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Immunology and Infection

म्यूरीन फेफड़े की जन्मजात और अनुकूली प्रतिरक्षा कोशिकाओं की पहचान के लिए फ्लो साइटोमेट्रिक विश्लेषण

Published: November 16, 2021 doi: 10.3791/62985
Automatic Translation
1,2, 1,2,3, 1,2, 1,2, 1,2
1Division of Hematology-Oncology, Beth Israel Deaconess Medical Center, Harvard Medical School, 2Department of Medicine, Beth Israel Deaconess Medical Center, Harvard Medical School, 3Harvard College

Summary

इस अध्ययन में, हम मुरीन श्वसन प्रणाली की प्रतिरक्षा आबादी को अलग करने के लिए एक प्रभावी और पुन: प्रस्तुत करने योग्य प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं। हम सभी जन्मजात और अनुकूली प्रतिरक्षा कोशिकाओं की पहचान के लिए एक विधि भी प्रदान करते हैं जो स्वस्थ चूहों के फेफड़ों में रहते हैं, एक 9-रंग-आधारित प्रवाह साइटोमेट्री पैनल का उपयोग करके।

Abstract

श्वसन पथ बाहरी वातावरण के साथ सीधे संपर्क में है और पर्यावरणीय एंटीजन के लिए अवांछित प्रतिक्रियाओं को दबाते हुए सुरक्षा प्रदान करने के लिए एक सटीक विनियमित प्रतिरक्षा प्रणाली की आवश्यकता होती है। फेफड़े जन्मजात और अनुकूली प्रतिरक्षा कोशिकाओं की कई आबादी की मेजबानी करते हैं जो प्रतिरक्षा निगरानी प्रदान करते हैं लेकिन सुरक्षात्मक प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं की मध्यस्थता भी करते हैं। ये कोशिकाएं, जो स्वस्थ फुफ्फुसीय प्रतिरक्षा प्रणाली को संतुलन में रखती हैं, अस्थमा, संक्रमण, ऑटोइम्यून बीमारियों और कैंसर जैसी कई रोग संबंधी स्थितियों में भी भाग लेती हैं। सतह और इंट्रासेल्युलर प्रोटीन की चयनात्मक अभिव्यक्ति फेफड़ों की प्रतिरक्षा कोशिकाओं को अद्वितीय इम्यूनोफेनोटाइपिक गुण प्रदान करती है। नतीजतन, प्रवाह साइटोमेट्री स्थिर-राज्य और रोग संबंधी स्थितियों के दौरान ऐसी कोशिका आबादी की पहचान में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है। यह पेपर एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करता है जो प्रतिरक्षा कोशिकाओं की पहचान करने के लिए एक सुसंगत और पुन: प्रस्तुत करने योग्य विधि का वर्णन करता है जो स्थिर-राज्य स्थितियों के तहत स्वस्थ चूहों के फेफड़ों में रहते हैं। हालांकि, इस प्रोटोकॉल का उपयोग फेफड़ों की प्रतिरक्षा परिदृश्य में रोग-विशिष्ट परिवर्तनों की पहचान करने में मदद करने के लिए विभिन्न रोग मॉडलों में इन कोशिका आबादी में परिवर्तनों की पहचान करने के लिए भी किया जा सकता है।

Introduction

मुरीन श्वसन पथ में रोगजनकों से लड़ने और प्रतिरक्षा होमियोस्टैसिस को बनाए रखने के लिए जिम्मेदार एक अद्वितीय प्रतिरक्षा प्रणाली होती है। फुफ्फुसीय प्रतिरक्षा प्रणाली में सेलुलर आबादी होती है जिसमें उनके फेनोटाइप, कार्य, उत्पत्ति और स्थान में महत्वपूर्ण विषमता होती है। निवासी वायुकोशीय मैक्रोफेज (एएम), मुख्य रूप से भ्रूण मोनोसाइट्स से उत्पन्न होते हैं, वायुकोशीय लुमेन 1 में रहते हैं, जबकि अस्थि मज्जा-व्युत्पन्न अंतरालीय मैक्रोफेज (आईएम) फेफड़ों के पैरेन्काइमा 2 में रहते हैं। आईएम को CD206 की अभिव्यक्ति द्वारा आगे उपवर्गीकृत किया जा सकता है। CD206+ IMs पेरिब्रोन्कियल और पेरिवैस्कुलर क्षेत्र को पॉप्युलेट करते हैं, जबकि CD206- IMs वायुकोशीय इंटरस्टिटियम 3 पर स्थित हैं। आईएम के कुछ उप-वर्गीकरण हाल ही में प्रस्तावित किए गए हैं3,4,5,6। हालांकि आईएम का एएम की तुलना में कम अध्ययन किया जाता है, हाल के सबूत फेफड़ों की प्रतिरक्षा प्रणाली के विनियमन में उनकी महत्वपूर्ण भूमिका का समर्थन करते हैं। इसके अलावा, CD206 को वैकल्पिक रूप से सक्रिय AMs8 में भी व्यक्त किया जाता है।

फुफ्फुसीय डेंड्राइटिक कोशिकाएं (डीसी) फेफड़ों की प्रतिरक्षा कोशिकाओं का एक और विषम समूह हैं जो उनके कार्यात्मक गुणों, स्थान और मूल के संबंध में हैं। फेफड़ों में डीसी की चार उपश्रेणियों का वर्णन किया गया है: पारंपरिक CD103 + DCs (जिसे cDC1 के रूप में भी जाना जाता है), पारंपरिक CD11b + DC (जिसे cDC2 के रूप में भी जाना जाता है), मोनोसाइट-व्युत्पन्न डीसी (MoDCs), और plasmacytoid DCs9,10,11,12,13। पहले तीन उपवर्गों को प्रमुख हिस्टोकम्पैटिबिलिटी कॉम्प्लेक्स (एमएचसी) II + CD11c + 9,10,14,15 के रूप में परिभाषित किया जा सकता है। Plasmacytoid डीसी एमएचसी द्वितीय व्यक्त करते हैं और CD11c के लिए मध्यवर्ती रूप से सकारात्मक हैं, लेकिन B220 और PDCA-19,13,16 के उच्च स्तर को व्यक्त करते हैं। भोले मुरीन फेफड़ों में, CD103 डीसी और CD11b डीसी वायुमार्ग इंटरस्टिटियम में स्थित हैं, जबकि plasmacytoid डीसी वायुकोशीय interstitium17 में स्थित हैं।

मोनोसाइट्स की दो प्रमुख आबादी स्थिर स्थिति के दौरान फेफड़ों में रहती है: शास्त्रीय मोनोसाइट्स और गैर-शास्त्रीय मोनोसाइट्स। शास्त्रीय monocytes Ly6C + हैं और प्रारंभिक भड़काऊ प्रतिक्रिया के लिए महत्वपूर्ण हैं। इसके विपरीत, गैर-शास्त्रीय मोनोसाइट्स Ly6C हैं- और व्यापक रूप से विरोधी भड़काऊ कोशिकाओं 3,16,18 के रूप में देखा गया है। हाल ही में, CD64 + CD16.2 + मोनोसाइट्स की एक अतिरिक्त आबादी का वर्णन किया गया था, जो Ly6C- मोनोसाइट्स से उत्पन्न होता है और CD206 + IMs3 को जन्म देता है।

ईोसिनोफिल मुख्य रूप से हेल्मिंथ संक्रमण या एलर्जी की स्थिति के दौरान फेफड़ों में दिखाई देते हैं। हालांकि, स्थिर अवस्था के दौरान फुफ्फुसीय पैरेन्काइमा में ईोसिनोफिल की एक छोटी संख्या होती है, जिसे निवासी ईोसिनोफिल के रूप में जाना जाता है। निवासी ईोसिनोफिल के विपरीत, भड़काऊ ईोसिनोफिल फेफड़ों के इंटरस्टिटियम और ब्रोन्कोएल्वोलर लैवेज (बीएएल) में पाए जाते हैं। घर की धूल घुन (एचडीएम) के माउस मॉडल में, भड़काऊ ईोसिनोफिल को एंटीजन-मध्यस्थता उत्तेजना के बाद फेफड़ों में भर्ती किया जाता है। यह प्रस्तावित किया गया है कि निवासी ईोसिनोफिल की एचडीएम 19 के लिए टी हेल्पर 2 (टी 2) संवेदीकरण को रोककर एलर्जी में नियामक भूमिका हो सकती है।

बाकी फुफ्फुसीय माइलॉयड कोशिकाओं के विपरीत, न्यूट्रोफिल Ly6G व्यक्त करते हैं लेकिन CD68 नहीं और CD68-Ly6G + immunophenotype16,20,21 के हस्ताक्षर की विशेषता है। विज़ुअलाइज़ेशन अध्ययनों से पता चला है कि स्थिर स्थिति के दौरान, फेफड़े इंट्रावैस्कुलर डिब्बे में न्यूट्रोफिल का एक पूल आरक्षित करते हैं और काफी संख्या में एक्स्ट्रावैस्कुलर न्यूट्रोफिल 22 की मेजबानी करते हैं। ईोसिनोफिल के समान, न्यूट्रोफिल स्थिर अवस्था में बीएएल में नहीं पाए जाते हैं; हालांकि, प्रतिरक्षा उत्तेजना के कई रूप, जैसे कि एलपीएस चुनौती, अस्थमा, या निमोनिया, वायुकोशीय लुमेन में न्यूट्रोफिल चलाते हैं, जिसके परिणामस्वरूप BAL21,22,23 में उनकी उपस्थिति होती है।

फेफड़ों की CD45+ कोशिकाओं की एक बड़ी संख्या प्राकृतिक हत्यारा (एनके), टी कोशिकाओं और बी कोशिकाओं का प्रतिनिधित्व करती है और अधिकांश माइलॉयड मार्करों 24 के लिए नकारात्मक होती है। भोले चूहों के फेफड़ों में, इन तीन सेल प्रकारों को CD11b और MHC II18 की अभिव्यक्ति के आधार पर पहचाना जा सकता है। फुफ्फुसीय सीडी 45 + कोशिकाओं का लगभग 25% बी कोशिकाएं हैं, जबकि एनके कोशिकाओं का प्रतिशत अन्य लिम्फोइड और गैर-लिम्फोइड ऊतकों की तुलना में फेफड़ों में अधिक है24,25,26। फुफ्फुसीय टी कोशिकाओं में, एक काफी अंश CD4-CD8 है- और श्वसन संक्रमण 26 में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है।

क्योंकि फेफड़े एक बहुत ही जटिल और अद्वितीय प्रतिरक्षा प्रणाली की मेजबानी करते हैं, फेफड़ों की प्रतिरक्षा कोशिकाओं की पहचान के लिए कई गेटिंग रणनीतियों को विकसित किया गया है और रिपोर्ट किया गया है16,18,20,27। यहां वर्णित गेटिंग रणनीति 9 मार्करों का उपयोग करके 12 अलग-अलग फुफ्फुसीय माइलॉयड और गैर-माइलॉयड प्रतिरक्षा आबादी की पहचान करने के लिए एक व्यापक और पुन: प्रस्तुत करने योग्य तरीका प्रदान करती है। परिणामों को सत्यापित करने के लिए अतिरिक्त मार्करों का उपयोग किया गया है। इसके अलावा, एक एकल-सेल निलंबन की तैयारी के लिए एक विस्तृत विधि प्रदान की जाती है जो सेल की मृत्यु को कम करती है और फेफड़ों के प्रतिरक्षा सेल डिब्बे के सबसे पूर्ण प्रोफ़ाइल की पहचान की अनुमति देती है। यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि फेफड़ों की गैर-प्रतिरक्षा कोशिकाओं की पहचान, जैसे कि उपकला कोशिकाएं (CD45-CD326+ CD31-), एंडोथेलियल कोशिकाएं (CD45-CD326-CD31+), और फाइब्रोब्लास्ट्स को एक अलग दृष्टिकोण 28,29 की आवश्यकता होती है। ऐसी आबादी की पहचान यहां वर्णित प्रोटोकॉल और विधि में शामिल नहीं है।

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Protocol

इस प्रोटोकॉल में वर्णित सभी अध्ययन और प्रयोगों को बेथ इज़राइल डेकोनेस मेडिकल सेंटर की संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति (आईएसीयूसी) के अनुसार दिशानिर्देशों के तहत आयोजित किया गया था। इस प्रोटोकॉल को विकसित करने के लिए या तो लिंग के छह से दस सप्ताह पुराने C57BL / 6 चूहों का उपयोग किया गया था।

1. सर्जिकल उच्छेदन और ऊतक तैयारी

  1. इंट्रापेरिटोनियल रूप से ट्राइब्रोमोएथेनॉल के 1 एमएल इंजेक्ट करके माउस को यूथेनाइज़ करें (मानक प्रोटोकॉल के अनुसार तैयार किया गया; सामग्री की तालिका)।
    नोट: फेफड़ों के अध्ययन में सीओ 2 श्वासावरोध से बचा जाना चाहिए क्योंकि यह फेफड़ों की चोट का कारण बन सकता है और फेफड़ों की प्रतिरक्षा कोशिकाओं की विशेषताओं और गुणों को बदल सकता है। सर्वाइकल विस्थापन से भी बचा जाना चाहिए क्योंकि यह फेफड़ों की यांत्रिक चोट का कारण बन सकता है।
  2. सर्जिकल ऑपरेशन के लिए माउस को एक साफ और समर्पित क्षेत्र में स्थानांतरित करें।
  3. चार छोरों पर सुइयों या टेप का उपयोग करके माउस पृष्ठीय पक्ष को नीचे स्थिर करें। वेंट्रल क्षेत्र की त्वचा को साफ करने के लिए 70% इथेनॉल का उपयोग करें।
  4. त्वचा में एक चीरा प्रदर्शन, गर्दन से पेट तक। ध्यान से वक्षीय क्षेत्र से त्वचा को हटा दें।
  5. उरोस्थि और पसलियों को सावधानीपूर्वक हटा दें।
  6. 18-21 जी सुई का उपयोग करके सीधे दाएं वेंट्रिकल में 10 मिलीलीटर ठंडे पीबीएस को इंजेक्ट करके फेफड़ों को फ्लश करें, जब तक कि फेफड़े पूरी तरह से सफेद न हो जाएं।
  7. फेफड़ों को छूने के बिना थाइमस और दिल को सावधानीपूर्वक हटा दें।
  8. धीरे से फेफड़ों को आसपास के ऊतकों से अलग करें और उन्हें ठंडे बीएसए बफर (तालिका 1) के साथ एक ट्यूब में स्थानांतरित करें।
    नोट: एकल-सेल निलंबन को आगे तैयार करने से पहले फेफड़ों से सभी आसन्न वसा को हटाने का प्रयास किया जाना चाहिए, क्योंकि यह रीडआउट को पूर्वाग्रहित कर सकता है।

2. एकल सेल निलंबन की तैयारी

  1. फेफड़ों को एक खाली पेट्री डिश में स्थानांतरित करें और उन्हें दो महीन स्केलपेल के साथ कीमा बना लें। कीमा बनाया हुआ फेफड़े के सभी टुकड़ों को एक नए 50 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में स्थानांतरित करें। प्लेट को धोने के लिए 5 मिलीलीटर पाचन बफर का उपयोग करें और इसे 50 मिलीलीटर ट्यूब में जोड़ें जिसमें कीमा बनाया हुआ फेफड़े (तालिका 1) शामिल है।
    नोट: पाचन बफर को उपयोग करने से तुरंत पहले तैयार किया जाना चाहिए। कोलेजनेज 28 के 5 मिलीग्राम / एमएल का उपयोग करें। बीएसए बफर या प्रोटीन मुक्त पीबीएस के साथ 1 या 5 मिलीग्राम कोलेजेनेस के संयोजन ने परिणामों में सुधार नहीं किया (पूरक चित्रा एस 1)।
  2. ट्यूब के ढक्कन को सुरक्षित करें और 37 डिग्री सेल्सियस पर 150 आरपीएम की गति से एक कक्षीय शेकर पर 30 मिनट के लिए फेफड़ों को पचाएं। ठंडे बीएसए बफर के 10 मिलीलीटर जोड़कर प्रतिक्रिया को रोकें।
  3. पाचन के बाद, फेफड़ों के टुकड़ों को मिलाने और भंग करने के लिए 18 जी सुई का उपयोग करें। एक नई 50 मिली शंक्वाकार ट्यूब के शीर्ष पर एक 70 μm फिल्टर छलनी रखें।
    नोट: एक छोटे माइक्रोन फ़िल्टर के उपयोग के परिणामस्वरूप प्रमुख माइलॉयड आबादी का नुकसान हो सकता है।
  4. धीरे-धीरे पचाए गए फेफड़ों के मिश्रण को सीधे छलनी पर स्थानांतरित करें। फिल्टर पर शेष फेफड़ों के टुकड़ों को तोड़ने के लिए 10 मिलीलीटर सिरिंज प्लंजर के रबर पक्ष का उपयोग करें। BSA बफर के साथ फिल्टर पर संसाधित सामग्री धोएं।
  5. 4 डिग्री सेल्सियस पर 8 मिनट के लिए 350 × जी पर एकल सेल निलंबन को सेंट्रीफ्यूज करें।
  6. ध्यान से supernatant को त्याग और ACK lysis बफर के 1 mL में कोशिकाओं resuspend. एक 1 एमएल पिपेट का उपयोग करके अच्छी तरह से मिलाएं, और कमरे के तापमान पर 90 सेकंड के लिए इनक्यूबेट करें।
  7. 4 °C पर 7 मिनट के लिए 350 × g पर प्रतिक्रिया और सेंट्रीफ्यूज को रोकने के लिए ठंडे BSA बफर के 10 mL जोड़ें. ध्यान से supernatant को त्यागें और एक हेमोसाइटोमीटर का उपयोग करके कोशिकाओं की गिनती करने के लिए स्टेनिंग बफर में गोली को फिर से निलंबित करें।
  8. कोशिकाओं को 5 × 106 कोशिकाओं / एमएल की एकाग्रता पर फिर से निलंबित करें और सतह के दाग के लिए उनका उपयोग करें (अनुभाग 3 देखें)।
    नोट: इस उद्देश्य के लिए, एक 96-अच्छी तरह से गोल-नीचे प्लेट में कोशिकाओं को प्लेट करें, जिसके बाद एंटीबॉडी धुंधला और धोया जाता है। यदि एक प्लेट सेंट्रीफ्यूज उपलब्ध नहीं है, तो प्लेटों के बजाय प्रवाह ट्यूबों का उपयोग करें। इस प्रोटोकॉल के साथ, ~ 15-20 × प्रति फेफड़े 106 कोशिकाओं को औसत आकार के 6-10-सप्ताह पुराने C57BL / 6 माउस से प्राप्त किया जा सकता है।

3. सतह एंटीबॉडी धुंधला

  1. 96-अच्छी तरह से प्लेट में 200 μL प्रति अच्छी तरह से 106 कोशिकाओं में 1 × 106 कोशिकाओं को स्थानांतरित करें। 4 डिग्री सेल्सियस पर 7 मिनट के लिए 350 × ग्राम पर प्लेट को सेंट्रीफ्यूज करें। इस बीच, एंटी-16/32 एंटीबॉडी (1: 100) को धुंधला बफर (तालिका 1) में पतला करके एफसी-ब्लॉक समाधान तैयार करें।
  2. पूर्व-तैयार एफसी-ब्लॉकिंग समाधान (सामग्री की तालिका) के 50 μL में कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें और 4 डिग्री सेल्सियस या बर्फ पर 15-20 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
  3. धुंधला बफर के 150 μL जोड़ें और 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 350 × जी पर प्लेट centrifuge। इस बीच, सतह एंटीबॉडी (1: 100) को पतला करके सतह एंटीबॉडी कॉकटेल तैयार करें; तालिका 2) बफर धुंधला करने में।
    नोट: (i) एफसी-ब्लॉकिंग के लिए एंटी-16/32 एंटीबॉडी का उपयोग एक ही मिश्रण में सतह एंटीबॉडी के साथ किया जा सकता है। (ii) यदि फिक्सेबल व्यवहार्यता डाई का उपयोग किया जाता है, तो इसे 1: 1,000 के कमजोर पड़ने पर सतह एंटीबॉडी कॉकटेल में जोड़ें।
  4. पूर्व-तैयार सतह एंटीबॉडी कॉकटेल के 50 μL में कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें और अंधेरे में 4 डिग्री सेल्सियस पर 30-40 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें। धुंधला बफर के साथ कोशिकाओं को दो बार धोएं।
    नोट: यदि कोई इंट्रासेल्युलर धुंधला करने की आवश्यकता नहीं है, तो 200 μL में कोशिकाओं को धुंधला बफर के पुन: निलंबित करें और प्रवाह साइटोमीटर पर डेटा के अधिग्रहण के लिए सीधे आगे बढ़ें। वैकल्पिक रूप से, कोशिकाओं को बाद में अधिग्रहण के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर तय और संग्रहीत किया जा सकता है। हम 24 घंटे के भीतर प्रवाह साइटोमेट्री के लिए कोशिकाओं का उपयोग करने की सलाह देते हैं।

4. सेल निर्धारण और इंट्रासेल्युलर धुंधला

  1. निर्धारण/परमेबिलाइजेशन बफर (फिक्स/पर्म बफर) को फिक्सेशन/परमेबिलाइजेशन कंसंट्रेट के तीन भागों और फॉक्सपी3/ट्रांसक्रिप्शन फैक्टर स्टेनिंग बफर सेट (तालिका 1) के फिक्सेशन/परमीबिलाइजेशन डिलुएंट के 1 भाग को मिलाकर तैयार करें।
  2. 96-वेल प्लेट के प्रति अच्छी तरह से पूर्व-तैयार फिक्स / पर्म बफर के 50 μL में कोशिकाओं को फिर से निलंबित कर दिया गया, जहां कोशिकाओं को अनुभाग 3 में वर्णित के रूप में मढ़वाया गया था, और उन्हें अंधेरे में 4 डिग्री सेल्सियस पर 20-25 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
  3. 1x permeabilization बफर तैयार करने के लिए शुद्ध विआयनीकृत पानी में 10x permeabilization बफर के रूप में 10x permeabilization बफर पतला।
  4. कोशिकाओं को एक बार 1x permeabilization बफर के साथ धोलें। इस बीच, इंट्रासेल्युलर एंटीबॉडी कॉकटेल को 1 मिलीलीटर पर्मेबिलाइजेशन बफर में इंट्रासेल्युलर एंटीबॉडी (1: 100) को पतला करके तैयार करें।
  5. 96-अच्छी तरह से प्लेट के प्रति सेल पूर्व-तैयार सतह एंटीबॉडी कॉकटेल के 50 μL का उपयोग करके कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें और अंधेरे में 4 डिग्री सेल्सियस पर 40 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
  6. कोशिकाओं को एक बार permeabilization बफर के साथ और धुंधला बफर के साथ एक बार धोलें। अंतिम धोने के बाद, धुंधला बफर के 200 μL में कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें।
    नोट: यदि प्लेट रीडर के साथ कोई प्रवाह साइटोमीटर उपलब्ध नहीं है, तो कोशिकाओं को प्रवाह साइटोमेट्री ट्यूबों में स्थानांतरित करें।
  7. प्रवाह साइटोमीटर पर प्रति नमूना 1.5 × 106 कोशिकाओं की एक न्यूनतम प्राप्त करें।
    नोट:: एकल रंग और unstained नियंत्रण नमूनों के लिए, 0.5-1 × प्रति नमूना 106 कक्ष पर्याप्त होगा। इष्टतम धुंधला प्राप्त करने और लागत को कम करने के लिए उपयोग किए जाने वाले व्यक्तिगत एंटीबॉडी को टाइटर करने की सिफारिश की जाती है। वर्तमान प्रोटोकॉल FoxP3 धुंधला बफ़र सेट का उपयोग कर तैयार फिक्स/पर्म बफ़र का उपयोग कर ऑप्टिमाइज़ किया गया है। क्योंकि CD68 एक साइटोप्लाज्मिक है और परमाणु मार्कर नहीं है, इसलिए विभिन्न विक्रेताओं से पैराफॉर्मेल्डिहाइड या साइटोफिक्स / साइटोपर्म किट की कम एकाग्रता जैसे अन्य permeabilization समाधान पर्याप्त हो सकते हैं।

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Representative Results

गेटिंग रणनीति
हमारी गेटिंग रणनीति का पहला कदम मलबे और डबल्स का बहिष्करण है (चित्रा 1 ए)। गलत-सकारात्मक आबादी (पूरक चित्रा S2) से बचने के लिए डबल्स का सावधानीपूर्वक बहिष्करण महत्वपूर्ण है। फिर, प्रतिरक्षा कोशिकाओं को CD45+ का उपयोग करके पहचाना जाता है, जो हेमटोपोएटिक कोशिकाओं के लिए एक मार्कर है (चित्रा 1 B)। मृत कोशिकाओं को बाहर करने के लिए जीवित-मृत दाग जोड़ा जा सकता है। हालांकि, इस प्रोटोकॉल के परिणामस्वरूप CD45+ कोशिकाओं (चित्रा 1C) के <5% की मृत्यु हो जाती है, जबकि अधिक CD45- कोशिकाओं को मृत (पूरक चित्रा S3) के रूप में पहचाना जाता है।

मोनोसाइट्स और न्यूट्रोफिल की पहचान करने के लिए, पिछले अध्ययनों के विपरीत, जो इन आबादी में से प्रत्येक के लिए विशिष्ट एंटीबॉडी का उपयोग करते थे16,18, हम एक एंटी-जीआर -1 एंटीबॉडी का उपयोग करना पसंद करते हैं जो Ly6C + और Ly6G + कोशिकाओं दोनों की पहचान करता है। एंटी-सीडी 68 के साथ एंटी-जीआर -1 एंटीबॉडी का उपयोग करने से फेफड़ों की प्रतिरक्षा कोशिकाओं को तीन समूहों में अलग करने की अनुमति मिलती है: CD68-GR-1+, CD68+ (जिसे आगे GR-1+ या GR-1-के रूप में पहचाना जा सकता है), और CD68-GR-1-/int (चित्रा 1D)। CD68 एक मार्कर है जो मुख्य रूप से इंट्रासेल्युलर रूप से पाया जाता है। सतह CD68 की जांच की गई थी, लेकिन निर्धारण / permeabilization (पूरक चित्रा S4) के बिना पता नहीं लगाया जा सका।

Polymorphonuclear कोशिकाओं (न्यूट्रोफिल) को CD45 + CD68-GR-1 + CD11b + (चित्रा 1E) के रूप में पहचाना गया था। इन परिणामों को LY6G (चित्रा 2) के लिए विशिष्ट एंटीबॉडी के साथ GR1 का उपयोग करके सत्यापित किया गया था, जो पॉलीमोर्फोन्यूक्लियर न्यूट्रोफिल 16,18,27 के लिए एक अद्वितीय मार्कर है। CD45+ CD68-GR-1-/int जनसंख्या के भीतर, लगभग 10-20% MHCII- और CD11blow हैं और NK कोशिकाओं (चित्रा 1F) का प्रतिनिधित्व करते हैं। NK1.1, NK कोशिकाओं के लिए एक अद्वितीय मार्कर, इसकी पुष्टि करने के लिए इस्तेमाल किया गया था (चित्रा 3)25,30. CD45+CD68-GR1-/intCD11b- जनसंख्या में MHCII-T कोशिकाएं और MHCII+ B कोशिकाएं (चित्रा 1F) शामिल हैं। दो अतिरिक्त एंटीबॉडी का उपयोग क्रमशः टी कोशिकाओं और बी कोशिकाओं-सीडी 3 और बी 220 को सत्यापित करने के लिए किया गया था (चित्रा 3)।

स्थिर-राज्य परिस्थितियों में स्वस्थ चूहों में, BAL में पाए गए CD45+ कोशिकाओं में से अधिकांश एएम हैं, जो वायुमार्ग के मुख्य निवासी हैं। इसलिए, BAL को उन मार्करों का आकलन करने के लिए किया गया था जो AMs20,31 की विशेषता है। ये कोशिकाएं CD45+ CD68+Siglec-F+CD11c+ हैं, लेकिन, अन्य माइलॉयड कोशिकाओं के विपरीत, CD11b (चित्रा 4) के उच्च स्तर को व्यक्त नहीं करती हैं। प्रतिरक्षा मार्करों का एक ही संयोजन भी कुल फेफड़ों के होमोजेनेट्स में एएम की पहचान करता है (चित्रा 1 जी, एच)। एएम के अलावा, CD45 + CD68 + Sigle-F + गेट (चित्रा 1 G) में, एक अलग सेल आबादी है जो CD11b के लिए सकारात्मक है लेकिन CD11c के लिए नहीं है। यह CD45+ CD68+Siglec-F+CD11b+CD11c- ल्यूकोसाइट्स की आबादी eosinophils (चित्रा 1G)19,32 का प्रतिनिधित्व करती है।

CD45+ CD68+ SiglecF- कोशिकाओं (चित्रा 1G) के साथ गेट में, एक CD11c + MHC + जनसंख्या है जो फुफ्फुसीय डीसी (चित्रा 1I) का प्रतिनिधित्व करती है। कई जांचकर्ता फुफ्फुसीय डीसी की पहचान CD11c + MHCII + CD24 + 16,18 के रूप में करते हैं। CD24 अभिव्यक्ति का मूल्यांकन इस आबादी की पहचान की पुष्टि करने के लिए किया गया था (चित्रा 5ए)। फेफड़ों के अधिकांश डीसी या तो CD103 + CD11b- या CD103-CD11b + (चित्रा 1J) हैं। CD103+ CD11b- DCs CD103+ पारंपरिक DC का प्रतिनिधित्व करते हैं और CD45+ CD68+ SiglecF-MHCII+CH11c+CD103+CD11b-के रूप में पहचाने जाते हैं। इसके विपरीत, CD103-CD11b+ DC को CD64 अभिव्यक्ति (चित्रा 1K) के आधार पर पारंपरिक डीसी और MoDCs में विभाजित किया गया है। इसलिए, पारंपरिक CD11b+ DC को CD45+CD68+SiglecF-MHCII+CH11c+CD103-CD11b+CD64 के रूप में पहचाना जाता है, जबकि MoDCs को CD45+CD68+SiglecF-MHCII+CH11c+CD103-CD11b+CD64+ के रूप में पहचाना जाता है। . पारंपरिक डीसी के विपरीत, MoDCs डीसी मार्कर CD24 के लिए कम सकारात्मक हैं और पैन-मैक्रोफेज मार्करों के लिए सकारात्मक हैं, जिनमें F4/80, CD64 और MERTK (चित्रा 5A)9,10,11,13,33,34 शामिल हैं।

आईएम और शास्त्रीय और गैर-शास्त्रीय मोनोसाइट्स CD45 + CD68 + Siglec-F-CD11c- / intCD11b + गेट (चित्रा 1L) में हैं और CD64 और GR-1 अभिव्यक्ति (चित्रा 1M) के आधार पर प्रतिष्ठित हैं। CD64, एक पैन-मैक्रोफेज मार्कर, मुख्य रूप से IMs और AMs द्वारा व्यक्त किया जाता है, साथ ही DC का सबसेट भी होता है। शास्त्रीय मोनोसाइट्स को Ly6C + मोनोसाइट्स और गैर-शास्त्रीय मोनोसाइट्स को Ly6C- मोनोसाइट्स के रूप में भी जाना जाता है। मोनोसाइट्स और आईएम दोनों Ly6G के लिए नकारात्मक हैं; हालांकि, शास्त्रीय monocytes Ly6C व्यक्त करते हैं और इसलिए GR-1 के लिए सकारात्मक हैं। इसके विपरीत, अंतरालीय मैक्रोफेज और गैर-शास्त्रीय मोनोसाइट्स दोनों जीआर -1 और Ly6C3, 4,11,16,18,20,35,36 के लिए नकारात्मक हैं। इसके अलावा, गैर-शास्त्रीय मोनोसाइट्स CD11cint हैं, जबकि शास्त्रीय मोनोसाइट्स CD11c-हैं। यद्यपि CD11c अभिव्यक्ति में यह अंतर आमतौर पर आधार रेखा पर दो प्रकार के मोनोसाइट्स को अलग करने के लिए महत्वहीन है, यह शास्त्रीय मोनोसाइट्स जमा होने पर रोग संबंधी स्थितियों के लिए महत्वपूर्ण हो सकता है। उपर्युक्त के आधार पर, अंतरालीय मैक्रोफेज को CD45+CD68+Siglec-F-CD11c-/intCD11b+GR-1-CD64+, शास्त्रीय मोनोसाइट्स को CD45+CD68+Siglec-F-CD11c-CD11c-CD11b+GR-1+CD64-, और गैर-शास्त्रीय मोनोसाइट्स को CD45+CD68+CD11c-1-CD11c-1-CD11c-1 के रूप में परिभाषित किया गया है। . एएम और आईएम दोनों सभी मैक्रोफेज मार्करों के लिए सकारात्मक हैं, जिनमें CD68, CD64, F4/80 और MERTK प्रोटो-ऑन्कोजीन शामिल हैं। हालांकि, आईएम के विपरीत, एएम सीएम के विपरीत सीएक्स 3 सीआर 1-, आईएम के विपरीत हैं, जिसे दो प्रकार के फेफड़ों के मैक्रोफेज 4,37,38,39 (चित्रा 5 बी) की उत्पत्ति में अंतर से समझाया जा सकता है।

Figure 1
चित्रा 1: मुरीन फेफड़ों में मौजूद प्रतिरक्षा कोशिकाओं की गेटिंग रणनीति। मलबे, डबल्स, मृत कोशिकाओं और गैर-प्रतिरक्षा कोशिकाओं (CD45-) (A-C) के सावधानीपूर्वक बहिष्करण के बाद, CD45+ कोशिकाओं को CD68 और GR-1 (D) की अभिव्यक्ति के आधार पर 3 मुख्य समूहों में विभाजित किया गया था। न्यूट्रोफिल CD68-GR-1+ जनसंख्या (E) से संबंधित हैं, जबकि CD68-GR-1-/int जनसंख्या में NK कोशिकाएं, B कोशिकाएं और T कोशिकाएं (F) होती हैं। CD68+ कोशिकाओं को आगे सिग्लेक एफ + कोशिकाओं (जी) में विभाजित किया जा सकता है, जो एएम और ईोसिनोफिल (एच), और सिग्लेक एफ- कोशिकाएं (जी) हैं, जिनमें मोनोसाइट्स, आईएम और डीसी (आई-एम) शामिल हैं। संक्षेप: एसएससी-ए = साइड-बिखरे हुए प्रकाश का चरम क्षेत्र; FSC-A = आगे बिखरे हुए प्रकाश का चरम क्षेत्र; एसएससी-एच = साइड-बिखरे हुए प्रकाश की चोटी की ऊंचाई; एल / डी = जीवित / मृत धुंधला; MHC = प्रमुख हिस्टोकॉम्पैटिबिलिटी कॉम्प्लेक्स; SF = Siglec F; जीआर -1 = जीपीआई-लिंक्ड माइलॉयड भेदभाव मार्कर (Ly-6G); NK = प्राकृतिक हत्यारा; आईएम = अंतरालीय मैक्रोफेज; डीसी = डेंड्राइटिक कोशिकाएं; एएम = वायुकोशीय मैक्रोफेज। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्र 2: फेफड़ों में Ly6G को केवल CD45+CD68-GR-1+CD11b+ कोशिकाओं द्वारा व्यक्त किया जाता है, जिन्हें पॉलीमोर्फोन्यूक्लियर न्यूट्रोफिल के रूप में पहचाना जाता है। कृपया इस आकृति के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 3
चित्रा 3: गेटिंग रणनीति द्वारा एनके कोशिकाओं, टी कोशिकाओं और बी कोशिकाओं की पहचान का सत्यापन। NK 1.1, CD3, और B220 के लिए विशिष्ट मार्करों का उपयोग क्रमशः NK कोशिकाओं, T कोशिकाओं और B कोशिकाओं की पहचान को सत्यापित करने के लिए किया गया था। यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि एनकेटी कोशिकाएं, यदि मौजूद हैं, तो एनके सेल गेट के भीतर सीडी 3 + सेल आबादी में गिर सकती हैं, और एनकेटी कोशिकाओं के साथ एनके के संदूषण से बचने के लिए सावधानी बरतने की आवश्यकता है। संक्षिप्त रूप: एनके = प्राकृतिक हत्यारा; MHC = प्रमुख हिस्टोकॉम्पैटिबिलिटी कॉम्प्लेक्स। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्रा 4: भोले चूहों में ब्रोन्कोएल्वोलर लैवेज द्वारा प्राप्त प्रतिरक्षा कोशिकाओं के बहुमत वायुकोशीय मैक्रोफेज हैं। संक्षेप: एएम = वायुकोशीय मैक्रोफेज; डीसी = डेंड्राइटिक कोशिकाएं; IM = अंतरालीय मैक्रोफेज; एसएससी-ए = साइड-बिखरे हुए प्रकाश का चरम क्षेत्र; FSC-A = आगे बिखरे हुए प्रकाश का चरम क्षेत्र; एसएससी-एच = साइड-बिखरे हुए प्रकाश की चोटी की ऊंचाई; SF = Siglec F; GR-1 = GPI-linked myeloid differentiation marker (Ly-6G)। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 5
चित्रा 5: प्रतिरक्षा कोशिकाओं में विभिन्न मार्करों की अभिव्यक्ति की तुलना। (A) फुफ्फुसीय डीसी में CD24, CD64, MERTK, F4/80, और CD103 अभिव्यक्ति की तुलना। (B) फुफ्फुसीय मैक्रोफेज और मोनोसाइट्स में CD68, CD64, MERTK, F4/80, CD11c, Siglec F (SF), CD11b, और CX3CR1 की तुलना। संक्षेप: डीसी = डेंड्राइटिक कोशिकाएं; MoDCs = मोनोसाइट-व्युत्पन्न डीसी; एएम = वायुकोशीय मैक्रोफेज; आईएम = अंतरालीय मैक्रोफेज; SF = Siglec F; MERTK = माइलॉयड-उपकला-प्रजनन tyrosine kinase। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

BSA बफ़र PBS + 0.5% गोजातीय सीरम एल्ब्यूमिन
पाचन बफर Prewarmed (37 °C) BSA बफर + 5 mg/mL कोलेजनेज प्रकार 1 + 0.2 mg/mL DNase I
धुंधला बफर PBS + 2.5% FBS
फिक्स/ पर्म बफ़र निर्धारण / permeabilization diluent के तीन भागों और Foxp3 / प्रतिलेखन कारक धुंधला बफर सेट के निर्धारण / permeabilization diluent के 1 भाग
परमीबिलाइज़ेशन बफ़र Foxp3 / ट्रांसक्रिप्शन फैक्टर धुंधला बफर सेट से 10x permeabilization बफर शुद्ध विआयनीकृत पानी में 10 बार पतला

तालिका 1: बफ़र्स।

प्रतिजन क्लोन फ्लोरोक्रोम तनूकरण सतह / इंट्रासेल्युलर
CD45 30-F11 APC/CY7 1:100 सतह
Gr-1 RB6-8C5 BV421 1:100 सतह
CD68 FA-11 PerCPCy5.5 1:100 इंट्रासेल्युलर
CD11b M1/70 PECy7 1:100 सतह
Siglec F S17007L FITC 1:100 सतह
CD11c N418 BV650 या BV510 1:100 सतह
CD64 X54-5/7.1 पीई/चकाचौंध 594 1:100 सतह
MHC-II M5/114.15.2 AF700 1:100 सतह
CD103 2.00E+07 पीई / FITC 1:100 सतह
लाइव / मृत फिक्सेबल अब तक पढ़ें मृत सेल स्टेन किट FarRed (APC) या एक्वा (BV510) 1:1000 सतह
CD3 17A2 पीई 1:100 सतह
B220 RA3-6B2 AF488 1:100 सतह
NK1.1 PK136 FITC 1:100 सतह
CD24 30-F1 पीई 1:100 सतह
MERTK 2B10C42 पीई 1:100 सतह
F4/80 BM8 BV605 1:100 सतह
CX3CR1 SA011F11 पीई 1:100 सतह
FcBlock (CD16/ 93 1:100 सतह

तालिका 2: मोनोक्लोनल एंटीबॉडी का उपयोग।

पूरक चित्रा S1: सबसे अच्छा सेलुलर पृथक्करण prewarmed PBS + 0.5% BSA में कोलेजनेज 1 के 5 मिलीग्राम / एमएल द्वारा प्राप्त किया जाता है। सभी अलग-अलग स्थितियों में, DNAse I के 0.2 मिलीग्राम को भी शामिल किया गया था। संक्षेप: बीएसए = गोजातीय सीरम एल्ब्यूमिन; FSC-A = आगे बिखरे हुए प्रकाश का चरम क्षेत्र; एल / डी = जीवित / मृत धुंधला; SF = Siglec F. कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें।

पूरक चित्रा S2: doublets के समावेश के परिणामस्वरूप झूठी-सकारात्मक आबादी हो सकती है। संक्षिप्त नाम: FP = false positive कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें।

पूरक आकृति S3: CD45+ की तुलना में अधिक CD45- में मृत कोशिकाओं के अनुरूप सुविधाएँ हैं। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक चित्रा S4: CD68 के लिए सतह धुंधला फेफड़ों की व्यक्तिगत प्रतिरक्षा कोशिका आबादी को ठीक से अलग करने के लिए पर्याप्त नहीं है। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें।

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Discussion

फुफ्फुसीय प्रतिरक्षा कोशिकाओं की पहचान चुनौतीपूर्ण हो सकती है क्योंकि फेफड़ों में रहने वाले कई प्रतिरक्षा सेल प्रकार और अन्य ऊतकों में रहने वाले उनके समकक्षों की तुलना में उनकी अद्वितीय इम्यूनोफेनोटाइपिक विशेषताओं। कई पैथोलॉजिकल स्थितियों में, फेफड़ों में अलग-अलग फेनोटाइपिक विशेषताओं वाली कोशिकाएं दिखाई देती हैं। उदाहरण के लिए, ब्लीओमाइसिन-प्रेरित फेफड़ों की चोट के परिणामस्वरूप वायुकोशीय अंतरिक्ष में परिसंचारी मोनोसाइट-व्युत्पन्न मैक्रोफेज की भर्ती होती है, जहां वे एक वर्ष तक रह सकते हैं और ब्लीओमाइसिन-प्रेरित फाइब्रोसिस के बाद भी बने रह सकते हैं। ऊतक-निवासी एएमएस के विपरीत, परिसंचारी मोनोसाइट-व्युत्पन्न मैक्रोफेज Siglec FlowCD11b + हैं। मोनोसाइट-व्युत्पन्न मैक्रोफेज की लक्षित कमी के परिणामस्वरूप ब्लीओमाइसिन-मध्यस्थता फुफ्फुसीय फाइब्रोसिस 16,40 का सुधार होता है। इसी तरह की विशेषताओं वाली कोशिकाओं को इन्फ्लूएंजा संक्रमण के दौरान फेफड़ों में भर्ती किया जाता है और स्ट्रेप्टोकोकल निमोनिया 15 के खिलाफ लंबे समय तक सुरक्षा प्रदान करता है।

CD11c और MHC II अभिव्यक्ति के आधार पर, IMs को आगे IM1, IM2 और IM3 में उप-वर्गीकृत किया गया है। IM1 को CD11c-MHC II-के रूप में परिभाषित किया गया है; IM2 को CD11c-MHC II+ के रूप में परिभाषित किया गया है; और IM3 को MHC II+ CD11c+ के रूप में परिभाषित किया गया है। यह प्रस्तावित किया गया है कि IM1, IM2, और IM3 अलग-अलग मैक्रोफेज श्रेणियों के बजाय मैक्रोफेज संक्रमण के लिए मोनोसाइट के शारीरिक चरणों का प्रतिनिधित्व करते हैं, जिसमें IM3 मोनोसाइटिक कंपार्टमेंट 41 का प्रतिनिधित्व करता है। जैसा कि ऊपर उल्लेख किया गया है, MoDCs डीसी मार्कर CD24 के लिए कम सकारात्मक हैं और पैन-मैक्रोफेज मार्करों के लिए सकारात्मक हैं, जिनमें F4/80, CD64, और MERTK9,10,11,13,33,34 शामिल हैं। हालांकि, कई अध्ययनों में CD64+ MERKT+ कोशिकाओं को फुफ्फुसीय मैक्रोफेज 4,10 के रूप में पहचाना जाता है। IM3 और MoDCs दोनों को CD64+ MERKT+ MHCII + CD11C + के रूप में परिभाषित किया गया है, यह सुझाव देते हुए कि ये दो आबादी सबसे अधिक संभावना एक ही सेल प्रकार का प्रतिनिधित्व करती है। इस परिकल्पना के अनुरूप, यहां प्रस्तुत गेटिंग रणनीति एमओडीसी के अलावा, आईएम 3 कोशिकाओं का प्रतिनिधित्व करने वाली एक अलग आबादी की पहचान नहीं करती है।

यहां वर्णित प्रोटोकॉल के महत्वपूर्ण चरणों में शामिल हैं: 1) एकल-सेल निलंबन तैयार करने से पहले फेफड़ों से सभी आसन्न वसा को हटाना, क्योंकि यह रीडआउट को पूर्वाग्रहित कर सकता है; 2) विरोधी CD68 एंटीबॉडी के साथ धुंधला करने से पहले permeabilization. वर्तमान प्रोटोकॉल की एक सीमा यह है कि यह फेफड़ों की गैर-प्रतिरक्षा कोशिकाओं की पहचान नहीं कर सकता है, जैसे कि उपकला (CD45-CD326+ CD31-), एंडोथेलियल कोशिकाएं (CD45-CD326-CD31+), और फाइब्रोब्लास्ट्स। ऐसी आबादी की पहचान के लिए एक अलग दृष्टिकोण 28,29 की आवश्यकता होती है। इसके अलावा, प्रोटोकॉल को सीडी 68, एक इंट्रासेल्युलर मार्कर के लिए धुंधला करने की आवश्यकता होती है, जो एक सीमा पैदा कर सकता है यदि अन्वेषक इंट्रासेल्युलर स्टेनिंग में अनुभव नहीं किया जाता है। मौजूदा तरीकों के संबंध में वर्तमान प्रोटोकॉल और गेटिंग रणनीति का महत्व यह है कि यह रणनीति एक सुव्यवस्थित दृष्टिकोण प्रदान करती है जो फेफड़ों की सभी प्रतिरक्षा आबादी की प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य पहचान की अनुमति देते हुए मार्करों की कम संख्या का उपयोग करती है।

इसके अलावा, एक एकल-सेल निलंबन की तैयारी के लिए एक विस्तृत विधि प्रदान की जाती है जो सेल मृत्यु को कम करती है और फेफड़ों के प्रतिरक्षा सेल डिब्बे की पूरी प्रोफ़ाइल की पहचान की अनुमति देती है। यद्यपि यहां उल्लिखित प्रोटोकॉल स्थिर-राज्य स्थितियों के तहत फेफड़ों की प्रतिरक्षा आबादी के लक्षण वर्णन और पहचान का वर्णन करता है, भविष्य के अनुप्रयोगों में विभिन्न रोग मॉडलों में इन आबादी का आकलन शामिल हो सकता है जहां यह फेफड़ों की प्रतिरक्षा परिदृश्य में रोग-विशिष्ट परिवर्तनों की पहचान करने में मदद कर सकता है। अंत में, यह लेख फेफड़ों की एकल-कोशिका तैयारी के लिए एक सरल और पुन: प्रस्तुत करने योग्य प्रोटोकॉल और 12 अलग-अलग प्रतिरक्षा कोशिका आबादी की पहचान के लिए 9-रंग-आधारित प्रवाह साइटोमेट्री पैनल प्रस्तुत करता है।

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Disclosures

वी.ए. .B के पास ब्रिस्टल-मायर्स स्क्विब, रोश, मर्क, ईएमडी-सेरोनो, बोहरिंगर इंगेलहेम, एस्ट्राजेनेका, नोवार्टिस और डाको द्वारा लाइसेंस प्राप्त पीडी -1 मार्ग पर पेटेंट हैं। लेखकों ने कोई अन्य प्रतिस्पर्धी वित्तीय हितों की घोषणा नहीं की है।

Acknowledgments

इस काम को NIH अनुदान R01CA238263 और R01CA229784 (VAB) द्वारा समर्थित किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10 mL syringe plunger EXELINT 26265
18 G needles BD Precision Glide Needle 305165
21 G needles BD Precision Glide Needle 305195
50 mL conical tubes Falcon 3520
70 μm cell strainer ThermoFisher 22363548
96-well plates Falcon/corning 3799
ACK Lysing Buffer ThermoFisher A10492-01
anti-mouse CD11b Biolegend 101215 For details see Table 2
anti-mouse CD11c Biolegend 117339 / 117337 For details see Table 2
anti-mouse CD45 Biolegend 103115 For details see Table 2
anti-mouse CD64 Biolegend 139319 For details see Table 2
anti-mouse CD68 Biolegend 137009 For details see Table 2
anti-mouse GR-1 Biolegend 108433 For details see Table 2
anti-mouse Siglec F Biolegend 155503 For details see Table 2
AVERTIN Sigma-Aldrich 240486
B220 Biolegend 103228 For details see Table 2
Bovine Serum Albumin (BSA) Sigma-Aldrich 9048-46-8
CD103 Biolegend 121405 / 121419 For details see Table 2
CD24 Biolegend 138503 For details see Table 2
CD3 Biolegend 100205 For details see Table 2
Centrifuge
Collagenase Type 1 Worthington Biochemical Corp LS004196
CX3CR1 Biolegend 149005 For details see Table 2
DNase I Millipore Sigma 10104159001
Ethanol
F4/80 Biolegend 123133 For details see Table 2
FcBlock (CD16/32) Biolegend 101301 For details see Table 2
Fetal Bovine Serum R&D Systems
Fine Serrated Forceps Roboz Surgical Instrument Co
Foxp3 / Transcription Factor Staining Buffer Set ThermoFisher 00-5523-00
Futura Safety Scalpel Merit Medical Systems SMS210
Live/Dead Fixable Far Read Dead Cell Stain Kit ThermoFisher L34973 For details see Table 2
MERTK Biolegend 151505 For details see Table 2
MHC-II Biolegend 107621 For details see Table 2
NK1.1 Biolegend 108705 For details see Table 2
Orbital Shaker VWR Model 200
Petri dish Falcon 351029
Refrigerated benchtop centrifuge SORVAL ST 16R
Small curved scissor Roboz Surgical Instrument Co

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References

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इम्यूनोलॉजी और संक्रमण अंक 177 फेफड़े प्रतिरक्षा कोशिकाओं गेटिंग रणनीति प्रवाह cytometry
म्यूरीन फेफड़े की जन्मजात और अनुकूली प्रतिरक्षा कोशिकाओं की पहचान के लिए फ्लो साइटोमेट्रिक विश्लेषण
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Christofides, A., Cao, C., Pal, R.,… More

Christofides, A., Cao, C., Pal, R., Aksoylar, H. I., Boussiotis, V. A. Flow Cytometric Analysis for Identification of the Innate and Adaptive Immune Cells of Murine Lung. J. Vis. Exp. (177), e62985, doi:10.3791/62985 (2021).

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