Summary
Apresentamos uma técnica de ultrassom não invasiva para geração de angiografias tridimensionais no olho sem o uso de agentes de contraste.
Abstract
A retina dentro do olho é um dos tecidos mais exigentes de energia do corpo e, portanto, requer altas taxas de entrega de oxigênio de um rico suprimento de sangue. A lâmina capilar das linhas coroides da superfície externa da retina e é a fonte dominante de oxigênio na maioria das retinas vertebradas. No entanto, este leito vascular é desafiador para a imagem com técnicas ópticas tradicionais devido à sua posição atrás da retina altamente absorvente de luz. Aqui descrevemos uma técnica de ultrassom de alta frequência com posterior aumento de fluxo para leitos vasculares profundos de imagem (0,5-3 cm) do olho com alta resolução espacial. Este método não invasivo funciona bem em espécies com glóbulos vermelhos nucleados (modelos animais não mamíferos e fetais). Permite a geração de angiografias tridimensionais não invasivas sem o uso de agentes de contraste, e é independente dos ângulos de fluxo sanguíneo com uma sensibilidade maior do que as técnicas de ultrassom baseadas em Doppler.
Introduction
O alto metabolismo da retina vertebrado impõe um tradeoff intrínseco entre duas necessidades contrastantes; altas taxas de fluxo sanguíneo e um caminho leve desprovido de vasos sanguíneos. Para evitar perturbação visual de glóbulos vermelhos perfumados, a retina de todos os vertebrados recebe oxigênio e nutrientes através de uma folha de capilares atrás dos fotorreceptores, o choriocapillaris1,2,3. No entanto, esta única fonte de nutrientes e oxigênio impõe uma limitação de difusão à espessura da retina4,5, de modo que muitas espécies visualmente ativas possuem uma variedade de redes vasculares elaboradas para fornecer suprimento sanguíneo adicional a este órgão metabolicamente ativo6. Esses leitos vasculares incluem vasos sanguíneos que perfumam as camadas internas da retina em mamíferos e alguns peixes4,7,8,9,10, vasos sanguíneos no lado interno (voltado para a luz) da retina encontrados em muitos peixes, répteis e aves4,11,12,13, e arranjos vasculares contracorrentes do choroide do peixe, o rete choroide mirabile, que permite a geração de pressões parciais de oxigênio super-atmosférica14,15,16,17,18,19,20. Apesar de esses caminhos adicionais não choroidais para o fornecimento de nutrientes da retina desempenharem um papel essencial no abastecimento dos requisitos metabólicos da visão superior4, a anatomia tridimensional dessas estruturas vasculares é mal compreendida, limitando nossa compreensão da evolução morfológica do olho vertebrado.
Tradicionalmente, o suprimento de sangue da retina tem sido estudado utilizando técnicas ópticas, como a oftalmoscopia fundus. Esta categoria de técnicas fornece informações não destrutivas de alto rendimento sobre anatomia não choroidal dos vasos sanguíneos em alta resolução21 e, portanto, é prontamente utilizada no diagnóstico clínico de anormalidades na estrutura do vaso da retina22. No entanto, o pigmento da retina absorve a luz transmitida e limita a profundidade de visão nessas técnicas ópticas, fornecendo informações reduzidas sobre estrutura e função coroidal sem o uso de agente de contraste21. Limitações de profundidade semelhantes são experimentadas na tomografia de coerência óptica (OUT). Esta técnica pode gerar angiografias fundus de alta resolução usando ondas de luz à custa técnica de penetração de profundidade23, enquanto a imagem de profundidade aprimorada OCT pode visualizar o coroide em detrimento da qualidade da imagem da retina24. A ressonância magnética supera as limitações ópticas da oftalmoscopia e do OCT e pode mapear camadas vasculares na retina, embora em baixa resolução25. A histologia e a tomografia microcomputada (μCT) mantêm a alta resolução das técnicas ópticas e fornecem informações sobre morfologia vascular de olhos inteiros4, mas ambas as técnicas requerem amostragem ocular e, portanto, não são possíveis na clínica ou espécies raras ou ameaçadas. Para superar algumas das limitações dessas técnicas de imagem da retina estabelecidas, o estudo aqui apresenta um protocolo de ultrassom em animais anestesiados, onde o movimento sanguíneo é mapeado em silico em uma série de ultrassonografias bidimensionais igualmente espaçadas que abrangem um olho inteiro, aplicando uma técnica comparável como descrito anteriormente para imagens embrionárias e cardiovasculares26,27, 28 e em ANgiografia OCT29. Esta abordagem permite a geração de angiografias oculares profundas tridimensionais não invasivas sem o uso de um agente de contraste e abre novas vias para mapear a distribuição do fluxo sanguíneo dentro do olho entre as espécies.
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Protocol
O protocolo abaixo foi realizado com permissão da Inspetoria Dinamarquesa de Experimentação animal dentro do Ministério dinamarquês de Alimentos, Agricultura e Pesca, Veterinária Dinamarquesa e Administração de Alimentos (Licença número 2016-15-0201-00835).
1. Anestesia e ultrassom médio
- Anestesiar o animal de pesquisa.
NOTA: Tipo e dose de anestesia apropriada são altamente dependentes de espécies. Em geral, anestésicos à base de imersão como MS-222 (ácido metanosulfônico etílico etílico, benzocaína (etílico 4-aminobenzoato) e propofol (2,6-diisopropil phenol) são úteis em peixes e anfíbios que absorvem prontamente o anestésico sobre brânquias ou pele (por exemplo, 0,05 mg· L-1 benzocaína em truta arco-íris). Uma gama de compostos dissolvidos que podem ser administrados por via intravenosa, intramuscularmente, intraperitoneally está disponível para amniotos, assim como anestésicos à base de gás. Alfaxalon administrado intramuscularmente é útil em répteis (por exemplo, 30 mg·kg-1 em lagartos), e o isoflurane administrado como gás é útil em aves (por exemplo, 2% no ar para pombos). Consulte a literatura publicada30,31,32 para uma visão geral completa dos anestésicos disponíveis entre as espécies. - Teste reflexos no animal para confirmar um nível ideal de anestesia. Certifique-se de que o animal está completamente imóvel durante o procedimento, pois o procedimento de ultrassom aumentado pelo fluxo é sensível ao ruído de movimento.
- Anestesia muito profunda pode alterar os padrões de fluxo sanguíneo, então realize uma titulação de dose na fase inicial de um experimento.
- Aumente a dosagem da anestesia em etapas e observe o fluxo sanguíneo no olho auxiliado pelo simples modo de brilho (modo B) ultrassom.
NOTA: Um nível ideal de anestesia é obtido quando o animal está imóvel (exceto respiração) com fluxo sanguíneo ocular visível.
- Se o tipo/dose de anestésico não for permissivo para movimentos respiratórios, então garanta ventilação adequada do animal, por exemplo, usando uma bomba de ar para oxigenar a água para espécies aquáticas ou um ventilador para espécies respiratórias.
- Posicione o animal em uma postura que permita acesso direto de cima ao olho.
NOTA: Dependendo das espécies, isso pode estar em uma posição supina ou lateral. Pode ser útil para construir um dispositivo de retenção simples usando um pequeno pedaço de metal não reativo (por exemplo, aço inoxidável) e elásticos soltos (ver Figura 1). - Coloque o meio de ultrassom adequado no olho do animal. Se as pálpebras dimensionadas (ultrassom impermeável) cobrirem o olho, então desloque-as suavemente com um cotonete.
NOTA: Para espécies aquáticas, o melhor meio de ultrassom é a água limpa do tanque em que o animal geralmente vive. Para espécies terrestres, uma generosa quantidade de gel de ultrassom garante movimentos livres e imagens do transdutor de ultrassom (ou seja, sonda de matriz linear) em toda a superfície do olho. A pomada veterinária no olho contralateral é necessária para espécies terrestres.
2. Aquisição de imagem de ultrassom ocular 2D e 3D
- Posicione o transdutor de ultrassom medial ao olho em uma orientação dorsal/ventral ou rostral/caudal, dependendo da orientação de imagem desejada.
- No modo B, com uma profundidade máxima de campo, imagem a parte medial e mais profunda do olho e certifique-se de que todas as estruturas de interesse são visíveis no campo da imagem.
NOTA: Em algumas espécies, a lente cristalina ocupa uma proporção relativamente grande do humor vítreo, que pode absorver o ultrassom, especialmente em frequências mais altas. - Traduza lentamente o transdutor para cada lado enquanto inspeciona as imagens em tempo real. Certifique-se de que todas as estruturas de interesse estejam visíveis no campo da imagem; se não, mude para um transdutor com menor frequência e maior profundidade de campo.
NOTA: As seguintes frequências centrais permitem a seguinte profundidade máxima de campo: 21 MHz: 3 cm, 40 MHz: 1,5 cm, 50 MHz: 1 cm (ver Tabela 1). No entanto, esses valores máximos de profundidade de campo podem ser marcadamente menores se o olho contiver estruturas calcificadas ou outras estruturas impermeáveis de ultrassom. - Ajuste a profundidade da imagem, deslocamento de profundidade (distância da parte superior da imagem até a estrutura de interesse), largura da imagem, bem como número e posição das zonas focais para cobrir a região desejada de interesse em todas as três dimensões espaciais (por exemplo, profundidade de imagem de 1 cm, deslocamento de profundidade de 2 mm, largura de imagem de 1 cm, uma zona focal).
NOTA: Embora a nomeação específica de botões que ajustam esses parâmetros possa variar entre sistemas de ultrassom, a maioria dos sistemas terá botões com nomes lógicos para esses ajustes. Essas configurações de parâmetros de imagem geralmente afetam o intervalo de possíveis resoluções temporais da aquisição do ultrassom. - Definir a taxa de quadros na faixa de 50-120 quadros·s-1.
NOTA: A resolução temporal (ou seja, o intervalo de tempo entre os sucessivos B-scans) deve ser adequada para exibir grande variabilidade de intensidade de pixel nos vasos sanguíneos imaged, ou seja, a resolução temporal não deve ser muito alta. Por outro lado, para completar uma gravação 3D completa do olho em um tempo razoável, a resolução temporal não pode ser muito baixa. Uma resolução temporal que varia de 50-120 quadros·s-1 é geralmente adequada para o procedimento aprimorado de fluxo na maioria das espécies. Em alguns sistemas de ultrassom, essa resolução temporal desejada pode ser obtida alternando entre os modos "imagem geral" (alta resolução espacial/baixa temporal) e "cardiologia" (baixa resolução espacial/alta temporal). - Ajuste o ganho 2D para um nível (~5 dB), de modo que as estruturas anatômicas são apenas visíveis na aquisição do modo B para aumentar a relação sinal-ruído na reconstrução subsequente aprimorada de fluxo.
- Para adquirir uma imagem aprimorada de fluxo 2D em uma única posição de fatia, traduza o transdutor para esta posição e continue na etapa 3.1.
- Para adquirir uma gravação 3D de toda uma região de interesse, por exemplo, a retina, traduza o transdutor a um extremo da região de interesse.
- Para determinar a posição exata do extremo final da região de interesse, aumente o ganho 2D brevemente.
- Após a colocação correta do transdutor ser concluída, diminua o ganho 2D antes de gravar para garantir a relação sinal-ruído máxima na reconstrução subsequente aprimorada de fluxo.
- Para cada etapa (fatia) na gravação 3D, adquira ≥100 quadros (ótimo ≥1000 quadros).
- Usando um micromanipulador ou motor transdutor de construção, traduza o transdutor em toda a região de interesse em etapas de, por exemplo, 25 μm ou 50 μm (lembre-se de notar o tamanho da etapa) e repita a aquisição de quadros ≥100 para cada etapa.
- Eutanize o animal de pesquisa de acordo com as diretrizes de cuidados com animais da instituição.
3. Reconstrução de imagem aprimorada pelo fluxo
- Exporte as gravações para o formato de arquivo de imagem digital e comunicações em medicina (DICOM) (pouco endian).
- Para produzir uma única imagem aprimorada de fluxo com base em uma gravação cine de ≥100 quadros (T), calcule o desvio padrão no nível do pixel (STD(x,y)) usando a fórmula:
Onde It(x,y) é a intensidade do pixel na coordenada (x,y) pixel no tempo t, e Īt(x,y) é o valor médio aritmético de I ao longo do tempo. - Repita o passo 3.2 para cada fatia na gravação 3D.
- Para automatizar o processo de cálculo de DST e reconstrução de imagem para várias fatias em uma gravação 3D, realize esta operação no modo de lote usando, por exemplo, ImageJ e o script de macro suplementar (Arquivo Suplementar 1).
- Combine todas as fatias reconstruídas em uma pilha de imagens (Imagens para Stack comando no ImageJ).
- Especifique a espessura da fatia do tamanho da etapa usada durante a aquisição (comando Propriedades no ImageJ).
- Salve a pilha de imagens como um arquivo TIF 3D.
NOTA: Gravações tridimensionais ponderadas por fluxo de vasos sanguíneos oculares podem ser posteriormente usadas para criar renderizações de volume e construir modelos anatômicos digitais e físicos de estruturas vasculares do olho. Essas opções de processamento de imagens estão fora do escopo deste protocolo; consulte os artigos publicados anteriormente para mais detalhes33,34,35.
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Representative Results
A técnica de ultrassom aprimorada de fluxo para a imagem de leitos vasculares do olho pode ser aplicada em uma variedade de espécies e tem sido usada atualmente em 46 espécies diferentes de vertebrados (Figura 1, Tabela 1). A presença de glóbulos vermelhos nucleados em vertebrados não adulto-mamíferos fornece contraste positivo do sangue fluindo em comparação com tecido estático em gravações de cine (Arquivo Suplementar 2). No entanto, quando analisada em uma base quadro a quadro, a clara distinção entre sangue e tecido circundante é menos óbvia (Figura 2A). O procedimento de aprimoramento do fluxo sanguíneo descrito neste protocolo essencialmente compila uma gravação de ponto multi-tempo em espaço 2D (uma fatia feita de quadros T ) em uma única imagem na qual as flutuações inerentes ao valor do sinal em pixels posicionados no fluxo sanguíneo escorram um desvio padrão maior do que o tecido estático circundante, produzindo assim contraste positivo (Figura 2B). Para aumentar de forma percebida o contraste dos vasos sanguíneos, o Look Up Tables pode ser usado para produzir imagens pseudocoloridas (Figura 2C). Em aquisições 3D, várias fatias paralelas com espaçamento conhecido podem ser combinadas em dados de imagem 3D (Arquivo Suplementar 3 e Arquivo Suplementar 4) que podem ser usados para renderização de volume tridimensional (Figura 2D) e modelagem anatômica (Figura 2E e Arquivo Suplementar 5). A imagem de ultrassom baseada em doppler também fornece a opção de imagem específica do fluxo sanguíneo, no entanto com menos sensibilidade do que o método descrito (compare a Figura 2G com a Figura 2H e a Figura 2I), e, principalmente, não se a orientação do fluxo sanguíneo estiver direta ou próxima da perpendicular à direção da onda sonora. O procedimento aprimorado de fluxo descrito neste protocolo é independente da orientação do fluxo sanguíneo dentro e fora do avião.
O procedimento de ultrassom aumentado pelo fluxo de fluxo permite a imagem do fluxo sanguíneo em uma variedade de espécies com glóbulos vermelhos nucleados (Figura 3A-D). Leitos vasculares oculares profundos, como o choroide rete mirabile em alguns peixes, podem ser imagens se presentes na espécie (ponta de flecha amarela na Figura 2, Figura 3B, Figura 4). O método é limitado pela ausência de glóbulos vermelhos nucleados em mamíferos adultos nos quais o procedimento de aumento de fluxo produz algum grau de contraste do fluxo sanguíneo, mas não é tão distinto quanto em espécies com glóbulos vermelhos nucleados (Figura 3E,F).
O ultrassom aumentado pelo fluxo é sensível ao ruído de movimento e, por exemplo, os movimentos respiratórios podem causar desfoque de imagem e artefatos como o aprimoramento da borda do tecido (Figura 4A-C, Arquivo Suplementar 6). Gating prospectivo ou retrospectivo pode ser usado para ajustar para ruído de movimento (Figura 4D,E).
Figura 1: Exemplos da variedade de espécies adequadas para imagens de ultrassom aumentadas de fluxo de vasculatura ocular. (A) Peixinho dourado (Carassius auratus). (B) Esturjão siberiano (Acipenser baerii). (C) Seabass europeu (Dicentrarchus labrax). (D) Pena de palhaço (Chitala ornata). (E) Carpa crucian (Carassius carassius). (F) Frango doméstico embrionário (Gallus gallus domesticus). Pode ser útil para construir um dispositivo de retenção simples usando um peso de metal não reativo e elásticos soltos (A,C,D). Tanto sistemas de ultrassom grandes e imóveis baseados em laboratório podem ser usados para o procedimento (A-D,F), bem como sistemas operacionais de pequeno campo (E). Quando imagens de espécies pequenas e altamente sensíveis à temperatura que não podem ser retidas em um banho de água controlado pela temperatura como aves embrionárias, a imagem pode ser realizada enquanto a amostra estiver dentro da incubadora (F). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Efeito do aprimoramento do fluxo em ultrassons oculares. (A) Exemplos de imagens ultrasonográficas cruas do modo B do olho de um peixinho dourado em uma gravação de 1000 quadros de cine. Considerando que o fluxo sanguíneo pode ser observado na gravação do cine (Arquivo Suplementar 2) é difícil de ver em quadros estáticos. (B) Imagem em escala de cinza aprimorada pelo fluxo (mesma fatia que em A). Tanto os leitos vasculares da retina quanto da retina são aprimorados. (C) Versão pseudocolorida da imagem em B com ImageJ Fire Look Up Table. (D) Exibição renderizada em volume de fluxo sanguíneo no olho do mesmo peixe dourado como em A-C, com base na aquisição 3D. (E) Modelo anatômico de dois segmentos (vasos de retina e pós-retina) do olho em A-D (para modelo interativo ver material suplementar 5). (F-I) Imagem ultrasonográfica do modo B bruto do olho de outro peixinho dourado (F) comparando a imagem de fluxo baseada em Doppler (G) com os métodos aprimorados de fluxo descritos neste protocolo (H-I, note I é uma sobreposição de H em F). Setas verdes indicam vasos de retina, pontas de flecha amarela indicam o choroide rete mirabile. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Exemplos representativos de imagens de ultrassom ocular aprimoradas pelo fluxo em uma variedade de espécies de vertebrados. a Senegal bichir (Polipopterus senegalo). (B) Piranha de barriga vermelha (Pygocentrus nattereri). (C) Iguana verde (Iguana iguana). (D) Embrionária (dia 18) frango doméstico (Gallus gallus domesticus). (E) Rato-de-casa (Mus musculus). (F) Rato marrom (Rattus norvegicus). Em espécies com glóbulos vermelhos nucleados, o procedimento de aumento de fluxo produz imagens úteis do fluxo sanguíneo ocular (A-D), enquanto em mamíferos adultos (glóbulos vermelhos enucleados), produz apenas contraste limitado entre o sangue fluindo e o tecido circundante (E-F). As setas verdes indicam vasos de retina; pontas de flecha azul indicam vasos pós-retina, como os choriocapillaris; pontas de flecha amarelas indicam coroide rete mirabile. No frango doméstico embrionário tardio, o fluxo sanguíneo no oculi pecten pode ser observado (arqueiro verde inferior em F). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Movimentos respiratórios induzem ruído de movimento que pode ser aliviada por gating retrospectivo. (A-B) Exemplo de movimentos respiratórios no olho de uma placa europeia (Pleuronectes platessa). O ponto vermelho está na mesma coordenada de imagem em A (fatia 54/410) e B (fatia 92/410), mas pode-se observar que o olho mudou de posição (ver também gravação de cine em material suplementar 6). (C) A tentativa de executar a operação de melhoria de fluxo na gravação completa de 410 quadros falha devido ao ruído de movimento. As bordas teciduais são artificialmente melhoradas devido aos movimentos. (D) operação de gating retrospectiva com base na intensidade de sinal normalizada (SI) no ponto vermelho em A-B. Apenas quadros com SI normalizado > 50 (no total de 38 quadros), ou seja, indicando que o olho está na mesma posição que em B, estão incluídos para o procedimento de aumento de fluxo. (E) Imagem resultante do procedimento de melhoria de fluxo fechado retrospectivamente. Compare com C. Na imagem fechada, o aprimoramento artificial da borda é evitado, e o fluxo sanguíneo no mirabile de rete choroide (ponta de flecha amarela) pode ser observado. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Tabela 1: Tem sido utilizada a lista de espécies nas quais a técnica de ultrassom aumentada de fluxo para o fluxo sanguíneo ocular da imagem foi utilizada. A aplicabilidade do método baseia-se na capacidade de produzir uma representação rica em contraste de leitos vasculares em comparação com o fundo estático. Clique aqui para baixar esta Tabela.
Arquivo complementar 1: Script macro para automatizar cálculos de melhoria de fluxo. O script é escrito na linguagem IJ1 Macro e pode ser executado tanto usando a função macro ImageJ (para gravação de fatia única) quanto o ImageJ Batch Process (para gravação 3D de várias fatias). Clique aqui para baixar este Arquivo.
Arquivo suplementar 2: Gravação de cine no modo B no olho de um peixinho dourado (Carassius auratus). O fluxo sanguíneo pode ser observado à medida que o vídeo está sendo reproduzido, mas não em um único quadro como na Figura 2A. Clique aqui para baixar este Arquivo.
Arquivo suplementar 3: Corte o vídeo através do olho de um peixinho dourado (Carassius auratus) de seções aumentadas pelo fluxo sanguíneo. Clique aqui para baixar este Arquivo.
Arquivo suplementar 4: Arquivo TIF tridimensional do olho aumentado de fluxo de peixe dourado (Carassius auratus). As imagens foram binadas por 3 x 3 x 3 para minimizar o tamanho do arquivo (redução de 27 vezes na resolução espacial e no tamanho do arquivo). Clique aqui para baixar este Arquivo.
Arquivo suplementar 5: Modelo 3D interativo de vasos pré e pós-retina no olho de um peixinho dourado (Carassius auratus). Clique aqui para baixar este Arquivo.
Arquivo suplementar 6: Gravação de cine no modo B bruto no olho de uma placa europeia (Pleuronectes platessa). Note os movimentos respiratórios. Clique aqui para baixar este Arquivo.
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Discussion
A imagem vascular usando ultrassom aprimorado pelo fluxo fornece um novo método para imagens não invasivas da vasculatura do olho que oferece várias vantagens sobre as técnicas atuais, mas tem suas limitações intrínsecas. A principal vantagem do ultrassom aumentado pelo fluxo é a capacidade de gerar angiografias oculares com uma profundidade de campo que excede o epitélio pigmento da retina, que limita a profundidade de campo em técnicas ópticas. Na imagem de ultrassom, a resolução espacial e a profundidade de campo são finalmente determinadas pela frequência do transdutor de ultrassom, onde frequências mais altas aumentam a resolução espacial, mas em detrimento de uma profundidade de campo mais rasa, assim a escolha da frequência transdutor introduz uma troca entre profundidade de imagem e resolução espacial. Em nossa experiência, a imagem ótima do ultrassom de retina é obtida utilizando transdutores de ultrassom de alta frequência (≥50 MHz) em pequenos olhos com profundidades de imagem de transdutores de < 1 cm e de menor frequência (20-40 MHz) em olhos maiores com profundidades de imagem de 1,5-3,0 cm. Para uma ultrassonografia 3D, a resolução da dimensão de fatia adicional é definida pelo tamanho da etapa entre as varreduras na pilha de ultrassom 2D. Em nossa experiência, é difícil realizar uma varredura 3D com um tamanho de passo menor que 20 μm.
O ultrassom 2D reforçado com fluxo tem uma alta resolução temporal. Idealmente, ≥1000 quadros por imagem são necessários para imagens vasculares aprimoradas pelo fluxo, de modo que pelo menos 8 s são necessários por varredura de imagem. A resolução temporal é significativamente reduzida ao realizar ultrassons 3D aumentados de fluxo, onde o tempo de digitalização aumenta com o número de imagens na pilha 3D de varreduras. Dada a alta resolução temporal, o fluxo de trabalho de ultrassom 2D aprimorado mostra forte potencial como método para identificar alterações temporais em velocidades relativas de fluxo sanguíneo e distribuição do fluxo sanguíneo durante a manipulação experimental. Assim, estudos futuros podem usar o fluxo de trabalho para identificar como as condições ambientais alteradas (por exemplo, temperatura, pO2, pCO2) ou administração farmacológica afetam o fluxo sanguíneo no olho e em outros órgãos.
O fluxo de trabalho do ultrassom baseia-se no contraste positivo dos glóbulos vermelhos nucleados da maioria dos vertebrados não mamíferos. Assim, os glóbulos vermelhos enucleados de mamíferos adultos e algumas espécies de salamandra37 fornecem muito pouco contraste para melhorar efetivamente o fluxo sanguíneo usando o fluxo de trabalho atual (Figura 3E,F). Nos fluxos tradicionais de ultrassom, a injeção vascular de microbolhas fornece contraste alto o suficiente para identificar a vasculatura em mamíferos38, que tem sido usada para gerar angiografias vasculares dos vasos retrobulbar dentro do olho de rato39. No entanto, os microbolhas estouram em poucos minutos, de modo que a geração de angiografias 3D requer sucessivas injeções de microbolhas.
O ultrassom aumentado pelo fluxo depende de gravações sequenciais na mesma posição do olho, de modo que a técnica não é possível em animais acordados, onde pequenos movimentos aleatórios podem compensar a imagem e minar os cálculos de aumento de fluxo. Assim, o presente método deve ser realizado sob anestesia adequada para imobilização para melhorar a qualidade da imagem, reduzindo movimentos aleatórios. No entanto, movimentos regulares do olho que ocorrem durante movimentos respiratórios regulares podem ser compensados por procriação prospectiva ou retrospectiva ao padrão de ventilação do animal, de modo que apenas o registro de varredura a partir do mesmo intervalo de tempo dentro do ciclo de ventilação é usado na análise dos dados. Embora a abordagem retrospectiva de gating para compensar os movimentos ventilatórios da imagem melhore significativamente a estabilidade da imagem, ela reduz pronunciadamente o número de quadros incluídos no cálculo do desvio padrão da intensidade do sinal levando a uma diminuição na relação sinal-ruído (compare Figura 4E com Figura 2C e Figura 2I ). Esse efeito é aliviada usando uma gating prospectiva no scanner de ultrassom, no qual os dados de imagem só são adquiridos quando o animal está na fase desejada de respiração. No entanto, isso causa um aumento acentuado no tempo de aquisição se o número desejado de quadros ≥1000 deve ser adquirido.
Vemos múltiplas aplicações em pesquisas zoológicas e veterinárias para o fluxo de trabalho de ultrassom para mapear a fisiologia e anatomia da vasculatura do olho. A vasculatura de peixes, mamíferos e aves são relativamente bem descritas1,3,4,8,9,12,15,40, mas este não é o caso de peixes não-ósseos (vertebrados sem mandíbula e chondrichthyans), anfíbios e répteis, que representam seus respectivos grupos irmãos divergentes anteriormente. A implementação do ultrassom aprimorado de fluxo nesses grupos animais mal compreendidos e a integração desses dados com o conhecimento sobre os grupos mais bem-estudados fornecerão uma visão fundamental sobre a evolução da vasculatura do olho vertebrado. Como a vasculatura do olho é semelhante em espécies intimamente relacionadas4, tais informações detalhadas sobre a vasculatura ocular em uma ampla gama de espécies fornecerão um ponto de referência para os veterinários identificarem malformações na vasculatura do olho devido a defeitos de desenvolvimento, doenças ou lesões físicas. Além disso, a capacidade de adquirir informações de fluxo sanguíneo 2D com uma alta resolução espostricular fornece os meios para quantificar os efeitos farmacocinéticos na distribuição do fluxo sanguíneo em leitos vasculares profundos, com vastas aplicações no desenvolvimento e testes de medicamentos. Estudos futuros sobre essa técnica devem se concentrar na identificação de compostos injetáveis que melhorem o contraste do sangue em espécies com glóbulos vermelhos enucleados, o que ampliará a aplicabilidade dessa técnica para mamíferos com vastas aplicações em pesquisas biomédicas e diagnósticos clínicos de disfunção vascular no olho e outros leitos vasculares profundos.
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Disclosures
Os autores declaram que não existem interesses completos.
Acknowledgments
Este trabalho recebeu financiamento da Fundação Carlsberg (CF17-0778; CF18-0658), a Fundação Lundbeck (R324-2019-1470; R346-2020-1210), as Fundações Velux (00022458), a Fundação A.P. Møller para o Avanço da Ciência Médica, o programa de pesquisa e inovação Horizon 2020 da União Europeia sob o acordo de subvenção Marie Skłodowska-Curie (No. 754513) e a Fundação de Pesquisa da Universidade de Aarhus.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MS-222 | Sigma | E10521-50G | |
| Benzocaine | Sigma | E-1501 | |
| Propofol | B Braun | 12260470_0320 |
|
| Alfaxalon | Jurox | NA | |
| Isoflurane | Zoetis | 50019100 | |
| Ultrasound scanner | VisualSonics | Vevo 2100 |
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