Summary
Cryo-section-dissekering möjliggör färsk, fryst beredning av den största neurogena nischen i murin hjärnan för djup kvantitativ proteom analys. Metoden är exakt, effektiv och orsakar minimal vävnadsperturbation. Därför är den idealisk för att studera den molekylära mikromiljön av denna nisch, liksom andra organ, regioner och arter.
Abstract
Subependymal neurogenic nisch består av ett paraventricular band av den laterala ventrikulära väggen i laterala ventrikel. Subependymal zonen (SEZ) är en tunn och distinkt region som utsätts för ventriklarna och ryggmärgsvätskan. Isoleringen av denna nisch möjliggör analys av en neurogen stamcellsmikromiljön. Extraktion av små vävnader för proteomanalys är dock utmanande, särskilt för upprätthållandet av betydande mätdjup och uppnåendet av tillförlitlig robusthet. En ny metod som kallas cryo-section-dissekering (CSD), som kombinerar hög precision med minimal vävnadsperturbation, utvecklades för att ta itu med dessa utmaningar. Metoden är kompatibel med toppmoderna metoder för masspektrometri (MS) som gör det möjligt att upptäcka låg rikliga nischregulatorer. I denna studie jämfördes CSD och dess proteomdata med den metod och data som erhållits genom laserinfångning-mikrodissection (LCM) och en standard för fullmount dissekering. CSD-metoden resulterade i dubbelt så stort kvantifieringsdjup på mindre än hälften av beredningstiden jämfört med LCM och överträffade samtidigt tydligt dissekeringsprecisionen för hela avelsen. Därför är CSD en överlägsen metod för att samla in SEZ för proteomanalys.
Introduction
Eftersom neurogenes är begränsad i den vuxna hjärnan, olika centrala nervsystemet reparationsstrategier skulle dra stor nytta av en ökad förståelse för grunderna för vuxna neurala utbyte. Gnagare har hjälpt oss att förstå de grundläggande mekanismerna för postnatal neurogenes, även om det bör noteras att vuxen neurogenes är starkt artberoende. Hos möss finns det tre vuxna neurala stamceller (NSC) nischer. Hypotalamus är en vuxen NSC nisch med neurogenic potential1,2, medan kontinuerlig vuxen neurogenesis är främst begränsad till hippocampus3 och SEZ av laterala väggar i laterala Venttricles4,5,6. SEZ är den största groddregionen som innehåller NSCs (typ B-celler) som utvecklas till neuroblaster (typ A-celler) via transitförstärkande stamceller (typ C-celler). SEZ innehåller 20-35% av typ B-celler, 1-15% av typ C-celler, 1-30% av typ A-celler och 25-50% av ependymala celler7. SEZ har en komplex mikroarkitektur, med endotelceller, mikrogliaceller och ependymala celler som bor i och påverkar stamcellsnisch8,9,10. Även om nervceller är knappa i SEZ, axoner som härrör från avlägsna källor såsom striatum, ventrala tegmental området eller hypotalamus räckvidd och påverka typ B celler4. En unik egenskap hos denna stamcellsnisch är separationen mellan spridningsplatsen och differentieringsplatsen. Efter spridning migrerar neuronala stamceller flera millimeter från SEZ till luktlampan, där de terminalt differentierar sig i nervceller och integreras i befintliga neurala kretsar. Undersökningar av cell-inneboende program associerade med neurogenes har redan gett kunskap som är viktig för experimentella terapeutiska cell omprogrammering och transplantation strategier15,16,17,18,19,20. Cellextrinsiska signaler reglerar dock också neurogenes, och vävnadsmiljöer kan bestämma stamcellernas neurogena öde11,12,14,21,22,23. Följaktligen är undersökningen av mikromiljön av de neurogena nischerna och dess interaktion med stamcellerna av avgörande betydelse.
Den extracellulära matrisen (ECM) och andra utsöndrade proteiner är en stor del av mikromiljön. För korrekt identifiering och kvantifiering är ett proteomiskt tillvägagångssätt bättre lämpat än en transkriptomisk metod för att bestämma ECM sammansättning på grund av den låga korrelationen mellan transkriptom och proteinnivåer för ECM24,25. Dessutom finns det betydande bevis för att nischtillsynsmyndigheter i den exklusiva ekonomiska zon och den ekonomiska zon inte uteslutande produceras av celler som befolkar själva nischen. Mer avlägsna platser, såsom choroid plexus, utsöndrar modulerande signaler som överförs till stamcellerna via cerebrospinalvätskan22,23. Att undersöka nischproteom kan hjälpa till att identifiera nischregulatorer som finns i nischen oberoende av deras produktionsanläggning, med tanke på att en betydande del av den extracellulära mikromiljön monteras av proteiner.
För att samla murin ventrikulära zonen för opartisk proteomisk analys krävs en metod med hög precision, fånga ca. 50 μm tunt paraventrikulärt band som innehåller stamceller samtidigt som vävnaden i den intilliggande striatum. Dessutom måste vävnadsperturbation under dissekeringen minimeras för att analysera den extracellulära mikromiljön eftersom lösliga proteiner, inklusive tillväxtfaktorer eller cytokiner, lätt kan tvättas bort. Även om det är möjligt att analysera massspektrat av fast vävnad, kommer det nödvändiga medlet, såsom paraformaldehyd, att minska proteinidentifieringsdjupet och kan införa posttranslational modifieringar. En vanlig helmonterad SEZ-dissekering, t.ex. för insamling av celler för fluorescensaktiverad cellsorteringsanalys, tar bort hela SEZ med sax26. Denna standard dissekering är snabb med minimal vävnadsperturbation. Striatal kontaminering av proverna kan dock inte undvikas. Omvänt har LCM den enastående fördelen med överlägsen dissekeringsprecision. LCM kan dock införa vävnadsperturbations, till exempel på grund av bakgrundsfärgning eller laser-orsakad protein denaturation. För att kombinera styrkorna i den helmonterade dissekeringen och LCM utvecklades en ny metod som är kompatibel med MS, så kallade cryo-section-dissekering (CSD), (figur 1A-D). CSD tillåter extraktion av SEZ och dissekering av SEZ av de mediala väggarna i laterala ventriklarna (MEZ), vilket är en idealisk, mestadels icke-neurogen kontrollregion för SEZ (se protokollet). Nisch proteom som erhållits genom kombinationen av CSD och state-of-the-art MS metoder visade sig vara användbart för karakterisering och identifiering av nya tillsynsmyndigheter i denna vuxna NSC nisch25. Därför kommer denna metod att vara användbar för bestämning av SEZ vävnadsproteinkomposition.
Protocol
Alla experimentella förfaranden i denna studie utfördes i enlighet med tyska och europeiska unionens riktlinjer och godkändes av den institutionella djurvårdskommittén och regeringen i övre Bayern (Regierung von Oberbayern). Endast manliga C57Bl6 möss mellan 8-10 veckor användes för experimenten.
1. Förberedelse av mushjärnan (~ 15 min per mus)
- Förbered dissekeringsmediet genom att tillsätta 5 ml 1 M HEPES (slutlig koncentration 10 mM) till 500 ml 1x Hanks balanserade saltlösning (HBSS).
OBS: Lagringstiden för dissekeringsmediet (+4 °C) bör inte överstiga 2 veckor. - Offra mössen genom livmoderhalscancer förskjutning och försiktigt dissekera hjärnan.
OBS: Vid undersökning av ECM bör vävnaden helst vara oförändrad. Livmoderhalscancer förskjutning håller dissekeringstiden så kort som möjligt, vilket förhindrar post-dödlig enzymatisk autodigestion så mycket som möjligt. Om avlägsnande av blod är avgörande för forskningsfrågan, perfusera helt enkelt musen transcardially med fosfatbuffrad saltlösning (PBS) innan du tar bort hjärnan. - Extrahera hjärnan genom manuell dissekering och placera den i en odlingsfat som innehåller iskallt dissekeringsmedium (figur 1B - 1).
OBS: Håll hjärnorna i dissekeringsmedium på is under hela dissekeringen. - Ta bort luktlampan (OB) med en skalpell (figur 1B - 2) genom ett rakt koronalsnitt mellan OB och cortex främre pol.
- Ta bort cortex främre pol med skalpellen med hjälp av ett koronalsnitt för att göra de laterala ventriklarna synliga i koronalplanet (figur 1B - 3).
OBS: Se till att koronalskärningen görs ~5 mm rostrally från den optiska chiasmen; Annars kommer den rostala delen av SEZ/MEZ att gå förlorad. - Använd sax, öppna båda laterala ventriklarna uppifrån, med början med en sagital sektion från den kortikala ytan till ventrikulär lumen, och förlänga detta snitt på ett c-format sätt efter ventrikulär flexion (figur 1B - 4).
- Anslut de kaudala ändarna av vänster och höger sagittal snitt med hjälp av en extra koronalskärning med saxen.
OBS: De tre snitten bildar nu en trapetsoid och kommer att underlätta avlägsnandet av cortex och corpus callosum i nästa steg. - Ta bort cortex och corpus callosum som täcker de laterala ventriklarna med tång (figur 1B - 5). Ta sedan bort cortex och corpus callosum som täcker de mediala ventrikulära väggarna. Här gör du ytterligare nedskärningar om vävnaden är fäst vid de mediala ventrikulära väggarna, eller helt enkelt lyfta cortex och corpus callosum med sax för att lossa vävnaden.
- Sprid försiktigt ventrikulära väggar med tång (figur 1B - 6). Ta bort choroidplexus med tång.
OBS: Fullständig borttagning av choroidplexus är viktigt för att undvika störningar i följande dissekeringssteg och undvika potentiell kontaminering av SEZ/MEZ-proverna. - Sätt hjärnan på en glasrutschbana och placera glasrutschbanan ovanpå torr is för att frysa hjärnan. Underhåll ventrikulära väggar i den öppna konfigurationen.
OBS: Se till att det finns tillräckligt avstånd mellan ventrikelns sido- och mediala väggar för att underlätta exakt och exklusiv dissekering av SEZ och MEZ. Om vävnaden drar ihop sig i en sluten konfiguration, använd tångarna för att fixera väggarna i önskat läge under frysning. Undvik skador på SEZ/MEZ. Försök att applicera minimal kraft, främst vid den övre kanten av de öppnade ventriklarna.
2. Sektionering av den beredda hjärnan (~ 15 min per mus)
- Skär 50-100 μm tjocka koronalsektioner i hjärnan till slutet av den laterala ventrikeln med en kryostat och montera sektionerna på glasrutschbanor. Se till att hjärnan är fastsatt på kryostatfästeplattan vid bakhjärnan med OCT-medium och att ingen OCT kommer i kontakt med förhjärnan, särskilt vid ventriklarna.
OBS: OCT-mediet stör MS-mätningarna. Om vävnaden kommer att användas för en antikroppsanalys är det dock onödigt att utesluta OCT-medium. Användning av belagda glasrutschbanor rekommenderas inte. Belagda diabilder applicerar för mycket självhäftande kraft på vävnaden, vilket hindrar flyttningen av vävnadsprovet från bilderna i mikrocentrifugeröret i följande steg.
3. Frihandsdesektion av hjärnskivor (~ 30 min per mus)
- Placera glasglasbilderna med hjärnsektionerna på torris under ett dissekeringsmikroskop (figur 1C - 1).
- Förbered mikrocentrifugerören på torris och se till att rören stannar på torris i minst 1 min för att vara tillräckligt kalla före provöverföring.
OBS: Använd mikrocentrifugerör av hög kvalitet, eftersom vissa rör av låg kvalitet kan kasta plast i de efterföljande vävnadsrötningsstegen i samband med MS-mätningar. - Lyft skivorna från torrisen i 15-30 s för att uppnå en kort, ofullständig upptining för att göra striatumets kompakta myelin observerbar som täta vita prickar.
OBS: Det blir möjligt att lokalisera gränsen mellan den särskilda ekonomiska zon och striatum (figur 1C - 2, se figur 2A för uteslutning av myelin och en jämförelse med hela metoden). Om upptining tar för lång tid kan processen påskyndas genom att trycka ett handsketäckt finger på motsatt sida av glasrutschbanan. Denna manöver bör dock utövas eftersom överdriven upptining sker lätt. - Separera SEZ med en förkyld skalpell från den intilliggande striatum (figur 1C,D).
- Överför SEZ antingen som en hel bit eller uppdelad i 2-4 delar i ett mikrocentrifugerör med hjälp av den trubbiga kanten på den kylda skalpellen. Om vävnaden ska användas för en annan typ av analys än MS, överför vävnadsprovet till lämplig behållare i stället (t.ex. en 96-brunnsplatta).
OBS: Att skära den helt frusna vävnaden kan leda till att vävnaden snabbt bryts bort och faller av glidbanan. Skärning av helt tinad vävnad leder till vävnadens sönderfall. Se till att vävnaden varken är helt frusen eller helt tinad.
Representative Results
När vävnadsproverna i mikrocentrifugerören följs är de klara för och kompatibla med MS-provberedningen. Efter provberedning erhöll vi ~ 5-7 μg peptider per prov av antingen SEZ eller MEZ per mus. De slutliga mängderna av peptiderna kan dock bero på MS-beredningsmetoden. I proteomjämförelserna nedan ökades proteinidentifierings- och kvantifieringsdjupet (500-1 000 proteiner per prov) genom beräkningsmatchning av peptidspektra till peptidspektrabibliotek som skapats för varje vävnadsregion25,27. Noterbart är den förlustfria nanofraktioneringsmetoden som används här för att skapa peptidspektrabiblioteken för närvarande inte kommersiellt tillgänglig. De råa MS-data analyserades med hjälp av MaxQuant-programvaran28, vilket uppnådde massnoggrannhet i delarna per miljard intervall29. Max Quant-miljön gör det möjligt att matcha mellan MS-körningar. Protein överflöd kvantifierades med hjälp av en etikettfri kvantifieringsalgoritm30. Immunohistochemical färgning gjordes på färska frysta vävnader och utfördes som tidigare rapporterats25 (se tabellen över material).
Cryo-section-dissekering
Den fullständiga SEZ och MEZ av vuxna möss (n = 4) erhölls med hjälp av CSD (se figur 1 och protokoll). Somatosensory cortex (Cx) dissekerades med kirurgisk sax. Ytterligare 4 möss dissekerades på samma sätt; Den dissekerade vävnaden samlades dock i ett prov per region för att skapa proteombiblioteket (10 923 identifierade proteiner) för ökad proteinidentifiering och kvantifiering i de enskilda proverna25. I de fyra enskilda proverna (medelvärdet ± SD) kvantifierades 6 673 ± 317,4 proteiner i SEZ och 6 747 ± 37,7 i MEZ. Alla ms proteomikdata deponerades i ProteomeXchange-konsortiet via PRIDE31-partnerarkivet , och anslutningsnumret för de proteomer som rapporteras här är ProteomeXchange: PXD016632 (http://proteomecentral.proteomexchange.org).
Jämförelse med fullmount dissekering
Wholemount dissekering utfördes enligt ett standardprotokoll26. Wholemount dissekering visade ett liknande antal proteiner (cirka 6 000 för SEZ och 6 000 för Cx, n = 4 per grupp) jämfört med CSD25. En av de avsedda förbättringarna med att använda CSD för den exklusiva ekonomiska zon och den ekonomiska zon, i stället för ett helt avsättningsprotokoll, är minskningen av potentiell striatal kontaminering. I SEZ-prover som är förorenade med vävnad från en annan region kan upptäckta kandidatproteiner inte tilldelas en region eftersom betydande anrikning kan bli följden av intresseområdet och kontaminatorn. Immunohistochemically identifierades myelin-associerade glykoprotein (MAG) positiva myelinrika inre kapslar av striatum i helamount prover men sällan i CSD prover (figur 2A). Striatal kontaminering i hela proverna kunde bekräftas genom att identifiera anrikning av myelinproteiner i SEZ jämfört med somatosensoriska cortex (Cx) Grey Matter (GM) prover (figur 2B). Observera att stora delar av Cx GM, särskilt de övre Cx-lagren, är täppt till32.
När stora fiberbuntar passerar genom striatum, resulterade förorening av denna region i berikning av myelinproteiner jämfört med Cx. De myelinproteiner som användes som markörer för striatal kontaminering i SEZ-proverna var myelin-grundproteinet (MBP), myelinassocierat glykoprotein (MAG), proteolipidproteinet 1 (Plp1) och 2',3'-cyklisk-nukleotid 3'-fosfodiesteras (Cnp). Alla myelmarkörproteiner berikades signifikant i SEZ jämfört med Cx. Omvänt gav jämförelser för de fyra myelinmarkörproteinerna i CSD-datauppsättningen inga signifikanta skillnader när man jämförde SEZ med Cx (figur 2B). Proteomic data av striatum33 stöder hypotesen att berikning av myelin proteiner i SEZ prover av helamount dissekering orsakades av förorening med striatal vävnad. Därför förhindrade CSD till stor del förorening av striatal vävnad (rik på kompakt myelin) jämfört med en fullmount dissekering.
Opartisk proteom analys av icke-dissociated vävnad kan avslöja intressanta extracellulära proteiner. Med förbättrad dissekering med hjälp av CSD berikades extracellulära associerade proteiner signifikant i proverna jämfört med hela provet (figur 2C, annoteringsberikningstest). CSD och wholemount dissekering visar en jämförbar anrikning av gen ontologi (GO) termer "extracellulär vesicular exosome" och "extracellulär region del." GO-termen "Matrisome-associerad" är dock något mer berikad i CSD än i hela denmount dissekeringen. Följaktligen hittades ECM korsbindande enzym och nyligen upptäckt neurogenesis regulator transglutaminase-2 (Tgm2) berikade i SEZ jämfört med Cx med hjälp av CSD25. Däremot konstaterades ingen skillnad mellan SEZ- och Cx-proverna som erhållits genom hela denmount dissekering (figur 2D). Proteomic data av striatum33 stöder hypotesen att påvisande av neurogenesis regulator Tgm2 genom fullmount dissekering hindrades av förorening med striatal vävnad. Därför är cryo-section-dissekeringen totalt sett en framgångsrik men också nödvändig förbättring av standard dissekeringen för nischspecifik proteomanalys.
Jämförelse med Laser-capture-mikroskopi
Den främre halvan av SEZ och MEZ av 3 vuxna möss erhölls för LCM (figur 3A ). Sammantaget uppvisar LCM-metoden vissa nackdelar, särskilt när det gäller vävnadsperturbation och effektivitet. För att visualisera den region som är av intresse under dissekeringsmikroskopet är bakgrundsfärgning nödvändig, vilket potentiellt tvättar bort små eller lösliga proteiner av intresse, t.ex. tillväxtfaktorer, cytokiner eller ECM-regulatorer som enzymer. Dessutom tillbringar rutschkanorna olika tider vid rumstemperatur under laserborttagning. Dessutom kan lasern själv denaturera proteiner av intresse.
CSD har en betydande fördel jämfört med LCM när det gäller den tid och ansträngning som krävs för att utföra dissekeringen: steg 1 i protokollet måste utföras på samma sätt för både CSD och LCM; utan detta steg förblir ventrikulära väggar vidhäftande, vilket gör det svårt att separera MEZ- och SEZ-prover. Med tanke på att CSD-sektionerna (100 μm) är 6-7 gånger tjockare än den maximala tjockleken34 i LCM-sektionerna (15 μm), kommer steg 2 (sektionering av hjärnan) och steg 3 (att ta bort MEZ och SEZ från varje koronalsektion) att ta minst 6-7 gånger längre tid för LCM. Den nödvändiga bakgrundsfärgningen och inställningen av lasermikroskopet förbrukar ytterligare tid. Här tog det tre gånger längre tid att skörda 50% av SEZ och MEZ av 3 djur med LCM jämfört med 100% av SEZ och MEZ av 4 djur av CSD, vilket utgör en åttafaldig hastighetsfördel av CSD. Sammanfattningsvis kräver LCM inte bara en anmärkningsvärd mängd ytterligare ansträngning, utan vävnaden utsätts också för en betydligt längre period av manipulering och temperaturförändringar som kan äventyra dynamiken och tillförlitligheten hos data som genereras av efterföljande analys.
MS-resultaten av CSD jämfördes med resultaten från laser capture microdissection (LCM). Båda data uppsättningarna matchades med det proteomiska biblioteket som genererades genom att slå samman CSD-exempel. I genomsnitt gav LCM 3 441 ± 270,0 respektive 3 613 ± 238,7 enskilda proteiner i SEZ respektive medial ventrikulär zon (figur 3B). Med tanke på den anmärkningsvärda skillnaden i proteinidentifiering visade huvudkomponentanalys (PCA) distinkt separation enligt dissekeringsmetoden (komponent 1: 62,7%, visas inte). Komponent 2 visade den största separationen för SEZ och MEZ bland LCM-proverna (8,5%, figur 3C). Komponent 3 verkar också skilja LCM och CSD åt. Denna skillnad kan dock bero på metodbaserade skillnader snarare än antalet identifierade proteiner (6,4 %). Den övergripande regionala separationen förblev dock påfallande tydlig för kryo-dissekeringsdata och mycket bättre än för LCM. Denna diskrepans i datadynamiken kan bero på olika tider som används av proverna vid rumstemperatur under laser dissekering eller en högre känslighet för små vävnad belopp till variabilitet i efterföljande proteomics protokoll och masspektrometri mätningar.
För att söka efter skillnader i ecm:s proteomprofil utfördes ett 2D-annoteringsberikningstest mellan CSD och LCM för SEZ och MEZ (figur 3D). Genom att beräkna den relativa berikningen av GO-termer mellan LCM- och CSD-prover kan man jämföra den relativa proteomdynamiken hos ECM-proteinklustren mellan de två metoderna trots den ojämlika mängden vävnad och skillnaderna i dissekeringsprotokollet. Tomterna avslöjar ett bra samband mellan LCM och CSD. Anteckningarna "extracellulär regiondel" och "extracellulär membranbunden organell" berikas på samma sätt i både metoder och regioner. Den ökade tidsefterfrågan på LCM verkar därför inte kompenseras av en relativt högre känslighet för ECM-associerade proteiner. Istället ger CSD mer robust identifiering/kvantifiering när man jämför provdata för neurogenes och SEZ-associerade ECM-proteiner Tgm2, Thrombospondin-4 (Thbs4), S100a6 och Tenacin-C (Tnc) (figur 3E). När det gäller TnC visade endast CSD berikning för SEZ jämfört med MEZ, även om det kvantifierades i alla prover. De SEZ-associerade basalmembranproteinerna Nidogen-1 (Nid1), Laminin subunit beta-2 (Lamb2) och källarmembranspecifika heparansulfatprooglykankärnprotein (Hspg2)35 uppvisade dock en ännu mer robust berikning i SEZ (jämfört med MEZ) i LCM-proverna än i CSD-proverna (visas inte). Därför kan CSD tillhandahålla vävnadsprover som ger en korrekt och djup kvantitativ proteom för SEZ-karakterisering inom en rimlig tidsram, utan att oroa sig för komprometterad vävnadsintegritet eller proteinförlust.
Statistik
Statistisk testning, 2D-annoteringsberikningstester och PCA gjordes i Perseus-miljön. Proteiner ingick i analysen om ett giltigt värde upptäcktes för varje metod i minst ett prov. Protein överflöd och antal jämförelser visualiserades med hjälp av dataanalys programvara (se tabellen över material). En permutation-baserad kontroll av den falska upptäcktsfrekvensen (FDR) (FDR var inställd på 0,05, 250 randomiseringar) användes för proteinjämförelser. För 2D-annoteringsberikningstesterna36 berikas de visade GO-termerna avsevärt (FDR sattes till 0,02 med hjälp av Benjamini-Hochberg FDR-kontrollmetoden).
Figur 1: Metoden Cryo-Section-Dissection. (A) Översikt över den region som är av intresse: den laterala ventrikeln med neurogen SEZ och den icke-neurogena MEZ. Neuroblaster immunostained med Dcx. (B) Stegvis avlägsnande av OB, främre polen, cortex och corpus callosum ovanför ventriklarna och choroid plexus: 1. placering i dissekering medium, 2. avlägsnande av OB, 3. avlägsnande av den främre polen i cortex, 4. sagittal snitt av ventrikulära toppen, 5. avlägsnande av ventrikulära toppen, 5. avlägsnande av ventrikulära toppen, 4. sagittal snitt av ventrikulära toppen, 5. avlägsnande av ventrikulära toppen, 5. avlägsnande av ventrikulära toppen, 4. sagittal snitt av ventrikulära toppen, 5. avlägsnande av ventrikulära toppen, 5. avlägsnande av ventrikulärt, topp 6. spridning av ventrikulära väggar. C) 100 μm koronalskivor av den nyfrysta mushjärnan,(1)före och (2)efter avlägsnandet av ventrikulära väggar med en iskall skalpell. Skalstänger = 4 mm (D) Färgning av en koronal del av en lateral ventrikel (GFAP: grön; DAPI: blå), som visar SEZ och MEZ dissekerade med CSD. Skalstänger = 300 μm (A), 200 μm (D). Förkortningar: CSD = dissekering av kryosektion; SEZ = subependymal zon; MEZ = medial ependymal zon; Dcx = Doublecortin; OB = luktlampa; GFAP = gliaflimmersyrat protein; DAPI = 4′,6-diamidino-2-fenylindole. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Figur 2: Överlägsen dissekeringsprecision med kryo-sektions-dissekering jämfört med fullmount dissekering. (A) Immunohistokemisk bild av ett SEZ-prov som erhållits genom fullmount dissekering (vänster). Införandet av myelin-rika striatal vävnad visualiseras genom färgning mot MAG (grön). Färgning av en SEZ dissekerad med CSD (höger). I CSD är nästan all striatal myelin (färgning mot MAG, grön) utesluten från provbandet. Kärnor visualiserades med DAPI (blå). B) Jämförelse av myelmarkörberikning i SEZ jämfört med Cx från fullmount (MBP: p = 0,0074; MAG: p = 0,0016; Plp1: p = 0,0011; CNP: p = 0,0029) och CSD (MBP: p = 0,0667; MAG: p = 0,0236; Plp1: p = 0,3420; CNP: p = 0,1842). C) 2D-annoteringsberikningstest som jämför hela den exklusiva ekonomiska zon och den ekonomiska zon och den gemensamma avsett vad som är fallet med CSD-SEZ. GO-termerna extracellulärt utrymme och Matrisome-associerade är mer berikade i CSD-data än i hela de stora data. D) Proteinförekomsten hos NSC-regulatorn Tgm225 som plottats för hela denmount dissekeringen och värdepapperssen. Tgm2 berikas signifikant i SEZ jämfört med Cx i CSD (CSD: p = 0,0029; Wholemount: p = 0,1775). För B och D: Som referens ska proteomdata från Sharma et al.33 med mätningar av striatum och cortex som ritats upp för motsvarande proteiner som visas i helamount- och CSD-proverna. Skalstänger = 200 μm (A). Förkortningar: CSD = dissekering av kryosektion; SEZ = subependymal zon; MAG = myelinassocierad glykoprotein; Cx = somatosensory cortex; MBP = myelin grundläggande protein; Plp1 = proteolipidprotein 1; CNP = 2',3'-cyklisk-nukleotid 3'-fosfodiesteras; GO = gen ontologi; NSC = neural stamcell; Tgm2 = tranglutaminas 2; DAPI = 4′,6-diamidino-2-fenylindole; LFQ = etikettfri kvantitet. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Figur 3: Förbättrad extracellulär proteinkvantifiering med kryo-sektion-dissekering jämfört med LCM. (A) Cresyl violett färgning av en lateral ventrikel före och efter laserfångst av SEZ och MEZ (vänster). Som jämförelse, CSD-snittet av SEZ och MEZ (höger). Skalstänger = 150 μm. (B) Jämförelse av antalet detekterade proteiner i SEZ- och MEZ-proverna från CSD och LCM. Data presenteras som medelvärde ± SD. (C) Huvudkomponentanalys av SEZ- och MEZ-proverna som jämför CSD- och LCM -prover (komponent 2: 8,5 % av variansen; komponent 3: 6,4 %). (D) 2D-annoteringsberikning av kryo- och laserdi dissekerad MEZ (överst) och SEZ (botten). GO-termerna extracellulär organell och extracellulär regiondel berikas avsevärt (röda prickar). E) Överflöd av extracellulära SEZ-associerade markörproteiner i SEZ och MEZ för LCM (Tnc: p = 0,3789) och CSD-proverna (Tgm2: p = 0,2940; S100a6: p = 0,0218; THBS4: p = 0,3941; Tnc: p = 0,0004). Förkortningar: CSD = dissekering av kryosektion; LCM = laserinfångning-mikrodissection; SEZ = subependymal zon; MEZ = medial ependymal zon; GO = gen ontologi; Tnc = Tenacin-C; Tgm2 = transglutaminas 2; S100a6 = S100 kalciumbindande protein A6; THBS4 = trombospondin-4; LFQ = etikettfri kvantitet. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Discussion
CSD-metoden gjorde det möjligt att exakt extrahera SEZ-vävnad och generera ett tillförlitligt proteom med betydande djup med ms CSD visar en klar fördel jämfört med helamount dissekering när det gäller kraftigt minskad striatal förorening av SEZ-prover och extracellulär proteinberikning. Eftersom det också är möjligt att upptäcka ett liknande antal proteiner i enskilda prover (~ 6 500 proteiner per prov) med CSD och fullmount dissekering, är den extra tiden för CSD väl värt ansträngningen. LCM ger mer exakt SEZ-dissekering men nådde ett lägre proteomdjup, med endast 3 500 proteiner per prov trots att de använde samma MS-protokoll som CSD (biblioteksmatchning och etikettfri kvantifiering). Viktigt är att variationen var mycket större, förmodligen på grund av den åttafaldiga längre förberedelsetiden per prov. PCA av de prover som erhållits av LCM och CSD avslöjar en tydlig separation av båda metoderna med snäva regionspecifika kluster som är robust åtskilda från varandra. Däremot visade LCM-proverna en mer spridd fördelning, vilket förmodligen delvis beror på beredningens längd. Det är oklart om insamlingen av betydligt fler prover under en längre period skulle ha gett ett proteom av samma robusthet och djup med LCM. Att beräkna en uppskattning, samla in en liknande provvolym som gjorts för CSD skulle ta 5-8 gånger längre tid med LCM, även upp till 15 gånger längre om prover som tillhandahålls för peptidspektrabiblioteken inkluderades, och mycket av det under tinade förhållanden. Med tanke på de ytterligare störtingarna av vävnaden som är nödvändig för LCM (bakgrundsfärgning, laser dissekering), gav LCM liten, om någon, vinst över CSD. Därför kan CSD anses vara mer lämpligt för extracellulär proteomforskning, särskilt för SEZ.
Om intresseområdet är mindre än den särskilda ekonomiska zon (t.ex. att endast undersöka ependymalcellskiktet) ligger en frihandsmetod bakom LCM:s noggrannhet. Att till exempel använda CSD för att separera ependymalt från det subependymala skiktet är svårt eftersom ependymalskiktet bara är en celldiameter bred och avgränsningen mot det subependymala skiktet inte är synlig för blotta ögat i färsk frusen vävnad. LCM är därför ett bättre val än CSD om en exakt dissekering på en skala under 50 μm är viktigare än ostörd vävnad eller håller dissekeringstiden kort. För regioner med en bredd på 50 μm och mer är dock precisionen hos CSD jämförbar med den för LCM för ECM-proteinanalys.
CSD har redan visat sig vara användbart genom att bidra till undersökningen av ECM: s funktionella roll i den neurogena nischen25. Därför kan den fortsatta tillämpningen av CSD i SEZ för olika protein- och proteomundersökningar (eller till och med enkärniga RNA-sekvensering) leda till detektion av ytterligare neurogenesregulatorer, stamcellsaktiveringsmarkörer och en djupare förståelse för SEZ stamcells nischfysiologi. Med tanke på minskningen av neurogenes i åldrande SEZ37, en kortfattad analys av ECM förändringar av SEZ av äldre kontra unga möss kan främja förståelsen av de exakta nischmekanismer som främjar NSC utveckling och underhåll38,39. Dessutom är påverkan av inflammation och skada på SEZ neurogenes väl etablerad40,41,42,43. Berikning av blod-härledda fibrinogen i SEZ efter när hjärnskada och dess inflytande på SEZ astrogliogenes och ärr bildas44 belyser den potentiella påverkan av trauma-inducerad mikromiljö förändringar på SEZ stamcell fysiologi. Därför kan undersöka SEZ-ECM proteom i samband med hjärnskada med CSD hjälpa till att klargöra mekanismerna genom vilka skada och inflammation påverkar neurogenes. Viktigt är att metoden också kan tillämpas på humana hjärnneurogena nischer i hälsa och sjukdom eftersom färsk frusen vävnad ofta kan erhållas från operationer. Med tanke på artskillnaderna i vuxenneurogenes skulle det dessutom vara fascinerande att tillämpa CSD-metoden på andra arter, t.ex. i samband med striatal neurogenes. Med andra proteindetekteringsmetoder kan dessutom skillnader i lokalt producerade tillväxtfaktorer undersökas noggrant och effektivt med hjälp av CSD för SEZ och MEZ (t.ex. ELISA).
Slutligen kan dissekeringsförfarandet potentiellt ändras för korrekt extraktion av andra hjärnregioner, även för forskningsfrågor som inte är relaterade till neurogenes. Till exempel innehåller CSD ett kort halvupptiningssteg, under vilket kompakt myelin är synligt som vita områden som skiljer sig från den mer genomskinliga kvarvarande hjärnvävnaden. Med en enkel modifiering av metoden skulle denna funktion tillåta den exakta dissekeringen av endast corpus callosum kompakt myelin vävnad, som kan utsättas för proteomic analys av skada-relaterade förändringar. Ett förslag om en protokolländring som skulle tillåta corpus callous dissekering är att utelämna steg 1.5-1.9 av protokollet och fortsätta direkt till att förbereda koronal avsnitt istället för att öppna ventriklarna för att göra SEZ och MEZ tillgängliga. Placera sedan sektionerna på torr is, lyft och halv tina skivorna kort och ta helt enkelt bort corpus callosum med en skalpell. Detta preparat bör nu vara redo för alla analyser som kräver en effektiv dissekering av infödda corpus callosum vävnad.
Sammanfattningsvis presenterar denna studie en mikro-dissekeringsmetod som kan användas för tillförlitlig ventrikulärt neurogen nisch proteom analys. Uppgifterna understryker kompatibiliteten och nyttan av CSD-metoden tillsammans med MS-baserad proteomisk analys av mikromiljön för SEZ. Kombinationen av precision, effektivitet och minimal vävnadsperturbation gör CSD till en värdefull förlängning av befintliga metoder.
Disclosures
Författarna förklarar inga konkurrerande intressen
Acknowledgments
Vi vill uppriktigt tacka Mathias Mann för att ha tillåtit oss att utföra stora delar av experimenten i hans laboratorium, Fabian Coscia för hjälp med LCM och proteomanalys, Tatiana Simon-Ebert för hela avdissektioner och Korbinian Mayr och Igor Paron för deras tekniska hjälp. Vi erkänner tacksamt finansiering från det tyska forskningsrådet till MG (SFB870, TFR274), EU (Eranet S-700982-5008-001), ERC (aERC "NeuroCentro" till MG), Svenska sällskapet för medicinsk forskning (SSMF, till JK) postdoktoralt bidrag och KI-stiftelser och fonder (2020-01351, till JK).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cryostat CM3050S | Leica | ||
| Dissecting microscope | Leica | ||
| Dumont no. 5SF forceps, Inox super fine tip | Fine Science Tools | cat. no. 11252-00 | |
| Hank’s Balanced Salt Solution with CaCl2 and MgCl2 | Invitrogen | cat. no. 24020 | |
| HEPES buffer solution (1 M) | Invitrogen | cat. no. 15630 | |
| Microscope slides | RS France | cat. no. BPB018 | |
| Safe-lock tubes, PCR clean 2.0 mL | Eppendorf | cat. no. 0030123344 | |
| Spring scissors, Vannas-Tubingen 5 mm | Fine Science Tools | cat. no. 15003-08 | |
| Surgical disposable scalpels | B. Braun | cat. no. 5518083 | |
| Tissue culture dishes 60 mm | Greiner Bio-One | cat. no. 633180 | |
| Antibodies | |||
| Alexa Fluor secondary antibodies (488, 555) (1/1,000) | ThermoFisher Scientific | cat. no. A-11001 | |
| DAPI | Sigma | cat. no. D9542 | |
| guinea pig polyclonal anti-DCX 1:500 | Millipore | cat. no. AB2253, | |
| mouse monoclonal anti-GFAP 1:500 | Sigma | cat. no. G3893 | |
| mouse monoclonal anti-MAG 1:400 | Millipore | cat. no. MAB1567 | |
| Software | |||
| GraphPad Prism version 9 | GraphPad Software, San Diego California USA | www.graphpad.com | |
| Perseus Version 1.6.10.50 | Max-Planck Institute for Biochemistry, Munich Bavaria Germany | https://maxquant.net/perseus/ | |
| ZEN imaging software | Carl Zeiss |
References
- Goodman, T., Hajihosseini, M. K. Hypothalamic tanycytes-masters and servants of metabolic, neuroendocrine, and neurogenic functions. Frontiers in Neuroscience. 9, 387 (2015).
- Chaker, Z., et al. Hypothalamic neurogenesis persists in the aging brain and is controlled by energy-sensing IGF-I pathway. Neurobiology of Aging. 41, 64-72 (2016).
- Kuhn, H. G., Toda, T., Gage, F. H. Adult hippocampal neurogenesis: a coming-of-age story. Journal of Neuroscience. 38 (49), 10401-10410 (2018).
- Obernier, K., Alvarez-Buylla, A. Neural stem cells: origin, heterogeneity and regulation in the adult mammalian brain. Development. 146 (4), (2019).
- Obernier, K., et al. Adult neurogenesis is sustained by symmetric self-renewal and differentiation. Cell Stem Cell. 22 (2), 221-234 (2018).
- Bordiuk, O. L., Smith, K., Morin, P. J., Semënov, M. V. Cell proliferation and neurogenesis in adult mouse brain. PloS One. 9 (11), 111453 (2014).
- Doetsch, F., García-Verdugo, J. M., Alvarez-Buylla, A. Cellular composition and three-dimensional organization of the subventricular germinal zone in the adult mammalian brain. Journal of Neuroscience. 17 (13), 5046-5061 (1997).
- Lim, D. A., Alvarez-Buylla, A. The adult ventricular-subventricular zone (V-SVZ) and olfactory bulb (OB) neurogenesis. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 8 (5), 018820 (2016).
- Sato, K.
- Tavazoie, M., et al. A specialized vascular niche for adult neural stem cells. Cell Stem Cell. 3 (3), 279-288 (2008).
- Sirko, S., et al. Chondroitin sulfates are required for fibroblast growth factor-2-dependent proliferation and maintenance in neural stem cells and for epidermal growth factor-dependent migration of their progeny. Stem Cells. 28 (4), 775-787 (2010).
- Mercier, F. Fractones: extracellular matrix niche controlling stem cell fate and growth factor activity in the brain in health and disease. Cellular and Molecular Life Sciences: CMLS. 73 (24), 4661-4674 (2016).
- Mercier, F., Kitasako, J. T., Hatton, G. I. Anatomy of the brain neurogenic zones revisited: fractones and the fibroblast/macrophage network. Journal of Comparative Neurology. 451 (2), 170-188 (2002).
- Nascimento, M. A., Sorokin, L., Coelho-Sampaio, T. Fractone bulbs derive from ependymal cells and their laminin composition influence the stem cell niche in the subventricular zone. Journal of Neuroscience. 38 (16), 3880-3889 (2018).
- Chen, G., et al. In vivo reprogramming for brain and spinal cord repair. eNeuro. 2 (5), 0106-0115 (2015).
- Zhang, Q., Chen, W., Tan, S., Lin, T. Stem cells for modeling and therapy of Parkinson's disease. Human Gene Therapy. 28 (1), 85-98 (2017).
- Wei, C., Xiong, S., Cheng, L. Reprogramming of fibroblasts to neural stem cells by a chemical cocktail. Methods in Molecular Biology. 2117, 265-270 (2020).
- Tian, Z., Zhao, Q., Biswas, S., Deng, W. Methods of reactivation and reprogramming of neural stem cells for neural repair. Methods. 133, 3-20 (2018).
- Heinrich, C., et al. Sox2-mediated conversion of NG2 glia into induced neurons in the injured adult cerebral cortex. Stem Cell Reports. 3 (6), 1000-1014 (2014).
- Masserdotti, G., et al. Transcriptional mechanisms of proneural factors and REST in regulating neuronal reprogramming of astrocytes. Cell Stem Cell. 17 (1), 74-88 (2015).
- Seidenfaden, R., Desoeuvre, A., Bosio, A., Virard, I., Cremer, H. Glial conversion of SVZ-derived committed neuronal precursors after ectopic grafting into the adult brain. Molecular and Cellular Neurosciences. 32 (1-2), 187-198 (2006).
- Lepko, T., et al. Choroid plexus-derived miR-204 regulates the number of quiescent neural stem cells in the adult brain. EMBO Journal. 38 (17), 100481 (2019).
- Silva-Vargas, V., Maldonado-Soto, A. R., Mizrak, D., Codega, P., Doetsch, F. Age-dependent niche signals from the choroid plexus regulate adult neural stem cells. Cell Stem Cell. 19 (5), 643-652 (2016).
- Angelidis, I., et al. An atlas of the aging lung mapped by single cell transcriptomics and deep tissue proteomics. Nature Communications. 10 (1), 963 (2019).
- Kjell, J., et al. Defining the adult neural stem cell niche proteome identifies key regulators of adult neurogenesis. Cell Stem Cell. 26 (2), 277-293 (2020).
- Mirzadeh, Z., Doetsch, F., Sawamoto, K., Wichterle, H., Alvarez-Buylla, A. The subventricular zone en-face: wholemount staining and ependymal flow. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (39), e1938 (2010).
- Kulak, N. A., Geyer, P. E., Mann, M. Loss-less nano-fractionator for high sensitivity, high coverage proteomics. Molecular & Cellular Proteomics: MCP. 16 (4), 694-705 (2017).
- Tyanova, S., Temu, T., Cox, J. The MaxQuant computational platform for mass spectrometry-based shotgun proteomics. Nature Protocols. 11 (12), 2301-2319 (2016).
- Cox, J., Mann, M. MaxQuant enables high peptide identification rates, individualized p.p.b.-range mass accuracies and proteome-wide protein quantification. Nature Biotechnology. 26 (12), 1367-1372 (2008).
- Cox, J., et al. Accurate proteome-wide label-free quantification by delayed normalization and maximal peptide ratio extraction, termed MaxLFQ. Molecular & Cellular Proteomics: MCP. 13 (9), 2513-2526 (2014).
- Perez-Riverol, Y., et al. The PRIDE database and related tools and resources in 2019: improving support for quantification data. Nucleic Acids Research. 47 (1), 442-450 (2019).
- Tomassy, G. S., et al. Distinct profiles of myelin distribution along single axons of pyramidal neurons in the neocortex. Science. 344 (6181), 319-324 (2014).
- Sharma, K., et al. Cell type- and brain region-resolved mouse brain proteome. Nature Neuroscience. 18 (12), 1819-1831 (2015).
- Datta, S., et al. Laser capture microdissection: Big data from small samples. Histology and Histopathology. 30 (11), 1255-1269 (2015).
- Kerever, A., et al. Novel extracellular matrix structures in the neural stem cell niche capture the neurogenic factor fibroblast growth factor 2 from the extracellular milieu. Stem Cells. 25 (9), 2146-2157 (2007).
- Cox, J., Mann, M. 1D and 2D annotation enrichment: a statistical method integrating quantitative proteomics with complementary high-throughput data. BMC Bioinformatics. 13, Suppl 16 12 (2012).
- Daynac, M., Morizur, L., Chicheportiche, A., Mouthon, M. -A., Boussin, F. D. Age-related neurogenesis decline in the subventricular zone is associated with specific cell cycle regulation changes in activated neural stem cells. Scientific Reports. 6, 21505 (2016).
- Navarro Negredo, P., Yeo, R. W., Brunet, A. Aging and rejuvenation of neural stem cells and their niches. Cell Stem Cell. 27 (2), 202-223 (2020).
- Smith, L. K., White, C. W., Villeda, S. A. The systemic environment: at the interface of aging and adult neurogenesis. Cell and Tissue Research. 371 (1), 105-113 (2018).
- Neuberger, E. J., Swietek, B., Corrubia, L., Prasanna, A., Santhakumar, V. Enhanced dentate neurogenesis after brain injury undermines long-term neurogenic potential and promotes seizure susceptibility. Stem Cell Reports. 9 (3), 972-984 (2017).
- Fisch, U., Brégère, C., Geier, F., Chicha, L., Guzman, R. Neonatal hypoxia-ischemia in rat elicits a region-specific neurotrophic response in SVZ microglia. Journal of Neuroinflammation. 17 (1), 26 (2020).
- Götz, M., Sirko, S., Beckers, J., Irmler, M. Reactive astrocytes as neural stem or progenitor cells: In vivo lineage, In vitro potential, and Genome-wide expression analysis. Glia. 63 (8), 1452-1468 (2015).
- Kernie, S. G., Parent, J. M. Forebrain neurogenesis after focal Ischemic and traumatic brain injury. Neurobiology of Disease. 37 (2), 267-274 (2010).
- Pous, L., et al. Fibrinogen induces neural stem cell differentiation into astrocytes in the subventricular zone via BMP signaling. Nature Communications. 11 (1), 630 (2020).
