Summary
I denne undersøgelse præsenterer vi en effektiv og reproducerbar protokol til at isolere immunpopulationerne i murine åndedrætssystemet. Vi leverer også en metode til identifikation af alle medfødte og adaptive immunceller, der befinder sig i lungerne hos raske mus, ved hjælp af et 9-farvebaseret flowcytometripanel.
Abstract
Luftvejene er i direkte kontakt med det ydre miljø og kræver et præcist reguleret immunsystem for at yde beskyttelse, samtidig med at uønskede reaktioner på miljøantigener undertrykkes. Lunger er vært for flere populationer af medfødte og adaptive immunceller, der giver immunovervågning, men også formidler beskyttende immunresponser. Disse celler, som holder det sunde lungeimmunsystem i balance, deltager også i flere patologiske tilstande som astma, infektioner, autoimmune sygdomme og kræft. Selektiv ekspression af overflade- og intracellulære proteiner giver unikke immunofænotypiske egenskaber til lungens immunceller. Følgelig har flowcytometri en instrumentel rolle i identifikationen af sådanne cellepopulationer under steady-state og patologiske tilstande. Dette papir præsenterer en protokol, der beskriver en konsekvent og reproducerbar metode til at identificere de immunceller, der befinder sig i lungerne hos raske mus under steady-state betingelser. Denne protokol kan dog også bruges til at identificere ændringer i disse cellepopulationer i forskellige sygdomsmodeller for at hjælpe med at identificere sygdomsspecifikke ændringer i lungeimmunlandskabet.
Introduction
Murine luftvejene indeholder et unikt immunsystem, der er ansvarligt for at bekæmpe patogener og opretholde immunhomeostase. Lungeimmunsystemet består af cellulære populationer med signifikant heterogenitet i deres fænotype, funktion, oprindelse og placering. Residente alveolære makrofager (AMs), der hovedsagelig stammer fra føtale monocytter, befinder sig i det alveolære lumen1, mens knoglemarvsafledte interstitielle makrofager (IM'er) befinder sig i lungeparenchyma2. IM'er kan yderligere underklassificeres ved hjælp af udtrykket CD206. CD206+ IM'er befolker det peribronchiale og perivaskulære område, mens CD206- IM'er er placeret ved det alveolære interstitium3. Et par underklassifikationer af IM'er er blevet foreslået for nylig3,4,5,6. Selvom IM'er er mindre undersøgt end AMs, understøtter de seneste beviser deres afgørende rolle i reguleringen af immunsystemet i lungen7. Derudover udtrykkes CD206 også i alternativt aktiverede AMs8.
Pulmonale dendritiske celler (LLC'er) er en anden heterogen gruppe af lungeimmunceller med hensyn til deres funktionelle egenskaber, placering og oprindelse. Fire underkategorier af DC'er er blevet beskrevet i lungen: konventionelle CD103 + DC'er (også kendt som cDC1), konventionelle CD11b + DC'er (også kendt som cDC2), monocytafledte DC'er (MoDC'er) og plasmacytoid DC'er9,10,11,12,13. De første tre underklasser kan defineres som major histocompatibility complex (MHC) II+CD11c+9,10,14,15. Plasmacytoid-DCs udtrykker MHC II og er mellemliggende positive for CD11c, men udtrykker høje niveauer af B220 og PDCA-19,13,16. I naive murinlunger er CD103DC'er og CD11bDC'er placeret i luftvejsinterstitiumet, mens plasmacytoid-LLC'er er placeret i det alveolære interstitium17.
To store populationer af monocytter befinder sig i lungen under steady state: klassiske monocytter og ikke-klassiske monocytter. Klassiske monocytter er Ly6C + og er kritiske for det indledende inflammatoriske respons. I modsætning hertil er ikke-klassiske monocytter Ly6C- og er blevet bredt betragtet som antiinflammatoriske celler3,16,18. For nylig blev en yderligere population af CD64 + CD16.2+ monocytter beskrevet, som stammer fra Ly6C-monocytter og giver anledning til CD206+ IMs3.
Eosinofiler forekommer hovedsageligt i lungerne under helminthinfektion eller allergiske tilstande. Der er dog et lille antal eosinofiler i lungeparenchymen under steady state, kendt som bosiddende eosinofiler. I modsætning til de bosiddende eosinofiler findes inflammatoriske eosinofiler i lungeinterstitium og bronchoalveolær skylning (BAL). I musemodeller af husstøvmide (HDM) rekrutteres inflammatoriske eosinofiler i lungen efter antigenmedieret stimulering. Det er blevet foreslået, at hjemmehørende eosinofiler kan have en regulerende rolle i allergi ved at hæmme T-hjælper 2 (Th2) sensibilisering over for HDM19.
I modsætning til resten af lunge myeloide celler udtrykker neutrofiler Ly6G, men ikke CD68 og er kendetegnet ved en signatur af CD68-Ly6G + immunophenotype16,20,21. Visualiseringsundersøgelser har vist, at lungen under steady state reserverer en pulje neutrofiler i det intravaskulære rum og er vært for et betydeligt antal ekstravaskulære neutrofiler22. I lighed med eosinofiler findes neutrofiler ikke i BAL ved steady state; Imidlertid driver flere former for immunstimulering, såsom LPS-udfordring, astma eller lungebetændelse, neutrofiler ind i det alveolære lumen, hvilket resulterer i deres tilstedeværelse i BAL21,22,23.
Et betydeligt antal CD45+-celler i lungen repræsenterer naturlige dræberceller (NK), T-celler og B-celler og er negative for de fleste myeloide markører24. I lungerne hos naive mus kan disse tre celletyper identificeres ud fra ekspressionen af CD11b og MHC II18. Omkring 25% af lunge-CD45+ cellerne er B-celler, mens procentdelen af NK-celler er højere i lungen end andre lymfoide og ikke-lymfoide væv24,25,26. Blandt lunge-T-celler er en betydelig brøkdel CD4-CD8- og spiller en vigtig rolle i luftvejsinfektioner26.
Fordi lungen er vært for et meget komplekst og unikt immunsystem, er der udviklet og rapporteret flere gating strategier til identifikation af lungeimmunceller16,18,20,27. Gating-strategien beskrevet heri giver en omfattende og reproducerbar måde at identificere op til 12 forskellige lunge myeloide og ikke-myeloide immunpopulationer ved hjælp af 9 markører. Yderligere markører er blevet brugt til at validere resultaterne. Desuden er der tilvejebragt en detaljeret metode til fremstilling af en enkeltcellesuspension, der minimerer celledød og muliggør identifikation af den mest komplette profil af lungens immuncellerum. Det skal bemærkes, at identifikationen af ikke-immune celler i lungen, såsom epitelceller (CD45-CD326 + CD31-), endotelceller (CD45-CD326-CD31+) og fibroblaster kræver en anden tilgang28,29. Identifikation af sådanne populationer er ikke inkluderet i protokollen og metoden beskrevet her.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle undersøgelser og eksperimenter beskrevet i denne protokol blev udført under retningslinjer i henhold til Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) fra Beth Israel Deaconess Medical Center. Seks til ti uger gamle C57BL/6 mus af begge køn blev brugt til at udvikle denne protokol.
1. Kirurgisk udskæring og vævsforberedelse
- Aflive musen ved intraperitonealt at injicere 1 ml tribromethanol (fremstillet i henhold til standardprotokollen; Tabel over materialer).
BEMÆRK: CO2-kvælning bør undgås i lungeundersøgelser, da det kan forårsage lungeskade og ændre lungeimmuncellernes egenskaber og egenskaber. Cervikal dislokation bør også undgås, da det kan forårsage mekanisk skade på lungen. - Overfør musen til et rent og dedikeret område til kirurgisk operation.
- Stabiliser musens dorsale side nedad ved hjælp af nåle eller tape på de fire ekstremiteter. Brug 70% ethanol til at desinficere huden i det ventrale område.
- Udfør et snit i huden, fra nakken til maven. Fjern forsigtigt huden fra brystområdet.
- Fjern forsigtigt brystbenet og ribbenene.
- Skyl lungerne ved at injicere 10 ml kold PBS direkte i højre ventrikel ved hjælp af en 18-21 G nål, indtil lungerne bliver helt hvide.
- Fjern forsigtigt thymus og hjerte uden at røre lungerne.
- Fjern forsigtigt lungerne fra det omgivende væv og overfør dem til et rør med kold BSA-buffer (tabel 1).
BEMÆRK: Der skal gøres en indsats for at fjerne alt tilstødende fedt fra lungerne, inden du yderligere forbereder enkeltcellesuspensionen, da dette kan skævvride udlæsningerne.
2. Fremstilling af enkeltcellesuspension
- Overfør lungerne til en tom petriskål og hak dem med to fine skalpeller. Overfør alle stykker af den hakkede lunge til et nyt 50 ml konisk rør. Brug 5 ml fordøjelsesbuffer til at vaske pladen og tilsæt den til 50 ml-røret, der indeholder hakket lunge (tabel 1).
BEMÆRK: Fordøjelsesbufferen skal fremstilles umiddelbart før brug. Brug 5 mg/ml kollagenase28. Kombination af 1 eller 5 mg kollagenase med BSA-buffer eller proteinfri PBS forbedrede ikke resultaterne (supplerende figur S1). - Fastgør låget på røret, og fordøje lungen i 30 minutter på en orbitalryster med en hastighed på 150 o / min ved 37 ° C. Stop reaktionen ved at tilsætte 10 ml kold BSA-buffer.
- Efter fordøjelsen skal du bruge en 18 G nål til at blande og opløse lungestykkerne. Anbring en 70 μm filtersil øverst på et nyt 50 ml konisk rør.
BEMÆRK: Brug af et mindre mikronfilter kan resultere i tab af større myeloide populationer. - Overfør langsomt den fordøjede lungeblanding direkte på silen. Brug gummisiden af et 10 ml sprøjtestempel til at smadre de resterende lungestykker på filteret. Vask det forarbejdede materiale på filteret med BSA-buffer.
- Centrifugering af enkeltcellesuspensionen ved 350 × g i 8 minutter ved 4 °C.
- Kassér forsigtigt supernatanten og resuspend cellerne i 1 ml ACK lysis buffer. Bland godt ved hjælp af en 1 ml pipet, og inkuber i 90 s ved stuetemperatur.
- Tilsæt 10 ml kold BSA-buffer for at stoppe reaktionen og centrifugen ved 350 × g i 7 minutter ved 4 ° C.Kassér forsigtigt supernatanten og brug pelleten i farvningsbufferen igen for at tælle cellerne ved hjælp af et hæmocytometer.
- Resuspend cellerne i en koncentration på 5 × 106 celler/ml og brug dem til overfladefarvning (se pkt. 3).
BEMÆRK: Til dette formål skal du plade cellerne i en 96-brønds rund bundplade efterfulgt af antistoffarvning og vask. Hvis en pladecentrifuge ikke er tilgængelig, skal du bruge flowrør i stedet for plader. Med denne protokol kan ~ 15-20 × 106 celler pr. Lunge opnås fra en 6-10 uger gammel C57BL / 6 mus af gennemsnitlig størrelse.
3. Farvning af overfladeantistof
- Overfør 1 × 106 celler i 200 μL pr. Brønd i en 96-brønds plade. Centrifugering af pladen ved 350 × g i 7 minutter ved 4 °C. I mellemtiden fremstilles Fc-blokopløsningen ved at fortynde anti-16/32-antistoffet (1:100) i farvningsbufferen (tabel 1).
- Resuspend cellerne i 50 μL af den forberedte Fc-blokerende opløsning (Table of Materials) og inkuber i 15-20 minutter ved 4 °C eller på is.
- Der tilsættes 150 μL farvningsbuffer, og pladen centrifugeres ved 350 × g i 5 minutter ved 4 °C. I mellemtiden skal du forberede overfladeantistofcocktailen ved at fortynde overfladeantistoffer (1:100; Tabel 2) i farvningsbuffer.
BEMÆRK: (i) Anti-16/32-antistof til Fc-blokering kan anvendes sammen med overfladeantistofferne i samme blanding. (ii) Hvis der anvendes et fargenskabsstof, der kan fikseres levedygtighed, tilsættes det til overfladeantistofcocktailen ved en fortynding på 1:1.000. - Resuspend cellerne i 50 μL af den forberedte overfladeantistofcocktail og inkuber i 30-40 minutter ved 4 ° C i mørket. Vask cellerne med farvningsbuffer to gange.
BEMÆRK: Hvis der ikke kræves intracellulær farvning, skal du suspendere cellerne igen i 200 μL farvningsbuffer og fortsætte direkte til erhvervelsen af data om flowcytometeret. Alternativt kan celler fastgøres og opbevares ved 4 °C til senere erhvervelse. Vi anbefaler at bruge cellerne til flowcytometri inden for 24 timer.
4. Cellefiksering og intracellulær farvning
- Forbered fikserings-/permeabiliseringsbufferen (Fix/Perm-bufferen) ved at blande tre dele fikserings-/permeabiliseringskoncentrat og 1 del af fikserings-/permeabiliseringsfortyndingsfortyndende af FoxP3/Transcription Factor Staining Buffer Set (tabel 1).
- Resuspend cellerne i 50 μL af den forberedte Fix/Perm Buffer pr. brønd på 96-brøndspladen, hvor cellerne blev belagt som beskrevet i punkt 3, og inkuber dem i 20-25 minutter ved 4 °C i mørke.
- Fortynd 10x permeabiliseringsbufferen som 1: 10 i renset deioniseret vand for at forberede 1x permeabiliseringsbuffer.
- Vask cellerne en gang med 1x permeabiliseringsbuffer. I mellemtiden forberedes den intracellulære antistofcocktail ved at fortynde intracellulære antistoffer (1:100) i 1 ml permeabiliseringsbuffer.
- Resuspend cellerne ved hjælp af 50 μL af den forberedte overfladeantistofcocktail pr. celle i 96-brøndspladen og inkuber i 40 minutter ved 4 ° C i mørket.
- Vask cellerne en gang med permeabiliseringsbuffer og en gang med farvningsbuffer. Efter den endelige vask skal cellerne suspenderes igen i 200 μL farvningsbuffer.
BEMÆRK: Hvis der ikke findes et flowcytometer med pladelæser, skal du overføre cellerne til flowcytometrirør. - Der opnås mindst 1,5 × 106 celler pr. prøve på flowcytometeret.
BEMÆRK: For enkeltfarver og ikke-tilbageholdte kontrolprøver vil 0,5-1 × 106 celler pr. Prøve være tilstrækkeligt. Det anbefales at titrere de enkelte antistoffer, der anvendes til at opnå optimal farvning og reducere omkostningerne. Den nuværende protokol er blevet optimeret ved hjælp af Fix/Perm Buffer fremstillet ved hjælp af FoxP3-farvningsbuffersættet. Fordi CD68 er et cytoplasmatisk og ikke en nuklear markør, kan andre permeabiliseringsopløsninger såsom en lav koncentration af paraformaldehyd eller cytofix / cytopermsæt fra forskellige leverandører være tilstrækkelige.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Gating strategi
Det første skridt i vores gating-strategi er udelukkelsen af snavs og doublets (figur 1A). Omhyggelig udelukkelse af doublets er afgørende for at undgå falsk-positive populationer (supplerende figur S2). Derefter identificeres immunceller ved hjælp af CD45 +, en markør for hæmatopoietiske celler (figur 1B). Den levende-døde plet kan tilføjes for at udelukke døde celler. Denne protokol resulterer imidlertid i døden af <5% af CD45 + -cellerne (figur 1C), mens flere CD45-celler identificeres som døde (supplerende figur S3).
For at identificere monocytter og neutrofiler foretrækker vi i modsætning til tidligere undersøgelser, der brugte specifikke antistoffer for hver af disse populationer16,18, at bruge et anti-GR-1-antistof, der identificerer både Ly6C + og Ly6G + celler. Brug af anti-GR-1-antistoffet sammen med anti-CD68 muliggør adskillelse af lungeimmuncellerne i tre klynger: CD68-GR-1+, CD68+ (der yderligere kan identificeres som GR-1+ eller GR-1-) og CD68-GR-1-/int (figur 1D). CD68 er en markør, der overvejende detekteres intracellulært. Surface CD68 blev undersøgt, men kunne ikke påvises uden fiksering/permeabilisering (supplerende figur S4).
Polymorfonukleære celler (neutrofiler) blev identificeret som CD45+ CD68-GR-1+CD11b+ (figur 1E). Disse resultater blev verificeret ved hjælp af GR1 sammen med et antistof, der er specifikt for Ly6G (figur 2), en unik markør for polymorfonukleære neutrofiler16,18,27. Inden for CD45+CD68-GR-1-/int-populationen er ca. 10-20 % MHCII- og CD11blow og repræsenterer NK-cellerne (figur 1F). NK1.1, en unik markør for NK-celler, blev brugt til at bekræfte dette (figur 3) 25,30. CD45+CD68-GR1-/intCD11b-populationen består af MHCII-T-celler og MHCII+ B-celler (figur 1F). To yderligere antistoffer blev anvendt til at verificere T-celler og B-celler-CD3 og B220, henholdsvis (figur 3).
Hos raske mus under steady-state-forhold er størstedelen af CD45+-cellerne, der påvises i BAL, AMs, de vigtigste beboere i luftvejene. Derfor blev BAL udført for at vurdere de markører, der karakteriserer AMs20,31. Disse celler er CD45 + CD68 + Siglec-F + CD11c +, men i modsætning til andre myeloide celler udtrykker de ikke høje niveauer af CD11b (figur 4). Den samme kombination af immunmarkører identificerer også AMs i homogenater af totale lunger (figur 1G,H). Ud over AMs er der i CD45 + CD68 + Sigle-F + -porten (figur 1G) en særskilt cellepopulation, der er positiv for CD11b, men ikke for CD11c. Denne CD45+ CD68 + Siglec-F + CD11b + CD11c- population af leukocytter repræsenterer eosinofiler (figur 1G) 19,32.
I porten med CD45 + CD68 + SiglecF-cellerne (figur 1G) er der en CD11c + MHC + population, der repræsenterer lunge-LLC'er (figur 1I). Flere efterforskere identificerer lunge-VC'er som CD11c + MHCII + CD24 + 16,18. CD24-ekspression blev vurderet for at bekræfte denne populations identitet (figur 5A). Størstedelen af lunge-VC'erne er enten CD103+CD11b- eller CD103-CD11b+ (figur 1J). CD103+CD11b-DCs repræsenterer CD103+ konventionelle DCs og er identificeret som CD45+CD68+SiglecF-MHCII+CH11c+CD103+CD11b-. I modsætning hertil er CD103-CD11b + DCs opdelt i konventionelleDC'er og MoDC'er baseret på CD64-udtryk (figur 1K). Derfor identificeres konventionelle CD11b + LLC'er som CD45 + CD68 + SiglecF-MHCII + CH11c + CD103-CD11b + CD64 - mens MoDC'erne identificeres som CD45 + CD68 + SiglecF-MHCII + CH11c + CD103-CD11b + CD64 + . I modsætning til konventionelle DC'er er MoDC'er lavpositive for DC-markøren CD24 og positive for pan-makrofagmarkører, herunder F4/80, CD64 og MERTK (figur 5A) 9,10,11,13,33,34.
IM'er og klassiske og ikke-klassiske monocytter findes i CD45+CD68+Siglec-F-CD11c-/intCD11b+-porten (figur 1L) og skelnes ud fra CD64- og GR-1-ekspression (figur 1M). CD64, en pan-makrofagmarkør, udtrykkes hovedsageligt af IM'er og AM'er samt en delmængde af DCs. Klassiske monocytter er også kendt som Ly6C + monocytter og ikke-klassiske monocytter som Ly6C-monocytter. Både monocytter og IM'er er negative for Ly6G; klassiske monocytter udtrykker dog Ly6C og er derfor positive for GR-1. I modsætning hertil er både interstitielle makrofager og ikke-klassiske monocytter negative for GR-1 og Ly6C3,4,11,16,18,20,35,36. Derudover er ikke-klassiske monocytter CD11cint, mens klassiske monocytter er CD11c-. Selvom denne forskel i CD11c-ekspression generelt er ubetydelig for at skelne mellem de to typer monocytter ved baseline, kan det være kritisk for patologiske tilstande, når klassiske monocytter akkumuleres. På baggrund af ovenstående defineres interstitielle makrofager som CD45+CD68+Siglec-F-CD11c-/intCD11b+GR-1-CD64+, klassiske monocytter som CD45+CD68+Siglec-F-CD11c-CD11b+GR-1+CD64-, og ikke-klassiske monocytter som CD45+CD68+CD11c-/intCD11b+GR-1-CD64- . Både AMs og IM'er er positive for alle makrofagmarkører, herunder CD68, CD64, F4/80 og MERTK proto-onkogen. I modsætning til IM'er er AV'er imidlertid CX3CR1-, i modsætning til IM'er, hvilket kan forklares med forskellen i oprindelsen af de to typer lungemakrofager4,37,38,39 (figur 5B).
Figur 1: Gating-strategi for immunceller, der er til stede i murinelungen. Efter omhyggelig udelukkelse af snavs, dubleter, døde celler og de ikke-immune celler (CD45-) (A-C) blev CD45 + -celler adskilt i 3 hovedklynger baseret på ekspressionen af CD68 og GR-1 (D). Neutrofiler tilhører CD68-GR-1+ populationen (E), mens CD68-GR-1-/int-populationen består af NK-celler, B-celler og T-celler (F). CD68+ celler kan yderligere opdeles i Siglec F + celler (G), som er AMs og eosinofiler (H) og Siglec F-celler (G), som består af monocytter, IM'er og DCs (I-M). Forkortelser: SSC-A = topareal af side-spredt lys; FSC-A = topområde af fremadspredt lys; SSC-H = tophøjde af sidepredt lys; L / D = levende / død farvning; MHC = stort histokompatibilitetskompleks; SF = Siglec F; GR-1 = GPI-bundet myeloid differentieringsmarkør (Ly-6G); NK = naturlig morder; IM'er = interstitielle makrofager; DCs = dendritiske celler; AMs = alveolære makrofager. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Ly6G i lungen udtrykkes kun af CD45+CD68-GR-1+CD11b+-celler identificeret som polymorfonukleære neutrofiler.
Figur 3: Verifikation af identifikation af NK-celler, T-celler og B-celler ved hjælp af gating-strategien. Markører, der er specifikke for NK 1.1, CD3 og B220, blev brugt til at verificere identifikationen af henholdsvis NK-celler, T-celler og B-celler. Det skal bemærkes, at NKT-celler, hvis de er til stede, kan falde i CD3+ -cellepopulationen inden for NK-celleporten, og der kræves forsigtighed for at undgå forurening af NK med NKT-celler. Forkortelser: NK = naturlig morder; MHC = stort histokompatibilitetskompleks. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: Størstedelen af de immunceller, der opnås ved bronchoalveolær skylning hos naive mus, er alveolære makrofager. Forkortelser: AMs = alveolære makrofager; DCs = dendritiske celler; IM = interstitiel makrofag; SSC-A = topareal af sidepredt lys; FSC-A = topområde af fremadspredt lys; SSC-H = tophøjde af sidepredt lys; SF = Siglec F; GR-1 = GPI-bundet myeloid differentieringsmarkør (Ly-6G). Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 5: Sammenligning af ekspressionen af forskellige markører i immunceller. (A) Sammenligning af CD24-, CD64-, MERTK-, F4/80- og CD103-ekspression i lunge-DC'er. (B) Sammenligning af CD68, CD64, MERTK, F4/80, CD11c, Siglec F (SF), CD11b og CX3CR1 i lungemakrofager og monocytter. Forkortelser: DCs = dendritiske celler; MoDC'er = monocytafledte LLC'er; AMs = alveolære makrofager; IM'er = interstitielle makrofager; SF = Siglec F; MERTK = myeloid-epitel-reproduktiv tyrosinkinase. Klik her for at se en større version af denne figur.
| BSA-buffer | PBS + 0,5% Bovin serumalbumin | ||
| Fordøjelsesbuffer | Forvarmet (37 °C) BSA-buffer + 5 mg/ml kollagenase type 1 + 0,2 mg/ml DNase I | ||
| Farvning buffer | PBS + 2,5% FBS | ||
| Fix/Perm Buffer | Tre dele fikserings-/permeabiliseringsfortyndingsmiddel og 1 del af fikserings-/permeabiliseringsfortyndingsfortyndende af Foxp3/Transcription Factor Staining Buffer Set | ||
| Permeabiliseringsbuffer | 10x permeabiliseringsbuffer fra Foxp3 / Transcription Factor farvning Buffer Set fortyndet 10 gange i renset deioniseret vand | ||
Tabel 1: Buffere.
| Antigen | Klon | Fluorokrom | Fortynding | Overflade/intracellulær |
| Cd45 | 30-F11 | APC/CY7 | 1:100 | Overflade |
| Gr-1 | RB6-8C5 | BV421 | 1:100 | Overflade |
| Cd68 | FA-11 | PerCPCy5.5 | 1:100 | Intracellulære |
| CD11b | M1/70 | PECy7 | 1:100 | Overflade |
| Siglec F | S17007L | FITC | 1:100 | Overflade |
| CD11c | N418 | BV650 eller BV510 | 1:100 | Overflade |
| Cd64 | X54-5/7.1 | PE/Blænding 594 | 1:100 | Overflade |
| MHC-II | M5/114.15.2 | AF700 | 1:100 | Overflade |
| CD103 | 2.00E+07 | PE / FITC | 1:100 | Overflade |
| Live/Dead Fixable Far Read Dead Cell Stain Kit | FarRed (APC) eller Aqua (BV510) | 1:1000 | Overflade | |
| CD3 | 17A2 | PE | 1:100 | Overflade |
| B220 | RA3-6B2 | Af488 | 1:100 | Overflade |
| NK1.1 | PK136 | FITC | 1:100 | Overflade |
| Cd24 | 30-F1 | PE | 1:100 | Overflade |
| MERTK | 2B10C42 | PE | 1:100 | Overflade |
| F4/80 | BM8 | BV605 | 1:100 | Overflade |
| CX3CR1 | SA011F11 | PE | 1:100 | Overflade |
| FcBlock (CD16/32) | 93 | 1:100 | Overflade |
Tabel 2: Anvendelse af monoklonale antistoffer.
Supplerende figur S1: Den bedste cellulære dissociation opnås ved 5 mg / ml kollagenase 1 i forvarmet PBS + 0,5% BSA. Under alle forskellige forhold var 0,2 mg DNAse I også inkluderet. Forkortelser: BSA = bovin serumalbumin; FSC-A = topområde af fremadspredt lys; L / D = levende / død farvning; SF = Siglec F. Klik her for at downloade denne fil.
Supplerende figur S2: Inkludering af dubletter kan resultere i falsk-positive populationer. Forkortelse: FP = falsk positiv. Klik her for at downloade denne fil.
Supplerende figur S3: Mere CD45- end CD45+ har funktioner, der er i overensstemmelse med døde celler.
Supplerende figur S4: Overfladefarvning for CD68 er ikke tilstrækkelig til korrekt at skelne mellem de enkelte immuncellepopulationer i lungen. Klik her for at downloade denne fil.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Identifikation af lungeimmunceller kan være udfordrende på grund af de mange immuncelletyper, der bor i lungen og deres unikke immunophenotypiske egenskaber sammenlignet med deres modparter, der bor i andre væv. Under flere patologiske tilstande forekommer celler med forskellige fænotypiske træk i lungerne. For eksempel resulterer bleomycin-induceret lungeskade i rekruttering af cirkulerende monocytafledte makrofager i det alveolære rum, hvor de kan forblive i så længe som et år og endda fortsætte efter bleomycin-induceret fibrose. I modsætning til vævsresidenterede AMs er de cirkulerende monocytafledte makrofager Siglec FlowCD11b+. Målrettet udtømning af de monocytafledte makrofager resulterer i forbedring af bleomycinmedieret lungefibrose16,40. Celler med lignende træk rekrutteres til lungerne under influenzainfektion og giver langvarig beskyttelse mod streptokoklungebetændelse15.
Baseret på CD11c- og MHC II-udtryk er IM'er blevet yderligere underkategoriseret i IM1, IM2 og IM3. IM1 er immunophenotypisk defineret som CD11c-MHC II-; IM2 er defineret som CD11c-MHC II+; og IM3 er defineret som MHC II+CD11c+. Det er blevet foreslået, at IM1, IM2 og IM3 repræsenterer de fysiologiske stadier af monocyt til makrofagovergang snarere end forskellige makrofagkategorier, hvor IM3 repræsenterer det monocytiske rum41. Som nævnt ovenfor er MoDC'er lavpositive for DC-markøren CD24 og positive for pan-makrofagmarkører, herunder F4/80, CD64 og MERTK9,10,11,13,33,34. Imidlertid identificerer flere undersøgelser CD64 + MERKT + celler som lungemakrofager4,10. Både IM3 og MoDC'er er blevet defineret som CD64 + MERKT + MHCII + CD11C +, hvilket tyder på, at disse to populationer sandsynligvis repræsenterer den samme celletype. I overensstemmelse med denne hypotese identificerer gating-strategien, der præsenteres her, ikke en særskilt population, der repræsenterer IM3-celler, ud over MoDC'er.
Kritiske trin i protokollen beskrevet her omfatter: 1) fjernelse af alt tilstødende fedt fra lungerne, før du forbereder enkeltcellesuspensionen, da dette kan skævvride udlæsningerne; 2) permeabilisering før farvning med anti-CD68-antistoffet. En begrænsning af den nuværende protokol er, at den ikke kan identificere ikke-immune celler i lungen, såsom epitel (CD45-CD326 + CD31-), endotelceller (CD45-CD326-CD31+) og fibroblaster. Identifikation af sådanne populationer kræver en anden tilgang28,29. Derudover kræver protokollen farvning for CD68, en intracellulær markør, hvilket kan udgøre en begrænsning, hvis investigator ikke har erfaring med intracellulær farvning. Betydningen af den nuværende protokol og gating-strategi med hensyn til eksisterende metoder er, at denne strategi giver en strømlinet tilgang, der bruger et lavere antal markører, samtidig med at den tillader reproducerbar identifikation af alle lungepopulationer.
Desuden er der tilvejebragt en detaljeret metode til fremstilling af en enkeltcellesuspension, der minimerer celledød og muliggør identifikation af en komplet profil af lungens immuncellerum. Selvom den protokol, der er skitseret her, beskriver karakteriseringen og identifikationen af lungeimmunpopulationer under steady-state-forhold, kan fremtidige anvendelser omfatte vurdering af disse populationer i forskellige sygdomsmodeller, hvor det kan hjælpe med at identificere sygdomsspecifikke ændringer i lungeimmunlandskabet. Afslutningsvis præsenterer denne artikel en enkel og reproducerbar protokol til lunge-enkeltcellepræparat og et 9-farvebaseret flowcytometripanel til identifikation af 12 forskellige immuncellepopulationer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
V.A.B. har patenter på PD-1-vejen licenseret af Bristol-Myers Squibb, Roche, Merck, EMD-Serono, Boehringer Ingelheim, AstraZeneca, Novartis og Dako. Forfatterne erklærer ingen andre konkurrerende økonomiske interesser.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af NIH-tilskud R01CA238263 og R01CA229784 (VAB).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 mL syringe plunger | EXELINT | 26265 | |
| 18 G needles | BD Precision Glide Needle | 305165 | |
| 21 G needles | BD Precision Glide Needle | 305195 | |
| 50 mL conical tubes | Falcon | 3520 | |
| 70 μm cell strainer | ThermoFisher | 22363548 | |
| 96-well plates | Falcon/corning | 3799 | |
| ACK Lysing Buffer | ThermoFisher | A10492-01 | |
| anti-mouse CD11b | Biolegend | 101215 | For details see Table 2 |
| anti-mouse CD11c | Biolegend | 117339 / 117337 | For details see Table 2 |
| anti-mouse CD45 | Biolegend | 103115 | For details see Table 2 |
| anti-mouse CD64 | Biolegend | 139319 | For details see Table 2 |
| anti-mouse CD68 | Biolegend | 137009 | For details see Table 2 |
| anti-mouse GR-1 | Biolegend | 108433 | For details see Table 2 |
| anti-mouse Siglec F | Biolegend | 155503 | For details see Table 2 |
| AVERTIN | Sigma-Aldrich | 240486 | |
| B220 | Biolegend | 103228 | For details see Table 2 |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | 9048-46-8 | |
| CD103 | Biolegend | 121405 / 121419 | For details see Table 2 |
| CD24 | Biolegend | 138503 | For details see Table 2 |
| CD3 | Biolegend | 100205 | For details see Table 2 |
| Centrifuge | |||
| Collagenase Type 1 | Worthington Biochemical Corp | LS004196 | |
| CX3CR1 | Biolegend | 149005 | For details see Table 2 |
| DNase I | Millipore Sigma | 10104159001 | |
| Ethanol | |||
| F4/80 | Biolegend | 123133 | For details see Table 2 |
| FcBlock (CD16/32) | Biolegend | 101301 | For details see Table 2 |
| Fetal Bovine Serum | R&D Systems | ||
| Fine Serrated Forceps | Roboz Surgical Instrument Co | ||
| Foxp3 / Transcription Factor Staining Buffer Set | ThermoFisher | 00-5523-00 | |
| Futura Safety Scalpel | Merit Medical Systems | SMS210 | |
| Live/Dead Fixable Far Read Dead Cell Stain Kit | ThermoFisher | L34973 | For details see Table 2 |
| MERTK | Biolegend | 151505 | For details see Table 2 |
| MHC-II | Biolegend | 107621 | For details see Table 2 |
| NK1.1 | Biolegend | 108705 | For details see Table 2 |
| Orbital Shaker | VWR | Model 200 | |
| Petri dish | Falcon | 351029 | |
| Refrigerated benchtop centrifuge | SORVAL ST 16R | ||
| Small curved scissor | Roboz Surgical Instrument Co |
References
- Guilliams, M., et al. Alveolar macrophages develop from fetal monocytes that differentiate into long-lived cells in the first week of life via GM-CSF. Journal of Experimental Medicine. 210 (10), 1977-1992 (2013).
- Tan, S. Y., Krasnow, M. A.
- Schyns, J., et al. Non-classical tissue monocytes and two functionally distinct populations of interstitial macrophages populate the mouse lung. Nature Communications. 10 (1), 3964 (2019).
- Gibbings, S. L., et al. Three unique interstitial macrophages in the murine lung at steady state. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 57 (1), 66-76 (2017).
- Ural, B. B., et al. Identification of a nerve-associated, lung-resident interstitial macrophage subset with distinct localization and immunoregulatory properties. Science Immunology. 5 (45), 8756 (2020).
- Chakarov, S., et al. Two distinct interstitial macrophage populations coexist across tissues in specific subtissular niches. Science. 363 (6432), (2019).
- Liegeois, M., Legrand, C., Desmet, C. J., Marichal, T., Bureau, F. The interstitial macrophage: A long-neglected piece in the puzzle of lung immunity. Cellular Immunology. 330, 91-96 (2018).
- Stouch, A. N., et al. IkappaB kinase activity drives fetal lung macrophage maturation along a non-M1/M2 paradigm. Journal of Immunology. 193 (3), 1184-1193 (2014).
- Kopf, M., Schneider, C., Nobs, S. P. The development and function of lung-resident macrophages and dendritic cells. Nature Immunology. 16 (1), 36-44 (2015).
- Plantinga, M., et al. Conventional and monocyte-derived CD11b(+) dendritic cells initiate and maintain T helper 2 cell-mediated immunity to house dust mite allergen. Immunity. 38 (2), 322-335 (2013).
- Liu, H., et al. Dendritic cell trafficking and function in rare lung diseases. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 57 (4), 393-402 (2017).
- Cook, P. C., MacDonald, A. S.
- Guilliams, M., Lambrecht, B. N., Hammad, H. Division of labor between lung dendritic cells and macrophages in the defense against pulmonary infections. Mucosal Immunology. 6 (3), 464-473 (2013).
- Nobs, S. P., et al. PPARγ in dendritic cells and T cells drives pathogenic type-2 effector responses in lung inflammation. Journal of Experimental Medicine. 214 (10), 3015-3035 (2017).
- Aegerter, H., et al. Influenza-induced monocyte-derived alveolar macrophages confer prolonged antibacterial protection. Nature Immunology. 21 (2), 145-157 (2020).
- Misharin, A. V., Morales-Nebreda, L., Mutlu, G. M., Budinger, G. R., Perlman, H. Flow cytometric analysis of macrophages and dendritic cell subsets in the mouse lung. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 49 (4), 503-510 (2013).
- Hoffmann, F. M., et al. Distribution and interaction of murine pulmonary phagocytes in the naive and allergic lung. Frontiers in Immunology. 9, 1046 (2018).
- Yu, Y. R., et al. A protocol for the comprehensive flow cytometric analysis of immune cells in normal and inflamed murine non-lymphoid tissues. PLoS One. 11 (3), 0150606 (2016).
- Mesnil, C., et al. Lung-resident eosinophils represent a distinct regulatory eosinophil subset. Journal of Clinical Investigation. 126 (9), 3279-3295 (2016).
- Zaynagetdinov, R., et al. Identification of myeloid cell subsets in murine lungs using flow cytometry. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 49 (2), 180-189 (2013).
- Tavares, A. H., Colby, J. K., Levy, B. D., Abdulnour, R. E. A model of self-limited acute lung injury by unilateral intra-bronchial acid instillation. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (150), e60024 (2019).
- Kreisel, D., et al. In vivo two-photon imaging reveals monocyte-dependent neutrophil extravasation during pulmonary inflammation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (42), 18073-18078 (2010).
- Krishnamoorthy, N., et al. Neutrophil cytoplasts induce TH17 differentiation and skew inflammation toward neutrophilia in severe asthma. Science Immunology. 3 (26), (2018).
- Ascon, D. B., et al. Normal mouse kidneys contain activated and CD3+CD4- CD8- double-negative T lymphocytes with a distinct TCR repertoire. Journal of Leukocyte Biology. 84 (6), 1400-1409 (2008).
- Wang, J., et al. Lung natural killer cells in mice: phenotype and response to respiratory infection. Immunology. 137 (1), 37-47 (2012).
- Cowley, S. C., Meierovics, A. I., Frelinger, J. A., Iwakura, Y., Elkins, K. L. Lung CD4-CD8- double-negative T cells are prominent producers of IL-17A and IFN-gamma during primary respiratory murine infection with Francisella tularensis live vaccine strain. Journal of Immunology. 184 (10), 5791-5801 (2010).
- Gibbings, S. L., Jakubzick, C. V. Isolation and characterization of mononuclear phagocytes in the mouse lung and lymph nodes. In Lung innate immunity and inflammation. Methods in Molecular Biology. Alper, S., Janssen, W. 1809, Humana Press. New York, NY. (2018).
- Singer, B. D., et al. Flow-cytometric method for simultaneous analysis of mouse lung epithelial, endothelial, and hematopoietic lineage cells. American Journal of Physiology. Lung Cellular and Molecular Physiology. 310 (9), 796-801 (2016).
- Matsushima, S., et al. CD248 and integrin alpha-8 are candidate markers for differentiating lung fibroblast subtypes. BMC Pulmonary Medicine. 20 (1), 21 (2020).
- Cong, J., Wei, H.
- Daubeuf, F., et al. A fast, easy, and customizable eight-color flow cytometric method for analysis of the cellular content of bronchoalveolar lavage fluid in the mouse. Current Protocols in Mouse Biology. 7 (2), 88-99 (2017).
- Yi, S., et al. Eosinophil recruitment is dynamically regulated by interplay among lung dendritic cell subsets after allergen challenge. Nature Communications. 9 (1), 3879 (2018).
- Langlet, C., et al. CD64 expression distinguishes monocyte-derived and conventional dendritic cells and reveals their distinct role during intramuscular immunization. Journal of Immunology. 188 (4), 1751-1760 (2012).
- Moran, T. P., Nakano, H., Kondilis-Mangum, H. D., Wade, P. A., Cook, D. N. Epigenetic control of Ccr7 expression in distinct lineages of lung dendritic cells. Journal of Immunology. 193 (10), 4904-4913 (2014).
- Schyns, J., Bureau, F., Marichal, T. Lung interstitial macrophages: past, present, and future. Journal of Immunology Research. 2018, 5160794 (2018).
- Krljanac, B., et al. RELMalpha-expressing macrophages protect against fatal lung damage and reduce parasite burden during helminth infection. Science Immunology. 4 (35), (2019).
- Ginhoux, F., Guilliams, M. Tissue-resident macrophage ontogeny and homeostasis. Immunity. 44 (3), 439-449 (2016).
- Svedberg, F. R., et al. The lung environment controls alveolar macrophage metabolism and responsiveness in type 2 inflammation. Nature Immunology. 20 (5), 571-580 (2019).
- Yona, S., et al. Fate mapping reveals origins and dynamics of monocytes and tissue macrophages under homeostasis. Immunity. 38 (1), 79-91 (2013).
- Misharin, A. V., et al. Monocyte-derived alveolar macrophages drive lung fibrosis and persist in the lung over the life span. Journal of Experimental Medicine. 214 (8), 2387-2404 (2017).
- Koch, C. M., Chiu, S. F., Misharin, A. V., Ridge, K. M. Lung Interstitial Macrophages: Establishing Identity and Uncovering Heterogeneity. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 57 (1), 7-9 (2017).
