Ici, nous décrivons une méthode de surveillance non invasive impliquant l’expression de la luciférase et de la protéine fluorescente verte dans diverses lignées cellulaires de cancer du sein. Ce protocole fournit une technique pour surveiller la formation de tumeurs et la colonisation métastatique en temps réel chez la souris.
Le cancer du sein est une tumeur maligne hétérogène fréquente et la deuxième cause de mortalité chez les femmes, principalement due à des métastases d’organes distants. Plusieurs modèles animaux ont été générés, y compris les modèles murins orthotopiques largement utilisés, où des cellules cancéreuses sont injectées dans le coussinet adipeux mammaire. Cependant, ces modèles ne peuvent pas aider à surveiller la cinétique de croissance tumorale et la colonisation métastatique. Des outils de pointe pour surveiller les cellules cancéreuses en temps réel chez la souris feront progresser considérablement la compréhension de la biologie tumorale.
Ici, des lignées cellulaires de cancer du sein exprimant de manière stable la luciférase et la protéine fluorescente verte (GFP) ont été établies. Plus précisément, cette technique contient deux étapes séquentielles initiées par la mesure de l’activité de la luciférase in vitro et suivies de l’implantation des cellules cancéreuses dans les coussinets adipeux mammaires de souris atteintes d’immunodéficience combinée diabétique-sévère (NOD-SCID) non obèses. Après l’injection, la croissance tumorale et la colonisation métastatique sont surveillées en temps réel par le système d’imagerie par bioluminescence non invasif. Ensuite, la quantification des métastases exprimant la GFP dans les poumons sera examinée par microscopie à fluorescence pour valider les résultats de bioluminescence observés. Ce système sophistiqué combinant la luciférase et les outils de détection basés sur la fluorescence évalue les métastases cancéreuses in vivo, qui ont un grand potentiel d’utilisation dans les thérapies contre le cancer du sein et la gestion des maladies.
Les cancers du sein sont des types de cancer fréquents dans le monde entier, avec environ 250 000 nouveaux cas diagnostiqués chaque année aux États-Unis1. Malgré son incidence élevée, un nouvel ensemble de médicaments anticancéreux a considérablement amélioré les résultats des patientes atteintes d’un cancer du sein2. Cependant, ces traitements sont encore inadéquats, car de nombreux patients connaissent une rechute de la maladie et une propagation métastatique aux organes vitaux2, qui est la principale cause de morbidité et de mortalité des patients. Par conséquent, l’un des principaux défis de la recherche sur le cancer du sein est d’identifier les mécanismes moléculaires régulant la formation des métastases distales afin de développer de nouveaux moyens d’inhiber leur développement.
La métastase cancéreuse est un processus dynamique dans lequel les cellules se détachent de la tumeur primaire et envahissent les tissus voisins par la circulation sanguine. Ainsi, les modèles animaux dans lesquels les cellules subissent une cascade métastatique similaire peuvent faciliter l’identification des mécanismes qui régissent ce processus 3,4. De plus, ces modèles in vivo sont essentiels au développement d’agents thérapeutiques contre le cancer du sein 5,6. Cependant, ces modèles orthotopiques ne peuvent pas indiquer la cinétique réelle de croissance tumorale car l’effet n’est déterminé qu’à la fin. Par conséquent, nous avons mis en place un outil basé sur la luciférase pour détecter le développement de tumeurs et la colonisation métastatique en temps réel. De plus, ces cellules expriment la GFP pour détecter les colonies métastatiques. Cette approche est relativement simple et n’implique aucune procédure invasive3. Ainsi, la combinaison de la luciférase et de la détection par fluorescence est une stratégie utile pour faire progresser les études précliniques sur les thérapies contre le cancer du sein et la gestion de la maladie.
Les expériences sur les animaux sont obligatoires pour la recherche sur le cancer 7,8,9, et en effet de nombreux protocoles ont été développés 3,6,10,11,12,13,14. Cependant, la plupart de ces …
The authors have nothing to disclose.
Nous remercions les membres du laboratoire Y.D.S. Nous tenons à remercier l’Institut Wohl pour la médecine translationnelle du Centre médical Hadassah, à Jérusalem, pour avoir fourni l’installation d’imagerie pour petits animaux. Cette étude a été soutenue par le prix de développement de carrière en recherche du Fonds israélien de recherche sur le cancer.
1.7 mL eppendorf tubes | Lifegene | LMCT1.7B-500 | |
10 µL tips | Lifegene | LRT10 | |
1000 µL tips | Lifegene | LRT1000 | |
15 mL tubes | Lifegene | LTB15-500 | |
200 µL tips | Lifegene | LRT200 | |
6 well cell culture plate | COSTAR | 3516 | |
96 well Plates BLACK flat bottom | Bar Naor | BN30496 | |
Automated Cell Counters | Thermofisher | A50298 | |
BD FACSAria III sorter | BD | ||
BD Microlance 3 Needles 27 G (3/4'') | BD | 302200 | |
BD Plastipak Syringes 1 mL x 120 | BD | 303172 | |
Corning 100 mm x 20 mm Style Dish | CORNING | 430167 | |
Corning 150 mm x 20 mm Style Dish | CORNING | 430599 | |
Countess cell counting chamber slides | Thermofisher | C10228 | |
Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM), high glucose, no glutamine | Biological Industries | 01-055-1A | |
Eclipse 80i microscope | Nikon | ||
eppendorf Centrifuge 5810 R | Sigma Aldrich | EP5820740000 | |
Fetal Bovine Serum (FBS) | Biological Industries | 04-127-1A | |
FUW GFP | Gifted from Dr. Yossi Buganim's lab (Hebrew University of Jerusalem) | ||
HEK293T | Gifted from Dr. Lior Nissim's lab (Hebrew University of Jerusalem) | ||
Isoflurane, USP Terrell | Piramal | NDC 66794-01-25 | |
IVIS Spectrum In Vivo Imaging System | Perkin Elmer | 124262 | |
L-Glutamine Solution | Biological industries | 03-020-1A | |
Living Image Software | PerkinElmer | bioluminescence measurement | |
MCF-7 | ATCC | ATCC HTB-22 | |
MDA-MB-231 | ATCC | ATCC HTB-26 | |
MDA-MB-468 | ATCC | ATCC HTB-132 | |
Pasteur pipettes | NORMAX | 2430-475 | |
PBS | Hylabs | BP655/500D | |
pCMV-dR8.2-dvpr | Addgene | #8455 | Provided by David M. Sabatini’s lab (Whitehead institute, Boston, USA) |
pCMV-VSV-G | Addgene | #8454 | Provided by David M. Sabatini’s lab (Whitehead institute, Boston, USA) |
Penicillin-Streptomycin Solution | Biological Industries | 03-031-1B | |
Petri dish 90 mm (90×15) | MINI PLAST | 820-090-01-017 | |
Pipettes 10ml | Lifegene | LG-GSP010010S | |
Pipettes 25ml | Lifegene | LG-GSP010050S | |
Pipettes 5ml | Lifegene | LG-GSP010005S | |
pLX304 Luciferase-V5 blast plasmid | Addgene | #98580 | |
Polybrene | Sigma Aldrich | #107689 | |
Prism 9 | GraphPad | ||
Reagent Reservoirs | Bar Naor | BN20621STR200TC | |
SMZ18 Stereo microscopes | Nikon | ||
Sodium Chloride | Bio-Lab | 190359400 | |
Syringe filters | Lifegene | LG-FPV403030S | |
Trypan Blue 0.5% solution | Biological industries | 03-102-1B | |
Trypsin EDTA Solution B (0.25%), EDTA (0.05%) | Biological Industries | 03-052-1a | |
Vacuum driven Filters | SOFRA LIFE SCIENCE | SPE-22-500 | |
Virusolve | disinfectant | ||
VivoGlo Luciferin, In Vivo Grade | Promega | P1043 | |
X-tremeGENE HP DNA Transfection Reagent | Sigma Aldrich | #6366236001 |