Summary

Surveillance de la croissance du cancer du sein et de la formation de colonies métastatiques chez la souris à l’aide de la bioluminescence

Published: November 05, 2021
doi:

Summary

Ici, nous décrivons une méthode de surveillance non invasive impliquant l’expression de la luciférase et de la protéine fluorescente verte dans diverses lignées cellulaires de cancer du sein. Ce protocole fournit une technique pour surveiller la formation de tumeurs et la colonisation métastatique en temps réel chez la souris.

Abstract

Le cancer du sein est une tumeur maligne hétérogène fréquente et la deuxième cause de mortalité chez les femmes, principalement due à des métastases d’organes distants. Plusieurs modèles animaux ont été générés, y compris les modèles murins orthotopiques largement utilisés, où des cellules cancéreuses sont injectées dans le coussinet adipeux mammaire. Cependant, ces modèles ne peuvent pas aider à surveiller la cinétique de croissance tumorale et la colonisation métastatique. Des outils de pointe pour surveiller les cellules cancéreuses en temps réel chez la souris feront progresser considérablement la compréhension de la biologie tumorale.

Ici, des lignées cellulaires de cancer du sein exprimant de manière stable la luciférase et la protéine fluorescente verte (GFP) ont été établies. Plus précisément, cette technique contient deux étapes séquentielles initiées par la mesure de l’activité de la luciférase in vitro et suivies de l’implantation des cellules cancéreuses dans les coussinets adipeux mammaires de souris atteintes d’immunodéficience combinée diabétique-sévère (NOD-SCID) non obèses. Après l’injection, la croissance tumorale et la colonisation métastatique sont surveillées en temps réel par le système d’imagerie par bioluminescence non invasif. Ensuite, la quantification des métastases exprimant la GFP dans les poumons sera examinée par microscopie à fluorescence pour valider les résultats de bioluminescence observés. Ce système sophistiqué combinant la luciférase et les outils de détection basés sur la fluorescence évalue les métastases cancéreuses in vivo, qui ont un grand potentiel d’utilisation dans les thérapies contre le cancer du sein et la gestion des maladies.

Introduction

Les cancers du sein sont des types de cancer fréquents dans le monde entier, avec environ 250 000 nouveaux cas diagnostiqués chaque année aux États-Unis1. Malgré son incidence élevée, un nouvel ensemble de médicaments anticancéreux a considérablement amélioré les résultats des patientes atteintes d’un cancer du sein2. Cependant, ces traitements sont encore inadéquats, car de nombreux patients connaissent une rechute de la maladie et une propagation métastatique aux organes vitaux2, qui est la principale cause de morbidité et de mortalité des patients. Par conséquent, l’un des principaux défis de la recherche sur le cancer du sein est d’identifier les mécanismes moléculaires régulant la formation des métastases distales afin de développer de nouveaux moyens d’inhiber leur développement.

La métastase cancéreuse est un processus dynamique dans lequel les cellules se détachent de la tumeur primaire et envahissent les tissus voisins par la circulation sanguine. Ainsi, les modèles animaux dans lesquels les cellules subissent une cascade métastatique similaire peuvent faciliter l’identification des mécanismes qui régissent ce processus 3,4. De plus, ces modèles in vivo sont essentiels au développement d’agents thérapeutiques contre le cancer du sein 5,6. Cependant, ces modèles orthotopiques ne peuvent pas indiquer la cinétique réelle de croissance tumorale car l’effet n’est déterminé qu’à la fin. Par conséquent, nous avons mis en place un outil basé sur la luciférase pour détecter le développement de tumeurs et la colonisation métastatique en temps réel. De plus, ces cellules expriment la GFP pour détecter les colonies métastatiques. Cette approche est relativement simple et n’implique aucune procédure invasive3. Ainsi, la combinaison de la luciférase et de la détection par fluorescence est une stratégie utile pour faire progresser les études précliniques sur les thérapies contre le cancer du sein et la gestion de la maladie.

Protocol

Toutes les expériences sur la souris ont été réalisées dans le cadre du protocole MD-21-16429-5 approuvé par le Comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux de l’Université hébraïque. En outre, l’Université hébraïque est certifiée par l’Association pour l’évaluation et l’accréditation des soins aux animaux de laboratoire (AAALAC). 1. Maintenance des lignées cellulaires REMARQUE: Les lignées cellulaires du cancer du sein hum…

Representative Results

Nous avons généré des lignées cellulaires de cancer du sein (MDA-MB-231, MCF-7 et MDA-MB-468) exprimant des vecteurs GFP et luciférase. Plus précisément, cela a été réalisé par une infection séquentielle. Tout d’abord, les lignées cellulaires du cancer du sein ont été infectées par un vecteur de lentivirus exprimant la GFP fluorescente. Les cellules GFP positives (GFP+) ont été triées 2 jours après l’infection (Figure 1A,B) et infectées pa…

Discussion

Les expériences sur les animaux sont obligatoires pour la recherche sur le cancer 7,8,9, et en effet de nombreux protocoles ont été développés 3,6,10,11,12,13,14. Cependant, la plupart de ces …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Nous remercions les membres du laboratoire Y.D.S. Nous tenons à remercier l’Institut Wohl pour la médecine translationnelle du Centre médical Hadassah, à Jérusalem, pour avoir fourni l’installation d’imagerie pour petits animaux. Cette étude a été soutenue par le prix de développement de carrière en recherche du Fonds israélien de recherche sur le cancer.

Materials

1.7 mL eppendorf tubes Lifegene LMCT1.7B-500
10 µL tips Lifegene LRT10
1000 µL tips Lifegene LRT1000
15 mL tubes Lifegene LTB15-500
200 µL tips Lifegene LRT200
6 well cell culture plate COSTAR 3516
96 well Plates BLACK flat bottom Bar Naor BN30496
Automated Cell Counters Thermofisher A50298
BD FACSAria III sorter BD
BD Microlance 3 Needles 27 G (3/4'') BD 302200
BD Plastipak Syringes 1 mL x 120 BD 303172
Corning 100 mm x 20 mm Style Dish CORNING 430167
Corning 150 mm x 20 mm Style Dish CORNING 430599
Countess cell counting chamber slides Thermofisher C10228
Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM), high glucose, no glutamine Biological Industries 01-055-1A
Eclipse 80i microscope Nikon
eppendorf Centrifuge 5810 R Sigma Aldrich EP5820740000
Fetal Bovine Serum (FBS) Biological Industries 04-127-1A
FUW GFP Gifted from Dr. Yossi Buganim's lab (Hebrew University of Jerusalem)
HEK293T Gifted from Dr. Lior Nissim's lab (Hebrew University of Jerusalem)
Isoflurane, USP Terrell Piramal NDC 66794-01-25
IVIS Spectrum In Vivo Imaging System Perkin Elmer 124262
L-Glutamine Solution Biological industries 03-020-1A
Living Image Software PerkinElmer bioluminescence measurement
MCF-7 ATCC ATCC HTB-22
MDA-MB-231 ATCC ATCC HTB-26
MDA-MB-468 ATCC ATCC HTB-132
Pasteur pipettes NORMAX 2430-475
PBS Hylabs BP655/500D
pCMV-dR8.2-dvpr Addgene #8455 Provided by David M. Sabatini’s lab (Whitehead institute, Boston, USA)
pCMV-VSV-G Addgene #8454 Provided by David M. Sabatini’s lab (Whitehead institute, Boston, USA)
Penicillin-Streptomycin Solution Biological Industries 03-031-1B
Petri dish 90 mm (90×15) MINI PLAST 820-090-01-017
Pipettes 10ml Lifegene LG-GSP010010S
Pipettes 25ml Lifegene LG-GSP010050S
Pipettes 5ml Lifegene LG-GSP010005S
pLX304 Luciferase-V5 blast plasmid Addgene #98580
Polybrene Sigma Aldrich #107689
Prism 9 GraphPad
Reagent Reservoirs Bar Naor BN20621STR200TC
SMZ18 Stereo microscopes Nikon
Sodium Chloride Bio-Lab 190359400
Syringe filters Lifegene LG-FPV403030S
Trypan Blue 0.5% solution Biological industries 03-102-1B
Trypsin EDTA Solution B (0.25%), EDTA (0.05%) Biological Industries 03-052-1a
Vacuum driven Filters SOFRA LIFE SCIENCE SPE-22-500
Virusolve disinfectant
VivoGlo Luciferin, In Vivo Grade Promega P1043
X-tremeGENE HP DNA Transfection Reagent Sigma Aldrich #6366236001

References

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Cite This Article
Solaimuthu, B., Hayashi, A., Khatib, A., Shaul, Y. D. Monitoring Breast Cancer Growth and Metastatic Colony Formation in Mice using Bioluminescence. J. Vis. Exp. (177), e63060, doi:10.3791/63060 (2021).

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