., Britt, K. L., Wreford, N. G. M., Ebling, F. J. P., Kerr, J. B. Methods for quantifying follicular numbers within the mouse ovary. Reproduction. 127 (5), 569-580 (2004).
  37. Kagami, K., Shinmyo, Y., Ono, M., Kawasaki, H., Fujiwara, H. Three-dimensional evaluation of murine ovarian follicles using a modified CUBIC tissue clearing method. Reproductive Biology and Endocrinology. 16 (1), 72 (2018).
  38. Rinaldi, V. D., Hsieh, K., Munroe, R., Bolcun-Filas, E., Schimenti, J. C. Pharmacological inhibition of the DNA damage checkpoint prevents radiation-induced oocyte death. Genetics. 206 (4), 1823-1828 (2017).
  39. Malki, S., Tharp, M. E., Bortvin, A. A whole-mount approach for accurate quantitative and spatial assessment of fetal oocyte dynamics in mice. Biology of Reproduction. 93 (5), 113 (2015).
  40. Susaki, E. A., et al. Whole-brain imaging with single-cell resolution using chemical cocktails and computational analysis. Cell. 157 (3), 726-739 (2014).
  41. Hama, H., et al. ScaleS: an optical clearing palette for biological imaging. Nature Neuroscience. 18 (10), 1518-1529 (2015).
  42. Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (65), e3564 (2012).
  43. Microscope slide (25x75) with inset for coverslips (22x22). NIH 3D Print Exchange. Capel Lab at Duke University Medical Center. , Available from: https://3dprint.nih.gov/discover/3DPX-009765 (2018).
  44. Niu, W., Spradling, A. C. Two distinct pathways of pregranulosa cell differentiation support follicle formation in the mouse ovary. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (33), 20015-20026 (2020).
  45. Livera, G., Petre-Lazar, B., Guerquin, M. -J., Trautmann, E., Coffigny, H., Habert, R. p63 null mutation protects mouse oocytes from radio-induced apoptosis. Reproduction. 135 (1), 3-12 (2008).
  46. Carroll, J., Marangos, P. The DNA damage response in mammalian oocytes. Frontiers in genetics. 4, 117 (2013).
  47. McKey, J., Cameron, L. A., Lewis, D., Batchvarov, I. S., Capel, B. Combined iDISCO and CUBIC tissue clearing and lightsheet microscopy for in toto analysis of the adult mouse ovary. Biology of Reproduction. 102 (5), 1080-1089 (2020).
  48. McKey, J., Anbarci, D. N., Bunce, C., Capel, B. Integration of mouse ovary morphogenesis with developmental dynamics of the oviduct, ovarian ligaments, and rete ovarii. bioRxiv. , (2021).
  49. Udan, R. S., Piazza, V. G., Hsu, C. -W., Hadjantonakis, A. -K., Dickinson, M. E. Quantitative imaging of cell dynamics in mouse embryos using light-sheet microscopy. Development. 141 (22), 4406-4414 (2014).
  50. Di Giovanna, A. P., et al. Tailored sample mounting for light-sheet fluorescence Microscopy of clarified specimens by polydimethylsiloxane casting. Frontiers in Neuroanatomy. 13, 35 (2019).

Tags

ביולוגיה התפתחותית גיליון 175
אימונופלואורסצנציה של השחלה כולה, ניקוי ומיקרוסקופיה מרובת פוטון לניתוח תלת-ממדי כמותי של עתודת השחלות המתפתחות בעכבר
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Boateng, R., Boechat, N., Henrich,… More

Boateng, R., Boechat, N., Henrich, P. P., Bolcun-Filas, E. Whole Ovary Immunofluorescence, Clearing, and Multiphoton Microscopy for Quantitative 3D Analysis of the Developing Ovarian Reserve in Mouse. J. Vis. Exp. (175), e62972, doi:10.3791/62972 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter