Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

Hel eggstokkimofluorescens, rydding og multifotonmikroskopi for kvantitativ 3D-analyse av det utviklende ovariereservatet i musen

Published: September 3, 2021 doi: 10.3791/62972
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1The Jackson Laboratory

Summary

Her presenterer vi en optimalisert protokoll for avbildning av hele eggstokkene for kvantitative og kvalitative analyser ved hjelp av helmontert immunstaining, multifotonmikroskopi og 3D-visualisering og analyse. Denne protokollen har plass til høy gjennomstrømning, pålitelig og repeterbar behandling som gjelder for toksikologi, klinisk diagnostikk og genomiske analyser av eggstokkfunksjonen.

Abstract

Kvinnelig fruktbarhet og reproduktiv levetid avhenger av kvaliteten og mengden av ovarie oocyttreservatet. Anslagsvis 80% av kvinnelige bakterieceller som kommer inn i meiotisk profase, blir jeg eliminert under Fetal Oocyte Attrition (FOA) og den første uken av barsellivet. Tre store mekanismer regulerer antall oocytter som overlever under utvikling og etablerer eggstokkreservatet hos kvinner som kommer inn i puberteten. I den første bølgen av oocytttap elimineres 30-50% av oocyttene under tidlig FOA, et fenomen som tilskrives høyt Langt ispedd kjernefysisk element-1 (LINE-1) uttrykk. Den andre bølgen av oocytttap er eliminering av oocytter med meiotiske feil ved et meiotisk kvalitetskontrollpunkt. Den tredje bølgen av oocytttap oppstår perinatalt under primordial follikkeldannelse når noen oocytter ikke klarer å danne follikler. Det er fortsatt uklart hva som regulerer hver av disse tre bølgene av oocytttap og hvordan de former eggstokkreservatet hos enten mus eller mennesker.

Immunfluorescens og 3D-visualisering har åpnet en ny vei for å avbilde og analysere oocyttutvikling i sammenheng med hele eggstokken i stedet for i mindre informative 2D-seksjoner. Denne artikkelen gir en omfattende protokoll for hel eggstokkimmunisering og optisk rydding, noe som gir preparater for avbildning ved hjelp av multifotonmikroskopi og 3D-modellering ved hjelp av kommersielt tilgjengelig programvare. Den viser hvordan denne metoden kan brukes til å vise dynamikken i oocytt utmattelse under ovarial utvikling i C57BL / 6J mus og kvantifisere oocytt tap under de tre bølgene av oocytt eliminering. Denne protokollen kan brukes på prenatal og tidlig postnatal eggstokkene for oocytt visualisering og kvantifisering, samt andre kvantitative tilnærminger. Viktigst, protokollen ble strategisk utviklet for å imøtekomme høy gjennomstrømning, pålitelig og repeterbar behandling som kan møte behovene i toksikologi, klinisk diagnostikk og genomiske analyser av ovarialfunksjon.

Introduction

De fleste pattedyrhunner er født med et begrenset antall meiotisk arresterte oocytter lagret i primordiale follikler, som utgjør eggstokkreservatet (OR) 1,2. OR bestemmer den generelle kvinnelige reproduktive levetiden og helsen3. OR avtar normalt i størrelse med aldring og kan for tidlig utarmes ved eksponering for visse gentoksiske midler (stråling / kjemoterapi) og miljøspenninger (underernæring), noe som fører til ufruktbarhet 4,5,6. Idiopatisk kvinnelig infertilitet kan ofte tilskrives den genetiske og fysiologiske kvaliteten på egg som utvikler seg fra OR og forblir dårlig forstått 7,8. Fordi kvinnelig follikkelbegavelse i stor grad er forhåndsbestemt ved fødselen, er det viktig å forstå reguleringsmekanismene som er involvert i OR-etableringen og vedlikeholdet.

Hos mus starter OR-formasjonen med spesifikasjonen av primordiale bakterieceller (PGCer) rundt embryonal dag (E) 7,52. PGC-ene migrerer til kjønnsryggene, hvor de vil ligge ved ca. E10,59. Følgende omfattende spredning skjer med ufullstendig cytokinesis som resulterer i dannelse av cyster som vil bli brutt ned senere i utviklingen10,11. På ca E12.5 bestemmes gonadalsex, og PGC-spredning stopper i eggstokkene. Hos kvinner går PGCer, nå oocytter, inn i meiotisk profase I (MPI) på omtrent E13,512,13. Oocytter utvikler seg gjennom utvidet MPI og arrestasjon på dictyate scenen rundt fødselstidspunktet. I løpet av den første uken etter fødselen er hver arresterte oocytt omgitt av granulosa-celler, og danner dermed en primordial follikkel.

Antallet primordiale follikler i OR av en kvinne avhenger av hvor mange oocytter som overlevde bølgene av oocytt eliminering som oppstår før og under MPI-arrestasjon gjennom apoptose, autofagi eller nekrose14,15. Den første bølgen oppstår under fosterutvikling og er kjent som FOA. FOA er en evolusjonært bevart prosess hos kvinner (pattedyr og ikke-pattedyr), hvorved anslagsvis 50-80% av oocyttene elimineres avhengig av den kvinnelige arten 16,17,18,19. Hos mus oppstår FOA under E15,5 til E18,5 og har blitt tilskrevet reaktivering og uttrykk for retrotransposon LINE-1-sekvenser som forårsaker oocyttdød20,21. Den andre bølgen av oocytt eliminering skjer gjennom et meiotisk sjekkpunkt som eliminerer oocytter med meiotiske defekter som upred DNA double-strand breaks (DSBs)22,23. Den neste bølgen av oocytt eliminering skjer under cyste sammenbrudd, som kulminerer under dannelsen av primordiale follikler, som hver inneholder en enkelt oocytt 10,11,24,25.

Hos mus er det opprinnelige follikkelreservatet i stor grad etablert av puberteten, hvorpå det avtar når primordiale follikler aktiveres for vekst under vanlige reproduktive sykluser. OR-størrelsen varierer mellom individuelle kvinner og blant forskjellige genetiske stammer av mus; Likevel er den genetiske reguleringen av OR-størrelse ikke godt forstått 26,27,28,29. Genetiske studier av OR-regulering hindres av mangelen på standardiserte protokoller for å studere bølgene av oocytt eliminering under prenatal og postnatal utvikling. Flere oocytt kvantifiseringsmetoder er utviklet hos mus, med den vanligste og mest brukte er histomorfometrisk evaluering av histomorfometriske seksjoner30,31. I denne teknikken identifiseres oocytter på serielle seksjoner med histologiske flekker, som hematoksylin og eosin (H&E) og periodiske acid-Schiff (PAS) eller fluorescerende markører. Denne teknikken er pålitelig hvis alle forhold forblir konstante, inkludert seksjonstykkelse, effektiv gjenoppretting av alle seksjoner gjennom eggstokken, og telleordningene til individuelle laboratorier. Tall rapportert av forskjellige laboratorier varierer imidlertid ofte betydelig og er derfor ikke lett sammenlignbare.

Videre, gitt genetiske forskjeller, kan bruk av forskjellige musestammer også påvirke oocytttall. Ytterligere beregningsmetoder er utviklet for histomorfometrisk evaluering og inkluderer automatisert deteksjon av oocytter ved hjelp av fraksjonatortilnærming, automatisk telling ved hjelp av beregningsalgoritmer og 3D-rekonstruksjon av histologiske bilder for å forhindre flere tellinger av samme oocytt 31,32,33,34,35,36 . Selv med disse forbedringene lagt til histomorfometrisk evaluering, er teknikken relativt arbeidskrevende, spesielt for store og høygjennomstrømningsstudier. Dataene som samles inn, kan ikke reproduseres og sammenlignes mellom studier på grunn av forskjeller i telleordninger, dataalgoritmer og programvare som brukes.

Nylig, akselerert av utviklingen av nye medium-resolution multiphoton og lys ark mikroskopi og optisk vev clearing metoder, 3D modellering og analyse teknikker for intakt eggstokkene blir metoden for valg for effektivt å kvantifisere oocytt tall og studere protein lokalisering og dynamikk37,38. Disse 3D-metodene er vanligvis fordelaktige sammenlignet med histologiske metoder, da vev og organer er bedre bevart og holdt intakte. Videre gir 3D-analyse og modellering ytterligere innsikt i funksjon og interaksjoner i og mellom cellenisjer eller understrukturer i orgelet som kan gå glipp av i 2D-analyse.

3D-analyse av hele organer krever optimalisering av fiksering, immunstaining og optiske clearingprotokoller for individuelle organer, for eksempel eggstokkene, uten vevsforvrengning eller skade. Ytterligere optimalisering av prøvemontering for avbildning er nødvendig for mikroskopi med høy oppløsning og kan avhenge av hvilken bildeplattform som er tilgjengelig. Til slutt genererer avbildning av hele den intakte eggstokken en stor mengde data for etterfølgende beregningsanalyser. Derfor er det behov for å utvikle standardiserte 3D-metoder for å telle oocytter for komparative studier og på tvers av utviklingsstadier.

Denne protokollen bruker standard immunoppnåelse og tidligere rapporterte clearingprotokoller, med fokus på en enkel, brukervennlig og høy gjennomstrømningstilnærming 38,39,40,41. Protokollen er optimalisert for å analysere et stort antall prenatal og postnatal eggstokkene opp til postnatal dag 28 (P28) og varierende størrelser av eggstokkene fra forskjellige musen genetiske bakgrunner. Immunstainingstrinnene er like for alle stadier; Imidlertid varierer clearingprotokollene for pubertal eggstokkene på grunn av deres større størrelse, ScaleS4 (0) og CUBIC for små og store eggstokkene, henholdsvis40,41. Videre utføres perfusjon av hele kroppen hos P28-mus før fiksering for å forhindre autofluorescens fra blodceller. Et multifotonmikroskop ble bygget på Leica DIVE/4Tune-plattformen som et alternativ til lysarkmikroskopi for å skaffe bilder, og IMARIS 3D Visualization and Analysis-programvare med ulike analytiske verktøy ble valgt for denne protokollen. Denne protokollen er enkel å følge og mindre praktisk, og dermed tidsbesparende. Videre er oocytt kvantifisering relativt rask, avhengig av størrelsen på eggstokken og arrangementet av oocytter.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle musene som ble brukt var av den genetiske stammen C57BL/6J (se materialtabellen). Denne stammen har blitt fullstendig sekvensert og er standard for mange studier på eggstokkstruktur og funksjon. Mus ble plassert i henhold til NIH-retningslinjer, og prosedyrer utført ble godkjent av Institutional Animal Care and Use Committee of The Jackson Laboratory. Reagenser og komposisjoner som brukes i denne protokollen er oppført i henholdsvis Tabell over materialer og Tabell 1.

1. Utarbeidelse av reagenser

  1. Fixative: Forbered 4% paraformaldehyd (PFA) i 1x PBS. For eksempel, for 24 prøver (0,5 ml / prøve = 12 ml totalt volum), tilsett 3 ml 16% PFA elektronmikroskopi-klasse til 9 ml 1x PBS.
  2. Buffer for permeabilisering
    1. Mål polyvinylalkohol (PVA) i et 250 ml plastbeger som inneholder 1x PBS dagen før permeabiliseringsbufferen er nødvendig. Rør oppløsningen over natten slik at PVA kan oppløses helt.
    2. Tilsett natriumborohydrid til oppløst PVA og la blandingen homogenisere i ca. 3-5 min. Forvent at løsningen skummer.
    3. Legg Triton X-100 til løsningen, og bruk bufferen når Triton X-100 er oppløst.
      MERK: PVA tar lang tid å oppløse (minst 3 timer), og penetrasjonen av antistoffet avhenger av hvor godt det oppløses. For større eggstokkene er det avgjørende å oppløse PVA helt.
  3. Blokkering av buffer
    1. Mål bovint serumalbumin (BSA) til et beger med 1x PBS. Rør oppløsningen til BSA er oppløst.
    2. Tilsett glycin, Triton X-100, Penicillin-streptomycin og natriumazid. Rør til løsningen homogeniserer. Overfør bufferen til en flaske og oppbevar den ved 4 °C. Tilsett normalt geitserum før bruk.
  4. Vaskebuffer: Mål PVA i et beger som inneholder 1x PBS. Rør oppløsningen over natten slik at PVA kan oppløses. Tilsett Triton X-100 og natriumazid. Når bufferen er blandet, oppbevar den ved 4 °C.
  5. ScaleS4(0)-oppløsning (pH 8.1): Løs opp D-sorbitol i PBS i et beger med omrøring ved ≤100 °C. Tilsett urea til løsningen, og når ureaen oppløses, slå av varmen og la løsningen røre til den er helt oppløst. Tilsett glyserol og dimetylsulfoksid, og rør til løsningen homogeniserer. Oppbevar oppløsningen ved romtemperatur i mørket.
    MERK: ScaleS4(0)-oppløsningen må gjøres frisk på den første dagen av rydding av eggstokkene.
  6. ScaleCUBIC-1-løsning
    1. Løs opp urea i et beger som inneholder PBS med omrøring ved temperatur ≤100 °C. Mål N,N,N′,N′-tetrakis(2-hydroksypropyl)etylendiamin i et separat beger, tilsett deretter oppløst urea, og rør ved en temperatur på ≤ 100 °C til reagensene er helt oppløst. Når alle reagensene er i løsning, slå av varmen og avkjøl ved romtemperatur. Oppbevar i mørket.
    2. Degas løsningen ved å overføre den til en filtreringsflaske. Fest kolben til et vakuum med slanger, dekk kolben og slå på vakuumet til bobler i løsningen forsvinner. Bruk oppløsningen etter denne avgassingen.
      MERK: Oppløsningen kan lagres i mørket for bruk i opptil en måned.
  7. Sukroseoppløsning: Løs opp sukrose i 1x PBS; deretter avfette oppløsningen før bruk.
    MERK: Forbered oppløsningen på nytt før bruk.
  8. ScaleCUBIC-2-løsning
    1. Løs opp sukrose i et beger som inneholder PBS med omrøring ved en temperatur ≤100 °C. Tilsett urea og rør ved en temperatur på ≤100 °C til ureaen oppløses. Slå av varmen.
    2. Tilsett trietanolamin og Triton X-100. Rør til løsningen homogeniserer. La løsningen avkjøles til romtemperatur og lagre i mørket. Degas løsningen før bruk.
      MERK: Oppløsningen kan lagres i mørket for bruk i opptil en måned.

2. Avhandling og fiksering av prenatale eggstokkene (figur 1A)

  1. Mate voksne kvinner (≥8 uker) og menn i henhold til godkjent institusjonell protokoll. Se etter vaginale plugger hver morgen.
    MERK: Morgenen på en vaginal plugg er angitt som 0,5 dager etter coitum (d.p.c) eller E0,5.
  2. På dagen for disseksjon, forberede 4% paraformaldehyd (PFA) og aliquot ~ 0,5 ml i mikrocentrifuge rør, plassert på benken side (~ 4 per gravid kvinne).
    MERK: PFA er et farlig stoff og må håndteres under en kjemisk hette.
  3. Forbered tre 100 mm plater som inneholder ~ 10 ml 1x fosfatbufret saltvann (PBS) for hver gravid kvinne (for høsting av livmor, for dissekering av mesonephros-eggstokkkompleks og isolere eggstokkene).
  4. Euthanize gravide kvinner som bærer embryoer i det foretrukne utviklingsstadiet og fortsetter å disseksjon. Euthanize ikke mer enn 1-2 kvinner om gangen. Bruk en godkjent protokoll for eutanasi av gravide mus (f.eks. CO2-eksponering etterfulgt av cervical dislokasjon).
  5. Når en kvinne er euthanized, spray magen med 70% etanol. Bruk tang, løft bukhuden og bruk saks for å lage et V-form snitt gjennom magen og kroppsveggen. Klipp langs de to sidene av snittet og skrell huden tilbake for å eksponere indre organer og fostre i livmoren.
  6. Med tang og saks, kutt og skill livmoren med fostrene fra magefett og eggstokkarterier og årer. Fjern livmoren og legg den i en 100 mm plate som inneholder 1x PBS. Slipp fostrene i PBS ved å kutte livmorveggen og punktere eggeplommesekken. Kutt navlestrengen.
    MERK: For fostre yngre enn 15 dager i svangerskapet, sikrer eutanasi av moren og fjerning fra livmoren rask død av fosteret. Fostre eldre enn 15 dager i svangerskapet til fødselen må avlives ved halshugging.
  7. Overfør et foster til en ny plate med frisk 1x PBS. For å halshugge et E15.5-foster, fest forsiktig de to bakbenene fra hverandre på tallerkenen med tang for å immobilisere fosteret. Bruk et annet par tang holdt i den dominerende hånden, hold nakken mellom tangpinnene og klem for å kutte av fosterets hode, eller bruk saks til å kutte nakken.
  8. Med de dominerende hånd tangene, kutt under forbenene og trekk forsiktig overkroppen bort. Deretter setter du inn et endepunkt på de dominerende hånd tangene i bukhulen vertikalt inn i åpningen av bukområdet mens det andre endepunktet på tangene forblir utenfor. Lukk tangene, klem kroppsveggen for å kutte den og eksponere de indre organene.
  9. Med de samme tangene, fjern forsiktig organene, inkludert tarmene og leveren, til nyrene og reproduktive organer blir synlige. Bestem fosterets kjønn: På E15,5 har eggstokkene en langstrakt pølselignende form mens testiklene er ovale.
    MERK: På tidligere stadier kan genotyping være nødvendig for å bestemme kjønn.
  10. Bruk ett par tang, hold det kvinnelige fosteret ned og bruk de andre tangene til å gripe hvert mesonephros-eggstokkkompleks og forsiktig skille det fra nyrene og Müllerian-kanalene. Plasser eggstokkene i en ny plate med 1x PBS, la mesonephros festet, men fjern det omkringliggende vevet for å sikre at eggstokkene blir utsatt. Plasser begge eggstokkene i ~ 0,5 ml 4% PFA i mikrosenterrør og fest ved 4 °C over natten. Neste dag erstatter du PFA med 70% etanol.
  11. For avhandling og fiksering av E18.5 eggstokkene, separer fostrene fra livmoren som beskrevet ovenfor, og følg deretter protokollen for prepubertale valper beskrevet i avsnitt 3 (figur 1B).

3. Avhandling og fiksering av prepubertale eggstokkene (figur 1B)

  1. Forbered 4% PFA og aliquot ~ 0,5 ml i 1,5 ml rør og legg dem på benksiden (~ ett rør per valp). Forbered 35 mm plater med 1x PBS (~en per valp). Avlivet valpene ved hjelp av den godkjente institusjonelle protokollen.
    MERK: Halshugging er den foretrukne metoden for eutanasi for mus 8 dager eller yngre. Neonatal mus kan halshugges ved hjelp av enten 3-4 " dissekering saks eller 5-7 " Mayo saks.
  2. Bestem kjønn av valper ved å måle den anogenitale avstanden, som er større hos menn enn hos kvinner. Bruk skarp halshugging saks for å halshugge kvinnelige valper. Plasser kroppen, den åpne siden ned, på et papirhåndkle for å tømme blodet (~ 5-10 s).
  3. Fest valpen på ryggen ved å plassere en pinne i poteputen på hver fot. Spray magen med 70% etanol. Bruk tang til å holde valpens hud vekk fra kroppen og bruk saks for å lage et lite V-formet snitt i underlivets hud.
  4. Sett saksen inn i snittet under huden og kutt langs begge sider av magen. Bruk tangene til å forsiktig skrelle tilbake huden og avsløre underlivet. Beveg tarmen forsiktig opp og finn livmorhornene ved siden av blæren. Følg hvert livmorhorn mot nyrene og finn eggstokken med omkringliggende fettvev under hver nyre.
  5. For å dissekere eggstokkene, hold livmorhornet under eggstokken og ovidukten med ett par tang (tang A, figur 1B) og løft det forsiktig bort fra kroppen. Bruk et annet par tang (tang B), grip forsiktig under det første par tang slik at eggstokken og ovidukten i fettputen er synlige over det andre paret tang. Klipp deretter under det andre par tang med saks eller trekk forsiktig for å løsne eggstokkene og festet vev.
  6. Plasser de isolerte organene i en plate med 1x PBS. Trim bort det ekstra fettvevet, ovidukten og livmorhornet for å rengjøre og isolere eggstokken. Delikat åpne bursa rundt eggstokken og eksponere hele eggstokken.
  7. Trim bursamembranen uten å skade eggstokken og la vevet ligge rundt hilumen (ligamentlignende struktur mellom eggstokken og reproduksjonskanalen) for å håndtere eggstokken, som vist i figur 1B, P5. Når eggstokkene er trimmet, plasser dem i 4% PFA og fikse eggstokkene ved 4 °C over natten. Neste dag erstatter du 4% PFA med 70% etanol og lagrer eggstokkene ved 4 °C til immunstainingsprotokollen går.

4. Perfusjon, disseksjon og fiksering av pubertal eggstokkene (figur 1C)

  1. Perfuse mus i henhold til institusjonelt godkjente protokoller med musen under dyp anestesi i en kjemisk avtrekkshette. Forbered perfusjonsutstyret og reagensene. Se den detaljerte protokollen på 42.
    MERK: Perfusjon er en terminal eutanasiprosedyre som erstatter blodet gjennom hele det vaskulære systemet med et vevsfiksativ.
  2. Vei en pubertal kvinnelig mus (P28) og registrer musens vekt (vanligvis mellom 13 g og 15 g). Beregn mengden av det godkjente anestesimiddelet som skal brukes.
    MERK: Her ble 0,35 ml tribromoetanol per 10 g kroppsvekt brukt i denne protokollen.
  3. Bruk en 10 ml engangssprøyte med en 20 G kanyle til å fylle sprøyten med det godkjente bedøvelsesmiddelet. Sett på plass 20 G kanylen med en kanyle på 26 G x 3/8.
  4. Hold musen forsiktig tilbake ved å scruffing dorsal nakkehuden med en hånd. Snu musen for å eksponere magen. Injiser den tidligere beregnede mengden bedøvelse i bukhulen. Plasser musen i en beholder med et deksel til anestesi trer i kraft (dvs. musen beveger seg ikke lenger).
  5. Når musen slutter å bevege seg, klyp forsiktig føttene for å kontrollere at det ikke er noe svar og sørg for at musen er fullstendig bedøvet før du starter perfusjonen. Plasser og fest musen på ryggen ved å forsiktig feste alle fire beina gjennom poteputene på et brett. Pass på at bena er festet i en avslappet stilling, ikke overbelastet.
  6. Spray musen med 70% etanol fra magen til brystregionen. Bruk tang til å forsiktig klemme og løfte bukhuden og bruk deretter saks for å lage et lite V-formet kutt gjennom huden og kroppsveggen.
  7. Løft bort hudklaffen fra kroppshulen og sett inn saksen under huden og kroppsveggen. Klipp huden og kroppsveggen rett opp mot hodet til kanten av thoracic hulrommet på brystbenet.
  8. Åpne thoraxhulen ved å forsiktig kutte ribbenene på begge sider av brystbenet til like under scapulaen. Pass på at du ikke punkterer lungene under ribbeburet. Ta tak i hud-/ribbeklaffene med tang og fest dem for å eksponere de indre organene.
  9. Trim forsiktig ethvert vev, for eksempel tymus, som kan hindre klar tilgang til hjertet. Eksponer alle organer, inkludert mage-tarmkanalen, for å tillate visuell bekreftelse på at hele kroppen er perfundert, inkludert underlivet.
  10. Bruk disseksjonssaks for å klippe riktig atrium i hjertet og frigjøre blod fra systemet. Hold forsiktig hjertet med tang og sett inn en perfusjonsnål (koblet til en peristaltisk pumperegulator) i venstre ventrikel.
  11. Pumpe ~ 10 ml PBS, med mildt, men konstant trykk, til vev som lever, nyrer og reproduktive kanaler (figur 1E, F) blir fra rosa til hvitt. Deretter erstatter du PBS med nylaget 1% PFA og fortsetter perfusjonen med ca. 10 ml PFA eller til rykninger skjer i musens underkropp (f.eks. hale).
    MERK: Disse fikseringsskjelvene indikerer vellykket perfusjon.
  12. Når perfusjonen er fullført, finn fettputen med eggstokkene under nyrene og disseker forsiktig hele reproduksjonskanalen, inkludert fettputen, eggstokkene og livmorhornene, og legg kanalen i et hetteglass med 4% PFA. Fest eggstokkene ved romtemperatur over natten (~ 16-24 timer). Deretter erstatter du 4% PFA med 70% etanol i minst en dag og trimmer eggstokkene (figur 1E, F), som beskrevet ovenfor, før du starter immunstainingsprotokollen.

5. Helmontert eggstokkimmunisering (figur 2A)

MERK: Øv sterile teknikker under immunstainingsprotokollen, spesielt når du bytter buffere, for å forhindre forurensning i lengre inkubasjonsperioder.

  1. Utfør alle immundempende trinn i en 24-brønnsplate, som vist i figur 2A. Juster reagensvolumer for andre formater. Bytt buffere nøye for å unngå å miste små prenatal og prepubertal eggstokkene.
    MERK: Andre formater, som 48- og 96-brønnsplater, kan brukes, men de dypere brønnene og smalere åpninger gjør det vanskelig å aspirere buffere uten å miste eller skade eggstokkene.
  2. Dag 1
    1. Pipette 1 ml PBS/brønn inn i antall brønner som trengs i en ren 24-brønnsplate. Klipp av spissen av en 200 μL pipettespiss for å lage en bred åpning og bruk den til forsiktig å overføre prepubertale eggstokkene fra 1,5 ml rør med 70% etanol inn i brønnene. For pubertal eggstokkene, bruk en 1000 μL pipettespiss med spissen avskåret for overføringen.
      MERK: Den bredere åpningen av spissen forhindrer vevsskade under overføring.
    2. Når alle prøvene er overført til brønnene, bruk en ny spiss for å aspirere PBS og erstatte den med frisk 0,8 ml PBS /brønn. Inkuber prøvene ved romtemperatur på en shaker ved ~ 100-150 rpm over natten. Start klargjøringen av permeabiliseringsbufferen (se tabell 1 og avsnitt 1).
      MERK: Den nye spissen hindrer eggstokkene i å holde seg til spissen, og PBS-inkubasjonstrinnet gjør at eggstokkene kan likevekte i PBS og rehydrere før farging.
  3. Dag 2
    1. Fullfør klargjøringen av permeabiliseringsbufferen. Aspirer PBS fra brønnene og erstatt den med 0,8 ml permeabiliseringsbuffer per brønn. Plasser platene tilbake på shakeren og inkuber prøvene ved romtemperatur i 4 timer.
    2. Etter 4 timers inkubasjon aspirerer du permeabiliseringsbufferen fullstendig og erstatter den med 0,5 ml blokkeringsbuffer (se tabell 1 og avsnitt 1). Forsegle platen med parafilm for å forhindre fordampning, plasser i en sikkert dekket beholder på en shaker, og inkuber prøvene med mild agitasjon i blokkeringsbufferen over natten (16-24 timer) ved romtemperatur.
  4. Dag 3
    1. Forbered de primære antistoffene ved fortynning i blokkeringsbuffer. For visualisering av oocytter, bruk oocyttmarkører, for eksempel rotte anti-bakteriecelle kjernefysisk sur peptidase (GCNA)/TRA98 for både prenatal og prepubertal eggstokkene og kanin anti-DEAD-box helicase 4 (DDX4)/mus vasa homolog (MVH) for både prepubertal og pubertal eggstokkene. For kvantifisering av LINE-1 ORF1p-uttrykk i prenatal eggstokkene, bruk kanin anti-LINE-1 ORF1p eller et annet tilgjengelig antistoff.
      MERK: GCNA/TRA98-signalet kan ikke påvises i pubertalovaries.
    2. Aspirer blokkeringsbufferen fra prøvene og erstatt den med 0,5 ml fortynnede primære antistoffer. Forsegle platen med parafilm for å forhindre fordampning. Legg platene i en beholder med et deksel for å forhindre tørking av prøver under inkubasjon. Plasser beholderen på shakeren og inkuber prøvene i 3-4 dager ved romtemperatur.
  5. Dag 7
    1. Fjern forsiktig parafilmen fra platene og aspirer den primære antistoffblandingen fra prøvene. Oppbevar de primære antistoffblandingene ved 4 °C (i opptil en måned eller tre bruksområder) og gjenbruk dem senere ved å supplere med friske antistoffer (f.eks. 2 μL fersk antistoff aliquot per 5 ml av den tidligere brukte blandingen).
    2. Tilsett 1 ml vaskebuffer (se tabell 1 og avsnitt 1) per brønn i prøvene og berg platene forsiktig i noen sekunder for å skylle bort de resterende antistoffene. Aspirer forsiktig og erstatt vaskebufferen med 0,8 ml fersk vaskebuffer og rist platene ved romtemperatur over natten.
  6. Dag 8
    1. Aspirer vaskebufferen over natten, erstatt den med 0,8 ml fersk vaskebuffer, og rist ved romtemperatur i 2 timer. Gjenta vasketrinnet med fersk vaskebuffer i ytterligere 2 timer.
    2. Etter den siste vasken, erstatt vaskebufferen med 0,5 ml sekundære antistoffblandinger fortynnet i en blokkeringsbuffer, for eksempel geit anti-rotte Alexa Fluor 555 og geit anti-kanin Alexa Fluor 647 ved 1:1,000 fortynning. Forbered den sekundære antistoffblandingen frisk for hvert immundempende eksperiment.
    3. Forsegle platen med parafilm for å forhindre fordampning under inkubasjon. Inkuber prøvene ved romtemperatur i mørket eller i plater dekket med aluminiumsfolie med mild agitasjon i 3 dager.
      MERK: Dette trinnet og alle påfølgende trinn finner sted i mørket eller med aluminiumsfoliefolie.
  7. Dag 11
    1. Aspirer den sekundære antistoffblandingen og utfør en innledende vask med 1 ml vaskebuffer. Gyng platene forsiktig i noen sekunder for å skylle bort de gjenværende sekundære antistoffene.
    2. Aspirer vaskebufferen, erstatt den med 0,8 ml fersk vaskebuffer, og inkuber prøvene ved romtemperatur i 2 timer med risting, beskyttet mot lys. Gjenta vasketrinnet 2 ganger for totalt 3 vasker. Etter den tredje vasken går du videre til avregningstrinnet (avsnitt 6).

6. Rydding av immundempende eggstokkene på hele fjellet (figur 2A).

MERK: Utfør alle avregningstrinn i mørket ved å pakke platene i aluminiumsfolie eller plassering i ugjennomsiktige beholdere. Clearing trinnene er forskjellige for prepubertal og pubertal eggstokkene.

  1. Dag 11 [Prenatal og prepubertal eggstokkene er ryddet i en ett-trinns protokoll]
    1. Etter siste vask aspirerer du vaskebufferen og erstatter den med 0,8 ml nylaget ScaleS4(0)-løsning (se tabell 1 og avsnitt 1). Forsegle platen med parafilm og inkuber prøvene i mørket med risting ved romtemperatur i tre til fire dager før avbildning.
    2. Bytt ut ScaleS4(0)-løsningen med en ny løsning daglig om nødvendig; Vær forsiktig mens du bytter ut løsningene, da ryddede eggstokkene blir gjennomsiktige og er vanskelige å se. Etter tømming fortsetter du med prøveoppsett og bildebehandling (avsnitt 7).
      MERK: Endring av løsninger forbedret ikke bildekvaliteten betydelig. Daglige endringer øker sannsynligheten for å miste små og for det meste gjennomsiktige prøver.
  2. Dager 11-15 [Pubertal eggstokkene er ryddet i en to-trinns protokoll]
    1. Etter den siste immundempende vasken aspirerer du vaskebufferen og erstatter den med 0,8 ml ScaleCUBIC-1 (se tabell 1 og avsnitt 1). Forsegle platen med parafilm og rist forsiktig prøver ved 37 °C i 3 dager i mørket. Bytt ut ScaleCUBIC-1-oppløsningen med den ferske oppløsningen daglig.
    2. På dag 15 vasker du prøvene 3 ganger i 10 minutter hver gang i 0,8 ml PBS ved romtemperatur med skånsom risting. Bytt ut PBS med 0,8 ml avgasset 20 % sukrose tilberedt ferskt med PBS. Rist forsiktig ved romtemperatur i 1 time.
    3. Bytt ut 20% sukroseoppløsningen med 0,8 ml ScaleCUBIC-2 Solution (se tabell 1 og avsnitt 1), forsegle platen med parafilm, og rist forsiktig ved romtemperatur med daglige endringer i ScaleCUBIC-2-løsningen. Klar i 4-5 dager og fortsett til bildet. Vær forsiktig når du bytter løsninger for å unngå prøvetap, da klarerte eggstokkene er gjennomsiktige og vanskelige å se. Fortsett med prøveoppsett og avbildning (avsnitt 7).

7. Prøveoppsett og avbildning med et multifotonmikroskop

MERK: Alle trinnene beskrevet nedenfor ble utført med en Leica DIVE/4TUNE/FALCON med to justerbare moduslåste Ti:Sapphire multifoton-lasere med en pulsvarighet på 120 fs med en multi-nedsenking 16x/NA0.6 objektiv (nedsenkningsvæske = glyserol) med en maksimal arbeidsavstand på 2,2 mm. Se materialfortegnelsen hvis du vil ha mer informasjon om programvaren for bildeanskaffelse. Supplerende tabell S1 og tilleggsfigur S1 viser innstillingene som brukes for denne protokollen. For andre bildeplattformer, ta kontakt med mikroskopikjernen eller følg produsentens spesifikasjoner/anbefalinger.

  1. Eksempel på oppsett
    1. Klargjør oppsettet for montering av prøvene. Bruk for eksempel en klebrig og fleksibel silikonpakning for å lage en limbrønn. Plasser limbrønnen på en 25 mm x 25 mm nr.
      MERK: En pakning med 1 mm tykkelse passer til alle størrelser av eggstokkene. Dette oppsettet anbefales da det eliminerer eggstokkbevegelse under avbildning, noe som kan oppstå når eggstokkene plasseres i montant i en glassbunnsfat.
    2. Bruk en pipettespiss med spissen avskåret (20 μL for prenatal og prepubertal), overfør eggstokkene med ~ 5-10 μL ScaleS4(0) løsning til midten av limet, samt vist i figur 2B. For pubertal eggstokkene, bruk en 200 μL pipettespiss med spissen avskåret langt nok til å overføre eggstokkene. Tilsett ~15-20 μL av ScaleCUBIC-2 Solution i midten av limbrønnen.
      MERK: For mye løsning kan føre til lekkasje på mikroskopstadiet, og for lite løsning vil føre til dårlig bildekvalitet. Bruk et disseksjonsmikroskop for å overføre prøver etter hvert som klarerte eggstokkene blir gjennomsiktige og er vanskelige å se.
    3. Når eggstokkene er overført til individuelle brønner med en dråpe avregningsløsning, legg forsiktig et annet dekselglass på limbrønnen, trykk for å lage en forsegling, og hold prøvene på plass i et lite basseng med ryddeløsning smurt mellom de to dekslene (figur 2B). For avbildning plasserer du coverlip "sandwich" i en 3D-trykt mikroskopadaptersklie (f.eks. 43 ).
      MERK: Limbrønner gjenbrukes etter dekonstruering av "sandwichen" og vasking med vann.
  2. Avbildning (supplerende tabell S1 og supplerende figur S1)
    1. Slå på mikroskopet og programvaren i henhold til retningslinjene til mikroskopikjernen eller produsenten. Plasser de monterte prøvene på mikroskopstadiet og se gjennom okularet for å finne prøven opplyst med en led-fluorescenslampe med lavt strømforbruk.
    2. Når prøvene er plassert, slår du på laseren(e) og tilordner hver detektor til en bestemt Alexa Fluor-fargestoff/-markør. For flere lasere, tillat sekvensiell bildeanskaffelse. Skaff hele stabelen før du bytter laser.
      MERK: For denne protokollen ble en laser brukt til bildeinnhenting av både 555 nm og 647 nm fluoroforer.
    3. Definer parameterne for bildeanskaffelse i henhold til mikroskopikjernens eller produsentens spesifikasjoner. Bruk toveis bildeanskaffelse, hvis tilgjengelig, for å redusere skannetiden og forbedre effektiviteten. Juster andre innstillinger, inkludert linjegjennomsnittet (1), bildegjennomsnittet (1) og bildehopningen (1).
      MERK: Toveis bildeanskaffelse gjør det mulig for lasere å skanne i begge retninger når de beveger seg på X-aksen.
    4. Sett opp Z-Stack ved å identifisere begynnelsen (bunnen av prøven / bunnglassdekselet) og endeposisjonen (toppen av prøven / toppglassdekselet). Velg en Z-trinns størrelse på 2 μm for prepubertal eggstokkene og 5 μm for pubertal eggstokkene.
    5. Aktiver Z-kompensasjon-funksjonen, og aktiver eksitasjonsgevinsten i denne funksjonen. Angi Z-kompensasjon for bunnen og toppen av prøven ved å velge en laserintensitet for både den nederste (lave intensiteten) og toppstakken (høy intensitet). Se Tilleggsfigur S1, Lineær Z-kompensasjon, der eksitasjonsgevinstboks er valgt, og laserintensitet for henholdsvis bunnen (0) og toppen (347,75) er angitt som henholdsvis 10 og 12.
    6. Bruk flismodus for større prøver som ikke kan tas opp i ett enkelt synsfelt. Aktiver bildenavigatoren og angi antall fliser som trengs for å ta opp hele prøven ved hjelp av det rektangulære markeringsverktøyet.
    7. Start bildeanskaffelsen. For bilder med flere fliser starter du bildeinnhenting med navigatøren for å ta alle brikkene. Når bildeanskaffelsen er fullført, må du først lagre alle bildene, og hvis flere fliser ble anskaffet, kjører du mosaikkflettingsverktøyet for å slå sammen flisene til ett enkelt bilde.
    8. Lagre de sammenslåtte filene i en egen prosjektmappe for å gjøre det enklere å arbeide med bilder i Gigabyte-størrelse. Overfør filene for bildebehandling med 3D-bildevisualiserings- og analyseprogramvare. Figur 3 viser representative bilder tatt på ulike stadier med to markører (GCNA og DDX4).

8. Bildebehandling

MERK: Alle trinnene beskrevet nedenfor ble utviklet og utført ved hjelp av IMARIS 3D-bildevisualiserings- og analyseprogramvare.

  1. Importer bildene til programvaren(e) for 3D-bildevisualisering og -analyse, og konverter om nødvendig filene fra det opprinnelige formatet (f.eks.
  2. Om nødvendig behandler du bildene med det gaussiske filteret for å redusere pikselering (figur 4A). Bruk 3D-visningsfunksjonen til å plassere bildet og fjerne merkingen av rammealternativet (for å fjerne rammen).
    MERK: Det finnes andre valgfrie filtre som også kan brukes til å redusere pikselering og redusere bakgrunnsintensiteten.
  3. Forstørr bildet til en bestemt skala, og bruk snapshot-funksjonen. Angi innstillingene på følgende måte: Velg 300 PPT, lagre som TIFF-bilde og Gjennomsiktig bakgrunn. Ta en øyeblikksbilde av bildet og lagre det. Figur 3 viser fullstendige monterte bilder.

9. Oocyte kvantifisering

MERK: Hel eggstokkimmunofluorescens og 3D-bildevisualisering og analyse kan brukes til estimering av oocytttall i hele eggstokkene (figur 3 og figur 4) ved hjelp av Spot-funksjonen. GCNA-signalet kan brukes til å kvantifisere oocytter i prenatal og prepubertal eggstokkene, som vist i figur 4 (P5). I pubertalovaries, bruk DDX4-signalet til å kvantifisere to oocyttpopulasjoner i ikke-voksende follikler ("ringlignende" struktur, lukket pil) og voksende follikler (store strukturer, åpen pil, figur 4, P28).

  1. Bestem størrelsen på oocytter som skal brukes som parameter for å kvantifisere oocytter med Spots-funksjonen i trinn 9.2.
    1. Åpne bildet, og velg stykkealternativet for å åpne Z-stakkbildet.
    2. Velg Linje-alternativet i målepanelet , og mål avstanden ved å tegne en linje fra den ene kanten av en oocytt/markør til den andre kanten på det bredeste punktet for å bestemme XY-diameteren for oocytttypen/-størrelsen som skal telles. Beveg deg gjennom stabelen og oppnå diameterområdet for flere oocytter av samme type. Bruk den korteste lengden som størrelsesvalgkriterium for oocyttantall.
  2. Spots-funksjon : Velg alternativet 3D-visning og aktiver funksjonen Legg til nye flekker i Scene-panelet for å åpne Algoritme-panelet . Fjern merket for alle algoritmeinnstillingene som størrelsesvalgfilter med oocyttstørrelsen oppnådd i trinn 9.1 vil bli brukt.
    1. Klikk på enkeltpilen fremover for å gå til kildekanalen. Velg kanalen med den foretrukne markøren, og skriv inn den estimerte XY-diameteren som er oppnådd i trinn 9.1. Bruk for eksempel en estimert XY-diameter på 7 μm for prenatale oocytter og 11 μm for P5-oocytter (GCNA = grønt signal; Figur 3 og figur 4A).
    2. Bruk 30 μm for DDX4-signalet for å estimere antall oocytter i voksende follikler i P5-eggstokkene (DDX4 = magentasignal; Figur 3 og figur 4A). For pubertal eggstokkene, bruk DDX4 signal for oocytt kvantifiseringer. Bruk for eksempel XY-diametre på henholdsvis 15 μm og 80 μm for å identifisere oocytter i ikke-voksende follikler og voksende follikler, som vist i figur 4A.
      MERK: Størrelsen som velges, kan variere på grunn av kriterier for bildeanskaffelse og hvilken type mikroskop som brukes. Utvalget kan også variere mellom genetiske stammer da eggstokkene med flere oocytter vil kreve mindre størrelsesvalg for bedre automatisert oocyttdeteksjon.
    3. Etter størrelsesvalg aktiverer du avsnittet Modell PSF-forlengelse og Bakgrunn, som bestemmes automatisk. Velg enkeltpilen fremover for å gå til Filter spots-panelet . Legg til Kvalitet-filteret , og finn en terskelverdi. Hvis du vil sikre nøyaktig estimering av oocytttall, forstørrer du bildet etter hvert som terskelen justeres for å velge en terskelverdi som velger de fleste oocyttene. Klikk på dobbeltpilen for å fullføre automatiserte tellinger.
    4. Kontroller de valgte oocyttene manuelt ved hjelp av kategorien Rediger for å velge tapte oocytter, eller fjern merkingen av ikke-oocyttpartikler som er valgt av den automatiske terskelen. Registrer dataene i kategorien Statistikk i kategorien Generelt for videre analyse.
      MERK: Parametrene som brukes til å telle flekkene, kan lagres og brukes til et annet prøvesett, men det anbefales å utføre en manuell kontroll før du kjører batchanalyse.
    5. For å lagre parametrene, klikk på Opprettelsen-fanen og klikk på Lagre parametere for Batch.
      MERK: Kjernefysiske markører (GCNA+ oocytter, figur 4A) identifiseres enkelt av spotfunksjonen og krever kanskje ikke mye manuell justering. Den cytoplasmatiske markøren (DDX4+ oocytt, figur 3 (P28, lukket pil) og figur 4A) vil imidlertid kreve mer manuell justering for å sikre identifisering av riktig størrelse / type oocytter.

10. Kvantifiserende proteinuttrykk i eggstokkene

MERK: Det finnes flere måter å kvantifisere oocyttuttrykk for bestemte markører på ved hjelp av både Spots-funksjonen (avsnitt 9 og trinn 10.1) og Surfaces-funksjonen (trinn 10.2). Spots-funksjonen kan brukes til proteiner med distinkte lokaliseringsmønstre som kjernefysiske markører (GCNA), og Surfaces-funksjonen kan brukes til proteiner med ikke-ensartede lokaliseringsmønstre som vist i figur 5A der LINE-1 ORF1p-intensiteter i E15.5 og E18.5 eggstokkene ble målt. For å beregne og sammenligne intensiteten av proteinet av interesse mellom to prøver (f.eks. tidspunkter, behandlinger eller genotyper), samle bilder med samme egenskaper. Bruk prøver med et mer intenst signal for å bestemme parametrene som kan lagres og brukes til de andre prøvene.

  1. For å oppnå proteinuttrykket med Spots-funksjonen må du først identifisere oocytter som uthevet (avsnitt 9).
    1. Deretter velger du Statistikk-fanen under Spots-funksjonen, etterfulgt av Detaljert-fanen. Klikk på pil ned og velg Spesifikke verdier, som åpner en annen fane under den som inneholder forskjellige målinger. Velg intensitetsgjennomsnittet for kanalen som brukes for overflategenereringen (eller velg andre intensitetsmålinger, for eksempel intensitetsmedianen).
    2. Hvis du vil ha kombinert/gjennomsnittlig statistisk informasjon, velger du kriteriet for gjennomsnittsverdier . Når du er ferdig, eksporterer og lagrer du data for videre analyse.
  2. Hvis du vil hente proteinuttrykket med Surfaces-funksjonen , åpner du bildet, velger alternativet 3D-visning og aktiverer funksjonen Legg til nye overflater i Scene-panelet for å åpne Algoritme-panelet . Fjern merket for alle algoritmeinnstillingene om ikke nødvendig, og klikk på enkeltpilen fremover for å gå til kildekanalen.
    1. Velg kanalen med antistoffsignalet som skal måles. Andre egenskaper du kan velge, er brukerspesifikke alternativer. Her ble LINE-1-signalet brukt som markør. Verdiene for Surfaces Detail og Background Subtraction (Local Contrast) ble beholdt med standardverdiene henholdsvis 1,42 og 5,33.
    2. Klikk fremoverpilen for å gå til Terskelverdi-panelet . Velg en terskelverdi som kan sammenlignes i begge utvalgene (f.eks. her ble LINE-1-uttrykket i E18.5 brukt til å velge en terskel). Velg Aktiver med en standard seed points diameter på 7,10 (denne verdien ble funnet optimal for bildene, men kan avhenge av forventet pikselstørrelse på funksjoner).
    3. Klikk fremoverpilen for å gå til filteroverflatepanelet . Bruk et kvalitetsfilter ble brukt, og baser verdien, som med terskelverdien , på uttrykket av proteinene i begge eggstokkprøvene. Når filteregenskapen er valgt, klikker du på den doble fremoverpilen for å fullføre genereringen av overflaten.
    4. Hvis du vil hente intensitetsverdiene, velger du kategorien Statistikk etterfulgt av kategorien Detaljert . Klikk på pil ned og velg Spesifikke verdier, som åpner en annen fane under den som inneholder forskjellige målinger.
    5. Velg intensitetsgjennomsnittet for kanalen som brukes for overflategenereringen (eller velg andre intensitetsmålinger, for eksempel intensitetsmedianen).
    6. Hvis du vil ha kombinert/gjennomsnittlig statistisk informasjon, velger du kriteriet for gjennomsnittsverdier . Når du er ferdig, eksporterer og lagrer du dataene for videre analyse (figur 5C).

11. Estimering av totale oocytttall i skadet eggstokk med beregningskorreksjon

MERK: Hvis det oppstår en mindre eggstokkskade under disseksjonen, kan det være mulig å beregne totalt antall oocytter. Det anbefales å bruke intakte eggstokkene fra samme belastnings- og utviklingsstadium for oocyttnummerestimering som vist i figur 6. Simuleringer utført med eggstokkene på E15,5 indikerer at korrigering for et tap på ≥30 % resulterer i et betydelig avvik fra faktiske tall (figur 6C).

  1. Åpne bilder av intakte eggstokkene med IMARIS og velg Frame-funksjonen . Under Rammeinnstillinger velger du etikettene Boks, Rutenett, Hakemerker og Akse . Under fanen Posisjon X/Y/Z velger du 200 μm for å generere merker med 200 μm mellomrom i alle X/Y/Z-posisjoner.
    MERK: Hakemerkene oppretter et rutenett/linjal i X-, Y- og Z-plan for å identifisere oocytter innenfor et bestemt område.
  2. Aktiver Spots-funksjonen for å identifisere oocyttene som uthevet i avsnitt 9 (figur 4). Opprett en 3D-modell ved hjelp av oocyttene som identifiseres i alle intakte eggstokkene som brukes til simuleringen, ved å velge Sfære under kategorien Punktstil/-kvalitet i Spots-funksjonen .
    MERK: Pikselbredden kan også endres under kategorien Punktstil/-kvalitet .
  3. Når boksen er generert i trinn 11.1, justerer du 3D-modellene for de intakte eggstokkene i samme retning som vist i figur 6A.
  4. Ved hjelp av 200 μm tickmarks (trinn 11.1), velg oocytter som faller innenfor 50% av volumet av hver eggstokk. Klikk på Spots-funksjonen og velg Rediger etiketter for å klassifisere oocyttene som faller innenfor 50% -regionen etter farge, som vist i figur 6A.
    MERK: Når oocytter er klassifisert i en region, vil antall oocytter som faller innenfor hver klasse bli gitt.
  5. Zoom inn i 50% regionen og endre tickmarks fra 200 μm til 50 μm for å lage en mindre linjal for oocytt identifikasjon. Oppretthold zoomprosenten i alle bilder. Med 50 μm-merkene som guide, del 50% -regionen i fem like deler.
    MERK: Oocytter i hver del vil representere 10% av volumet som uthevet i figur 6A, der en intakt eggstokk viser oocytter i den øverste halvdelen av eggstokken klassifisert av fem forskjellige farger med hver farge som representerer oocytter innenfor en 10% volumetrisk region.
  6. Registrer oocytttallene i hver 10 % region, som vist i figur 6A,B. Beregn gjennomsnittlig antall oocytter for trinn på 10, 20, 30, 40 og 50 %.
  7. Bruk den uthevede i trinn 11.1 til 11.6 for å få oocyttnumre i den skadede delvise eggstokken. Plasser den skadede eggstokken i samme retning som de intakte eggstokkene, og beregn manglende volum/prosent som beskrevet ovenfor.
  8. Hvis du vil beregne det totale oocytttallet i hele eggstokken, legger du til gjennomsnittlig antall oocytter beregnet for et lignende volum som tallet som er hentet fra den delvise eggstokken (figur 6B).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Immunstaining og avbildning av hele eggstokken muliggjør visualisering og kvantifisering av oocytter eller proteinuttrykk i eggstokkene i ulike utviklingsstadier ved hjelp av samme teknikk og markører (figur 3). Denne protokollen ble utviklet for et stort prosjekt der analyse av eggstokkene på flere stadier og fra flere musestammer var nødvendig. Her presenterer vi data samlet inn for C57BL6/J-stammen, en standardstamme for genetisk analyse. Teknikken som presenteres her er grei, resultatene kan oppnås innen 14-19 dager (figur 2D) og kan brukes til eggstokkene fra prenatal, prepubertal og pubertal kvinner (figur 1 og figur 2A, B).

Denne tilnærmingen ble brukt til å studere dynamikken i oocytttapet som oppstår naturlig under dannelsen av eggstokk oocyttreservatet. I mange organismer, inkludert musen, antas oocytttall å toppe seg i fosterlivet rundt den tiden oocytter kommer inn i meiosis ~ E13.5. Oocytttallene reduseres på grunn av den fortsatt ikke fullt ut forståtte prosessen med foster oocytt utmattelse (FOA) (fra ~ E15,5 til E18,5), som har vært mekanistisk knyttet til uttrykket av retrotransposon LINE-120,21. Flere oocytter elimineres etter E18,5 til P0 på grunn av eliminering av unormale oocytter med et meiotisk kvalitetskontrollpunkt22,23. For å undersøke disse prosessene ved hjelp av denne protokollen, immunterte og avbildet vi eggstokkene på forskjellige utviklingsstadier ved hjelp av DDX4 og GCNA som oocyttmarkører som vist i figur 3.

Små oocytter som uttrykker GCNA og DDX4 ses fra E15.5 og utover, og de representerer oocytter under MPI eller arrestert ved dictyate innenfor primordial follikler. Større voksende oocytter med sterkt DDX4-uttrykk oppdages allerede i P2-eggstokkene der de mest sannsynlig representerer den første bølgen av follikler44. Stadig flere større oocytter ses i P5 og P28 eggstokkene. Bilder oppnådd ved multifotonmikroskopi (figur 4A) ble behandlet ved hjelp av IMARIS-programvare og 3D-gjengivelse ble utført for å identifisere små og større voksende oocytter basert på det kjernefysiske GCNA-signalet og størrelsen avgrenset av DDX4-signalet (figur 4A og video 1). Oocytter ble talt som beskrevet i protokollen, og resultatene er oppsummert i figur 4B. I samsvar med tidligere studier observerte vi et betydelig oocytttap fra E15,5 til E18,5 (~32 %) og E18,5 til P2 (~24 %). Når kvinner når puberteten (P28), har bare ~ 30% av oocytter til stede på E15.5 overlevd.

Denne metoden kan også brukes til å observere konsekvensene av gentoksiske behandlinger som bestråling, som har vist seg å fullstendig eliminere primordial follikkelreservat innen en uke 23,38,45. En signifikant visuell forskjell er tydelig mellom hele eggstokken behandlet med stråling og ubehandlet kontroll i figur 3 (sammenligning av P28 eggstokkene fra behandlede og ubehandlede kvinner). I P28-eggstokken uten strålingseksponering observerte vi to oocyttpopulasjoner merket med DDX4; rikelig små oocytter i opprinnelige follikler (lukket pil); og større oocytter av forskjellige størrelser som vanligvis finnes i voksende follikler (f.eks. primær, sekundær og preantral) (figur 3). I kontrast er eggstokken fra en kvinne utsatt for 0,5Gy av γ-stråling ved P7 helt blottet for små oocytter i primordiale follikler som tidligere observert i 2D-seksjoner. Interessant nok overlevde bare større oocytter av lignende størrelse stråling; Disse kan være de første bølgesekkene som allerede vokser i P7-eggstokken, da de er kjent for å være motstandsdyktige mot stråling46 (figur 3, P28).

I tillegg til kvantifisering av oocytttall, kan denne protokollen brukes til immunstaining og kvantitative analyser av andre proteiner involvert i oocyttutvikling. For eksempel brukte vi antistoffer mot LINE-1ORF1p protein, et RNA-bindende anstandsprotein, produsert av LINE-1 retrotransposons (figur 5). Det er foreslått en økning i overflod av LINE-1-elementer fra E15,5 til E18,5 for å forårsake oocytt eliminering20,21. Faktisk, ved hjelp av multifoton-fanget bilder og signalintensitetsanalyse i IMARIS, ble LINE-1 ORF1p-nivåer observert å øke betydelig i oocytter i løpet av denne tiden, noe som korrelerer med et betydelig fall i oocytttall som vist i figur 4B.

Under omstendigheter der en del av en eggstokk er skadet eller tapt, kan eggstokkene fra samme belastning og utviklingsstadium brukes til å estimere antall oocytter i den manglende regionen som vist i figur 6. Data fra E15.5 eggstokkene ble brukt til simuleringer for å teste nøyaktigheten av beregningskorreksjoner. Oocytter i eggstokkene med opptil 30% vevsskade kan estimeres å ha ≤10% avvik sammenlignet med oocytter i en intakt eggstokk, noe som tyder på at 3D eggstokkfarging og modellering effektivt kan brukes til å redde data fra dyrebare vev. Simuleringer utført med eggstokkene på E15,5 indikerer at korrigering for et tap på ≥30 % resulterer i et betydelig avvik fra faktiske tall (figur 6C).

Figure 1
Figur 1: Eggstokk disseksjon og perfusjon fra kvinner fra prenatal og postnatal stadier. (A-C) Eggstokk disseksjon fra ulike stadier krever forskjellige teknikker, som er avbildet skjematisk for å utfylle beskrivelsene i videoen. (D) Eggstokkene på barseldag 5 (P5) er mye mindre enn ved P28, noe som krever en annen clearingprotokoll som beskrevet i protokollen. (E,F) Riktig perfusjon av eggstokkene er viktig for å eliminere bakgrunnsfarging fra røde blodlegemer. Ikke-perfused reproduktive trakter og eggstokkene har rosa nyanse mens perfused organer blir hvite. Forkortelse: RI = ikke-perfused reproduktive trakter. Bilder A-C ble opprettet med BioRender.com. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 2: Immunstaining, rydding og avbildning av hele museovaries. (A) Flow-diagrammet viser delte og spesifikke trinn for immunstaining og rydding av protokoll for prenatal/prepubertal og pubertal eggstokkene. (B) Ryddet eggstokkene er montert i en dråpe clearing løsning i midten av en lim godt sandwiched mellom to deksel slips. For avbildning plasseres de monterte prøvene i et 3D-trykt adapterlysbilde. (C) Gråtone multifoton bilder av ikke-perfused vs. perfused eggstokkene, immunostained med oocyttmarkøren DDX4, viser forbedret bildekvalitet og lavere ikke-spesifikk farging etter perfusjon. Den lukkede pilen indikerer en oocytt med et tynt lag cytoplasmatisk DDX4-farging som er typisk for primordiale follikler, og de åpne pilene viser større oocytter i voksende follikler. Stjerne indikerer autofluorescence fra blodårene. (D) 3D-gjengivelser fra konfokale vs. multifotonbilder av P5-eggstokkene, immunostert med oocyttmarkører GCNA (grønn) og DDX4 (magenta), som viser en betydelig sfærisk avvik fra konfokal mikroskopi og nesten ingen fra multifoton. Skalastenger = 100 μm (C, D) og 50 μm (innfelt i D). Forkortelser: GCNA = bakteriecelle kjernefysisk sur peptidase; DDX4 = DEAD-box helicase 4. Bilde A ble opprettet med BioRender.com. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 3
Figur 3: Representative 3D-gjengitte bilder av eggstokkene i ulike utviklingsstadier. 3D-gjengivelser fra multifotonbilder av hele fjellet eggstokkene immunostert med GCNA (grønn) og LINE-1 ORF1p (blå) eller DDX4 (magenta), i henholdsvis prenatal og postnatal eggstokkene. Individuelle kanaler presenteres i gråtoner for å vise kjernefysiske og cytoplasmatiske signaler. De hvite boksene konturområder forstørret i de nederste venstre innfelte. To forskjellige eggstokkene vises for P28. Eggstokken fra kontrollen ikke-bestrålet kvinne (topp) inneholder en stor populasjon av små oocytter i primordiale follikler (se innsett). Derimot er eggstokken fra den kvinnelige bestrålet ved P7 med 0,5 Gy av γ-stråling (IR) helt blottet for små oocytter i primordiale follikler (se innsett). Den lukkede pilen indikerer en oocytt med et tynt lag cytoplasmatisk DDX4-farging som er typisk for primordiale follikler, og åpne piler viser større oocytter i voksende follikler. Skalastenger = 100 μm; 30 μm for P28 innsett; 10 μm for alle andre innsett. Innfelt inneholder forstørrede visninger av 3D-gjengitte bilder generert i IMARIS og kan avvike noe fra bilder med lav forstørrelse på grunn av perspektiv. Forkortelser: Ikke-IR = kontroll ikke-bestrålet; IR = bestrålet ved P7 med 0,5 Gy av γ-stråling; GCNA = bakteriecelle kjernefysisk sur peptidase; DDX4 = DEAD-box helicase 4; LINE-1 = lang interspersed kjernefysisk element-1. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 4
Figur 4: Bildebehandling, 3D-visning av oocytter og kvantifiseringsresultater. (A) 3D-gjengivelser fra flerfotonbilder (venstre) ble behandlet i IMARIS ved hjelp av gaussisk filter (midten) og oocytter av små og store størrelser ble identifisert ved hjelp av spotfunksjonen (høyre). P5 og P28 eggstokkene vist som eksempel. Skalastenger = 100 μm (P5); 10 μm (P5 innsett); 300 μm (P28); 50 μm (P28 innsett). (B) Små oocytter positive for GCNA ble kvantifisert i eggstokkene fra forskjellige stadier ved hjelp av spotfunksjoner (topp). For å illustrere synkende antall oocytter under utbyggingen ble gjennomsnittlig % av oocytter beregnet på hvert trinn sammenlignet med gjennomsnittstallet som var til stede i det tidligste stadiet som ble telt på E15,5 (nederst). Legg merke til det store fallet i oocytttall fra E15,5 til E18,5. Data presenteres som midler ± SD. Statistiske analyser ble utført ved hjelp av GraphPad Prism programvare og analysert av enveis ANOVA, og betydningen ble bestemt av Bonferronis post hoc flere sammenligningstest. * P ≤ 0,05; P ≤ 0.0001; ns >0,05. Forkortelse: GCNA = bakteriecelle kjernefysisk sur peptidase; ns = ikke signifikant. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 5
Figur 5: Deteksjon og kvantifisering av ORF1p-uttrykket i fosterocytter. (A) 3D-gjengivelser fra flerfotonbilder viser LINE-1 ORF1p (blått) uttrykk i E15.5 og E18.5 fosteroocytter (merket med grønne GCNA). (B) 3D-overflater generert i IMARIS ved hjelp av bilder på øverste rad i panel A. (C) LINE-1 ORF1p intensitetsanalyse viser høyere uttrykk for LINE-1 ORF1p per oocytt på E18,5 enn E15,5. Skalastenger = 100 μm; 10 μm (panel A innsett); 30 μm (panel B-innsett ). Data presenteres som midler ± SD. Statistiske analyser ble utført ved hjelp av GraphPad Prism programvare og analysert av Student t-test, og betydningen ble bestemt av Mann-Whitney U test. P ≤ 0.0001; ns >0,05. Forkortelser: GCNA = bakteriecelle kjernefysisk sur peptidase; LINE-1 = lang interspersed kjernefysisk element-1. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 6
Figur 6: Metode for å estimere totale oocytttall i skadede eggstokkprøver med beregningskorreksjon. (A) Modell av GCNA-positiv (grønn) E15,5 oocytter med fem 10% regioner uthevet i rødt, blått, grått, magenta og brunt i en intakt eggstokk. Hvert etterfølgende bilde, etter den intakte eggstokken, representerer en simulert eggstokk med 10% inkrementelle områder som mangler opptil 50%. (B) Skjematisk for beregningsmetode for å estimere oocyttnummer i skadet utvalg. (C) Totale oocytttall i simulerte eggstokkene ble sammenlignet med tall i de opprinnelige intakte eggstokkene (betraktet som 100%) og forskjellen presenteres som % avvik. Simulering fra seks individuelle eggstokkene med 10-50% volum mangler. Skalastenger = 80 μm. Forkortelse: GCNA = bakteriecelle kjernefysisk sur peptidase. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Video 1: 3D-gjengivelse og 3D-modellering av oocytter i P5 eggstokkene. Klikk her for å laste ned denne videoen.

Løsninger og buffere Reagens(er) Komposisjon
Bindemiddel Paraformaldehyd 4 % (v/v)
Buffer for permeabilisering Polyvinylalkohol (PVA) 0,2 % (med/v)
Natriumborohydrid 0,1 % (m/v)
Triton X-100 1,5 % (v/v)
Blokkering av buffer Bovine serum albumin (BSA) 3 % (m/v)
1 M Glycin (pH 7,4) 2 % (m/v)
Triton X-100 0,1 % (v/v)
200x Penicillin-Streptomycin 1 % (v/v)
10% natriumazid 0,2 % (v/v)
geit serum 10 % (v/v)
Vaskebuffer PVA 0,2 % (med/v)
Triton X-100 0,15 % (v/v)
10% natriumazid 0,1 % (v/v)
ScaleS4(0)-løsning (pH 8.1) D-Sorbitol 40 % (med/v)
Urea 24 % (m/v)
Glyserol 10 % (v/v)
DMSO 20 % (v/v)
ScaleCUBIC-1-løsning Urea 25 % (med/v)
N,N,N′,N′-Tetrakis(2-Hydroksypropyl)etylendiamin 25% (v/v)
Triton X-100 15 % (v/v)
Sukrose-løsning Sukrose 20 %(m/v)
ScaleCUBIC-2-løsning Sukrose 50 % (med/v)
Urea 25 % (med/v)
Trietanolamin 10 % (med/v)
Triton X-100 0,1 % (v/v)

Tabell 1: Løsninger og buffere.

Supplerende figur S1: Innstillinger for bildeanskaffelse. Klikk her for å laste ned denne filen.

Supplerende tabell S1: Innstillinger for bildeanskaffelse. Klikk her for å laste ned denne tabellen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Denne artikkelen presenterer en detaljert 3D-immuniserings- og bildeprotokoll for prenatal og postnatal eggstokkene for høy gjennomstrømning og komparative studier for kvantifisering av bakterieceller og proteinlokalisering. Vi utviklet denne protokollen for å analysere oocytttall i eggstokkene (N = 6-12) på seks utviklingstidspunkter i 10-16 forskjellige stammer, hvor 2-4 24-brønnsplater vanligvis behandles på en gang. Denne metoden kan tilpasses andre organer eller cellulære markører. For eksempel kan denne protokollen brukes til å merke og visualisere somatiske celler, for eksempel granulosa-celler i eggstokken, ved hjelp av passende antistoffer, og dermed lette studier av somatiske bakteriecelleinteraksjoner eller utvikling av andre eggstokkcelletyper.

En begrensning i denne protokollen og antistoffkombinasjonen er den definitive identifiseringen av forskjellige follikulære stadier. DNA-flekker som brukes i immunfluorescens og 2D-avbildning for å identifisere follikulære stadier ved lag av granulosa cellekjerner er utilstrekkelige for 3D-tilnærminger. Den 4′,6-diamidino-2-Phenylindole (DAPI) eller Hoechst brukes sjelden til helorganfarging på grunn av begrenset lysinntrengning og forfallende signal midt i stort vev. Propidiumjodid (PI) er et lite molekyl som kan trenge dypt inn i vevet, men er vanskelig å fange på multifotonavbildningssystemet på grunn av spektral overlapping. Bedre oppløsning av follikulære stadier kan oppnås ved ekstra markører som er spesifikke for granulosa celler som anti-mullerian hormon (AMH) eller FOXL247,48. Men selv om disse markørene er nyttige for å differensiere større voksende follikler, vil de ikke skille primordial fra primære follikler. Inntil spesifikke markører for disse tidlige stadiene blir tilgjengelige, tilbyr oocyttmarkører som DDX4 eller GCNA den beste indikatoren for follikkelutvikling. Videre fungerer denne protokollen for prenatal mannlige gonader, men har ennå ikke blitt testet i postnatal testis der størrelsen kan være den begrensende faktoren. Kritiske problemstillinger er listet opp nedenfor for bedre visualisering og kvantifisering av bakterieceller i eggstokkene av varierende størrelse, og teknikkene og tiltakene som er tatt for å sikre immunoppnåelse av god kvalitet for nedstrømsanalyse fremheves.

Det første kritiske trinnet er å forhindre skade på eggstokkene før og etter fiksering. Skadede eggstokkene kan mangle deler av organstrukturen, påvirke oocytttallene og forskyve de eksperimentelle resultatene. For å forhindre skade, ekstra somatisk vev er igjen festet til større eggstokk etter disseksjon for å gripe med tang for overføring av eggstokkene. Videre, for mindre eggstokkene, overfører dem med en pipettespiss kuttet bredt nok til at eggstokkene enkelt passer i spissen unngår skade. Hvis mindre vevsskader resulterer i at en del av eggstokken mangler, kan det reduseres ved en beregningsmetode der totale oocytttall i den skadede prøven kan ekstrapoleres ved hjelp av intakte prøver av samme type (figur 6).

Beregningssimuleringer viste imidlertid at nøyaktigheten av prediksjon reduseres med økende størrelse på det skadede området (100,8 % ± 0,2, 97,2 % ± 1,5 og 90,3 % ± 1 for henholdsvis 10, 20 og 30 % skade, henholdsvis figur 6C). Basert på simuleringer anbefaler vi at prøver med >30 % tap utelukkes fra analyse. Flere intakte eggstokkene fra samme utvalgstype ble brukt til å beregne gjennomsnittlig antall oocytter i området som ligner det som mangler i skadet prøve. Dette tallet ble deretter brukt til å forutsi det totale antallet oocytter i eggstokken med skade. Bruk av lignende størrelsesområde i samme eggstokk ved siden av den manglende regionen kan brukes som et alternativ, men ble ikke testet.

Et annet problem er å unngå forurensende celler som kan forårsake autofluorescence. For pubertal eggstokkene, perfusjon, som beskrevet ovenfor, med både 1x PBS og 1% PFA må utføres for å eliminere blodceller som vil forårsake autofluorescence (Figur 2C). Perfusjon med PBS bør fortsette til organer, spesielt eggstokkene og nyrene, blir ryddet for blod og blir hvite før de bytter til 1% PFA (figur 1E, F). Ineffektiv perfusjon med PBS vil resultere i en høy bakgrunn som kan maskere og gjøre visualiseringen av små oocytter vanskelig. Perfusjon med lavere (1 %) eller høyere (4 %) prosent av PFA gir bedre bildekvalitet enn perfusjon med PBS alene; Derfor ble den nedre prosentandelen av PFA brukt.

Optimalisering av antistofffarging krever oppmerksomhet til flere variabler. For permeabiliseringstrinnet ble det funnet at 4 t var ideelt for denne analysen, med perioder som var lengre enn 4 timer (6-8 t testet), noe som resulterte i ingen flekker i det hele tatt. Fordi mengden og kostnaden for antistoffer som brukes til store immundempende eksperimenter kan være høy, ble denne protokollen testet og optimalisert for gjenbruk av antistoffblandinger uten tap av immundempende kvalitet. For gjenbruk må antistoffblandingen suppleres med friskt antistoff som beskrevet i protokollen. Vasketrinn er også avgjørende for kvaliteten på immunstaining og bør utføres lenger for å oppnå et bedre signal-til-støy-forhold under avbildning og bør bestemmes for hvert antistoff du velger. For best resultat anbefaler vi at du klargjør ScaleS4(0)-avregningsløsningen fersk for hver bruk, mens ScaleCUBIC-1 og ScaleCUBIC-2 kan lagres ved romtemperatur i mørket i ~ 1-2 måneder.

ScaleCUBIC-1-ryddingen utføres ved 37 °C; Viktigst, høyere temperaturer bør unngås, da de vil resultere i reagensnedbør, noe som kan påvirke kvaliteten på immunostainingen. Det kan være tidkrevende å montere flere prøver for avbildning. Agar eller andre innebyggingsmetoder som brukes i andre protokoller er arbeidskrevende og kan trenge en ekstra re-clearing av prøver 47,49,50. Gjenbrukbare silisiumpakninger kan brukes som klebebrønner som er enkle å bruke med deksler og tilbys i forskjellige størrelser og dybder for å imøtekomme andre prøvestørrelser. For å oppnå bilder av høy kvalitet må det brukes tilstrekkelig volum av clearingløsning; For lite vil resultere i dårlig bildekvalitet, og for mye løsning kan lekke på mikroskopet. Dette trinnet bør optimaliseres for bestemte prøver, avhengig av størrelsen. Glassbunnsretter kan brukes, men prøver må immobiliseres for avbildning, da selv de minste bevegelsene vil forvrenge bildet. Silisiumpakninger kan brukes i kombinasjon med en glassbunnsfat og toppdeksler for å immobilisere prøvene for avbildning. Dette vil imidlertid begrense muligheten til å snu prøven hvis bildebehandling fra begge sider er nødvendig på grunn av størrelsen på eggstokken.

Et annet kritisk valg for denne store, høye gjennomstrømningsmetoden var avbildning på Leica DIVE/4TUNE/FALCON-plattformen med to justerbare Spectra-Physics multifoton (MP) lasere. Fordelene ved å bruke DIVE-plattformen inkluderer enkel prøvemontering (beskrevet ovenfor), minimering av optisk forvrengning (sammenlignet med konfikale plattformer), og viktigst av alt, bildehastighet og styring av oppkjøpte bildedata. Bildeprøver med multifotonlasere ved høyere forstørrelse (16x) er mye raskere og forårsaker mindre fotodamage enn de kondolerte laserne på Leica DIVE eller SP8 ved hjelp av lignende innstillinger for bildeanskaffelse med LAS X-programvare. MP-strålen er lav, fluoroforeksitasjonen er svært lokalisert til fokuspunktet og oppnår mer dybde ved lav forstørrelse uten å påføre fotodamage til tross for et høyere antall romlige / aksiale bildetrinn (konfokal: ~ 300-400 seksjoner maksimalt, MP: >800 seksjoner).

16x/NA0.6-målet tillater korreksjon for små brytningsindekskonflikter på grunn av prøve- og montantfordeling langs den optiske aksen via en mekanisk korreksjonskrage, som stilles optimalt for maksimalt signal, halvveis inn i prøven. Dessuten kan sfæriske strukturer, for eksempel oocytter, forvrenges av konfokal bildeanskaffelse som dybdeavhengig lokalisering av det konfokale planet (signal) på grunn av montør- og prøverefraktiv indekskonflikter ved en gitt pinhole-innstilling kan forekomme (figur 2D). Når fluorescenssignalet fanges opp via instrumentets indre pinhole for å fjerne signalet utenfor fokus, kan den indre optiske forvrengningen (sfærisk avvik) bli verre dypere inn i prøven, noe som er problematisk for større eggstokkene (dvs. ~ 400-600 mikrometer tykkelse).

Med de samme matchende objektivkorrigeringsinnstillingene kan nesten ingen sfærisk avvik oppdages på DIVE MP-systemet med varierende utslippsbølgelengder, og dermed forenkle kvantifisering og samlokaliseringsstudier (figur 2D). Til slutt gir den pulserte laseren høy effekt spennende lavere fluoroforonsentrasjon dypt inne i prøven, spesielt når den brukes med Z-dybdeeksitasjonskorreksjon. Videre forbedres fangsten av svakere signaler også av MP-hybriddetektoren (HyD-RLDs), som er en kombinasjon av vanlige fotomultiplierrør og skredfotontellingsdetektorer, noe som gir mer enn 30 ganger høyere signaldeteksjon over et bredt spekter av utslippsbølgelengder.

Lysark (LS) multifotonmikroskopi er en annen ny plattform for 3D-vevsavbildning47. LS krever imidlertid mer oppstillingstid for makroskopiske eksempler, inkludert agarinnbygging og oppsett for avbildning. Videre kan bilder som er anskaffet ved høyere forstørrelse med prøverotasjon generere store >100 GB-filer, noe som kan være nødvendig for å fjerne skyggeartefakter i lysarket (på grunn av brytningsindekskonflikter på det ytre mediet og det indre av prøven, eller prøveoverflateforvrengninger). Den presenterte metoden for montering av prøver i løsning i limbrønner er enkel og rask.

Videre tillater denne tilnærmingen avbildning av flere eggstokkene i en brønn med ett oppsett og uten flipping eller rotasjon. Men å snu dekslene "sandwich" kan være nødvendig for større eggstokkene. DIVE-systemavbildningen er raskere enn konfikal og LS; Ved 16x forstørrelse er prepubertal eggstokken avbildet i 3-5 min (Z-trinn 2 μm) og pubertal eggstokken i 1 time (Z-trinn 5 μm). Videre er filer generert i LAS X av håndterbar størrelse (2-20 GB), noe som også er kritisk for et stort antall prøver for nedstrømsanalyse. Selv om denne immundempende protokollen ble optimalisert for bruk i kombinasjon med DIVE-plattformen, kan immundempende prøver avbildes ved hjelp av andre MP / LS-plattformer med noen modifikasjoner.

Fordelen med hele eggstokkfargingen med 3D-modelleringsprotokollen er den effektive og relativt enkle dataanalysen sammenlignet med manuell datainnsamling i 2D-analyse. IMARIS 3D-visualiserings- og analyseprogramvaren ble valgt fordi den er kommersielt tilgjengelig og tilbys av mange mikroskopikjerner, krever ikke programmeringsferdigheter og er kompatibel med mange programvareplattformer for bildeanskaffelse som LAS X fra Leica eller ZEN fra ZEISS. Med IMARIS er standardparametrene satt opp som uthevet i protokolldelen, og disse parametrene kan brukes til andre bilder og prøver med mindre endringer, og dermed forbedre reproduserbarhet og effektivitet.

Bildeanalyse og kvantifisering er optimalisert for IMARIS-programvare; Lignende analyser kan imidlertid gjøres på annen kommersiell eller åpen kildekode-datavisualiseringsprogramvare etter lignende prinsipper. Avslutningsvis er det presentert en optimalisert protokoll for avbildning av hele eggstokkene for kvantitative og kvalitative analyser. Dette ble målrettet tilpasset kravene til høygjennomstrømningsbehandling som i økende grad vil bli nødvendig for toksikologitesting, kliniske og diagnostiske formål, og genomomfattende analyser av regulatorer av eggstokk tilstrekkelighet og funksjon.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingen interessekonflikter å avsløre.

Acknowledgments

Dette arbeidet ble støttet av National Institutes of Health grants (R01 HD093778 til E.B-F og T32 HD007065 til R.B). Vi takker Zachary Boucher for hans hjelp med strålingseksperiment. Vi takker Mary Ann Handel for kritisk lesning av manuskriptet. Vi anerkjenner takknemlig bidraget fra Sonia Erattupuzha og Microscopy Core Service ved Jackson Laboratory for eksperthjelp med mikroskopiarbeidet beskrevet i denne publikasjonen og Jarek Trapszo fra Scientific Instrument Services ved Jackson Laboratory for å designe det 3D-trykte adapterlyset.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Benchtop Incubator Benchmark Scientific H2200-H 37 °C incubator
Bovine Serum Albumin (BSA) VWR 97061-416
C57BL/6J The Jackson Laboratory 000664 mouse inbred strain
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Sigma-Aldrich D1435 Hazardous material
D-Sorbitol Sigma-Aldrich S6021
Dumont #5 Forceps FST 91150-20
FastWells Reagent Barriers GraceBio 664113 Sticky and flexible silicone gasket (adhesive well)
Fine Scissors FST 91460-11
Glycerol Sigma-Aldrich G2025
Glycine ThermoFisher Scientific BP381-500
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 647 Invitrogen A-21246 Dilution 1:1000
Goat anti-Rat IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 555 Invitrogen A-21434 Dilution 1:1000
Goat serum Sigma-Aldrich G9023
IMARIS Software Oxford Instruments Version 9.7.0 Image visualization and analysis software
Insight X3 Spectra-Physics InSight X3 Tunable Ultrafast Laser Laser for Multiphoton Imaging
LASX software Leica Version 3.5.6 Image acquisition software
Leica DIVE/4TUNE/FALCON Leica Leica Dmi8, 2P-M-ready: # 158005406 Multiphoton Microscope
MaiTai HP Spectra-Physics Mai Tai DeepSee One Box Ultrafast Laser Laser for Multiphoton Imaging
Masterflex Pump Controller SPW Industrial Model: 7553-50 Peristaltic pump for perfusion
Mayo Scissors FST 14010-17 5” –7” blunt/blunt scissors for decapitation
Micro Cover Glasses, Square, No. 1.5 25x25mm VWR 48366-249
Mini BioMixer Benchmark Scientific B3D1020 shaker/nutator for 37 °C incubator
Nikon Ergonomic SMZ1270 Leica  SMZ1270 stereomicroscope
Paraformaldehyde 16% (formaldehyde aqueous solution) Electron Microscopy Sciences 15710 Hazardous material
PBS Tablets, Phosphate-buffered Saline ThermoFisher Scientific BP2944100 Dissolve in Milli-Q water
Penicillin-Streptomycin, 200x, Dual Antibiotic Solution ThermoFisher Scientific ICN1670249
Polyvinyl alcohol (PVA) Sigma-Aldrich P8136
Quadrol (N,N,N′,N′-Tetrakis(2-Hydroxypropylethylenediamine) Sigma-Aldrich 122262
Rabbit anti-DDX4/MVH Abcam ab27591 Dilution 1:500
Rabbit anti-LINE-1 ORF1p Abcam ab216324 Dilution 1:500
Rat anti-TRA98/GCNA Abcam ab82527 Dilution 1:500
Sodium azide Sigma-Aldrich S2002 Hazardous material
Sodium borohydride Sigma-Aldrich 452882 Hazardous material
Sucrose ThermoFisher Scientific S0389
Tekmar Orbital Shaker Bimedis VXR-S10 shaker for room temperature
Triethanolamine Sigma-Aldrich 90279
Triton X-100 Sigma-Aldrich X100
UNOLOK Infusion Set MYCO Medical 7001-23 needles for perfusion
Urea Amresco 97061-920
X-Cite 120LED Excelitas S/N XT640-W-0147 low-power LED fluorescence lamp

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Pelosi, E., Forabosco, A., Schlessinger, D. Genetics of the ovarian reserve. Frontiers in Genetics. 6, 308 (2015).
  2. Pepling, M. E. From primordial germ cell to primordial follicle: mammalian female germ cell development. Genesis. 44 (12), 622-632 (2006).
  3. Wilkosz, P., Greggains, G. D., Tanbo, T. G., Fedorcsak, P. Female reproductive decline is determined by remaining ovarian reserve and age. PLoS One. 9 (10), 108343 (2014).
  4. Richardson, M. C., Guo, M., Fauser, B. C. J. M., Macklon, N. S. Environmental and developmental origins of ovarian reserve. Human Reproduction Update. 20 (3), 353-369 (2014).
  5. Spears, N., et al. Ovarian damage from chemotherapy and current approaches to its protection. Human Reproduction Update. 25 (6), 673-693 (2019).
  6. Morgan, S., Anderson, R. A., Gourley, C., Wallace, W. H., Spears, N. How do chemotherapeutic agents damage the ovary. Human Reproduction Update. 18 (5), 525-535 (2012).
  7. Wesevich, V., Kellen, A. N., Pal, L. Recent advances in understanding primary ovarian insufficiency. F1000Research. 9, (2020).
  8. Biswas, L., et al. Meiosis interrupted: the genetics of female infertility via meiotic failure. Reproduction. 161 (2), 13-35 (2021).
  9. Tam, P. P., Snow, M. H. Proliferation and migration of primordial germ cells during compensatory growth in mouse embryos. Journal of Embryology and Experimental Morphology. 64, 133-147 (1981).
  10. Pepling, M. E., Spradling, A. C. Female mouse germ cells form synchronously dividing cysts. Development. 125 (17), 3323-3328 (1998).
  11. Pepling, M. E., Spradling, A. C. Mouse ovarian germ cell cysts undergo programmed breakdown to form primordial follicles. Developmental Biology. 234 (2), 339-351 (2001).
  12. Adams, I. R., McLaren, A. Sexually dimorphic development of mouse primordial germ cells: switching from oogenesis to spermatogenesis. Development. 129 (5), 1155-1164 (2002).
  13. McLaren, A., Southee, D. Entry of mouse embryonic germ cells into meiosis. Developmental Biology. 187 (1), 107-113 (1997).
  14. Findlay, J. K., Hutt, K. J., Hickey, M., Anderson, R. A. How is the number of primordial follicles in the ovarian reserve established. Biology of Reproduction. 93 (5), 111 (2015).
  15. Tilly, J. L. Commuting the death sentence: how oocytes strive to survive. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 2 (11), 838-848 (2001).
  16. Baker, T. G. A quantitative and cytological study of germ cells in human ovaries. Proceedings of the Royal Society of London. Series B, Biological Sciences. 158, 417-433 (1963).
  17. Baker, T. G. A quantitative and cytological study of oogenesis in the rhesus monkey. Journal of Anatomy. 100, Pt 4 761-776 (1966).
  18. Kurilo, L. F. Oogenesis in antenatal development in man. Human Genetics. 57 (1), 86-92 (1981).
  19. Matova, N., Cooley, L. Comparative aspects of animal oogenesis. Developmental Biology. 231 (2), 291-320 (2001).
  20. Malki, S., vander Heijden, G. W., O'Donnell, K. A., Martin, S. L., Bortvin, A. A role for retrotransposon LINE-1 in fetal oocyte attrition in mice. Developmental Cell. 29 (5), 521-533 (2014).
  21. Tharp, M. E., Malki, S., Bortvin, A. Maximizing the ovarian reserve in mice by evading LINE-1 genotoxicity. Nature Communications. 11 (1), 330 (2020).
  22. Rinaldi, V. D., Bolcun-Filas, E., Kogo, H., Kurahashi, H., Schimenti, J. C. The DNA damage checkpoint eliminates mouse oocytes with chromosome synapsis failure. Molecular Cell. 67 (6), 1026-1036 (2017).
  23. Bolcun-Filas, E., Rinaldi, V. D., White, M. E., Schimenti, J. C. Reversal of female infertility by Chk2 ablation reveals the oocyte DNA damage checkpoint pathway. Science. 343 (6170), 533-536 (2014).
  24. Pepling, M. E. Follicular assembly: mechanisms of action. Reproduction. 143 (2), 139-149 (2012).
  25. Tingen, C., Kim, A., Woodruff, T. K. The primordial pool of follicles and nest breakdown in mammalian ovaries. Molecular Human Reproduction. 15 (12), 795-803 (2009).
  26. Wallace, W. H. B., Kelsey, T. W. Human ovarian reserve from conception to the menopause. PLoS One. 5 (1), 8772 (2010).
  27. Pepling, M. E., et al. Differences in oocyte development and estradiol sensitivity among mouse strains. Reproduction. 139 (2), 349-357 (2010).
  28. Nelson, S. M., Anderson, R. A. Prediction of premature ovarian insufficiency: foolish fallacy or feasible foresight. Climacteric. , 1-10 (2021).
  29. Wood, M. A., Rajkovic, A. Genomic markers of ovarian reserve. Seminars in Reproductive Medicine. 31 (6), 399-415 (2013).
  30. Tilly, J. L. Ovarian follicle counts--not as simple as 1, 2, 3. Reproductive Biology and Endocrinology. 1, 11 (2003).
  31. Winship, A. L., Sarma, U. C., Alesi, L. R., Hutt, K. J. Accurate follicle enumeration in adult mouse ovaries. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (164), e61782 (2020).
  32. Fiorentino, G., Parrilli, A., Garagna, S., Zuccotti, M. Three-dimensional imaging and reconstruction of the whole ovary and testis: a new frontier for the reproductive scientist. Molecular Human Reproduction. 27 (3), 007 (2021).
  33. Sarma, U. C., Winship, A. L., Hutt, K. J. Comparison of methods for quantifying primordial follicles in the mouse ovary. Journal of Ovarian Research. 13 (1), 121 (2020).
  34. Skodras, A., Marcelli, G. Computer-generated ovaries to assist follicle counting experiments. PLoS One. 10 (3), 0120242 (2015).
  35. Sonigo, C., et al. High-throughput ovarian follicle counting by an innovative deep learning approach. Scientific Reports. 8 (1), 13499 (2018).
  36. Myers, M., Britt, K. L., Wreford, N. G. M., Ebling, F. J. P., Kerr, J. B. Methods for quantifying follicular numbers within the mouse ovary. Reproduction. 127 (5), 569-580 (2004).
  37. Kagami, K., Shinmyo, Y., Ono, M., Kawasaki, H., Fujiwara, H. Three-dimensional evaluation of murine ovarian follicles using a modified CUBIC tissue clearing method. Reproductive Biology and Endocrinology. 16 (1), 72 (2018).
  38. Rinaldi, V. D., Hsieh, K., Munroe, R., Bolcun-Filas, E., Schimenti, J. C. Pharmacological inhibition of the DNA damage checkpoint prevents radiation-induced oocyte death. Genetics. 206 (4), 1823-1828 (2017).
  39. Malki, S., Tharp, M. E., Bortvin, A. A whole-mount approach for accurate quantitative and spatial assessment of fetal oocyte dynamics in mice. Biology of Reproduction. 93 (5), 113 (2015).
  40. Susaki, E. A., et al. Whole-brain imaging with single-cell resolution using chemical cocktails and computational analysis. Cell. 157 (3), 726-739 (2014).
  41. Hama, H., et al. ScaleS: an optical clearing palette for biological imaging. Nature Neuroscience. 18 (10), 1518-1529 (2015).
  42. Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (65), e3564 (2012).
  43. Microscope slide (25x75) with inset for coverslips (22x22). NIH 3D Print Exchange. Capel Lab at Duke University Medical Center. , Available from: https://3dprint.nih.gov/discover/3DPX-009765 (2018).
  44. Niu, W., Spradling, A. C. Two distinct pathways of pregranulosa cell differentiation support follicle formation in the mouse ovary. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (33), 20015-20026 (2020).
  45. Livera, G., Petre-Lazar, B., Guerquin, M. -J., Trautmann, E., Coffigny, H., Habert, R. p63 null mutation protects mouse oocytes from radio-induced apoptosis. Reproduction. 135 (1), 3-12 (2008).
  46. Carroll, J., Marangos, P. The DNA damage response in mammalian oocytes. Frontiers in genetics. 4, 117 (2013).
  47. McKey, J., Cameron, L. A., Lewis, D., Batchvarov, I. S., Capel, B. Combined iDISCO and CUBIC tissue clearing and lightsheet microscopy for in toto analysis of the adult mouse ovary. Biology of Reproduction. 102 (5), 1080-1089 (2020).
  48. McKey, J., Anbarci, D. N., Bunce, C., Capel, B. Integration of mouse ovary morphogenesis with developmental dynamics of the oviduct, ovarian ligaments, and rete ovarii. bioRxiv. , (2021).
  49. Udan, R. S., Piazza, V. G., Hsu, C. -W., Hadjantonakis, A. -K., Dickinson, M. E. Quantitative imaging of cell dynamics in mouse embryos using light-sheet microscopy. Development. 141 (22), 4406-4414 (2014).
  50. Di Giovanna, A. P., et al. Tailored sample mounting for light-sheet fluorescence Microscopy of clarified specimens by polydimethylsiloxane casting. Frontiers in Neuroanatomy. 13, 35 (2019).

Tags

Utviklingsbiologi utgave 175
Hel eggstokkimofluorescens, rydding og multifotonmikroskopi for kvantitativ 3D-analyse av det utviklende ovariereservatet i musen
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Boateng, R., Boechat, N., Henrich,… More

Boateng, R., Boechat, N., Henrich, P. P., Bolcun-Filas, E. Whole Ovary Immunofluorescence, Clearing, and Multiphoton Microscopy for Quantitative 3D Analysis of the Developing Ovarian Reserve in Mouse. J. Vis. Exp. (175), e62972, doi:10.3791/62972 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter