Summary
Aquí, describimos un método de monitoreo no invasivo que involucra la expresión de luciferasa y proteína fluorescente verde en varias líneas celulares de cáncer de mama. Este protocolo proporciona una técnica para monitorizar la formación tumoral y la colonización metastásica en tiempo real en ratones.
Abstract
El cáncer de mama es una neoplasia maligna heterogénea frecuente y la segunda causa de mortalidad en las mujeres, principalmente debido a la metástasis de órganos a distancia. Se han generado varios modelos animales, incluidos los modelos de ratón ortotópicos ampliamente utilizados, donde se inyectan células cancerosas en la almohadilla de grasa mamaria. Sin embargo, estos modelos no pueden ayudar a monitorear la cinética de crecimiento tumoral y la colonización metastásica. Las herramientas de vanguardia para monitorear las células cancerosas en tiempo real en ratones avanzarán significativamente en la comprensión de la biología del tumor.
Aquí, se establecieron líneas celulares de cáncer de mama que expresan de manera estable luciferasa y proteína fluorescente verde (GFP). Específicamente, esta técnica contiene dos pasos secuenciales iniciados por la medición de la actividad de la luciferasa in vitro y seguidos por la implantación de las células cancerosas en almohadillas de grasa mamaria de ratones de inmunodeficiencia combinada (NOD-SCID) diabéticos-graves no obesos. Después de la inyección, tanto el crecimiento del tumor como la colonización metastásica son monitoreados en tiempo real por el sistema de imágenes de bioluminiscencia no invasiva. Luego, la cuantificación de las metástasis que expresan GFP en los pulmones se examinará mediante microscopía de fluorescencia para validar los resultados de bioluminiscencia observados. Este sofisticado sistema que combina luciferasa y herramientas de detección basadas en fluorescencia evalúa la metástasis del cáncer in vivo, que tiene un gran potencial para su uso en la terapéutica del cáncer de mama y el manejo de enfermedades.
Introduction
Los cánceres de mama son tipos frecuentes de cáncer en todo el mundo, con aproximadamente 250,000 nuevos casos diagnosticados cada año en los Estados Unidos1. A pesar de su alta incidencia, un nuevo conjunto de medicamentos contra el cáncer ha mejorado significativamente los resultados de las pacientes con cáncer de mama2. Sin embargo, estos tratamientos siguen siendo inadecuados, ya que muchos pacientes experimentan recaída de la enfermedad y diseminación metastásica a órganos vitales2, que es la causa principal de morbilidad y mortalidad del paciente. Por lo tanto, uno de los principales desafíos en la investigación del cáncer de mama es identificar los mecanismos moleculares que regulan la formación de metástasis distales para desarrollar nuevos medios para inhibir su desarrollo.
La metástasis del cáncer es un proceso dinámico en el que las células se desprenden del tumor primario e invaden los tejidos vecinos a través de la circulación sanguínea. Así, los modelos animales en los que las células sufren una cascada metastásica similar pueden facilitar la identificación de los mecanismos que rigen este proceso 3,4. Además, estos modelos in vivo son esenciales para el desarrollo de agentes terapéuticos contra el cáncer de mama 5,6. Sin embargo, estos modelos ortotópicos no pueden indicar la cinética real del crecimiento tumoral, ya que el efecto solo se determina al finalizar. Por lo tanto, establecimos una herramienta basada en luciferasa para detectar el desarrollo tumoral y la colonización metastásica en tiempo real. Además, estas células expresan GFP para detectar las colonias metastásicas. Este enfoque es relativamente simple y no implica ningún procedimiento invasivo3. Por lo tanto, la combinación de la luciferasa y la detección de fluorescencia es una estrategia útil para avanzar en los estudios preclínicos de la terapéutica del cáncer de mama y el manejo de la enfermedad.
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Protocol
Todos los experimentos con ratones se llevaron a cabo bajo el protocolo MD-21-16429-5 aprobado por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad Hebrea. Además, la Universidad Hebrea está certificada por la Asociación para la Evaluación y Acreditación del Cuidado de Animales de Laboratorio (AAALAC).
1. Mantenimiento de la línea celular
NOTA: Las líneas celulares de cáncer de mama humano (MCF-7, MDA-MB-468 y MDA-MB-231) se utilizaron en este protocolo.
- Cultive todas las líneas celulares de cáncer de mama en el medio Eagle modificado (DMEM) de Dulbecco, suplementado con suero bovino fetal (FBS) al 10% y penicilina-estreptomicina al 37 °C en una incubadora de dióxido de carbono humidificado (5% CO2).
NOTA: Compruebe la densidad celular con regularidad; dividir y expandir para uso futuro cuando alcancen el 70% de confluencia.
2. Preparación del virus
- Trate las células HEK293T con 1 ml de tripsina hasta que se desprendan.
- Agregue 10 ml de DMEM (10% FBS) para neutralizar la actividad de tripsina y transfiera la suspensión celular a un nuevo tubo centrífugo de 15 ml.
- Centrifugar a 150 × g durante 5 min para sedimentar las células. Deseche el sobrenadante después de la centrifugación y agregue 1 ml de medio DMEM fresco.
- Determine la concentración celular y la semilla 1.2 × 106 células / pozo en una placa de seis pocillos.
- Al día siguiente, precalentar todos los reactivos necesarios, incluido el reactivo de transfección, el DMEM sin suero, el plásmido de la envoltura (VSV-G), el plásmido de empaque de lentivirus (ΔVPR) y el plásmido blástico pLX304 Luciferase-V5 o el plásmido FUW GFP.
- En un tubo centrífugo en autoclave de 1,5 ml, mezcle 50 μL de DMEM sin suero con 0,3 μg de plásmido VSV-G, 1 μg de ΔVPR y 1,2 μg de plásmido blásico pLX304 Luciferasa-V5 o plásmido FUW GFP.
- Después de mezclar bien estos plásmidos con el medio, agregue 5 μL del reactivo de transfección, mezcle suavemente e incube la mezcla a temperatura ambiente durante 15 min.
- Después de la incubación, agregue la mezcla gota a gota a las células HEK293T.
- Después de 24 h, reemplace el medio de crecimiento con 2 ml de (30% FBS) DMEM. Al día siguiente (48 h después de la transfección), recolecte el medio que contiene los virus ("pLX304 Luciferase-V5 o los virus FUW GFP").
NOTA: El uso de 30% de FBS mejora la eficiencia de producción de virus. - Para evitar cualquier residuo de células HEK293T, pase el medio que contiene el virus a través de un filtro de jeringa de 0,45 μm o centrífuga a 150 × g durante 5 min, y recoja el sobrenadante.
NOTA: Para el almacenamiento a largo plazo, mantenga las alícuotas de trabajo del virus a -80 °C.
3. Establecimiento de células que expresen de manera estable GFP y luciferasa ("células GFP + Luc+")
- El día antes de infectar las células, sembra 8 × 105 células por pozo en una placa de seis pocillos.
- Después de la incubación durante la noche, reemplace el medio de crecimiento con un medio fresco que contenga 8 μg / ml de polibreno. Agregue 200 μL de virus FUW GFP gota a gota a las células.
- Opcional: Para mejorar la eficiencia del virus, centrífuga la placa a 560 × g durante 30 min (37 °C) (infección por espín).
- Incubar las células durante 48 h, y verificar la expresión de GFP por microscopía de fluorescencia.
- Clasificar las células que expresan GFP por clasificación celular activada por fluorescencia (FACS) (GFP+) (Figura 1A).
- Infectar las células clasificadas por GFP con los virus blastocitos pLX304 Luciferasa-V5 como se describe en el paso 3.2.
- Tratar las células con blasticidina (10 μg/mL) 30 h después de la infección para enriquecer las células que expresan blastos de luciferasa-V5 pLX304 (células GFP+, Luc+ ). Luego, cada dos días, reemplace con un medio fresco que contenga blasticidina. Además, como control, trate las células naïve con el mismo medio que contiene blasticidina.
NOTA: Se debe observar una clara diferencia entre las células infectadas y las células de control después de unos días de tratamiento con blasticidina. Este efecto depende de la línea celular y generalmente toma ~ 8-10 días. Una tasa de supervivencia pobre indicará un bajo rendimiento de producción viral. Si es así, produzca un nuevo lote de virus, ya que la baja eficiencia puede afectar a futuros experimentos.
4. Validación de la actividad de la luciferasa in vitro
- Cultive las células MCF-7, MDA-MB-468 y MDA-MB-231 GFP+ Luc+ en una placa de 15 cm con una confluencia del 80%. Cosechar las células por tripsinización, como se describe en los pasos 2.1-2.2.
- Sembra un número creciente de células en cada pozo (0.1, 0.5, 1, 2, 3, 4 × 104) en una placa negra de 96 pocillos.
NOTA: Las placas negras de 96 pocillos son más adecuadas para medir los niveles de luciferasa, ya que las placas blancas o transparentes producirán señales de autoluminiscencia. Como control, use solución salina tamponada con fosfato (PBS) sola en un pozo para asegurarse de que no haya autoluminiscencia de PBS. - Llene todos los pozos con 100 μL de DMEM e incube durante 16-24 h.
- Preparar la solución de luciferina en PBS a una concentración de 1,5 mg/ml a partir del caldo de 30 mg/ml. Alícuota el caldo de solución de luciferina y guárdelo a -20 °C.
- Lave las células una vez con PBS suavemente, agregue 100 μL de solución de luciferina en cada pocillo y espere 2 min. Finalmente, mida la actividad de la luciferasa en todas las células de cáncer de mama utilizando bioluminiscencia.
NOTA: Examinar la expresión in vitro de GFP y luciferasa antes de los experimentos con animales es crucial. Además, se utilizan pozos en blanco para restar el fondo.
5. Inyectar ratones con células GFP+ Luc+
- Transfiera 5 × 106 (MCF-7 y MDA-MB-468) o 2 × 106 (MDA-MB-231) células GFP+ Luc+ a 200 μL o 100 μL PBS, respectivamente.
- Antes de la inyección, limpie la campana biológica estéril con una solución desinfectante al 5% (consulte la Tabla de materiales). Luego, anestesiar a los ratones con aire filtrado (0,2 μm) que contenga 4% de isoflurano a una velocidad de flujo de aire de 1 L / min durante 2-3 min.
NOTA: Es esencial confirmar la anestesia adecuada; pellizque el dedo del pie del ratón y busque cualquier respuesta. - Coloque un cono sobre la cabeza del ratón anestesiada en posición supina. Aplique ungüento veterinario en sus ojos para prevenir la sequedad mientras está bajo anestesia.
- Limpie el área abdominal del ratón, por encima de la glándula mamaria, con etanol usando un hisopo de algodón y levante la4ª glándula mamaria con fórceps.
- Inserte la aguja 27 G x 3/4 (0,4 x 19 mm) debajo de la almohadilla de grasa e inyecte lentamente 100 μL de la suspensión celular.
NOTA: Aparecerá una protuberancia redonda debajo de la piel. Además, una inyección inadecuada puede conducir a una desviación en la tasa de crecimiento del tumor o a la ausencia de tumor en el mismo grupo experimental. - Después del procedimiento de inyección, saque a los ratones de la capucha y transfiéralos a una nueva jaula. Monitorea a los ratones hasta que vuelvan a la conciencia.
NOTA: Asegúrese de que todas las agujas y jeringas usadas se desechen en la caja de objetos punzantes.
6. Medición de los niveles de luciferasa en ratones GFP+ Luc+
- Antes de la detección de bioluminiscencia, sujete al ratón consciente sosteniendo su cuello con la mano izquierda. Luego, incline la mano hacia la izquierda, lo que resulta en la cara del ratón hacia arriba con la parte inferior del cuerpo en posición supina.
- Inyecte 100 μL de luciferina (30 mg/ml) por vía intraperitoneal (i.p.) en la superficie abdominal del ratón en el cuadrante abdominal inferior izquierdo con una jeringa de 1,0 ml con aguja de tamaño 27 G x 3/4 (0,4 x 19 mm).
NOTA: La punta de la aguja no debe insertarse a más de 3-5 mm de la pared abdominal, ya que podría penetrar en los órganos viscerales. Además, se recomienda realizar la inyección i.p. sin anestesia, ya que la distribución de luciferina en el cuerpo de ratones anestesiados es más lenta que en ratones conscientes. Por lo tanto, el monitoreo de los niveles de luciferasa en ratones conscientes es un procedimiento más rápido. - Mantenga al ratón durante 7 minutos sin anestesia seguido de 3 minutos dentro de la cámara de anestesia antes de medir la cinética del tumor.
NOTA: El tiempo de incubación varía entre los diferentes experimentos, líneas celulares y de una especie a otra. Por lo tanto, se recomienda calibrar el tiempo de incubación antes de comenzar los experimentos. - Anestesiar a los ratones como se describe en los pasos 5.2-5.3.
- Abra el software (Tabla de materiales) durante la incubación, inicialice el sistema de imágenes y haga clic en el botón Inicializar .
NOTA: Tenga en cuenta que la cámara tardará ~ 10 minutos en enfriarse y alcanzar los -90 ° C. Además, como control de fondo, mida los niveles de luciferasa en ratones ingenuos (es decir, ratones GFP + inyectados con células que no expresan el gen de la luciferasa). - Mantenga la configuración en exposición automática utilizando los siguientes ajustes: tiempo de exposición automático, 60 s; Medio de binificación, F/Stop 1; Filtro de excitación bloqueado; Filtro de emisión abierto. Cuando finalice la inicialización , seleccione Asistente para imágenes | Bioluminiscencia y, a continuación, haga clic en Siguiente | Abrir | de filtro seleccione Ratón en el asunto de la imagen.
- En la vista de campo, seleccione la etapa C (10 cm) y la altura del sujeto: 1,50 cm.
- Haga clic en Etapa de configuración de imagen en C y, antes de hacer clic en el botón Adquirir , asegúrese de que el mouse esté colocado en el escenario en la posición supina adecuada.
- Cierre la puerta, haga clic en el botón Adquirir y espere a que aparezca una imagen en la pantalla.
NOTA: Con la opción de exposición automática, una señal fuerte tarda de 5 a 20 s dependiendo de la señal; una señal débil tardará alrededor de 60 s. - Repita este paso para los otros ratones.
- Para detectar metástasis pulmonares, cubra la señal fuerte del tumor primario con papel de cartón negro grueso y exponga solo el lado ventral de los pulmones hacia la cámara. Capture la imagen utilizando los mismos parámetros descritos anteriormente.
7. Adquisición de imagen ex vivo mediante bioluminiscencia y fluorescencia
- Sacrificar a los ratones usando la inhalación de dióxido de carbono (CO2) en el desecador y diseccionar a los ratones usando tijeras y fórceps en autoclave.
- Perfundir a los ratones usando solución salina al 0.9%, cosechar los órganos y enjuagar con 1x PBS para eliminar las manchas de sangre del órgano.
- Transfiera el órgano enjuagado a una placa de Petri y colóquelo en la etapa de la máquina de bioluminiscencia. Aplique el mismo ajuste de bioluminiscencia que se describe en los pasos 6.2-6.6.
NOTA: Debido a la disminución de la señal de luciferasa, este paso limita el tiempo. Por lo tanto, después de la eutanasia de ratones, visualice inmediatamente el órgano por bioluminiscencia. - Para las imágenes GFP, aplique la misma configuración que se describe en el paso 6.3, utilizando el filtro GFP de fluorescencia en lugar de Bioluminiscencia.
- Tome imágenes pulmonares con un microscopio estereoscópico para examinar la presencia de colonias de GFP+ .
8. Análisis de datos de bioluminiscencia
- Haga doble clic en el software y seleccione Abrir en el menú Archivo .
- Abra todos los archivos y minimícelos. Asegúrese de que todas las unidades sean Radiancia (Fotones).. Además, haga clic en Aplicar a todos para mantener los mismos parámetros para todas las imágenes.
- En el menú Ver , seleccione la Paleta de herramientas, que abrirá una nueva ventana.
- En la ventana Paleta de herramientas , seleccione la pestaña Herramientas de ROI y, en Tipo, elija el ROI promedio de Bkg.
- En las herramientas de ROI, seleccione Círculo y dibuje un círculo pequeño en el área torácica del mouse.
- Haga doble clic en el círculo, seleccione la opción Usar como BKG para futuros ROI en la pestaña ROI en segundo plano y haga clic en Listo.
9. Medición del flujo total
- En la ventana Paleta de herramientas , seleccione la pestaña Herramientas de ROI y, en Tipo, elija La medición del ROI.
- En las herramientas de ROI, seleccione Círculo y dibuje un círculo grande en el tumor primario del ratón.
- Haga clic con el botón derecho en Copiar ROI y haga clic con el botón derecho en Pegar ROI en cada archivo individual de cada mouse.
- Haga clic en Medir ROI en la pestaña Herramientas de ROI , que abrirá una nueva ventana denominada Mediciones de ROI. En esta pestaña, mantenga los tipos de medición como radiancia (fotones) y los atributos de imagen como todos los valores rellenados.
- Exporte el archivo como formato de archivo de medidas (*.txt) o Csv (*.csv).
- Abra los datos exportados en una hoja de cálculo y tome el flujo total (p / s) y los valores de las semanas.
NOTA: Este paso se puede utilizar para medir diferentes grupos. Por ejemplo, los ratones tratados con un vehículo frente a los tratados con un medicamento. - Genere una gráfica XY, donde el Tiempo se presenta a lo largo del eje X y el Flujo Total (p/s) a lo largo del eje Y. Para cada semana, tome el parámetro flujo total (p / s) para cada grupo de muestra y determine cualquier diferencia significativa utilizando la prueba t de Student no paramétrica.
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Representative Results
Generamos líneas celulares de cáncer de mama (MDA-MB-231, MCF-7 y MDA-MB-468) que expresan vectores de GFP y luciferasa. Específicamente, esto se logró mediante una infección secuencial. Primero, las líneas celulares de cáncer de mama se infectaron con un vector de lentivirus que expresa GFP fluorescente. Las células GFP-positivas (GFP+) se clasificaron 2 días después de la infección (Figura 1A, B) y se infectaron con el vector pLX304 Luciferasa-V5. Luego, se utilizó blasticidina para seleccionar que la luciferasa generara las células indicadas (GFP +, Luc +). Para validar la actividad de la luciferasa in vitro , demostramos un aumento dependiente del número de células en los niveles de actividad de la luciferasa (Figura 1C). Además, se encontró una correlación lineal entre la actividad de la luciferasa y el número de células (Figura 1D).
Para confirmar la detección de luciferasa en los ratones, las tres líneas celulares de cáncer de mama GFP +, Luc + se inyectaron en la almohadilla de grasa mamaria de ratones hembra NOD / SCID. Luego, los ratones fueron sometidos a lectura de bioluminiscencia cada dos semanas para determinar la cinética de crecimiento tumoral. Encontramos que la cinética de crecimiento tumoral varía entre las líneas celulares; es más rápido en el MDA-MB-231 más agresivo y más lento en las líneas celulares menos agresivas MCF-7 y MDA-MB-468 (Figura 2).
A continuación, se obtuvieron las lecturas de fluorescencia de los tumores aislados generados por la línea celular MDA-MB-231. Específicamente, 6 semanas después de la inyección, los tumores se recolectaron de los ratones para confirmar la fluorescencia GFP; se encontró que los tumores mantienen su expresión de GFP (Figura 3A). El siguiente objetivo fue determinar si la formación de colonias metastásicas podría evaluarse en tiempo real en el pulmón de un ratón vivo utilizando la máquina de bioluminiscencia; se obtuvieron lecturas positivas de bioluminiscencia del pulmón de todo el ratón (Figura 3B). Para verificar que se trataba de colonias metastásicas positivas, se recolectó el pulmón y se observaron las colonias metastásicas para GFP y bioluminiscencia (Figura 3C).
Figura 1: Validación de la expresión de GFP y la actividad de la luciferasa en las células. (A) Las células GFP fueron clasificadas por FACS. Imágenes representativas de células MDA-MB-231 no GFP y GFP+ . (B) Las células MDA-MB-231, MCF-7 y MDA-MB-468 se infectaron con el virus que expresa GFP, seguido de la clasificación FACS. Una imagen de cada línea celular se representa en campo brillante (izquierda) y GFP (derecha). Las células fueron capturadas bajo un microscopio Nikon Eclipse 80i con un aumento de 10x. Barras de escala = 100 μm. (C) La bioluminiscencia debida a la actividad de la luciferasa en cada célula fue determinada por un luminómetro. Un número creciente de células (como en A) fueron sembradas en una placa negra de 96 pocillos. La barra de color representa la intensidad de la luminiscencia. (D) Un gráfico XY que demuestra la actividad luciferasa de las células MDA-MB-231 (medida en C). Abreviaturas: GFP = proteína verde fluorescente; SSC-A = área de pico disperso lateralmente; GFP+ = GFP positivo; FACS = clasificación celular activada por fluorescencia. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: La cinética del crecimiento tumoral fue determinada por la máquina de bioluminiscencia. La cinética de crecimiento tumoral in vivo se determinó semanalmente en ratones NOD-SCID, y las imágenes representativas se capturaron utilizando bioluminiscencia para (A) MDA-MB-231, (B) MCF-7, (C) MDA-MB-468. La barra de color representa la intensidad de la luminiscencia. (D) La cuantificación de la actividad de luminiscencia se presenta como flujo total. (E) ratones MDA-MB-231; lectura individual representada como una trama. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Diferentes enfoques para validar la formación de tumores y la metástasis pulmonar. (A) Los ratones fueron perfundidos, y los tumores generados a partir de células MDA-MB-231 fueron cosechados. Los niveles de GFP en los tumores se midieron mediante la máquina de bioluminiscencia. (B) Metástasis pulmonar en ratones enteros, como lo demuestra la bioluminiscencia. (C) Para confirmar la presencia de metástasis, los pulmones fueron cosechados y observados bajo smZ18 Nikon Stereomicroscope (campo brillante y GFP). Se tomaron muestras bioluminiscentes de Luc inmediatamente después de la eutanasia de los ratones. La barra de color representa la intensidad de la luminiscencia. Abreviaturas: GFP = proteína verde fluorescente; Luc = luciferasa; BLI = imágenes de bioluminiscencia. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Los experimentos con animales son obligatorios para la investigación del cáncer 7,8,9, y de hecho se han desarrollado muchos protocolos 3,6,10,11,12,13,14. Sin embargo, la mayoría de estos estudios determinaron el efecto biológico solo al final de los experimentos, y por lo tanto el impacto en la cinética del crecimiento tumoral o la colonización de metástasis sigue sin determinarse. Aquí, proporcionamos un enfoque de bioluminiscencia dual no invasivo mediante la inoculación de células que expresan GFP y luciferasa en la almohadilla de grasa mamaria. Usando esta poderosa herramienta, el desarrollo de tumores y metástasis puede ser monitoreado en ratones en tiempo real14. Sin embargo, esta técnica contiene algunos pasos críticos, que exigen precaución adicional. Por ejemplo, uno de los pasos críticos para el éxito de este experimento es verificar la eficiencia de la infección mediante el monitoreo de los niveles de expresión de luciferasa y GFP en las células antes de la inyección en ratones. Por lo tanto, las dosis de blasticidina15 y el protocolo de producción lentiviral16 deben optimizarse para cada línea celular para aumentar la eficiencia experimental.
Algunos problemas técnicos pueden afectar la señal de bioluminiscencia en el experimento in vivo . Estos problemas incluyen el movimiento del ratón durante la lectura de bioluminiscencia, que puede interferir con la calidad de la imagen y, por lo tanto, afectar las curvas cinéticas del tumor. Por lo tanto, los animales deben estar completamente anestesiados después de la inyección de sustrato y durante todo el procedimiento. Además, colocar varios animales en la máquina simultáneamente puede conducir a una inconsistencia en la lectura de luminiscencia, ya que los ratones con una señal alta pueden enmascarar a los de menor intensidad. Por lo tanto, las lecturas de luminiscencia deben tomarse individualmente para cada ratón.
Al realizar la lectura de bioluminiscencia in vitro , es vital reemplazar el medio de cultivo con PBS, ya que el medio contiene suero y otros suplementos que pueden interferir con la señal. Además, es necesario eliminar la lectura de fondo midiendo la señal de luminiscencia de una muestra que solo contiene PBS (sin celdas).
Este protocolo describe una técnica no invasiva para medir el crecimiento de células de cáncer de mama y las metástasis. Específicamente, este artículo describe la inyección de líneas celulares de cáncer de mama, expresando tanto GFP como luciferasa en la almohadilla de grasa mamaria de ratón. Esta combinación proporciona un método rápido y fiable para medir la colonización metastásica in vivo y ex vivo.
A pesar de las claras ventajas de este método, tiene algunas limitaciones. La principal restricción es la necesidad de una máquina de bioluminiscencia, ya que esta es una máquina relativamente costosa y, por lo tanto, no siempre está disponible. Además, cada lectura requiere mucho tiempo y, por lo tanto, la máquina puede estar sobrevendida y no disponible. Otra limitación se refiere al protocolo en sí. Para detectar la señal de bioluminiscencia en las muestras ex vivo , se recomienda sacrificar a los ratones y examinar la muestra inmediatamente. Este paso es una etapa límite de tiempo y no es factible para un gran conjunto de experimentos.
En conclusión, esta herramienta de bioluminiscencia no invasiva es altamente sensible a la detección del desarrollo tumoral y la metástasis en ratones. Este protocolo no se limita al cáncer de mama y podría aplicarse a otros carcinomas como el cáncer de pulmón y de páncreas. Además, debido a que no es invasivo, se puede aplicar para medir la eficacia de los medicamentos contra el cáncer12 y sus efectos sobre la cinética de crecimiento tumoral en tiempo real.
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Disclosures
Todos los autores han revelado que no tienen ningún conflicto de intereses.
Acknowledgments
Agradecemos a los miembros del laboratorio Y.D.S. Nos gustaría agradecer al Instituto Wohl de Medicina Traslacional en el Centro Médico Hadassah, Jerusalén, por proporcionar la instalación de imágenes de animales pequeños. Este estudio fue apoyado por el Premio de Desarrollo de Carrera de Investigación del Fondo de Investigación del Cáncer de Israel.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.7 mL eppendorf tubes | Lifegene | LMCT1.7B-500 | |
| 10 µL tips | Lifegene | LRT10 | |
| 1000 µL tips | Lifegene | LRT1000 | |
| 15 mL tubes | Lifegene | LTB15-500 | |
| 200 µL tips | Lifegene | LRT200 | |
| 6 well cell culture plate | COSTAR | 3516 | |
| 96 well Plates BLACK flat bottom | Bar Naor | BN30496 | |
| Automated Cell Counters | Thermofisher | A50298 | |
| BD FACSAria III sorter | BD | ||
| BD Microlance 3 Needles 27 G (3/4'') | BD | 302200 | |
| BD Plastipak Syringes 1 mL x 120 | BD | 303172 | |
| Corning 100 mm x 20 mm Style Dish | CORNING | 430167 | |
| Corning 150 mm x 20 mm Style Dish | CORNING | 430599 | |
| Countess cell counting chamber slides | Thermofisher | C10228 | |
| Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM), high glucose, no glutamine | Biological Industries | 01-055-1A | |
| Eclipse 80i microscope | Nikon | ||
| eppendorf Centrifuge 5810 R | Sigma Aldrich | EP5820740000 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Biological Industries | 04-127-1A | |
| FUW GFP | Gifted from Dr. Yossi Buganim's lab (Hebrew University of Jerusalem) | ||
| HEK293T | Gifted from Dr. Lior Nissim's lab (Hebrew University of Jerusalem) | ||
| Isoflurane, USP Terrell | Piramal | NDC 66794-01-25 | |
| IVIS Spectrum In Vivo Imaging System | Perkin Elmer | 124262 | |
| L-Glutamine Solution | Biological industries | 03-020-1A | |
| Living Image Software | PerkinElmer | bioluminescence measurement | |
| MCF-7 | ATCC | ATCC HTB-22 | |
| MDA-MB-231 | ATCC | ATCC HTB-26 | |
| MDA-MB-468 | ATCC | ATCC HTB-132 | |
| Pasteur pipettes | NORMAX | 2430-475 | |
| PBS | Hylabs | BP655/500D | |
| pCMV-dR8.2-dvpr | Addgene | #8455 | Provided by David M. Sabatini’s lab (Whitehead institute, Boston, USA) |
| pCMV-VSV-G | Addgene | #8454 | Provided by David M. Sabatini’s lab (Whitehead institute, Boston, USA) |
| Penicillin-Streptomycin Solution | Biological Industries | 03-031-1B | |
| Petri dish 90 mm (90x15) | MINI PLAST | 820-090-01-017 | |
| Pipettes 10ml | Lifegene | LG-GSP010010S | |
| Pipettes 25ml | Lifegene | LG-GSP010050S | |
| Pipettes 5ml | Lifegene | LG-GSP010005S | |
| pLX304 Luciferase-V5 blast plasmid | Addgene | #98580 | |
| Polybrene | Sigma Aldrich | #107689 | |
| Prism 9 | GraphPad | ||
| Reagent Reservoirs | Bar Naor | BN20621STR200TC | |
| SMZ18 Stereo microscopes | Nikon | ||
| Sodium Chloride | Bio-Lab | 190359400 | |
| Syringe filters | Lifegene | LG-FPV403030S | |
| Trypan Blue 0.5% solution | Biological industries | 03-102-1B | |
| Trypsin EDTA Solution B (0.25%), EDTA (0.05%) | Biological Industries | 03-052-1a | |
| Vacuum driven Filters | SOFRA LIFE SCIENCE | SPE-22-500 | |
| Virusolve | disinfectant | ||
| VivoGlo Luciferin, In Vivo Grade | Promega | P1043 | |
| X-tremeGENE HP DNA Transfection Reagent | Sigma Aldrich | #6366236001 |
References
- Waks, A. G., Winer, E. P. Breast cancer treatment: A review. JAMA. 321 (3), 288-300 (2019).
- Jin, X., Mu, P.
- Saha, D., et al. In vivo bioluminescence imaging of tumor hypoxia dynamics of breast cancer brain metastasis in a mouse model. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (56), e3175 (2011).
- Rashid, O. M., et al. Is tail vein injection a relevant breast cancer lung metastasis model. Journal of Thoracic Disease. 5 (4), 385-392 (2013).
- Fantozzi, A., Christofori, G. Mouse models of breast cancer metastasis. Breast Cancer Research. 8 (4), 212 (2006).
- Kocatürk, B., Versteeg, H. H. Orthotopic injection of breast cancer cells into the mammary fat pad of mice to study tumor growth. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (96), e51967 (2015).
- Baker, M.
- Wang, Y., Tseng, J. -C., Sun, Y., Beck, A. H., Kung, A. L. Noninvasive imaging of tumor burden and molecular pathways in mouse models of cancer. Cold Spring Harbor Protocols. 2015 (2), 135-144 (2015).
- Kim, J. E., Kalimuthu, S., Ahn, B. -C. In vivo cell tracking with bioluminescence imaging. Nuclear Medicine and Molecular Imaging. 49 (1), 3-10 (2015).
- Paschall, A. V., Liu, K. An orthotopic mouse model of spontaneous breast cancer metastasis. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (114), (2016).
- Morten, B. C., Scott, R. J., Avery-Kiejda, K. A. Comparison of Three Different Methods for Determining Cell Proliferation in Breast Cancer Cell Lines. Journal of Visualized Experiments. (115), e54040 (2016).
- Zimmerman, M., Hu, X., Liu, K. Experimental metastasis and CTL adoptive transfer immunotherapy mouse model. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (45), e2077 (2010).
- Lv, X., et al. Orthotopic transplantation of breast tumors as preclinical models for breast cancer. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (159), e61173 (2020).
- Cheng, R. Y. S., et al. Studying triple negative breast cancer using orthotopic breast cancer model. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (157), e60316 (2020).
- Bajikar, S. S., et al. Tumor-suppressor inactivation of GDF11 occurs by precursor sequestration in triple-negative breast cancer. Developmental Cell. 43 (4), 418-435 (2017).
- Khatib, A., et al. The glutathione peroxidase 8 (GPX8)/IL-6/STAT3 axis is essential in maintaining an aggressive breast cancer phenotype. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (35), 21420-21431 (2020).
