Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

Hele ovarieimmunfluorescens, clearing og multifotonmikroskopi til kvantitativ 3D-analyse af den udviklende ovariereserve i mus

Published: September 3, 2021 doi: 10.3791/62972
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1The Jackson Laboratory

Summary

Her præsenterer vi en optimeret protokol til billeddannelse af hele æggestokke til kvantitative og kvalitative analyser ved hjælp af helmonteret immunstaining, multifotonmikroskopi og 3D-visualisering og analyse. Denne protokol rummer høj gennemstrømning, pålidelig og repeterbar behandling, der gælder for toksikologi, klinisk diagnostik og genomiske assays af ovariefunktionen.

Abstract

Kvindelig fertilitet og reproduktiv levetid afhænger af kvaliteten og mængden af æggestokkens oocytreserve. Anslået 80% af kvindelige kimceller, der kommer ind i meiotisk profase I, elimineres under føtal oocytslidning (FOA) og den første uge af postnatal liv. Tre hovedmekanismer regulerer antallet af oocytter, der overlever under udvikling og etablerer ovariereserven hos kvinder, der går ind i puberteten. I den første bølge af oocyttab elimineres 30-50% af oocytterne under tidlig FOA, et fænomen, der tilskrives højt Langt spredt nukleart element-1 (LINE-1) udtryk. Den anden bølge af oocyttab er eliminering af oocytter med meiotiske defekter ved hjælp af et meiotisk kvalitetskontrolpunkt. Den tredje bølge af oocyttab forekommer perinat under primordial follikeldannelse, når nogle oocytter ikke danner follikler. Det er stadig uklart, hvad der regulerer hver af disse tre bølger af oocyttab, og hvordan de former ovariereserven hos enten mus eller mennesker.

Immunofluorescens og 3D-visualisering har åbnet en ny vej til at afbilde og analysere oocytudvikling i sammenhæng med hele æggestokken snarere end i mindre informative 2D-sektioner. Denne artikel indeholder en omfattende protokol for hel æggestokimmunstainering og optisk clearing, hvilket giver præparater til billeddannelse ved hjælp af multifotonmikroskopi og 3D-modellering ved hjælp af kommercielt tilgængelig software. Det viser, hvordan denne metode kan bruges til at vise dynamikken i oocytnedslidning under ovarieudvikling i C57BL / 6J-mus og kvantificere oocyttab under de tre bølger af oocyteliminering. Denne protokol kan anvendes på prænatale og tidlige postnatale æggestokke til oocytvisualisering og kvantificering samt andre kvantitative tilgange. Det er vigtigt, at protokollen blev strategisk udviklet til at rumme høj gennemstrømning, pålidelig og gentagelig behandling, der kan imødekomme behovene inden for toksikologi, klinisk diagnostik og genomiske assays af ovariefunktion.

Introduction

De fleste pattedyrhunner er født med et begrænset antal meiotisk arresterede oocytter opbevaret i primordiale follikler, der udgør ovariereserven (OR)1,2. OR bestemmer den samlede kvindelige reproduktive levetid og sundhed3. OR falder normalt i størrelse med aldring og kan udtømmes for tidligt ved udsættelse for visse genotoksiske midler (stråling / kemoterapi) og miljøbelastninger (underernæring), hvilket fører til infertilitet 4,5,6. Idiopatisk kvindelig infertilitet kan ofte tilskrives den genetiske og fysiologiske kvalitet af æg, der udvikler sig fra OR og forbliver dårligt forstået 7,8. Fordi kvindelig follikelbegavelse stort set er forudbestemt ved fødslen, er det vigtigt at forstå de reguleringsmekanismer, der er involveret i oprettelsen og vedligeholdelsen af or' or.

I mus starter OR-dannelsen med specifikationen af primordiale kimceller (PGC'er) omkring embryonal dag (E) 7,52. PGC'erne migrerer til kønskanterne, hvor de vil opholde sig med ca. E10,59. Følgende omfattende spredning sker med ufuldstændig cytokinese, der resulterer i dannelse af cyster, der vil blive nedbrudt senere i udvikling10,11. Ved ca. E12,5 bestemmes gonadale køn, og PGC-spredning stopper i æggestokke. Hos kvinder indtaster PGC'er, nu oocytter, meiotisk profase I (MPI) ved ca. E13,5 12,13. Oocytter udvikler sig gennem udvidet MPI og anholdelse på diktatstadiet omkring fødslen. I løbet af den første uge efter fødslen er hver arresteret oocyt omgivet af granulosaceller og danner derved en primordial follikel.

Antallet af primordiale follikler i OR hos en kvinde afhænger af, hvor mange oocytter der overlevede bølgerne af oocyteliminering, der forekommer før og under MPI-anholdelse gennem apoptose, autofagi eller nekrose14,15. Den første bølge opstår under fosterudvikling og er kendt som FOA. FOA er en evolutionært bevaret proces hos hunner (pattedyr og ikke-pattedyr), hvorved anslået 50-80% af oocytterne elimineres afhængigt af hunarten 16,17,18,19. Hos mus forekommer FOA under E15.5 til E18.5 og er blevet tilskrevet reaktivering og ekspression af retrotransposon LINE-1-sekvenser, der forårsager oocytdød20,21. Den anden bølge af oocyteliminering sker gennem et meiotisk kontrolpunkt, der eliminerer oocytter med meiotiske defekter såsom ureparerede DNA-dobbeltstrengsbrud (DSB'er)22,23. Den næste bølge af oocyteliminering forekommer under cystenedbrydning, der kulminerer under dannelsen af primordiale follikler, som hver indeholder en enkelt oocyt 10,11,24,25.

Hos mus er den oprindelige follikelreserve stort set etableret ved puberteten, hvorefter den falder, da primordiale follikler aktiveres til vækst under regelmæssige reproduktive cyklusser. OR-størrelsen varierer mellem individuelle kvinder og mellem forskellige genetiske stammer af mus; alligevel er den genetiske regulering af OR-størrelse ikke godt forstået 26,27,28,29. Genetiske undersøgelser af OR-regulering hæmmes af manglen på standardiserede protokoller til at studere bølgerne af oocyteliminering under prænatal og postnatal udvikling. Flere oocytkvantificeringsmetoder er blevet udviklet i mus, hvor den mest almindelige og udbredte er histomorfometrisk evaluering af histologiske sektioner30,31. I denne teknik identificeres oocytter på serielle sektioner med histologiske pletter, såsom hæmatoxylin og eosin (H & E) og periodiske syre-Schiff (PAS) eller fluorescerende markører. Denne teknik er pålidelig, hvis alle forhold forbliver konstante, herunder sektionstykkelse, effektiv genopretning af alle sektioner i hele æggestokken og tælleordningerne i de enkelte laboratorier. Antallet rapporteret af forskellige laboratorier varierer imidlertid ofte betydeligt og er derfor ikke let sammenlignelige.

I betragtning af genetiske forskelle kan brugen af forskellige musestammer desuden også påvirke oocyttællinger. Yderligere beregningsmetoder er udviklet til histomorfometrisk evaluering og omfatter automatiseret detektion af oocytter ved hjælp af fraktionatormetoden, automatisk tælling ved hjælp af beregningsalgoritmer og 3D-rekonstruktion af histologiske billeder for at forhindre flere tællinger af den samme oocyt 31,32,33,34,35,36 . Selv med disse forbedringer tilføjet til histomorfometrisk evaluering er teknikken relativt arbejdskrævende, især til store og højkapacitetsundersøgelser. De indsamlede data er muligvis ikke reproducerbare og sammenlignelige mellem undersøgelser på grund af forskelle i tælleordninger, computeralgoritmer og anvendt software.

For nylig, fremskyndet af udviklingen af nye multifoton- og lysarkmikroskopi og optiske vævsclearingsmetoder, bliver 3D-modellerings- og analyseteknikker til intakte æggestokke den valgte metode til effektivt at kvantificere oocyttal og studere proteinlokalisering og dynamik37,38. Disse 3D-metoder er typisk fordelagtige i forhold til histologiske metoder, da væv og organer bevares bedre og holdes intakte. Desuden giver 3D-analyse og modellering yderligere indsigt i funktion og interaktioner inden for og mellem cellenicher eller understrukturer i organet, der kan gå glip af i 2D-analyse.

3D-analyse af hele organer kræver optimering af fiksering, immunstaining og optiske clearingprotokoller for individuelle organer, såsom æggestokke, uden vævsforvrængning eller skade. Yderligere optimering af prøvemontering til billeddannelse er nødvendig for mikroskopi i høj opløsning og kan afhænge af den tilgængelige billedbehandlingsplatform. Endelig genererer billeddannelse af hele den intakte æggestok en stor mængde data til efterfølgende beregningsanalyser. Derfor er der behov for at udvikle standardiserede 3D-metoder til at tælle oocytter til komparative undersøgelser og på tværs af udviklingsstadier.

Denne protokol bruger standard immunstaining og tidligere rapporterede clearingprotokoller med fokus på en enkel, brugervenlig og høj gennemstrømningsmetode 38,39,40,41. Protokollen er optimeret til at analysere et stort antal prænatale og postnatale æggestokke op til postnatal dag 28 (P28) og varierende størrelser af æggestokke fra forskellige musegenetiske baggrunde. De immunstainerende trin er ens for alle faser; Rydningsprotokollerne adskiller sig imidlertid for pubertetsæggestokker på grund af deres større størrelse, ScaleS4(0) og CUBIC for små og store æggestokke, henholdsvis40,41. Endvidere udføres helkropsperfusion i P28-mus før fiksering for at forhindre autofluorescens fra blodlegemer. Et multifotonmikroskop blev bygget på Leica DIVE/4Tune-platformen som et alternativ til lysarkmikroskopi for at erhverve billeder, og IMARIS 3D-visualiserings- og analysesoftware med forskellige analytiske værktøjer blev valgt til denne protokol. Denne protokol er enkel at følge og mindre praktisk, hvilket sparer tid. Desuden er oocytkvantificering relativt hurtig afhængigt af æggestokkens størrelse og arrangement af oocytter.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle anvendte mus var af den genetiske stamme C57BL/6J (se materialetabellen). Denne stamme er blevet fuldt sekventeret og er standard for mange undersøgelser af æggestokkenes struktur og funktion. Mus blev anbragt i henhold til NIH-retningslinjer, og udførte procedurer blev godkendt af Institutional Animal Care and Use Committee of The Jackson Laboratory. Reagenser og sammensætninger, der anvendes i denne protokol, er opført i henholdsvis tabel over materialer og tabel 1.

1. Fremstilling af reagenser

  1. Fikseringsmiddel: Forbered 4% paraformaldehyd (PFA) i 1x PBS. For eksempel tilsættes 3 ml PFA-elektronmikroskopikvalitet til 9 ml 1x PBS for 24 prøver (0,5 ml / prøve = 12 ml totalvolumen).
  2. Permeabiliseringsbuffer
    1. Mål polyvinylalkohol (PVA) i et 250 ml plastbægerglas indeholdende 1x PBS dagen før permeabiliseringsbufferen er nødvendig. Rør opløsningen natten over for at lade PVA opløses fuldstændigt.
    2. Tilsæt natriumborhydrid til den opløste PVA, og lad blandingen homogenisere i ca. 3-5 minutter. Forvent, at opløsningen skummer.
    3. Tilsæt Triton X-100 til opløsningen, og brug bufferen, når Triton X-100 er opløst.
      BEMÆRK: PVA tager lang tid at opløse (mindst 3 timer), og antistoffets indtrængning afhænger af, hvor godt det opløses. For større æggestokke er det afgørende at opløse PVA fuldstændigt.
  3. Blokering af buffer
    1. Mål bovin serumalbumin (BSA) i et bægerglas med 1x PBS. Rør opløsningen, indtil BSA er opløst.
    2. Tilsæt glycin, Triton X-100, Penicillin-streptomycin og natriumazid. Rør, indtil opløsningen homogeniseres. Bufferen overføres til en flaske og opbevares ved 4 °C. Tilsæt normalt gedeserum før brug.
  4. Vaskebuffer: Mål PVA i et bægerglas, der indeholder 1x PBS. Rør opløsningen natten over for at lade PVA'en opløses. Tilsæt Triton X-100 og natriumazid. Når bufferen er blandet, opbevares den ved 4 °C.
  5. SkalaS4(0)-opløsning (pH 8.1): D-sorbitol opløses i PBS i et bægerglas under omrøring ved ≤100 °C. Tilsæt urinstof til opløsningen, og når urinstoffet er opløst, skal du slukke for varmen og lade opløsningen røre, indtil den er helt opløst. Tilsæt glycerol og dimethylsulfoxid, og rør, indtil opløsningen homogeniseres. Opbevar opløsningen ved stuetemperatur i mørke.
    BEMÆRK: ScaleS4(0)-opløsningen skal laves frisk på den første dag, hvor æggestokkene ryddes.
  6. ScaleCUBIC-1-opløsning
    1. Urinstof opløses i et bægerglas indeholdende PBS under omrøring ved temperatur ≤100 °C. N,N,N′,N′-tetrakis(2-hydroxypropyl)ethylendiamin måles i et separat bægerglas, tilsættes derefter det opløste urinstof, og der omrøres ved en temperatur på ≤100 °C, indtil reagenserne er helt opløst. Når alle reagenserne er i opløsning, skal du slukke for varmen og afkøle ved stuetemperatur. Opbevares i mørke.
    2. Afgas opløsningen ved at overføre den til en filtreringskolbe. Kolben fastgøres til et vakuum med slange, dæk kolben til, og tænd for vakuummet, indtil bobler i opløsningen forsvinder. Brug opløsningen efter denne afgasning.
      BEMÆRK: Opløsningen kan opbevares i mørke til brug i op til en måned.
  7. Saccharoseopløsning: Opløs saccharose i 1x PBS; afgas derefter opløsningen inden brug.
    BEMÆRK: Forbered opløsningen frisk inden brug.
  8. ScaleCUBIC-2-opløsning
    1. Saccharose opløses i et bægerglas indeholdende PBS under omrøring ved en temperatur ≤100 °C. Tilsæt urinstof og rør ved en temperatur på ≤100 °C, indtil urinstoffet opløses. Sluk for varmen.
    2. Tilsæt triethanolamin og Triton X-100. Rør, indtil opløsningen homogeniseres. Lad opløsningen afkøle til stuetemperatur og opbevar i mørke. Afgas opløsningen inden brug.
      BEMÆRK: Opløsningen kan opbevares i mørke til brug i op til en måned.

2. Dissektion og fiksering af prænatale æggestokke (figur 1A)

  1. Mate voksne kvinder (≥8 uger) og mænd i henhold til den godkendte institutionelle protokol. Kontroller for vaginale stik hver morgen.
    BEMÆRK: Morgenen for et vaginalstik betegnes som 0,5 dage efter coitum (d.p.c) eller E0.5.
  2. På dissektionsdagen skal du forberede 4% paraformaldehyd (PFA) og alikvote ~ 0,5 ml i mikrocentrifugerør, placeret på bænksiden (~ 4 pr. Gravid kvinde).
    BEMÆRK: PFA er et farligt stof og skal håndteres under en emhætte.
  3. Forbered tre 100 mm plader indeholdende ~ 10 ml 1x fosfatbufret saltvand (PBS) for hver gravid kvinde (til høst af livmoder, til dissekering af mesonephros-ovariekompleks og isolering af æggestokke).
  4. Aflive gravide kvinder, der bærer embryoner af det foretrukne udviklingsstadium og fortsætter med dissektion. Afliv ikke mere end 1-2 kvinder ad gangen. Brug en godkendt protokol for eutanasi af gravide mus (f.eks. CO2 - eksponering efterfulgt af cervikal dislokation).
  5. Når en kvinde er aflivet, spray maven med 70% ethanol. Brug tang til at løfte mavehuden og bruge en saks til at lave et V-formet snit gennem maven og kropsvæggen. Skær langs de to sider af snittet og skræl huden tilbage for at udsætte de indre organer og fostre i livmoderen.
  6. Med tang og saks skal du klippe og adskille livmoderen med fostrene fra mavefedt og æggestokke og vener. Fjern livmoderen og læg den i en 100 mm plade indeholdende 1x PBS. Slip fostrene i PBS ved at skære livmodervæggen og punktere æggeblommesækken. Klip navlestrengen.
    BEMÆRK: For fostre yngre end 15 dage i drægtighed sikrer moderens eutanasi og fjernelse fra livmoderen hurtig død af fosteret. Fostre ældre end 15 dage i drægtighed til fødsel skal aflives ved halshugning.
  7. Overfør et foster til en ny tallerken med frisk 1x PBS. For at halshugge et E15.5-foster skal du forsigtigt fastgøre de to bagben fra hinanden på pladen med tang for at immobilisere fosteret. Brug et andet par tang, der holdes i den dominerende hånd, hold nakken mellem tangstængerne og klem for at afskære fostrets hoved eller brug en saks til at skære nakken.
  8. Med den dominerende hånd tang skæres under forbenene og trækkes forsigtigt overkroppen væk. Indsæt derefter et endepunkt af den dominerende håndtakt i bughulen lodret ind i åbningen af abdominalområdet, mens det andet endepunkt for tangen forbliver udenfor. Luk tangen, klem kropsvæggen for at skære den, og udsæt de indre organer.
  9. Med de samme tang skal du forsigtigt fjerne organerne, herunder tarmene og leveren, indtil nyrerne og reproduktive organer bliver synlige. Bestem fostrets køn: Ved E15.5 har æggestokke en langstrakt pølselignende form, mens testiklerne er ovale.
    BEMÆRK: På tidligere stadier kan genotypning være nødvendig for at bestemme kønnet.
  10. Brug et par tang til at holde det kvindelige foster nede og bruge den anden tang til at gribe fat i hvert mesonephros-ovariekompleks og forsigtigt adskille det fra nyrerne og de müllerske kanaler. Placer æggestokkene i en ny plade med 1x PBS, lad mesonephros være fastgjort, men fjern det omgivende væv for at sikre, at æggestokkene udsættes. Læg begge æggestokke i ~ 0,5 ml 4% PFA i mikrocentrifugerør og fastgør ved 4 ° C natten over. Næste dag skal PFA udskiftes med 70% ethanol.
  11. Ved dissektion og fiksering af E18.5 æggestokke skal fostrene adskilles fra livmoderen som beskrevet ovenfor og derefter følge protokollen for præpubertale hvalpe beskrevet i punkt 3 (figur 1B).

3. Dissektion og fiksering af præpubertale æggestokke (figur 1B)

  1. Forbered 4% PFA og aliquot ~ 0,5 ml i 1,5 ml rør og læg dem på bænksiden (~ et rør pr. Hvalp). Forbered 35 mm plader med 1x PBS (~ en pr. Hvalp). Afliv hvalpene ved hjælp af den godkendte institutionelle protokol.
    BEMÆRK: Halshugning er den foretrukne metode til eutanasi for mus 8 dage eller yngre. Neonatale mus kan halshugges ved hjælp af enten 3-4" dissekeringssaks eller 5-7" Mayo saks.
  2. Bestem hvalpenes køn ved at måle den anogenitale afstand, som er større hos mænd end hos kvinder. Brug en skarp halshugningssaks til at halshugge hunhvalpe. Placer kroppen, åben med siden nedad, på et papirhåndklæde for at dræne blodet (~ 5-10 s).
  3. Fastgør hvalpen på ryggen ved at placere en stift i potepuden på hver fod. Sprøjt maven med 70% ethanol. Brug tang til at holde hvalpens hud væk fra kroppen og brug en saks til at lave et lille V-formet snit i huden på underlivet.
  4. Indsæt saksen i snittet under huden og skær langs begge sider af maven. Brug tangen til forsigtigt at skrælle huden tilbage og afsløre underlivet. Flyt forsigtigt tarmen op og find livmoderhornene ved siden af blæren. Følg hvert livmoderhorn mod nyrerne og find æggestokken med omgivende fedtvæv under hver nyre.
  5. For at dissekere æggestokkene skal du holde livmoderhornet under æggestokken og ovidukten med et par tang (tang A, figur 1B) og forsigtigt løfte det væk fra kroppen. Brug et andet par tang (tang B) til forsigtigt at gribe under det første par tang, så æggestokken og ovidukten i fedtpuden er synlige over det andet par tang. Skær derefter under det andet par tang med en saks eller træk forsigtigt for at løsne æggestokkene og fastgjort væv.
  6. Anbring de isolerede organer i en plade med 1x PBS. Trim det ekstra fedtvæv, ovidukt og livmoderhorn væk for at rense og isolere æggestokken. Åbn forsigtigt bursa omkring æggestokken og udsæt hele æggestokken.
  7. Trim bursamembranen uden at beskadige æggestokken og efterlad væv omkring hilum (ledbåndslignende struktur mellem æggestokken og reproduktionskanalen) for at håndtere æggestokken, som vist i figur 1B, P5. Når æggestokkene er trimmet, skal du placere dem i 4% PFA og fiksere æggestokkene ved 4 °C natten over. Den næste dag skal du udskifte 4% PFA med 70% ethanol og opbevare æggestokkene ved 4 °C indtil immunfarvningsprotokoltrinnet.

4. Perfusion, dissektion og fiksering af pubertetsæggestokke (figur 1C)

  1. Perfuse mus i henhold til institutionelt godkendte protokoller med musen under dyb anæstesi i en kemisk røghætte. Forbered perfusionsudstyret og reagenserne. Se den detaljerede protokol på 42.
    BEMÆRK: Perfusion er en terminal eutanasiprocedure, der erstatter blodet i hele det vaskulære system med et vævsfikseringsmiddel.
  2. Vej en pubertal hunmus (P28) og registrer musens vægt (typisk mellem 13 g og 15 g). Beregn mængden af det godkendte anæstesimiddel, der skal anvendes.
    BEMÆRK: Her blev 0,35 ml tribromethanol pr. 10 g kropsvægt anvendt i denne protokol.
  3. Brug en 10 ml engangssprøjte med en 20 G nål til at fylde sprøjten med det godkendte bedøvelsesmiddel. Udskift 20 G nålen med en 26 G x 3/8 nål.
  4. Begræns forsigtigt musen ved at skrubbe den dorsale halshud med den ene hånd. Vend musen for at udsætte maven. Injicer den tidligere beregnede mængde bedøvelsesmiddel i bughulen. Placer musen i en beholder med et dæksel, indtil anæstesien træder i kraft (dvs. musen bevæger sig ikke længere).
  5. Når musen holder op med at bevæge sig, skal du forsigtigt klemme fødderne for at kontrollere, at der ikke er noget svar og sikre, at musen er fuldt bedømt, før perfusionen påbegyndes. Placer og fastgør musen på ryggen ved forsigtigt at fastgøre alle fire ben gennem potepuderne på et bræt. Sørg for, at benene er fastgjort i en afslappet position, ikke overstrakt.
  6. Sprøjt musen med 70% ethanol fra maven til brystområdet. Brug tang til forsigtigt at klemme og løfte mavehuden, og brug derefter en saks til at lave et lille V-formet snit gennem huden og kropsvæggen.
  7. Løft hudklappen væk fra kropshulrummet, og indsæt saksen under huden og kropsvæggen. Skær hud- og kropsvæggen lige op mod hovedet til kanten af brysthulen ved brystbenet.
  8. Åbn brysthulen ved forsigtigt at skære ribbenene på begge sider af brystbenet til lige under scapulaen. Pas på ikke at punktere lungerne under ribbenburet. Tag fat i hud/ribbenklapperne med tang og fastgør dem for at eksponere de indre organer.
  9. Trim forsigtigt ethvert væv, såsom thymus, der kan hindre klar adgang til hjertet. Udsæt alle organer, herunder mave-tarmkanalen, for at muliggøre visuel bekræftelse af, at hele kroppen er perfuseret, herunder underlivet.
  10. Brug dissektionssaks til at klippe hjertets højre atrium og frigive blod fra systemet. Hold forsigtigt hjertet med tang og indsæt en perfusionsnål (forbundet til en peristaltisk pumpecontroller) i venstre ventrikel.
  11. Pump ~ 10 ml PBS med blidt, men konstant tryk, indtil væv som lever, nyrer og reproduktive kanaler (figur 1E, F) bliver fra lyserød til hvid. Udskift derefter PBS med frisklavet 1% PFA og fortsæt perfusionen med ca. 10 ml PFA, eller indtil der opstår trækninger i musens underkrop (f.eks. Hale).
    BEMÆRK: Disse fikseringskælv indikerer vellykket perfusion.
  12. Når perfusionen er afsluttet, skal du lokalisere fedtpuden med æggestokkene under nyrerne og forsigtigt dissekere hele reproduktionskanalen, herunder fedtpuden, æggestokkene og livmoderhornene, og placere kanalen i et hætteglas med 4% PFA. Fastgør æggestokkene ved stuetemperatur natten over (~ 16-24 timer). Udskift derefter 4% PFA med 70% ethanol i mindst en dag og trim æggestokkene (figur 1E,F), som beskrevet ovenfor, inden immunstainingsprotokollen påbegyndes.

5. Hele montering af ovarieimmunstaining (figur 2A)

BEMÆRK: Øv sterile teknikker under immunfarvningsprotokollen, især ved skift af buffere, for at forhindre kontaminering i længere inkubationsperioder.

  1. Udfør alle immunstaining trin i en 24-brønds plade, som vist i figur 2A. Juster reagensvolumener for andre formater. Skift buffere omhyggeligt for at undgå at miste små prænatale og præpubertale æggestokke.
    BEMÆRK: Andre formater, såsom 48- og 96-brøndsplader, kan bruges, men de dybere brønde og smallere åbninger gør det vanskeligt at aspirere buffere uden at miste eller beskadige æggestokke.
  2. Dag 1
    1. Pipette 1 ml PBS/brønd ind i det antal brønde, der er behov for i en ren 24-brønds plade. Skær spidsen af en 200 μL pipettespids af for at lave en bred åbning, og brug den til forsigtigt at overføre præpubertale æggestokke fra 1,5 ml rør med 70% ethanol ind i brøndene. Til pubertetsæggestode skal du bruge en 1000 μL pipettespids med spidsen afskåret til overførslen.
      BEMÆRK: Den bredere åbning af spidsen forhindrer vævsskade under overførsel.
    2. Når alle prøverne er overført til brøndene, skal du bruge en ny spids til at aspirere PBS og erstatte den med frisk 0,8 ml PBS / brønd. Inkuber prøverne ved stuetemperatur på en ryster ved ~ 100-150 o / min natten over. Påbegyndelse af forberedelsen af permeabiliseringsbufferen (se tabel 1 og pkt. 1).
      BEMÆRK: Det nye tip forhindrer æggestokke i at klæbe til spidsen, og PBS-inkubationstrinnet gør det muligt for æggestokkene at udligne i PBS og rehydrere inden farvning.
  3. Dag 2
    1. Afslut forberedelsen af permeabiliseringsbufferen. Aspirer PBS fra brøndene og udskift det med 0,8 ml permeabiliseringsbuffer pr. Brønd. Læg pladerne tilbage på rysteren og inkuber prøverne ved stuetemperatur i 4 timer.
    2. Efter 4 timers inkubation aspirerer permeabiliseringsbufferen fuldstændigt og erstatter den med 0,5 ml blokerende buffer (se tabel 1 og afsnit 1). Forsegl pladen med parafilm for at forhindre fordampning, anbring den i en sikkert dækket beholder på en ryster, og inkuber prøverne med blid omrøring ved blokering af buffer natten over (16-24 timer) ved stuetemperatur.
  4. Dag 3
    1. Forbered de primære antistoffer ved fortynding i blokerende buffer. Til visualisering af oocytter skal du bruge oocytmarkører, f.eks. rotte anti-kimcelle nuklear sur peptidase (GCNA)/TRA98 til både prænatale og præpubertale æggestokke og kanin anti-DEAD-box helicase 4 (DDX4)/mus vasa homolog (MVH) til både præpubertale og pubertale æggestokke. Til kvantificering af LINE-1 ORF1p-ekspression i prænatale æggestokke skal du bruge kaninanti-LINE-1 ORF1p eller et andet tilgængeligt antistof.
      BEMÆRK: GCNA/TRA98-signalet kan ikke påvises i pubertetsæggestokkene.
    2. Aspirer den blokerende buffer fra prøverne og erstat den med 0,5 ml fortyndede primære antistoffer. Forsegl pladen med parafilm for at forhindre fordampning. Anbring pladerne i en beholder med et låg for at forhindre udtørring af prøver under inkubation. Anbring beholderen på rysteren og inkuber prøverne i 3-4 dage ved stuetemperatur.
  5. Dag 7
    1. Fjern forsigtigt parafilmen fra pladerne, og aspirer den primære antistofblanding fra prøverne. Opbevar de primære antistofblandinger ved 4 °C (i op til en måned eller tre anvendelser), og genbrug dem senere ved at supplere med friske antistoffer (f.eks. 2 μL frisk antistofallikvot pr. 5 ml af den tidligere anvendte blanding).
    2. Der tilsættes 1 ml vaskebuffer (se tabel 1 og punkt 1) pr. brønd til prøverne, og sten forsigtigt pladerne i et par sekunder for at skylle de resterende antistoffer væk. Aspirer forsigtigt og udskift vaskebufferen med 0,8 ml frisk vaskebuffer og ryst pladerne ved stuetemperatur natten over.
  6. Dag 8
    1. Aspirer den overnattende vaskebuffer, udskift den med 0,8 ml frisk vaskebuffer, og ryst ved stuetemperatur i 2 timer. Gentag vasketrinnet med frisk vaskebuffer i yderligere 2 timer.
    2. Efter den sidste vask skal vaskebufferen udskiftes med 0,5 ml sekundære antistofblandinger fortyndet i en blokerende buffer, f.eks. gede-anti-rotte Alexa Fluor 555 og gede-anti-kanin Alexa Fluor 647 ved 1:1.000 fortynding. Forbered den sekundære antistofblanding frisk for hvert immunstainerende forsøg.
    3. Forsegl pladen med parafilm for at forhindre fordampning under inkubation. Inkuber prøverne ved stuetemperatur i mørke eller i plader dækket med aluminiumsfolie med blid omrøring i 3 dage.
      BEMÆRK: Dette trin og alle efterfølgende trin finder sted i mørke eller med aluminiumsfoliefolie.
  7. Dag 11
    1. Aspirer den sekundære antistofblanding og udfør en indledende vask med 1 ml vaskebuffer. Rock forsigtigt pladerne i et par sekunder for at skylle de resterende sekundære antistoffer væk.
    2. Aspirer vaskebufferen, udskift den med 0,8 ml frisk vaskebuffer, og inkuber prøverne ved stuetemperatur i 2 timer med omrystning, beskyttet mod lys. Gentag vasketrinnet 2 gange for i alt 3 vaske. Efter den tredje vask skal du fortsætte til rydningstrinnet (afsnit 6).

6. Rydning af immunplettede helmonterede æggestokke (figur 2A).

BEMÆRK: Udfør alle rydningstrin i mørke ved at pakke pladerne ind i aluminiumsfolie eller placere dem i uigennemsigtige beholdere. Clearingtrinnene er forskellige for præpubertale og pubertale æggestokke.

  1. Dag 11 [Prænatal og præpubertal æggestokke ryddes i en et-trins protokol]
    1. Efter den sidste vask aspireres vaskepufferen, og den udskiftes med 0,8 ml frisklavet ScaleS4(0)-opløsning (se tabel 1 og punkt 1). Forsegl pladen med parafilm og inkuber prøverne i mørke med omrystning ved stuetemperatur i tre til fire dage før billeddannelse.
    2. Udskift ScaleS4(0)-opløsningen med en frisk opløsning dagligt, hvis det er nødvendigt. Vær forsigtig, mens du udskifter løsningerne, da ryddede æggestokke bliver gennemsigtige og er vanskelige at se. Efter rydning fortsættes til prøveopsætning og billeddannelse (afsnit 7).
      BEMÆRK: Ændring af løsninger forbedrede ikke billedkvaliteten væsentligt. Daglige ændringer øger sandsynligheden for at miste små og for det meste gennemsigtige prøver.
  2. Dag 11-15 [Pubertetsæggestode ryddes i en totrinsprotokol]
    1. Efter den sidste immunstaineringsvask aspireres vaskebufferen og udskiftes med 0,8 ml ScaleCUBIC-1 (se tabel 1 og pkt. 1). Forsegl pladen med parafilm og ryst forsigtigt prøverne ved 37 °C i 3 dage i mørke. Udskift ScaleCUBIC-1-opløsningen med den friske opløsning dagligt.
    2. På dag 15 vaskes prøverne 3 gange i 10 minutter hver gang i 0,8 ml PBS ved stuetemperatur med blid omrystning. Udskift PBS med 0,8 ml afgasset 20 % saccharose tilberedt frisk med PBS. Ryst forsigtigt ved stuetemperatur i 1 time.
    3. Udskift 20 % saccharoseopløsningen med 0,8 ml ScaleCUBIC-2-opløsning (se tabel 1 og punkt 1), forsegl pladen med parafilm, og ryst forsigtigt ved stuetemperatur med daglige ændringer af ScaleCUBIC-2-opløsningen. Ryd i 4-5 dage og fortsæt til billedet. Vær forsigtig, når du udveksler løsninger for at undgå tab af prøver, da ryddede æggestokke er gennemsigtige og vanskelige at se. Fortsæt til prøveopsætning og billeddannelse (afsnit 7).

7. Prøveopsætning og billeddannelse med et multifotonmikroskop

BEMÆRK: Alle nedenstående trin blev udført med en Leica DIVE/4TUNE/FALCON med to justerbare tilstandslåste Ti:Sapphire multifotonlasere med en pulsvarighed på 120 fs med et mål med flere nedsænkninger på 16x/NA0,6 (nedsænkningsvæske = glycerol) med en maksimal arbejdsafstand på 2,2 mm. Se tabellen over materialer for at få flere oplysninger om billedoptagelsessoftwaren. Supplerende tabel S1 og supplerende figur S1 viser de indstillinger, der er anvendt til denne protokol. For andre billedbehandlingsplatforme skal du rådføre dig med mikroskopikernen eller følge producentens specifikationer/anbefalinger.

  1. Eksempel på opsætning
    1. Forbered opsætningen til montering af prøverne. Brug for eksempel en klæbrig og fleksibel silikonepakning til at skabe en klæbende brønd. Placer klæbemiddelbrønden på en 25 mm x 25 mm nr. 1.5 mikrodæksler for at skabe en brønd, hvor æggestokkene placeres (figur 2B).
      BEMÆRK: En pakning med en tykkelse på 1 mm rummer alle størrelser af æggestokke. Denne opsætning anbefales, da den eliminerer ovariebevægelse under billeddannelse, hvilket kan forekomme, når æggestokke placeres i monteringsmiddel i en glasbundsskål.
    2. Brug en pipettespids med spidsen afskåret (20 μL for prænatal og præpubertal) til at overføre æggestokkene med ~5-10 μL ScaleS4(0) opløsning til midten af klæbemidlet som vist i figur 2B. Til pubertetsæggestode skal du bruge en 200 μL pipettespids med spidsen afskåret langt nok til at overføre æggestokkene. Tilsæt ~15-20 μL af ScaleCUBIC-2-opløsningen i midten af klæbebrønden.
      BEMÆRK: For meget løsning kan forårsage lækage på mikroskopscenen, og for lidt løsning vil resultere i dårlig billedkvalitet. Brug et dissektionsmikroskop til at overføre prøver, da ryddede æggestokke bliver gennemsigtige og er vanskelige at se.
    3. Når æggestokkene er overført til individuelle brønde med en dråbe clearingopløsning, skal du forsigtigt placere et andet dækglas på klæbemiddelbrønden, trykke for at skabe en tætning og holde prøverne på plads i en lille pulje af clearingopløsning klemt mellem de to dæksler (figur 2B). Til billeddannelse skal du placere coverlip "sandwich" i et 3D-trykt mikroskopadapterdias (f.eks. 43 ).
      BEMÆRK: Selvklæbende brønde kan genbruges efter dekonstruktion af "sandwich" og vask med vand.
  2. Billeddannelse (supplerende tabel S1 og supplerende figur S1)
    1. Tænd mikroskopet og softwaren i henhold til retningslinjerne fra mikroskopikernen eller producenten. Placer de monterede prøver på mikroskoptrinnet, og kig gennem okularet for at finde prøven, der er oplyst med en LED-fluorescenslampe med lav effekt.
    2. Når prøverne er placeret, skal du tænde laseren (e) og tildele hver detektor til et specifikt Alexa Fluor-farvestof / markør. For flere lasere skal du give mulighed for sekventiel billedoptagelse. Anskaf hele stakken, inden du skifter laser.
      BEMÆRK: Til denne protokol blev en laser brugt til billedoptagelse af både 555 nm og 647 nm fluoroforer.
    3. Konfigurer parametrene for billedoptagelse i henhold til mikroskopikernens eller producentens specifikationer. Brug tovejs billedoptagelse, hvis det er tilgængeligt, til at reducere scanningstiden og forbedre effektiviteten. Juster andre indstillinger, herunder linjegennemsnit (1), billedgennemsnit (1) og rammeakkumulering (1).
      BEMÆRK: Tovejs billedoptagelse gør det muligt for lasere at scanne i begge retninger, når de bevæger sig på X-aksen.
    4. Konfigurer Z-Stack ved at identificere begyndelsen (bunden af prøve-/bundglasdækslet) og slutpositionen (toppen af prøven/det øverste glasdæksel). Vælg en Z-trinstørrelse på 2 μm for præpubertale æggestokke og 5 μm for pubertetsæggestogestode.
    5. Aktivér Z-kompensationsfunktionen, og aktiver excitationsgevinsten inden for denne funktion. Indstil Z-kompensationen for bunden og toppen af prøven ved at vælge en laserintensitet for både den nederste (lav intensitet) og den øverste stak (høj intensitet). Se supplerende figur S1, Lineær Z-kompensation, hvor excitationsgevinstboks er valgt, og laserintensitet for bund (0) og top (347,75) er indstillet til henholdsvis 10 og 12.
    6. Brug flisetilstanden til større eksempler, der ikke kan hentes i et enkelt synsfelt. Aktivér billednavigatoren, og angiv antallet af felter, der er nødvendige for at fange hele prøven ved hjælp af det rektangulære markeringsværktøj.
    7. Start billedoptagelsen. For billeder med flere felter skal du starte billedoptagelse med navigatoren for at fange alle felter. Når billedoptagelsen er fuldført, skal du først gemme alle billeder, og hvis der blev erhvervet flere felter, skal du derefter køre mosaikfletningsværktøjet for at flette felterne til et enkelt billede.
    8. Gem de flettede filer i en separat projektmappe for at gøre det nemmere at arbejde med billeder i Gigabyte-størrelse. Overfør filerne til billedbehandling med 3D-billedvisualiserings- og analysesoftware. Figur 3 viser repræsentative billeder taget på forskellige stadier med to markører (GCNA og DDX4).

8. Billedbehandling

BEMÆRK: Alle trin beskrevet nedenfor blev udviklet og udført ved hjælp af IMARIS 3D-billedvisualiserings- og analysesoftware.

  1. Importer billedet/billederne til 3D-billedvisualiserings- og analysesoftwaren, og konverter om nødvendigt filerne fra det oprindelige format (f.eks. .lif, .czi, .lsm, .lei, .oib, .oif, .nd2) til .ims-formatet.
  2. Hvis det er nødvendigt, skal du behandle billederne med det gaussiske filter for at reducere pixeleringen (figur 4A). Brug 3D-visningsfunktionen til at placere billedet og fravælge rammeindstillingen (for at fjerne rammen).
    BEMÆRK: Der er andre valgfrie filtre, der også kan bruges til at reducere pixelering og reducere baggrundsintensiteten.
  3. Forstør billedet til en bestemt skala, og brug funktionen Snapshot. Indstil indstillingerne på følgende: Vælg 300 DPI, gem som TIFF-billede og Gennemsigtig baggrund. Tag et øjebliksbillede af billedet, og gem det. Figur 3 viser komplette samlede billeder.

9. Oocytkvantificering

BEMÆRK: Hele ovarieimmunfluorescens og 3D-billedvisualisering og -analyse kan bruges til estimering af oocyttal i hele æggestokke (figur 3 og figur 4) ved hjælp af Spot-funktionen. GCNA-signalet kan bruges til at kvantificere oocytter i prænatale og præpubertale æggestokke, som vist i figur 4 (P5). I pubertetsæggestokke skal du bruge DDX4-signalet til at kvantificere to oocytpopulationer i ikke-voksende follikler ("ringlignende" struktur, lukket pil) og voksende follikler (store strukturer, åben pil, figur 4, P28).

  1. Bestem størrelsen af oocytter, der skal bruges som parameter til at kvantificere oocytter med funktionen Spots i trin 9.2.
    1. Åbn billedet, og vælg indstillingen Udsnit for at åbne Z-stack-billedet.
    2. Vælg indstillingen Linje i panelet Mål , og mål afstanden ved at tegne en linje fra den ene kant af en oocyt/markør til den anden kant på det bredeste punkt for at bestemme XY-diameteren for den oocyttype/-størrelse, der skal tælles. Flyt gennem stakken og få området af diametre til flere oocytter af samme type. Brug den korteste længde som størrelsesudvælgelseskriterium for oocyttællinger.
  2. Spots-funktion : Vælg indstillingen 3D-visning, og aktiver funktionen Tilføj nye pletter i panelet Scene for at åbne panelet Algoritme . Fravælg alle algoritmeindstillingerne, da filteret til valg af størrelse med den oocytstørrelse, der er opnået i trin 9.1, vil blive brugt.
    1. Klik på den enkelte pil fremad for at flytte til kildekanalen. Vælg kanalen med den foretrukne markør, og indtast den estimerede XY-diameter , der er opnået i trin 9.1. Brug for eksempel en estimeret XY-diameter på 7 μm for prænatale oocytter og 11 μm for P5-oocytter (GCNA = grønt signal; Figur 3 og figur 4A).
    2. Brug 30 μm til DDX4-signalet til at estimere antallet af oocytter i voksende follikler i P5 æggestokke (DDX4 = magenta signal; Figur 3 og figur 4A). For pubertale æggestokke skal du bruge DDX4-signalet til oocytkvantificeringer. Brug f.eks. XY-diametre på 15 μm og 80 μm til at identificere oocytter i henholdsvis ikke-voksende follikler og voksende follikler som vist i figur 4A.
      BEMÆRK: Den valgte størrelse kan variere på grund af billedoptagelseskriterier og den anvendte type mikroskop. Selektionen kan også variere mellem genetiske stammer, da æggestokke med flere oocytter vil kræve mindre størrelsesvalg for bedre automatiseret oocytdetektion.
    3. Efter valg af størrelse skal du aktivere Model PSF-forlængelse og baggrundssubtraktion, som automatisk bestemmes. Vælg den enkelte pil fremad for at flytte til panelet Filtrer pletter . Tilføj filteret Kvalitet, og bestem en tærskel. For at sikre en nøjagtig estimering af oocyttal skal du forstørre billedet, når tærsklen justeres, for at vælge en tærskelværdi, der vælger de fleste oocytter. Klik på dobbeltpilen for at afslutte automatiserede optællinger.
    4. Kontroller manuelt de valgte oocytter ved hjælp af fanen Rediger for at vælge ubesvarede oocytter eller fravælge ikke-oocytpartikler valgt af den automatiske tærskel. Registrer dataene under fanen Statistik under fanen Samlet for yderligere analyse.
      BEMÆRK: De parametre, der bruges til at tælle pletterne, kan gemmes og bruges til et andet prøvesæt, men det anbefales at foretage en manuel kontrol, før du kører batchanalyse.
    5. For at gemme parametrene skal du klikke på fanen Oprettelse og klikke på Gem parametre for batch.
      BEMÆRK: Nukleare markører (GCNA+ oocytter, figur 4A) identificeres let ved hjælp af spotfunktionen og kræver muligvis ikke meget manuel justering. Den cytoplasmatiske markør (DDX4+ oocyt, figur 3 (P28, lukket pil) og figur 4A) vil imidlertid kræve mere manuel justering for at sikre identifikation af den korrekte størrelse/type oocytter.

10. Kvantificering af proteinekspression i æggestokke

BEMÆRK: Der er flere måder at kvantificere oocytekspression af specifikke markører ved hjælp af både funktionen Spots (afsnit 9 og trin 10.1) og Surfaces-funktionen (trin 10.2). Spots-funktionen kan bruges til proteiner med forskellige lokaliseringsmønstre såsom nukleare markører (GCNA), og Surfaces-funktionen kan bruges til proteiner med ikke-ensartede lokaliseringsmønstre som vist i figur 5A , hvor LINE-1 ORF1p-intensiteter i E15.5 og E18.5 æggestokke blev målt. For at beregne og sammenligne intensiteten af det protein, der er af interesse mellem to prøver (f.eks. Tidspunkter, behandlinger eller genotyper), skal du indsamle billeder med de samme egenskaber. Brug prøver med et mere intenst signal til at bestemme de parametre, der kan gemmes og bruges til de andre prøver.

  1. For at opnå proteinekspressionen med Spots-funktionen skal oocytter først identificeres som fremhævet (afsnit 9).
    1. Vælg derefter fanen Statistik under funktionen Pletter efterfulgt af fanen Detaljeret. Klik på pil ned, og vælg Specifikke værdier, som åbner en anden fane under den, der indeholder forskellige målinger. Vælg intensitetsgennemsnittet for den kanal, der bruges til overfladegenereringen (eller vælg andre intensitetsmålinger, f.eks. intensitetsmedianen).
    2. Hvis du vil have de kombinerede/gennemsnitlige statistiske oplysninger, skal du vælge kriteriet Gennemsnitsværdier . Når det er gjort, skal du eksportere og gemme data til yderligere analyse.
  2. Hvis du vil have proteinudtrykket med funktionen Overflader , skal du åbne billedet, vælge indstillingen 3D-visning og aktivere funktionen Tilføj nye overflader i panelet Scene for at åbne panelet Algoritme . Fravælg alle algoritmeindstillingerne, hvis det ikke er nødvendigt, og klik på den enkelte pil fremad for at flytte til kildekanalen.
    1. Vælg den kanal med antistofsignalet, der skal måles. Andre egenskaber, der skal vælges, er brugerspecifikke indstillinger. Her blev LINE-1-signalet brugt som markør. Værdierne Surfaces Detail og Background Subtraktion (Local Contrast) blev holdt på standardværdierne på henholdsvis 1,42 og 5,33.
    2. Klik på pilen fremad for at flytte til panelet Tærskel . Vælg en tærskelværdi, der er sammenlignelig i begge prøver (f.eks. her blev LINE-1-udtrykket i E18.5 brugt til at vælge en tærskel). Vælg Aktivér med en standarddiameter på 7,10 (denne værdi blev fundet optimal for billederne, men kan afhænge af den forventede pixelstørrelse af funktioner).
    3. Klik på pilen fremad for at flytte til panelet Filteroverflader . Brug et kvalitetsfilter blev anvendt, og basere værdien, som med tærskelværdien , på ekspressionen af proteinerne i begge ovarieprøver. Når filteree egenskaben er valgt, skal du klikke på den dobbelte pil fremad for at afslutte genereringen af overfladen.
    4. For at få intensitetsværdierne skal du vælge fanen Statistik efterfulgt af fanen Detaljeret . Klik på pil ned , og vælg Specifikke værdier, som åbner en anden fane under den, der indeholder forskellige målinger.
    5. Vælg intensitetsgennemsnittet for den kanal, der bruges til overfladegenereringen (eller vælg andre intensitetsmålinger, f.eks . intensitetsmedianen).
    6. Hvis du vil have de kombinerede/gennemsnitlige statistiske oplysninger, skal du vælge kriteriet Gennemsnitsværdier . Når det er gjort, skal du eksportere og gemme dataene til yderligere analyse (figur 5C).

11. Estimering af det samlede oocyttal i beskadiget æggestok med beregningsmæssig korrektion

BEMÆRK: Hvis der opstår en mindre ovarieskade under dissektion, kan det være muligt beregningsmæssigt at estimere det samlede oocytantal. Det anbefales at anvende intakte æggestokke fra samme stamme og udviklingsstadium til estimering af oocytantal som vist i figur 6. Simuleringer udført med æggestokke ved E15.5 indikerer, at korrigering for et tab på ≥30% resulterer i en signifikant afvigelse fra de faktiske tal (figur 6C).

  1. Åbn billeder af intakte æggestokke med IMARIS, og vælg funktionen Frame . Under Rammeindstillinger skal du markere etiketterne Boks, Gitter, Markeringer og Akse . Under fanen Position X/Y/Z skal du vælge 200 μm for at generere flueben med 200 μm mellemrum i alle X/Y/Z-positioner.
    BEMÆRK: Fluebenene opretter et gitter / lineal i X-, Y- og Z-planer for at identificere oocytter inden for et bestemt område.
  2. Aktivér funktionen Spots for at identificere oocytterne som fremhævet i afsnit 9 (figur 4). Opret en 3D-model ved hjælp af de oocytter, der er identificeret i alle intakte æggestokke, der bruges til simuleringen, ved at vælge Kugle under fanen Punktstil/kvalitet i funktionen Pletter .
    BEMÆRK: Pixelbredden kan også ændres under fanen Punktstil/-kvalitet .
  3. Med den boks, der genereres i trin 11.1, skal du justere 3D-modellerne af de intakte æggestokke i samme retning som vist i figur 6A.
  4. Brug 200 μm-flueben (trin 11.1) til at vælge oocytter, der falder inden for 50% af volumenet af hver æggestok. Klik på funktionen Pletter , og vælg Rediger etiketter for at klassificere de oocytter, der falder inden for 50% -området efter farve, som vist i figur 6A.
    BEMÆRK: Når oocytter er klassificeret i en region, vil antallet af oocytter, der falder inden for hver klasse, blive angivet.
  5. Zoom ind på 50% -området, og skift flueben fra 200 μm til 50 μm for at lave en mindre lineal til oocytidentifikation. Bevar zoomprocenten i alle billeder. Med 50 μm-flueben som vejledning skal du opdele 50% -regionen i fem lige store dele.
    BEMÆRK: Oocytter inden for hver del vil repræsentere 10% af volumenet som fremhævet i figur 6A, hvor en intakt æggestok viser oocytter i den øverste halvdel af æggestokken klassificeret efter fem forskellige farver, hvor hver farve repræsenterer oocytter inden for et 10% volumetrisk område.
  6. Optag oocyttallene i hver 10 % region som vist i figur 6A,B. Beregn det gennemsnitlige antal oocytter for trin på 10, 20, 30, 40 og 50%.
  7. Brug det fremhævede i trin 11.1 til 11.6 for at opnå oocyttal i den beskadigede partielle æggestok. Placer den beskadigede æggestok i samme retning som de intakte æggestokke, og vurder manglende volumen/procentdel som beskrevet ovenfor.
  8. For at estimere det samlede oocytantal i hele æggestokken skal du tilføje det gennemsnitlige antal oocytter beregnet for et lignende volumen som det antal, der er opnået fra den delvise æggestok (figur 6B).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Immunstaining og billeddannelse af hele æggestokken muliggør visualisering og kvantificering af oocytter eller proteinekspression i æggestokke på forskellige udviklingsstadier ved hjælp af samme teknik og markører (figur 3). Denne protokol blev udviklet til et stort projekt, hvor analyse af æggestokke i flere faser og fra flere musestammer var påkrævet. Her præsenterer vi data indsamlet for C57BL6/J-stammen, en standardstamme til genetisk analyse. Teknikken, der præsenteres her, er ligetil, resultater kan opnås inden for 14-19 dage (figur 2D) og kan bruges til æggestokke fra prænatale, præpubertale og pubertale kvinder (figur 1 og figur 2A, B).

Denne tilgang blev brugt til at studere dynamikken i oocyttabet, der forekommer naturligt under dannelsen af ovarie oocytreserven. I mange organismer, herunder musen, menes oocyttal at toppe i fosterlivet omkring det tidspunkt, hvor oocytter kommer ind i meiose ~ E13.5. Oocyttal falder på grund af den stadig ikke fuldt forståede proces med føtal oocytslidning (FOA) (fra ~ E15.5 til E18.5), som er mekanistisk forbundet med ekspressionen af retrotransposon LINE-120,21. Flere oocytter elimineres efter E18.5 til P0 på grund af eliminering af unormale oocytter ved et meiotisk kvalitetskontrolpunkt 22,23. For at undersøge disse processer ved hjælp af denne protokol immunfarvede og afbildede vi æggestokke på forskellige udviklingsstadier ved hjælp af DDX4 og GCNA som oocytmarkører som vist i figur 3.

Små oocytter, der udtrykker GCNA og DDX4, ses fra E15.5 og fremefter, og de repræsenterer oocytter under MPI eller arresteret ved diktat inden for oprindelige follikler. Større voksende oocytter med stærk DDX4-ekspression påvises allerede i P2-æggestokke, hvor de sandsynligvis repræsenterer den første bølge af follikler44. Et stigende antal større oocytter ses i P5 og P28 æggestokke. Billeder opnået ved multifotonmikroskopi (figur 4A) blev behandlet ved hjælp af IMARIS-software, og 3D-gengivelse blev udført for at identificere små og større voksende oocytter baseret på det nukleare GCNA-signal og størrelsen afgrænset af DDX4-signalet (figur 4A og video 1). Oocytter blev talt som beskrevet i protokollen, og resultaterne er opsummeret i figur 4B. I overensstemmelse med tidligere undersøgelser observerede vi et signifikant oocyttab fra E15,5 til E18,5 (~ 32%) og E18,5 til P2 (~ 24%). Når kvinder når puberteten (P28), har kun ~ 30% af oocytterne til stede ved E15.5 overlevet.

Denne metode kan også bruges til at observere konsekvenserne af genotoksiske behandlinger såsom bestråling, som har vist sig fuldstændigt at eliminere den oprindelige follikelreserve inden for en uge 23,38,45. En signifikant visuel forskel er tydelig mellem hele æggestokken behandlet med stråling og den ubehandlede kontrol i figur 3 (sammenligning af P28 æggestokke fra behandlede og ubehandlede hunner). I P28-æggestokken uden strålingseksponering observerede vi to oocytpopulationer mærket med DDX4; rigelige små oocytter i primordiale follikler (lukket pil); og større oocytter af forskellig størrelse, der typisk findes i voksende follikler (f.eks. Primær, sekundær og preantral) (figur 3). I modsætning hertil er æggestokken fra en kvinde udsat for 0,5Gy γ-stråling ved P7 fuldstændig blottet for små oocytter i primordiale follikler som tidligere observeret i 2D-sektioner. Interessant nok overlevede kun større oocytter af samme størrelse stråling; disse kan være de første bølgefollikler, der allerede vokser i P7-æggestokken, da de vides at være resistente over for stråling46 (figur 3, P28).

Ud over kvantificeringen af oocyttal kan denne protokol anvendes til immunstaining og kvantitative analyser af andre proteiner, der er involveret i oocytudvikling. For eksempel brugte vi antistoffer mod LINE-1ORF1p-protein, et RNA-bindende chaperonprotein, produceret af LINE-1 retrotransposoner (figur 5). Forøgelse af mængden af LINE-1-elementer fra E15.5 til E18.5 er blevet foreslået for at forårsage oocyteliminering20,21. Ved hjælp af multifoton-optagne billeder og signalintensitetsanalyse i IMARIS blev LINE-1 ORF1p-niveauer observeret at stige signifikant i oocytter i løbet af denne tid, hvilket korrelerer med et signifikant fald i oocyttal som vist i figur 4B.

Under omstændigheder, hvor en del af en æggestok er beskadiget eller går tabt, kan æggestokke fra samme stamme og udviklingsstadium anvendes til beregningsmæssigt at estimere antallet af oocytter i det manglende område som vist i figur 6. Data fra E15.5 æggestokke blev brugt til simuleringer for at teste nøjagtigheden af beregningsmæssige korrektioner. Oocytter i æggestokke med op til 30% vævsskade kan beregningsmæssigt anslås at have ≤10% afvigelse sammenlignet med oocytter i en intakt æggestok, hvilket tyder på, at 3D-ovariefarvning og modellering effektivt kan bruges til at redde data fra dyrebart væv. Simuleringer udført med æggestokke ved E15.5 indikerer, at korrigering for et tab på ≥30% resulterer i en signifikant afvigelse fra de faktiske tal (figur 6C).

Figure 1
Figur 1: Ovariedissektion og perfusion fra kvinder fra prænatale og postnatale stadier. (A-C) Æggestokdissektion fra forskellige stadier kræver forskellige teknikker, som er afbildet skematisk for at supplere beskrivelserne i videoen. (D) Æggestokke på postnatal dag 5 (P5) er meget mindre end ved P28, hvilket nødvendiggør en anden clearingprotokol som beskrevet i protokollen. (E,F) Korrekt perfusion af æggestokkene er vigtig for at eliminere baggrundsfarvning fra røde blodlegemer. Ikke-perfuserede reproduktive kanaler og æggestokke har lyserød nuance, mens perfusionerede organer bliver hvide. Forkortelse: RI = ikke-perfuserede reproduktive kanaler. Billeder A-C blev oprettet med BioRender.com. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 2
Figur 2: Immunstaining, clearing og billeddannelse af hele museæggestokke. (A) Flowdiagram viser delte og specifikke trin til immunsåbning og clearingprotokol for prænatal / præpubertal og pubertal æggestokke. (B) Ryddede æggestokke monteres i en dråbe clearingopløsning midt i en klæbende brønd klemt inde mellem to dæksedler. Til billeddannelse placeres de monterede prøver i et 3D-printet adapterdias. (C) Gråtonebilleder af multifotonbilleder af ikke-perfuserede vs. perfuserede æggestokke, immunfarvede med oocytmarkøren DDX4, der viser forbedret billedkvalitet og lavere uspecifik farvning efter perfusion. Den lukkede pil angiver en oocyt med et tyndt lag cytoplasmatisk DDX4-farvning, der er typisk for primordiale follikler, og de åbne pile viser større oocytter inden for voksende follikler. Stjerne indikerer autofluorescens fra blodkar. (D) 3D-gengivelser fra konfokale vs. multifotonbilleder af P5-æggestokke, immunfarvede med oocytmarkører GCNA (grøn) og DDX4 (magenta), der viser en signifikant sfærisk aberration fra konfokalmikroskopi og stort set ingen fra multifoton. Skalabjælker = 100 μm (C, D) og 50 μm (indsætninger i D). Forkortelser: GCNA = kimcelle nuklear sur peptidase; DDX4 = DEAD-box helicase 4. Billede A blev oprettet med BioRender.com. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 3
Figur 3: Repræsentative 3D-gengivne billeder af æggestokke i forskellige udviklingsstadier. 3D-gengivelser fra multifotonbilleder af hele monteringsæggestokke, der er immunfarvet med GCNA (grøn) og LINE-1 ORF1p (blå) eller DDX4 (magenta), i henholdsvis prænatale og postnatale æggestokke. Individuelle kanaler præsenteres i gråtoner for at vise nukleare og cytoplasmatiske signaler. De hvide felter skitserer områder, der er forstørret i venstre nederste indsat. To forskellige æggestokke er vist for P28. Æggestokken fra den kontrollerende ikke-bestrålede hun (øverst) indeholder en stor population af små oocytter i primordiale follikler (se inset). I modsætning hertil er æggestokken fra hunnen bestrålet ved P7 med 0,5 Gy γ-stråling (IR) fuldstændig blottet for små oocytter i primordiale follikler (se inset). Den lukkede pil angiver en oocyt med et tyndt lag cytoplasmatisk DDX4-farvning, der er typisk for primordiale follikler, og åbne pile viser større oocytter inden for voksende follikler. Skalastænger = 100 μm; 30 μm for P28-indsætninger; 10 μm for alle andre indsætninger. Indsat indeholder forstørrede visninger af 3D-gengivne billeder, der er genereret i IMARIS, og kan afvige lidt fra billeder med lav forstørrelse på grund af perspektiv. Forkortelser: Ikke-IR = kontrol ikke-bestrålet; IR = bestrålet ved P7 med 0,5 Gy γ-stråling; GCNA = kimcelle nuklear sur peptidase; DDX4 = DEAD-box helicase 4; LINE-1 = langt spredt nukleart element-1. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 4
Figur 4: Billedbehandling, 3D-visning af oocytter og kvantificeringsresultater. (A) 3D-gengivelser fra multifotonbilleder (til venstre) blev behandlet i IMARIS ved hjælp af gaussisk filter (midten), og oocytter af små og store størrelser blev identificeret ved hjælp af spotfunktionen (højre). P5 og P28 æggestokke vist som eksempel. Skalastænger = 100 μm (P5); 10 μm (P5-indsætninger); 300 μm (P28); 50 μm (P28-indsætninger). (B) Små oocytter, der var positive for GCNA, blev kvantificeret i æggestokke fra forskellige stadier ved hjælp af spotegenskaber (øverst). For at illustrere det faldende antal oocytter under udviklingen blev den gennemsnitlige % af oocytter beregnet på hvert trin sammenlignet med det gennemsnitlige antal, der var til stede i det tidligste stadium, talt ved E15,5 (nederst). Bemærk det store fald i oocyttal fra E15.5 til E18.5. Statistisk ±e analyser blev udført ved hjælp af GraphPad Prism-software og analyseret af envejs ANOVA, og betydningen blev bestemt af Bonferronis post-hoc multiple sammenligningstest. * P ≤ 0,05; P ≤ 0,0001; ns >0,05. Forkortelse: GCNA = kimcelle nuklear sur peptidase; ns = ikke signifikant. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 5
Figur 5: Påvisning og kvantificering afLINE-1 ORF1p-ekspression i føtale oocytter. (A) 3D-gengivelser fra multifotonbilleder viser LINE-1 ORF1p (blå) udtryk i E15.5 og E18.5 føtale oocytter (markeret med grøn GCNA). (B) 3D-overflader genereret i IMARIS ved hjælp af billeder i øverste række i panel A. (C) LINE-1 ORF1p intensitetsanalyse viser højere ekspression af LINE-1 ORF1p pr. oocyt ved E18.5 end E15.5. Skalastænger = 100 μm; 10 μm (panel A-indsætninger); 30 μm (panel B-indsætninger). Data præsenteres som midler ± SD. Statistiske analyser blev udført ved hjælp af GraphPad Prism-software og analyseret af Student's t-test, og betydningen blev bestemt af Mann-Whitney U-test. P ≤ 0,0001; ns >0,05. Forkortelser: GCNA = kimcelle nuklear sur peptidase; LINE-1 = langt spredt nukleart element-1. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 6
Figur 6: Metode til estimering af det samlede oocyttal i beskadigede ovarieprøver med beregningsmæssig korrektion. (A) Model af GCNA-positive (grønne) E15,5 oocytter med fem 10% regioner fremhævet i rød, blå, grå, magenta og brun i en intakt æggestok. Hvert efterfølgende billede, efter den intakte æggestok, repræsenterer en simuleret æggestok med 10% trinvise regioner, der mangler op til 50%. (B) Skematisk beregningsmetode til estimering af oocytantal i beskadiget prøve. (C) Det samlede oocyttal i simulerede æggestokke blev sammenlignet med tallene i de oprindelige intakte æggestokke (betragtes som 100 %), og forskellen præsenteres som %-afvigelse. Simulering fra seks individuelle æggestokke med 10-50% volumen mangler. Skalastænger = 80 μm. Forkortelse: GCNA = kimcelle nuklear sur peptidase. Klik her for at se en større version af denne figur.

Video 1: 3D-gengivelse og 3D-modellering af oocytter i P5 æggestokke.

Løsninger og buffere Reagens(er) Sammensætning
Fiksativ Paraformaldehyd 4% (v/v)
Permeabiliseringsbuffer Polyvinylalkohol (PVA) 0,2% (w/v)
Natriumborhydrid 0,1% (w/v)
Triton X-100 1,5% (v/v)
Blokering af buffer Bovin Serum Albumin (BSA) 3% (m/v)
1 M glycin (pH 7,4) 2% (m/v)
Triton X-100 0,1% (v/v)
200x Penicillin-Streptomycin 1% (v/v)
10% Natriumazid 0,2% (v/v)
ged serum 10% (v/v)
Vaskebuffer PVA 0,2% (w/v)
Triton X-100 0,15% (v/v)
10% Natriumazid 0,1% (v/v)
ScaleS4(0)-opløsning (pH 8,1) D-Sorbitol 40% (m/v)
Urinstof 24% (w/v)
Glycerol 10% (v/v)
DMSO 20% (v/v)
ScaleCUBIC-1-opløsning Urinstof 25% (w/v)
N,N,N′,N′-Tetrakis(2-hydroxypropyl)ethylendiamin 25% (v/v)
Triton X-100 15% (v/v)
Saccharose opløsning Saccharose 20%(w/v)
ScaleCUBIC-2-opløsning Saccharose 50% (w/v)
Urinstof 25% (w/v)
Triethanolamin 10% (m/v)
Triton X-100 0,1% (v/v)

Tabel 1: Opløsninger og buffere.

Supplerende figur S1: Præferencer for billedoptagelse. Klik her for at downloade denne fil.

Supplerende tabel S1: Indstillinger for billedanskaffelse. Klik her for at downloade denne tabel.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Denne artikel præsenterer en detaljeret 3D-immunstainerings- og billeddannelsesprotokol for prænatale og postnatale æggestokke til høj gennemstrømning og komparative undersøgelser til kimcellekvantificering og proteinlokalisering. Vi udviklede denne protokol til at analysere oocyttal i æggestokke (N = 6-12) på seks udviklingstidspunkter i 10-16 forskellige stammer, hvor 2-4 24-brøndsplader typisk behandles ad gangen. Denne metode kan tilpasses andre organer eller cellulære markører. For eksempel kan denne protokol bruges til at mærke og visualisere somatiske celler, såsom granulosaceller i æggestokken, ved hjælp af passende antistoffer, hvilket letter undersøgelser af somatisk-kimcelleinteraktioner eller udvikling af andre ovariecelletyper.

En begrænsning af denne protokol og antistofkombination er den endelige identifikation af forskellige follikulære stadier. DNA-pletter, der anvendes i immunofluorescens og 2D-billeddannelse til at identificere follikulære stadier af lag af granulosacellekerner, er utilstrækkelige til 3D-tilgange. 4′,6-diamidino-2-Phenylindole (DAPI) eller Hoechst anvendes sjældent til farvning af hele organer på grund af begrænset lysindtrængning og henfaldende signal midt i stort væv. Propidiumiodid (PI) er et lille molekyle, der er i stand til at trænge dybt ind i vævet, men er vanskeligt at fange på multifotonbilleddannelsessystemet på grund af spektral overlapning. Bedre opløsning af follikulære stadier kan opnås ved yderligere markører, der er specifikke for granulosaceller, såsom anti-mullerisk hormon (AMH) eller FOXL247,48. Men selvom disse markører er nyttige til at differentiere større voksende follikler, vil de ikke skelne primordial fra primære follikler. Indtil specifikke markører for disse tidlige stadier bliver tilgængelige, tilbyder oocytmarkører som DDX4 eller GCNA den bedste indikator for follikeludvikling. Desuden virker denne protokol for prænatale mandlige gonorder, men er endnu ikke blevet testet i postnatal testiklerne, hvor dens størrelse kan være den begrænsende faktor. Kritiske spørgsmål er anført nedenfor for bedre visualisering og kvantificering af kimceller i æggestokke af varierende størrelse, og de teknikker og skridt, der er taget for at sikre immunstaining af god kvalitet til downstream-analyse, fremhæves.

Det første kritiske skridt er at forhindre skade på æggestokkene før og efter fiksering. Beskadigede æggestokke kan mangle dele af organstrukturen, hvilket påvirker oocyttallene og skævvrider forsøgsresultaterne. For at forhindre skade efterlades ekstra somatisk væv fastgjort til den større æggestok efter dissektion for at få fat i tang til overførsel af æggestokkene. For mindre æggestokke undgår man desuden skader ved at overføre dem med en pipettespids, der er skåret bredt nok til, at æggestokkene let kan passe ind i spidsen. Hvis mindre vævsskader resulterer i, at en del af æggestokken mangler, kan den afhjælpes ved hjælp af en beregningsmetode, hvor det samlede oocyttal i den beskadigede prøve kan ekstrapoleres ved hjælp af intakte prøver af samme type (figur 6).

Beregningssimuleringer afslørede imidlertid, at nøjagtigheden af forudsigelsen mindskes med stigende størrelse af det beskadigede område (100,8% ± 0,2, 97,2% ± 1,5 og 90,3% ± 1 for henholdsvis 10, 20 og 30% skade, figur 6C). Baseret på simuleringer anbefaler vi, at prøver med >30% tab udelukkes fra analysen. Flere intakte æggestokke fra samme prøvetype blev brugt til at beregne det gennemsnitlige antal oocytter i området svarende til det, der manglede i beskadiget prøve. Dette tal blev derefter brugt til at forudsige det samlede antal oocytter i æggestokken med skade. Brug af et areal af samme størrelse i samme æggestok, der støder op til det manglende område, kan anvendes som et alternativ, men blev ikke testet.

Et andet problem er at undgå at forurene celler, der kan forårsage autofluorescens. For pubertetsæggestokke skal perfusion, som beskrevet ovenfor, med både 1x PBS og 1% PFA udføres for at eliminere blodlegemer, der vil forårsage autofluorescens (figur 2C). Perfusion med PBS bør fortsætte, indtil organer, især æggestokkene og nyrerne, er renset for blod og bliver hvide, før de skifter til 1% PFA (figur 1E,F). Ineffektiv perfusion med PBS vil resultere i en høj baggrund, der kan maskere og gøre visualiseringen af små oocytter vanskelig. Perfusion med lavere (1%) eller højere (4%) procentdele af PFA resulterer i bedre billedkvalitet end perfusion med PBS alene; Derfor blev den lavere procentdel af PFA anvendt.

Optimering af antistoffarvning kræver opmærksomhed på flere variabler. For permeabiliseringstrinnet viste det sig, at 4 timer var ideelt til dette assay, med perioder længere end 4 timer (6-8 timer testet), hvilket resulterede i ingen farvning overhovedet. Fordi mængden og omkostningerne ved antistoffer, der anvendes til store immunstainingsforsøg, kan være høje, blev denne protokol testet og optimeret til genbrug af antistofblandinger uden tab af immunstainingkvalitet. Til genbrug skal antistofblandingen suppleres med frisk antistof som beskrevet i protokollen. Vasketrin er også afgørende for kvaliteten af immunstaining og bør udføres længere for at opnå et bedre signal-støj-forhold under billeddannelse og bør bestemmes for hvert af de valgte antistoffer. For at få de bedste resultater anbefaler vi, at du forbereder ScaleS4(0)-renseopløsningen frisk til hver brug, mens ScaleCUBIC-1 og ScaleCUBIC-2 kan opbevares ved stuetemperatur i mørke i ~1-2 måneder.

ScaleCUBIC-1-rydningen udføres ved 37 °C; Det er vigtigt, at højere temperaturer undgås, da de vil resultere i reagensudfældning, hvilket kan påvirke kvaliteten af immunstainingen. Montering af flere prøver til billeddannelse kan være tidskrævende. Agar eller andre indlejringsmetoder, der anvendes i andre protokoller, er arbejdskrævende og kan have brug for en yderligere genrydning af prøver 47,49,50. Genanvendelige siliciumpakninger kan bruges som klæbende brønde, der er nemme at bruge med dæksler og tilbydes i forskellige størrelser og dybder for at imødekomme andre prøvestørrelser. For at opnå billeder af høj kvalitet skal der anvendes en tilstrækkelig mængde clearingopløsning; for lidt vil resultere i dårlig billedkvalitet, og for meget løsning kan lække på mikroskopet. Dette trin skal optimeres til specifikke prøver afhængigt af deres størrelser. Glasbundsskåle kan bruges, men prøver skal immobiliseres til billeddannelse, da selv de mindste bevægelser vil forvrænge billedet. Siliciumpakninger kan anvendes i kombination med et glasbundsfad og topdæksler til at immobilisere prøverne til billeddannelse. Dette vil dog begrænse evnen til at vende prøven, hvis billeddannelse fra begge sider er nødvendig på grund af æggestokkens størrelse.

Et andet vigtigt valg til denne storstilede tilgang med høj kapacitet var billeddannelse på Leica DIVE/4TUNE/FALCON-platformen med to justerbare Spectra-Physics multifotonlasere (MP). Fordelene ved at bruge DIVE-platformen inkluderer nem prøvemontering (beskrevet ovenfor), minimering af optisk forvrængning (sammenlignet med konfokale platforme) og vigtigst af alt billedhastighed og styring af erhvervede billeddata. Billeddannelse af prøver med multifotonlasere ved højere forstørrelse (16x) er meget hurtigere og forårsager mindre fotoskader end de konfokale lasere på Leica DIVE eller SP8 ved hjælp af lignende indstillinger til billedoptagelse med LAS X-software. MP-strålen er lav, dens fluorofor-excitation er meget lokaliseret til brændpunktet og opnår mere dybde ved lav forstørrelse uden at påføre fotoskader på trods af et højere antal rumlige / aksiale billeddannelsestrin (konfokal: ~ 300-400 sektioner maksimalt, MP: >800 sektioner).

Målet 16x/NA0.6 gør det muligt at korrigere for små brydningsindeksuoverensstemmelser på grund af prøve- og monteringsfordeling langs den optiske akse via en mekanisk korrektionskrave, som indstilles optimalt til maksimalt signal halvvejs ind i prøven. Desuden kan sfæriske strukturer, såsom oocytter, forvrænges ved konfokal billedoptagelse, da dybdeafhængig lokalisering af det konfokale plan (signal) på grund af mountant- og prøvebaktivt indeksuoverensstemmelser ved en given pinhole-indstilling kan forekomme (figur 2D). Da fluorescenssignalet fanges via instrumentets indre pinhole for at fjerne signal uden for fokus, kan den iboende optiske forvrængning (sfærisk aberration) blive værre dybere ind i prøven, hvilket er problematisk for større æggestokke (dvs. ~ 400-600 mikrometer tykkelse).

Med de samme matchende linsekorrektionsindstillinger kan der stort set ikke detekteres nogen sfærisk aberration på DIVE MP-systemet med varierende emissionsbølgelængder, hvilket forenkler kvantificering og co-lokaliseringsundersøgelser (figur 2D). Endelig giver den pulserende laser med høj effekt mulighed for spændende lavere fluoroforkoncentration dybt inde i prøven, især når den bruges sammen med Z-dybde excitationskorrektionen. Desuden forbedres optagelsen af svagere signaler også af MP-hybriddetektoren (HyD-RLD'er), som er en kombination af almindelige fotomultiplikatorrør og lavinefotontællingsdetektorer, hvilket muliggør mere end 30 gange højere signaldetektion over en lang række emissionsbølgelængder.

Light sheet (LS) multifotonmikroskopi er en anden ny platform til 3D-vævsbilleddannelse47. LS kræver dog mere opsætningstid for makroskopiske prøver, herunder agarindlejring og opsætning til billeddannelse. Desuden kan billeder, der er erhvervet ved højere forstørrelse med prøverotation, generere store >100 GB-filer, hvilket kan være nødvendigt for at fjerne lette arkskyggende artefakter (på grund af brydningsindeksuoverensstemmelser mellem det udvendige medium og det indre af prøven eller prøve-overfladeforvrængninger). Den præsenterede metode til montering af prøver i opløsning i klæbende brønde er enkel og hurtig.

Desuden tillader denne tilgang billeddannelse af flere æggestokke i en brønd med en opsætning og uden at vende eller rotere. Det kan dog være nødvendigt at vende dæksedlen "sandwich" for større æggestokke. DIVE-systembilleddannelsen er hurtigere end konfokal og LS; ved 16x forstørrelse afbildes præpubertal æggestok i 3-5 min (Z-trin 2 μm) og pubertetsæggestokken i 1 time (Z-trin 5 μm). Desuden er filer, der genereres i LAS X, af håndterbar størrelse (2-20 GB), hvilket også er afgørende for et stort antal prøver til downstream-analyse. Selvom denne immunstainingsprotokol blev optimeret til brug i kombination med DIVE-platformen, kan immunfarvede prøver afbildes ved hjælp af andre MP / LS-platforme med nogle ændringer.

Fordelen ved hele æggestokkens farvning med 3D-modelleringsprotokol er den effektive og relativt lette dataanalyse sammenlignet med manuel dataindsamling i 2D-analyse. IMARIS 3D-visualiserings- og analysesoftwaren blev valgt, fordi den er kommercielt tilgængelig og tilbydes af mange mikroskopikkerner, ikke kræver programmeringsfærdigheder og er kompatibel med mange billedoptagelsessoftwareplatforme som LAS X fra Leica eller ZEN fra ZEISS. Med IMARIS er standardparametrene sat op som fremhævet i protokolafsnittet, og disse parametre kan bruges til andre billeder og prøver med mindre ændringer, hvilket forbedrer reproducerbarheden og effektiviteten.

Billedanalyse og kvantificering er optimeret til IMARIS-software; lignende analyser kan dog udføres på anden kommerciel eller open source-datavisualiseringssoftware efter lignende principper. Afslutningsvis er der her præsenteret en optimeret protokol til billeddannelse af hele æggestokke til kvantitative og kvalitative analyser. Dette blev målrettet tilpasset kravene til den behandling med høj kapacitet, der i stigende grad vil blive krævet til toksikologiske test, kliniske og diagnostiske formål og genomdækkende analyser af regulatorer af ovarietilstrækkelighed og funktion.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingen interessekonflikter at oplyse.

Acknowledgments

Dette arbejde blev støttet af National Institutes of Health-tilskud (R01 HD093778 til E.B-F og T32 HD007065 til R.B). Vi takker Zachary Boucher for hans hjælp med strålingseksperimentet. Vi takker Mary Ann Händel for kritisk læsning af manuskriptet. Vi anerkender taknemmeligt bidraget fra Sonia Erattupuzha og Microscopy Core Service på Jackson Laboratory for ekspertbistand med mikroskopiarbejdet beskrevet i denne publikation og Jarek Trapszo fra Scientific Instrument Services på The Jackson Laboratory for at designe det 3D-trykte adapterdias.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Benchtop Incubator Benchmark Scientific H2200-H 37 °C incubator
Bovine Serum Albumin (BSA) VWR 97061-416
C57BL/6J The Jackson Laboratory 000664 mouse inbred strain
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Sigma-Aldrich D1435 Hazardous material
D-Sorbitol Sigma-Aldrich S6021
Dumont #5 Forceps FST 91150-20
FastWells Reagent Barriers GraceBio 664113 Sticky and flexible silicone gasket (adhesive well)
Fine Scissors FST 91460-11
Glycerol Sigma-Aldrich G2025
Glycine ThermoFisher Scientific BP381-500
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 647 Invitrogen A-21246 Dilution 1:1000
Goat anti-Rat IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 555 Invitrogen A-21434 Dilution 1:1000
Goat serum Sigma-Aldrich G9023
IMARIS Software Oxford Instruments Version 9.7.0 Image visualization and analysis software
Insight X3 Spectra-Physics InSight X3 Tunable Ultrafast Laser Laser for Multiphoton Imaging
LASX software Leica Version 3.5.6 Image acquisition software
Leica DIVE/4TUNE/FALCON Leica Leica Dmi8, 2P-M-ready: # 158005406 Multiphoton Microscope
MaiTai HP Spectra-Physics Mai Tai DeepSee One Box Ultrafast Laser Laser for Multiphoton Imaging
Masterflex Pump Controller SPW Industrial Model: 7553-50 Peristaltic pump for perfusion
Mayo Scissors FST 14010-17 5” –7” blunt/blunt scissors for decapitation
Micro Cover Glasses, Square, No. 1.5 25x25mm VWR 48366-249
Mini BioMixer Benchmark Scientific B3D1020 shaker/nutator for 37 °C incubator
Nikon Ergonomic SMZ1270 Leica  SMZ1270 stereomicroscope
Paraformaldehyde 16% (formaldehyde aqueous solution) Electron Microscopy Sciences 15710 Hazardous material
PBS Tablets, Phosphate-buffered Saline ThermoFisher Scientific BP2944100 Dissolve in Milli-Q water
Penicillin-Streptomycin, 200x, Dual Antibiotic Solution ThermoFisher Scientific ICN1670249
Polyvinyl alcohol (PVA) Sigma-Aldrich P8136
Quadrol (N,N,N′,N′-Tetrakis(2-Hydroxypropylethylenediamine) Sigma-Aldrich 122262
Rabbit anti-DDX4/MVH Abcam ab27591 Dilution 1:500
Rabbit anti-LINE-1 ORF1p Abcam ab216324 Dilution 1:500
Rat anti-TRA98/GCNA Abcam ab82527 Dilution 1:500
Sodium azide Sigma-Aldrich S2002 Hazardous material
Sodium borohydride Sigma-Aldrich 452882 Hazardous material
Sucrose ThermoFisher Scientific S0389
Tekmar Orbital Shaker Bimedis VXR-S10 shaker for room temperature
Triethanolamine Sigma-Aldrich 90279
Triton X-100 Sigma-Aldrich X100
UNOLOK Infusion Set MYCO Medical 7001-23 needles for perfusion
Urea Amresco 97061-920
X-Cite 120LED Excelitas S/N XT640-W-0147 low-power LED fluorescence lamp

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Pelosi, E., Forabosco, A., Schlessinger, D. Genetics of the ovarian reserve. Frontiers in Genetics. 6, 308 (2015).
  2. Pepling, M. E. From primordial germ cell to primordial follicle: mammalian female germ cell development. Genesis. 44 (12), 622-632 (2006).
  3. Wilkosz, P., Greggains, G. D., Tanbo, T. G., Fedorcsak, P. Female reproductive decline is determined by remaining ovarian reserve and age. PLoS One. 9 (10), 108343 (2014).
  4. Richardson, M. C., Guo, M., Fauser, B. C. J. M., Macklon, N. S. Environmental and developmental origins of ovarian reserve. Human Reproduction Update. 20 (3), 353-369 (2014).
  5. Spears, N., et al. Ovarian damage from chemotherapy and current approaches to its protection. Human Reproduction Update. 25 (6), 673-693 (2019).
  6. Morgan, S., Anderson, R. A., Gourley, C., Wallace, W. H., Spears, N. How do chemotherapeutic agents damage the ovary. Human Reproduction Update. 18 (5), 525-535 (2012).
  7. Wesevich, V., Kellen, A. N., Pal, L. Recent advances in understanding primary ovarian insufficiency. F1000Research. 9, (2020).
  8. Biswas, L., et al. Meiosis interrupted: the genetics of female infertility via meiotic failure. Reproduction. 161 (2), 13-35 (2021).
  9. Tam, P. P., Snow, M. H. Proliferation and migration of primordial germ cells during compensatory growth in mouse embryos. Journal of Embryology and Experimental Morphology. 64, 133-147 (1981).
  10. Pepling, M. E., Spradling, A. C. Female mouse germ cells form synchronously dividing cysts. Development. 125 (17), 3323-3328 (1998).
  11. Pepling, M. E., Spradling, A. C. Mouse ovarian germ cell cysts undergo programmed breakdown to form primordial follicles. Developmental Biology. 234 (2), 339-351 (2001).
  12. Adams, I. R., McLaren, A. Sexually dimorphic development of mouse primordial germ cells: switching from oogenesis to spermatogenesis. Development. 129 (5), 1155-1164 (2002).
  13. McLaren, A., Southee, D. Entry of mouse embryonic germ cells into meiosis. Developmental Biology. 187 (1), 107-113 (1997).
  14. Findlay, J. K., Hutt, K. J., Hickey, M., Anderson, R. A. How is the number of primordial follicles in the ovarian reserve established. Biology of Reproduction. 93 (5), 111 (2015).
  15. Tilly, J. L. Commuting the death sentence: how oocytes strive to survive. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 2 (11), 838-848 (2001).
  16. Baker, T. G. A quantitative and cytological study of germ cells in human ovaries. Proceedings of the Royal Society of London. Series B, Biological Sciences. 158, 417-433 (1963).
  17. Baker, T. G. A quantitative and cytological study of oogenesis in the rhesus monkey. Journal of Anatomy. 100, Pt 4 761-776 (1966).
  18. Kurilo, L. F. Oogenesis in antenatal development in man. Human Genetics. 57 (1), 86-92 (1981).
  19. Matova, N., Cooley, L. Comparative aspects of animal oogenesis. Developmental Biology. 231 (2), 291-320 (2001).
  20. Malki, S., vander Heijden, G. W., O'Donnell, K. A., Martin, S. L., Bortvin, A. A role for retrotransposon LINE-1 in fetal oocyte attrition in mice. Developmental Cell. 29 (5), 521-533 (2014).
  21. Tharp, M. E., Malki, S., Bortvin, A. Maximizing the ovarian reserve in mice by evading LINE-1 genotoxicity. Nature Communications. 11 (1), 330 (2020).
  22. Rinaldi, V. D., Bolcun-Filas, E., Kogo, H., Kurahashi, H., Schimenti, J. C. The DNA damage checkpoint eliminates mouse oocytes with chromosome synapsis failure. Molecular Cell. 67 (6), 1026-1036 (2017).
  23. Bolcun-Filas, E., Rinaldi, V. D., White, M. E., Schimenti, J. C. Reversal of female infertility by Chk2 ablation reveals the oocyte DNA damage checkpoint pathway. Science. 343 (6170), 533-536 (2014).
  24. Pepling, M. E. Follicular assembly: mechanisms of action. Reproduction. 143 (2), 139-149 (2012).
  25. Tingen, C., Kim, A., Woodruff, T. K. The primordial pool of follicles and nest breakdown in mammalian ovaries. Molecular Human Reproduction. 15 (12), 795-803 (2009).
  26. Wallace, W. H. B., Kelsey, T. W. Human ovarian reserve from conception to the menopause. PLoS One. 5 (1), 8772 (2010).
  27. Pepling, M. E., et al. Differences in oocyte development and estradiol sensitivity among mouse strains. Reproduction. 139 (2), 349-357 (2010).
  28. Nelson, S. M., Anderson, R. A. Prediction of premature ovarian insufficiency: foolish fallacy or feasible foresight. Climacteric. , 1-10 (2021).
  29. Wood, M. A., Rajkovic, A. Genomic markers of ovarian reserve. Seminars in Reproductive Medicine. 31 (6), 399-415 (2013).
  30. Tilly, J. L. Ovarian follicle counts--not as simple as 1, 2, 3. Reproductive Biology and Endocrinology. 1, 11 (2003).
  31. Winship, A. L., Sarma, U. C., Alesi, L. R., Hutt, K. J. Accurate follicle enumeration in adult mouse ovaries. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (164), e61782 (2020).
  32. Fiorentino, G., Parrilli, A., Garagna, S., Zuccotti, M. Three-dimensional imaging and reconstruction of the whole ovary and testis: a new frontier for the reproductive scientist. Molecular Human Reproduction. 27 (3), 007 (2021).
  33. Sarma, U. C., Winship, A. L., Hutt, K. J. Comparison of methods for quantifying primordial follicles in the mouse ovary. Journal of Ovarian Research. 13 (1), 121 (2020).
  34. Skodras, A., Marcelli, G. Computer-generated ovaries to assist follicle counting experiments. PLoS One. 10 (3), 0120242 (2015).
  35. Sonigo, C., et al. High-throughput ovarian follicle counting by an innovative deep learning approach. Scientific Reports. 8 (1), 13499 (2018).
  36. Myers, M., Britt, K. L., Wreford, N. G. M., Ebling, F. J. P., Kerr, J. B. Methods for quantifying follicular numbers within the mouse ovary. Reproduction. 127 (5), 569-580 (2004).
  37. Kagami, K., Shinmyo, Y., Ono, M., Kawasaki, H., Fujiwara, H. Three-dimensional evaluation of murine ovarian follicles using a modified CUBIC tissue clearing method. Reproductive Biology and Endocrinology. 16 (1), 72 (2018).
  38. Rinaldi, V. D., Hsieh, K., Munroe, R., Bolcun-Filas, E., Schimenti, J. C. Pharmacological inhibition of the DNA damage checkpoint prevents radiation-induced oocyte death. Genetics. 206 (4), 1823-1828 (2017).
  39. Malki, S., Tharp, M. E., Bortvin, A. A whole-mount approach for accurate quantitative and spatial assessment of fetal oocyte dynamics in mice. Biology of Reproduction. 93 (5), 113 (2015).
  40. Susaki, E. A., et al. Whole-brain imaging with single-cell resolution using chemical cocktails and computational analysis. Cell. 157 (3), 726-739 (2014).
  41. Hama, H., et al. ScaleS: an optical clearing palette for biological imaging. Nature Neuroscience. 18 (10), 1518-1529 (2015).
  42. Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (65), e3564 (2012).
  43. Microscope slide (25x75) with inset for coverslips (22x22). NIH 3D Print Exchange. Capel Lab at Duke University Medical Center. , Available from: https://3dprint.nih.gov/discover/3DPX-009765 (2018).
  44. Niu, W., Spradling, A. C. Two distinct pathways of pregranulosa cell differentiation support follicle formation in the mouse ovary. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (33), 20015-20026 (2020).
  45. Livera, G., Petre-Lazar, B., Guerquin, M. -J., Trautmann, E., Coffigny, H., Habert, R. p63 null mutation protects mouse oocytes from radio-induced apoptosis. Reproduction. 135 (1), 3-12 (2008).
  46. Carroll, J., Marangos, P. The DNA damage response in mammalian oocytes. Frontiers in genetics. 4, 117 (2013).
  47. McKey, J., Cameron, L. A., Lewis, D., Batchvarov, I. S., Capel, B. Combined iDISCO and CUBIC tissue clearing and lightsheet microscopy for in toto analysis of the adult mouse ovary. Biology of Reproduction. 102 (5), 1080-1089 (2020).
  48. McKey, J., Anbarci, D. N., Bunce, C., Capel, B. Integration of mouse ovary morphogenesis with developmental dynamics of the oviduct, ovarian ligaments, and rete ovarii. bioRxiv. , (2021).
  49. Udan, R. S., Piazza, V. G., Hsu, C. -W., Hadjantonakis, A. -K., Dickinson, M. E. Quantitative imaging of cell dynamics in mouse embryos using light-sheet microscopy. Development. 141 (22), 4406-4414 (2014).
  50. Di Giovanna, A. P., et al. Tailored sample mounting for light-sheet fluorescence Microscopy of clarified specimens by polydimethylsiloxane casting. Frontiers in Neuroanatomy. 13, 35 (2019).

Tags

Udviklingsbiologi nummer 175
Hele ovarieimmunfluorescens, clearing og multifotonmikroskopi til kvantitativ 3D-analyse af den udviklende ovariereserve i mus
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Boateng, R., Boechat, N., Henrich,… More

Boateng, R., Boechat, N., Henrich, P. P., Bolcun-Filas, E. Whole Ovary Immunofluorescence, Clearing, and Multiphoton Microscopy for Quantitative 3D Analysis of the Developing Ovarian Reserve in Mouse. J. Vis. Exp. (175), e62972, doi:10.3791/62972 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter