Summary
Her beskriver vi en ikke-invasiv overvåkingsmetode som involverer luciferase og grønt fluorescerende proteinuttrykk i ulike brystkreftcellelinjer. Denne protokollen gir en teknikk for å overvåke tumordannelse og metastatisk kolonisering i sanntid hos mus.
Abstract
Brystkreft er en hyppig heterogen malignitet og den nest ledende årsaken til dødelighet hos kvinner, hovedsakelig på grunn av fjern organmetastase. Flere dyremodeller har blitt generert, inkludert de mye brukte ortotopiske musemodellene, hvor kreftceller injiseres i pattedyrfettputen. Imidlertid kan disse modellene ikke bidra til å overvåke tumorvekstkinetikk og metastatisk kolonisering. Banebrytende verktøy for å overvåke kreftceller i sanntid hos mus vil øke forståelsen av tumorbiologi betydelig.
Her ble brystkreftcellelinjer stabilt uttrykt luciferase og grønt fluorescerende protein (GFP) etablert. Spesielt inneholder denne teknikken to sekvensielle trinn initiert ved å måle luciferase aktivitet in vitro og etterfulgt av implantasjon av kreftceller i mammary fett pads av nonobese diabetisk-alvorlig kombinert immunsvikt (NOD-SCID) mus. Etter injeksjonen overvåkes både tumorveksten og metastatisk kolonisering i sanntid av det ikke-invasive bioluminescensavbildningssystemet. Deretter vil kvantifiseringen av GFP-uttrykkende metastaser i lungene bli undersøkt ved fluorescensmikroskopi for å validere de observerte bioluminescensresultatene. Dette sofistikerte systemet som kombinerer luciferase og fluorescensbaserte deteksjonsverktøy evaluerer kreftmetastase in vivo, som har stort potensial for bruk i brystkreftterapeutikk og sykdomshåndtering.
Introduction
Brystkreft er hyppige typer kreft over hele verden, med omtrent 250.000 nye tilfeller diagnostisert hvert år i USA1. Til tross for sin høye forekomst har et nytt sett med kreftmedisiner forbedret pasientresultatenefor brystkreft betydelig 2. Imidlertid er disse behandlingene fortsatt utilstrekkelige, da mange pasienter opplever tilbakefall av sykdom og metastatisk spredning til vitale organer2, som er hovedårsaken til pasientens sykelighet og dødelighet. Derfor er en av hovedutfordringene i brystkreftforskning å identifisere molekylære mekanismer som regulerer dannelsen av distale metastaser for å utvikle nye midler for å hemme utviklingen.
Kreftmetastase er en dynamisk prosess der celler løsner fra den primære svulsten og invaderer nærliggende vev gjennom blodsirkulasjonen. Dermed kan dyremodeller der cellene gjennomgår en lignende metastatisk kaskade lette identifiseringen av mekanismene som styrer denne prosessen 3,4. I tillegg er disse in vivo-modellene avgjørende for å utvikle brystkreftterapeutiske midler 5,6. Imidlertid kan disse ortotopiske modellene ikke indikere den faktiske tumorvekstkinetikken, da effekten bare bestemmes ved avslutning. Derfor etablerte vi et luciferasebasert verktøy for å oppdage tumorutvikling og metastatisk kolonisering i sanntid. I tillegg uttrykker disse cellene GFP for å oppdage metastatiske kolonier. Denne tilnærmingen er relativt enkel og involverer ingen invasive prosedyrer3. Dermed er kombinasjon av luciferase og fluorescensdeteksjon en nyttig strategi for å fremme de prekliniske studiene av brystkreftterapeutikk og sykdomshåndtering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle museeksperimenter ble utført under det hebraiske universitetets institusjonelle dyrepleie- og brukskomitégodkjente protokoll MD-21-16429-5. I tillegg er det hebraiske universitetet sertifisert av Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care (AAALAC).
1. Vedlikehold av cellelinje
MERK: Cellelinjene for human brystkreft (MCF-7, MDA-MB-468 og MDA-MB-231) ble brukt i denne protokollen.
- Kultur alle brystkreft celle linjer i Dulbecco modifisert Eagle medium (DMEM), supplert med 10% foster bovint serum (FBS) og 1% penicillin-streptomycin ved 37 °C i en fuktet karbondioksid (5% CO2) inkubator.
MERK: Kontroller celletettheten regelmessig; dele og utvide for fremtidig bruk når de når 70% samløp.
2. Virus forberedelse
- Behandle HEK293T-cellene med 1 ml trypsin til de løsner.
- Tilsett 10 ml DMEM (10% FBS) for å nøytralisere trypsinaktiviteten, og overfør cellefjæringen til et nytt 15 ml sentrifugerør.
- Sentrifuge ved 150 × g i 5 min for å sedimentere cellene. Kast supernatanten etter sentrifugeringen og tilsett 1 ml ferskt DMEM-medium.
- Bestem cellekonsentrasjonen og frøet 1,2 × 106 celler/brønn i en seksbrønnsplate.
- Påfølgende dag, prewarm alle nødvendige reagenser, inkludert transfection reagens, serum-fri DMEM, konvolutt plasmid (VSV-G), lentivirus emballasje plasmid (ΔVPR), og pLX304 Luciferase-V5 blast plasmid eller FUW GFP plasmid.
- I et 1,5 ml autoklavert sentrifugerør blander du 50 μL serumfri DMEM med 0,3 μg VSV-G plasmid, 1 μg ΔVPR og 1,2 μg pLX304 Luciferase-V5-eksplosjonsplasmid eller FUW GFP-plasmid.
- Etter grundig blanding av disse plasmidene med mediet, tilsett 5 μL av transfeksjonsreagenset, bland forsiktig og inkuber blandingen ved romtemperatur i 15 minutter.
- Etter inkubasjon, tilsett blandingen dråpevis til HEK293T-cellene.
- Etter 24 timer, erstatt vekstmediet med 2 ml (30% FBS) DMEM. Neste dag (48 timer etter transfeksjon) høster du mediet som inneholder virusene ("pLX304 Luciferase-V5 eller FUW GFP-virusene").
MERK: Bruken av 30% FBS forbedrer virusproduksjonseffektiviteten. - For å unngå hek293T cellerester, send det virusholdige mediet gjennom et 0,45 μm sprøytefilter eller sentrifuge ved 150 × g i 5 minutter, og samle supernatanten.
MERK: For langvarig lagring, hold arbeids aliquots av viruset ved -80 °C.
3. Etablering av celler som stabilt uttrykker GFP og luciferase ("GFP + Luc + celler")
- Dagen før cellene smittes, frø 8 × 105 celler per brønn i en seksbrønnsplate.
- Etter overnatting inkubasjon, erstatt vekstmediet med friskt medium som inneholder 8 μg / ml polybrene. Tilsett 200 μL FUW GFP-virus dråpevis i cellene.
- Valgfritt: For å forbedre viruseffektiviteten, sentrifuger platen ved 560 × g i 30 min (37 °C) (spinninfeksjon).
- Inkuber cellene i 48 timer, og kontroller GFP-uttrykket ved fluorescensmikroskopi.
- Sorter GFP-uttrykkende celler ved fluorescensaktivert cellesortering (FACS) (GFP+) (figur 1A).
- Infiser de GFP-sorterte cellene med pLX304 Luciferase-V5-eksplosjonsvirusene som beskrevet i trinn 3.2.
- Behandle cellene med blasticidin (10 μg/ml) 30 timer etter infeksjon for å berike for pLX304 Luciferase-V5 eksplosjonsgivende celler (GFP+, Luc+ celler). Deretter, annenhver dag, erstatt med friskt medium som inneholder blasticidin. I tillegg, som en kontroll, behandle naive celler med samme blasticidinholdige medium.
MERK: En klar forskjell mellom de infiserte og kontrollcellene bør observeres etter noen dager med blasticidinbehandling. Denne effekten er cellelinjeavhengig og tar vanligvis ~ 8-10 dager. En dårlig overlevelsesrate vil indikere et lavt viralt produksjonsutbytte. I så fall kan det å produsere en ny gruppe virus som lav effektivitet påvirke fremtidige eksperimenter.
4. Validering av in vitro luciferase aktivitet
- Utvid cellene MCF-7, MDA-MB-468 og MDA-MB-231 GFP+ Luc+ i en 15 cm plate til 80 % konfluens. Høst cellene ved trypsinisering, som beskrevet i trinn 2.1-2.2.
- Frø et økende antall celler i hver brønn (0,1, 0,5, 1, 2, 3, 4 × 104) i en svart 96-brønnsplate.
MERK: Svarte 96-brønnsplater er mer egnet for måling av luciferasenivåer, da hvite eller gjennomsiktige plater vil produsere autoluminescenssignaler. Som kontroll, bruk fosfatbufret saltvann (PBS) alene i en brønn for å sikre at det ikke er noen autoluminescens fra PBS. - Fyll alle brønnene med 100 μL DMEM og inkuber i 16-24 timer.
- Forbered luciferinoppløsning i PBS ved en konsentrasjon på 1,5 mg/ml fra lageret på 30 mg/ml. Aliquot lageret av luciferin løsning og lagre ved -20 °C.
- Vask cellene en gang med PBS forsiktig, tilsett 100 μL luciferinoppløsning i hver brønn, og vent i 2 min. Til slutt måler du luciferaseaktiviteten i alle brystkreftcellene ved hjelp av bioluminescens.
MERK: Det er avgjørende å undersøke in vitro GFP og luciferaseuttrykk før dyreforsøk. I tillegg brukes tomme brønner til å trekke fra bakgrunnen.
5. Injisere mus med GFP+ Luc+ celler
- Overfør 5 × 106 (MCF-7 og MDA-MB-468) eller 2 × 106 (MDA-MB-231) GFP+ Luc+ celler til henholdsvis 200 μL eller 100 μL PBS.
- Før injeksjon, rengjør den sterile biologiske hetten med 5% desinfeksjonsmiddeloppløsning (se materialtabellen). Bedøv deretter musene med filtrert (0,2 μm) luft som inneholder 4% isofluran med en luftstrømshastighet på 1 l / min i 2-3 min.
MERK: Det er viktig å bekrefte riktig bedøvelse; knipe musens tå og se etter svar. - Plasser en kjegle over det bedøvede musehodet i en liggende stilling. Påfør veterinærsalve på øynene for å forhindre tørrhet mens du er under anestesi.
- Tørk av bukområdet på musen, over brystkjertelen, med etanol ved hjelp av en bomullspinne og løft denfjerde brystkjertelen med tang.
- Sett nålen 27 G x 3/4 (0,4 x 19 mm) under fettputen og injiser sakte 100 μL av celleopphenget.
MERK: En rund bule vises under huden. I tillegg kan en feil injeksjon føre til avvik i tumorvekstraten eller fravær av svulst i samme eksperimentelle gruppe. - Etter injeksjonsprosedyren, ta musene ut av hetten og overfør dem til et nytt bur. Overvåk musene til de kommer tilbake til bevisstheten.
MERK: Pass på at alle brukte kanyler og sprøyter kastes i slipeboksen.
6. Måling av luciferasenivåene i GFP+ Luc+ mus
- Før bioluminescensdeteksjonen, hold den bevisste musen ved å holde nakken med venstre hånd. Vipp deretter hånden til venstre, noe som resulterer i at musen vender oppover med underkroppen i en liggende stilling.
- Injiser 100 μL luciferin (30 mg/ml) intraperitonealt (dvs.) i bukoverflaten på musen i nedre venstre abdominal kvadrant ved hjelp av en 1,0 ml sprøyte med nålstørrelse 27 G x 3/4 (0,4 x 19 mm).
MERK: Spissen av nålen bør ikke settes inn mer enn 3-5 mm fra bukveggen, da den kan trenge inn i viscerale organer. I tillegg anbefales det å utføre i.p. injeksjon uten anestesi som luciferinfordeling i kroppen av bedøvede mus er langsommere enn hos bevisste mus. Dermed er overvåking av luciferasenivåer hos bevisste mus en raskere prosedyre. - Hold musen i 7 min uten anestesi etterfulgt av 3 min i anestesikammeret før du måler tumorkinetikken.
MERK: Inkubasjonstiden varierer mellom de ulike eksperimentene, cellelinjene og artene til arter. Dermed anbefales det å kalibrere inkubasjonstiden før du starter forsøkene. - Bedøv musene som beskrevet i trinn 5.2-5.3.
- Åpne programvaren (Tabell over materialer) under inkubasjonen, initialiser bildesystemet og klikk på Initialize-knappen .
MERK: Vær oppmerksom på at kameraet vil ta ~ 10 min å kjøle seg ned og nå -90 °C. I tillegg måler du som bakgrunnskontroll luciferasenivåene hos naive mus (dvs. GFP+ mus injisert med celler som ikke uttrykker luciferasegenet). - Hold oppsettet i automatisk eksponering ved hjelp av følgende innstillinger: eksponeringstid automatisk, 60 s; Innbindingsmedium, F/Stopp 1; Eksitasjonsfilter blokkert. Utslippsfilteret er åpent. Når initialiseringen er over, velger du Imaging Wizard | Bioluminescens, og klikk deretter Neste | Åpne Filter | velger du Mus i bildeemnet.
- I Feltvisning velger du trinn C (10 cm) og Motivhøyde: 1,50 cm.
- Klikk Image Setup Stage til C, og før du klikker på Hent-knappen , må du kontrollere at musen er plassert på scenen i riktig posisjon.
- Lukk døren, klikk på Hent-knappen , og vent til et bilde vises på skjermen.
MERK: Med alternativet Automatisk eksponering tar et sterkt signal 5-20 s avhengig av signalet; et svakt signal vil ta rundt 60 s. - Gjenta dette trinnet for de andre musene.
- For å oppdage lungemetastase, dekk det sterke signalet til den primære svulsten ved hjelp av tykt svart papppapir og eksponer bare den ventrale siden av lungene mot kameraet. Ta bilde ved hjelp av de samme parameterne som er beskrevet ovenfor.
7. Anskaffe ex vivo bilde ved hjelp av bioluminescens og fluorescens
- Avlive musene ved hjelp av karbondioksid (CO2) innånding i tørkeapparatet og disseker musene ved hjelp av autoklaved saks og tang.
- Perfuse musene ved hjelp av 0,9% saltvann, høst organene og skyll med 1x PBS for å eliminere blodflekker fra orgelet.
- Overfør det skyllede organet til en Petri-tallerken og legg det inn i scenen på bioluminescensmaskinen. Påfør samme bioluminescensinnstilling som beskrevet i trinn 6.2-6.6.
MERK: På grunn av reduksjonen i luciferasesignalet er dette trinnet tidsbegrensende. Således, etter euthanizing mus, visualiser umiddelbart orgelet ved bioluminescens. - For GFP-bilder bruker du samme innstilling som beskrevet i trinn 6.3, ved hjelp av Fluorescence GFP-filter i stedet for Bioluminescence.
- Ta lungebilder ved hjelp av et stereomikroskop for å undersøke tilstedeværelsen av GFP+- kolonier.
8. Analyse av bioluminescensdata
- Dobbeltklikk programvaren, og velg Åpne på Fil-menyen .
- Åpne alle filene og minimer dem. Forsikre deg om at alle enhetene er utstråling (fotoner). I tillegg klikker du Bruk på alle for å beholde de samme parameterne for alle bildene.
- Velg verktøypaletten på Vis-menyen, som åpner et nytt vindu.
- Velg kategorien ROI-verktøy i Verktøypalett-vinduet, og velg gjennomsnittlig Bkg-avkastning i Type.
- Velg Sirkel på ROI-verktøyene, og tegn en liten sirkel på det thoraxområdet på musen.
- Dobbeltklikk sirkelen, velg alternativet Bruk som BKG for fremtidige ROIer på fanen Bakgrunns-ROI , og klikk Ferdig.
9. Måling av total flux
- Velg kategorien ROI-verktøy i Verktøypalett-vinduet, og velg måling av avkastning i Type.
- Velg Sirkel på ROI-verktøyene, og tegn en stor sirkel på musens primære svulst.
- Høyreklikk Kopier avkastning og høyreklikk Lim inn avkastning i hver enkelt fil på hver muse.
- Klikk på Mål ROIer i kategorien ROI-verktøy, som åpner et nytt vindu med navnet ROI-målinger. I denne kategorien beholder du måltypene som Radiance(Photons) og Bildeattributter som Alle utfylte verdier.
- Eksporter filen som målfilformat (*.txt) eller CSV-format (*.csv).
- Åpne de eksporterte dataene i et regneark, og ta Total Flux (p/s) og verdiene for ukene.
MERK: Dette trinnet kan brukes til å måle forskjellige grupper. For eksempel, mus behandlet med et kjøretøy vs. de som behandles med et stoff. - Generer et XY-plott, der tiden presenteres langs X-aksen og Total Flux (p/s) langs Y-aksen. For hver uke tar du parameteren Total Flux (p/s) for hver utvalgsgruppe og bestemmer eventuelle signifikante forskjeller ved hjelp av den ikke-parametriske Student t-testen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vi genererte brystkreftcellelinjer (MDA-MB-231, MCF-7 og MDA-MB-468) som uttrykte GFP- og luciferasevektorer. Spesielt ble dette oppnådd ved en sekvensiell infeksjon. For det første ble brystkreftcellelinjene smittet med en lentivirusvektor som uttrykker fluorescerende GFP. GFP-positive celler (GFP+) ble sortert 2 dager etter infeksjon (figur 1A,B) og infisert med pLX304 Luciferase-V5 vektoren. Deretter ble blasticidin brukt til å velge for luciferase for å generere de angitte (GFP +, Luc +) cellene. For å validere in vitro luciferase-aktiviteten viste vi en cellenummeravhengig økning i luciferaseaktivitetsnivåene (figur 1C). I tillegg ble det funnet en lineær korrelasjon mellom luciferaseaktiviteten og cellenummeret (figur 1D).
For å bekrefte luciferasedeteksjon hos musene ble alle tre GFP +, Luc + brystkreftcellelinjene injisert i brystfettputen til kvinnelige NOD / SCID-mus. Deretter ble musene utsatt for bioluminescensavlesning annenhver uke for å bestemme tumorvekstkinetikken. Vi fant at tumorvekstkinetikk varierer mellom cellelinjene; Det er raskere i den mer aggressive MDA-MB-231 og langsommere i de mindre aggressive cellelinjene MCF-7 og MDA-MB-468 (figur 2).
Deretter ble fluorescensavlesningene av de isolerte svulstene generert av MDA-MB-231-cellelinjen oppnådd. Spesielt 6 uker etter injeksjon ble svulstene høstet fra musene for å bekrefte GFP-fluorescensen; svulstene ble funnet å opprettholde sitt GFP-uttrykk (figur 3A). Det neste målet var å avgjøre om metastatisk kolonidannelse kunne vurderes i sanntid i lungene til en levende mus ved hjelp av bioluminescensmaskinen; positive bioluminescensavlesninger ble oppnådd fra lungen til hele musen (figur 3B). For å verifisere at disse var positive metastatiske kolonier, ble lungen høstet, og de metastatiske koloniene ble observert for GFP og bioluminescens (figur 3C).
Figur 1: Validering av GFP-uttrykk og luciferaseaktivitet i celler. (A) GFP-cellene ble sortert etter aktiva. Representative bilder av MDA-MB-231 ikke-GFP- og GFP+ -celler. (B) MDA-MB-231-, MCF-7- og MDA-MB-468-celler ble infisert med GFP-uttrykkende virus, etterfulgt av FACS-sortering. Et bilde av hver cellelinje representeres i brightfield (venstre) og GFP(right). Cellene ble fanget under et Nikon Eclipse 80i mikroskop ved 10x forstørrelse. Skalastenger = 100 μm. (C) Bioluminescensen på grunn av luciferaseaktivitet i hver celle ble bestemt av et luminometer. Et økende antall celler (som i A) ble sådd i en svart 96-brønnsplate. Fargelinjen representerer intensiteten av luminescens. (D) Et XY-plott som demonstrerer luciferaseaktiviteten til MDA-MB-231 celler (målt i C). Forkortelser: GFP = grønt fluorescerende protein; SSC-A = areal med sidespredningstoppen. GFP+ = GFP-positiv; FACS = fluorescensaktivert cellesortering. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Kinetikk av tumorvekst ble bestemt av bioluminescensmaskinen. In vivo tumor vekst kinetikk ble bestemt ukentlig i NOD-SCID mus, og de representative bildene ble tatt ved hjelp av bioluminescens for (A) MDA-MB-231, (B) MCF-7, (C) MDA-MB-468. Fargelinjen representerer intensiteten av luminescens. (D) Kvantifisering av luminescensaktiviteten presenteres som total flux. (E) MDA-MB-231 mus; individuell lesing representert som et plott. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Ulike tilnærminger for å validere tumordannelse og lungemetastase. (A) Musene ble perfundert, og svulstene generert fra MDA-MB-231 celler ble høstet. GFP-nivåene i svulstene ble målt av bioluminescensmaskinen. (B) Lungemetastase hos hele musene, som vist ved bioluminescensen. (C) For å bekrefte tilstedeværelsen av metastaser ble lungene høstet og observert under SMZ18 Nikon Stereomicroscope (brightfield og GFP). Bioluminescent-Luc-prøver ble tatt umiddelbart etter euthanizing musene. Fargelinjen representerer intensiteten av luminescens. Forkortelser: GFP = grønt fluorescerende protein; Luc = luciferase; BLI = bioluminescensavbildning. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dyrebaserte eksperimenter er obligatoriske for kreftforskning 7,8,9, og faktisk er det utviklet mange protokoller 3,6,10,11,12,13,14. Imidlertid bestemte de fleste av disse studiene den biologiske effekten bare på slutten av forsøkene, og dermed forblir virkningen på tumorvekstkinetikk eller metastasekolonisering ubestemt. Her gir vi en ikke-invasiv dobbel bioluminescens tilnærming ved å inokulere celler som uttrykker GFP og luciferase inn i pattedyrfettputen. Ved hjelp av dette kraftige verktøyet kan tumorutvikling og metastase overvåkes hos mus i sanntid14. Denne teknikken inneholder imidlertid noen kritiske trinn, som krever ekstra forsiktighet. Et av de kritiske trinnene for å lykkes med dette eksperimentet er for eksempel å kontrollere effektiviteten av infeksjonen ved å overvåke luciferase- og GFP-uttrykksnivåene i cellene før museinjeksjon. Dermed bør blasticidindosene15 og lentiviral produksjon16-protokollen optimaliseres for hver cellelinje for å øke den eksperimentelle effektiviteten.
Noen få tekniske problemer kan påvirke bioluminescenssignalet i in vivo-eksperimentet . Disse problemene inkluderer musens bevegelse under bioluminescensavlesningen, noe som kan forstyrre bildekvaliteten og dermed påvirke tumorkinetiske kurver. Dermed må dyrene være fullstendig bedøvet etter substratinjeksjonen og under hele prosedyren. I tillegg kan det å plassere flere dyr i maskinen samtidig føre til inkonsekvens i luminescensavlesning, da mus med høyt signal kan maskere de med mindre intensitet. Derfor må luminescensavlesningene tas individuelt for hver mus.
Når du utfører in vitro bioluminescensavlesningen, er det viktig å erstatte kulturmediet med PBS, da mediet inneholder serum og andre kosttilskudd som kan forstyrre signalet. I tillegg er det nødvendig å eliminere bakgrunnsavlesningen ved å måle luminescenssignalet til en prøve som bare inneholder PBS (ingen celler).
Denne protokollen beskriver en ikke-invasiv teknikk for å måle brystkreftcellevekst og metastaser. Spesielt beskriver dette papiret injeksjonen av brystkreftcellelinjer, og uttrykker både GFP og luciferase i musens pattedyrfettpute. Denne kombinasjonen gir en rask og pålitelig metode for å måle metastatisk kolonisering in vivo og ex vivo.
Til tross for de klare fordelene ved denne metoden, har den noen begrensninger. Den primære begrensningen er behovet for en bioluminescensmaskin, da dette er en relativt dyr maskin og derfor ikke alltid tilgjengelig. I tillegg er hver lesing tidkrevende, og dermed kan maskinen være overbooket og utilgjengelig. En annen begrensning refererer til selve protokollen. For å oppdage bioluminescenssignalet i ex vivo-prøvene , anbefales det å avlive musene og undersøke prøven umiddelbart. Dette trinnet er et tidsbegrensende stadium og er ikke mulig for et stort sett med eksperimenter.
Til slutt er dette ikke-invasive bioluminescensverktøyet svært følsomt for å oppdage tumorutvikling og metastase hos mus. Denne protokollen er ikke begrenset til brystkreft og kan brukes på andre karsinomer som lunge- og bukspyttkjertelkreft. Videre, fordi det er ikke-invasivt, kan det brukes til å måle effekten av anticancer medisiner12 og deres effekter på tumorvekstkinetikk i sanntid.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Alle forfattere har avslørt at de ikke har noen interessekonflikter.
Acknowledgments
Vi takker medlemmene av Y.D.S. laboratoriet. Vi vil takke Wohl Institute for Translational Medicine ved Hadassah Medical Center, Jerusalem, for å ha levert det lille dyreavbildningsanlegget. Denne studien ble støttet av Research Career Development Award fra Israel Cancer Research Fund.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.7 mL eppendorf tubes | Lifegene | LMCT1.7B-500 | |
| 10 µL tips | Lifegene | LRT10 | |
| 1000 µL tips | Lifegene | LRT1000 | |
| 15 mL tubes | Lifegene | LTB15-500 | |
| 200 µL tips | Lifegene | LRT200 | |
| 6 well cell culture plate | COSTAR | 3516 | |
| 96 well Plates BLACK flat bottom | Bar Naor | BN30496 | |
| Automated Cell Counters | Thermofisher | A50298 | |
| BD FACSAria III sorter | BD | ||
| BD Microlance 3 Needles 27 G (3/4'') | BD | 302200 | |
| BD Plastipak Syringes 1 mL x 120 | BD | 303172 | |
| Corning 100 mm x 20 mm Style Dish | CORNING | 430167 | |
| Corning 150 mm x 20 mm Style Dish | CORNING | 430599 | |
| Countess cell counting chamber slides | Thermofisher | C10228 | |
| Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM), high glucose, no glutamine | Biological Industries | 01-055-1A | |
| Eclipse 80i microscope | Nikon | ||
| eppendorf Centrifuge 5810 R | Sigma Aldrich | EP5820740000 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Biological Industries | 04-127-1A | |
| FUW GFP | Gifted from Dr. Yossi Buganim's lab (Hebrew University of Jerusalem) | ||
| HEK293T | Gifted from Dr. Lior Nissim's lab (Hebrew University of Jerusalem) | ||
| Isoflurane, USP Terrell | Piramal | NDC 66794-01-25 | |
| IVIS Spectrum In Vivo Imaging System | Perkin Elmer | 124262 | |
| L-Glutamine Solution | Biological industries | 03-020-1A | |
| Living Image Software | PerkinElmer | bioluminescence measurement | |
| MCF-7 | ATCC | ATCC HTB-22 | |
| MDA-MB-231 | ATCC | ATCC HTB-26 | |
| MDA-MB-468 | ATCC | ATCC HTB-132 | |
| Pasteur pipettes | NORMAX | 2430-475 | |
| PBS | Hylabs | BP655/500D | |
| pCMV-dR8.2-dvpr | Addgene | #8455 | Provided by David M. Sabatini’s lab (Whitehead institute, Boston, USA) |
| pCMV-VSV-G | Addgene | #8454 | Provided by David M. Sabatini’s lab (Whitehead institute, Boston, USA) |
| Penicillin-Streptomycin Solution | Biological Industries | 03-031-1B | |
| Petri dish 90 mm (90x15) | MINI PLAST | 820-090-01-017 | |
| Pipettes 10ml | Lifegene | LG-GSP010010S | |
| Pipettes 25ml | Lifegene | LG-GSP010050S | |
| Pipettes 5ml | Lifegene | LG-GSP010005S | |
| pLX304 Luciferase-V5 blast plasmid | Addgene | #98580 | |
| Polybrene | Sigma Aldrich | #107689 | |
| Prism 9 | GraphPad | ||
| Reagent Reservoirs | Bar Naor | BN20621STR200TC | |
| SMZ18 Stereo microscopes | Nikon | ||
| Sodium Chloride | Bio-Lab | 190359400 | |
| Syringe filters | Lifegene | LG-FPV403030S | |
| Trypan Blue 0.5% solution | Biological industries | 03-102-1B | |
| Trypsin EDTA Solution B (0.25%), EDTA (0.05%) | Biological Industries | 03-052-1a | |
| Vacuum driven Filters | SOFRA LIFE SCIENCE | SPE-22-500 | |
| Virusolve | disinfectant | ||
| VivoGlo Luciferin, In Vivo Grade | Promega | P1043 | |
| X-tremeGENE HP DNA Transfection Reagent | Sigma Aldrich | #6366236001 |
References
- Waks, A. G., Winer, E. P. Breast cancer treatment: A review. JAMA. 321 (3), 288-300 (2019).
- Jin, X., Mu, P.
- Saha, D., et al. In vivo bioluminescence imaging of tumor hypoxia dynamics of breast cancer brain metastasis in a mouse model. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (56), e3175 (2011).
- Rashid, O. M., et al. Is tail vein injection a relevant breast cancer lung metastasis model. Journal of Thoracic Disease. 5 (4), 385-392 (2013).
- Fantozzi, A., Christofori, G. Mouse models of breast cancer metastasis. Breast Cancer Research. 8 (4), 212 (2006).
- Kocatürk, B., Versteeg, H. H. Orthotopic injection of breast cancer cells into the mammary fat pad of mice to study tumor growth. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (96), e51967 (2015).
- Baker, M.
- Wang, Y., Tseng, J. -C., Sun, Y., Beck, A. H., Kung, A. L. Noninvasive imaging of tumor burden and molecular pathways in mouse models of cancer. Cold Spring Harbor Protocols. 2015 (2), 135-144 (2015).
- Kim, J. E., Kalimuthu, S., Ahn, B. -C. In vivo cell tracking with bioluminescence imaging. Nuclear Medicine and Molecular Imaging. 49 (1), 3-10 (2015).
- Paschall, A. V., Liu, K. An orthotopic mouse model of spontaneous breast cancer metastasis. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (114), (2016).
- Morten, B. C., Scott, R. J., Avery-Kiejda, K. A. Comparison of Three Different Methods for Determining Cell Proliferation in Breast Cancer Cell Lines. Journal of Visualized Experiments. (115), e54040 (2016).
- Zimmerman, M., Hu, X., Liu, K. Experimental metastasis and CTL adoptive transfer immunotherapy mouse model. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (45), e2077 (2010).
- Lv, X., et al. Orthotopic transplantation of breast tumors as preclinical models for breast cancer. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (159), e61173 (2020).
- Cheng, R. Y. S., et al. Studying triple negative breast cancer using orthotopic breast cancer model. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (157), e60316 (2020).
- Bajikar, S. S., et al. Tumor-suppressor inactivation of GDF11 occurs by precursor sequestration in triple-negative breast cancer. Developmental Cell. 43 (4), 418-435 (2017).
- Khatib, A., et al. The glutathione peroxidase 8 (GPX8)/IL-6/STAT3 axis is essential in maintaining an aggressive breast cancer phenotype. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (35), 21420-21431 (2020).
