Summary
ここでは、初代マウス肝臓正弦波内皮細胞(LSEC)単離のためのプロトコールを概説し、実証する。このプロトコールは、肝臓コラゲナーゼ灌流、低速遠心分離による非実質細胞精製、およびCD146磁気ビーズ選択に基づいている。また、フローサイトメトリーと走査型電子顕微鏡を用いて、これらの単離されたLSECの表現型と特性評価も行っています。
Abstract
肝正弦波内皮細胞(LSEC)は、循環と肝実質との界面に位置する特殊な内皮細胞である。LSECは、フェネストラの存在および基底膜の欠如を特徴とする明確な形態を有する。LSECは、代謝調節不全、炎症、線維症、血管新生、および発癌を含む肝臓における多くの病理学的障害において不可欠な役割を果たす。しかし、LSECの単離と特性評価についてはほとんど発表されていない。ここで、このプロトコルは、健常および非アルコール性脂肪肝疾患(NAFLD)マウスの両方からのLSECの単離について論じる。プロトコールは、LSECを精製するためのマウス肝臓および非実質細胞の磁気ビーズ陽性選択のコラゲナーゼ灌流に基づいている。本研究では、フローサイトメトリーによる特異的マーカーを用いてLSECを特徴付け、走査型電子顕微鏡により特徴的な表現型の特徴を同定する。このプロトコールに従って単離されたLSECは、接着および透過性アッセイを含む機能的研究、ならびに関心のある特定の経路についての下流研究に使用することができる。さらに、これらのLSECは個別にプールまたは使用することができ、RNA-seqバルクまたは単一細胞、プロテオミクスまたはホスホプロテオミクス、およびシーケンシング(ATAC-seq)を使用したトランスポザーゼアクセシブルクロマチンのアッセイなどのマルチオミクスデータ生成を可能にします。このプロトコルは、健康および疾患におけるLSECと他の肝細胞とのコミュニケーションを研究する研究者にとって有用であり、急性および慢性肝障害の病原性メカニズムにおけるLSECの役割の詳細な理解を可能にする。
Introduction
肝正弦波内皮細胞(LSEC)は、肝正弦波壁に並び、肝臓1の中で最も豊富な非実質細胞である。LSECは、フェネストラの存在および古典的な基底膜または隔膜の欠如によって、体内の他の場所にある他の毛細血管内皮細胞と区別される2,3。したがって、LSECは、脂質およびリポタンパク質を含む様々な循環巨大分子を排除する透過性およびエンドサイトーシス能力を高める独特の表現型および構造特性を有する。LSECは、星状細胞や免疫細胞などの実質細胞と非実質細胞のクロストークにおいて極めて重要な役割を果たしています。LSECは、星状細胞およびクッパー細胞を静止状態に保つことによって肝臓恒常性を維持する上で重要である4。LSECsは、循環白血球の接着および経内皮遊走を媒介することによって肝免疫細胞集団の組成を調節する5,6。虚血再灌流傷害(IRI)8、非アルコール性脂肪性肝炎(NASH)9、および肝細胞癌(HCC)を含む急性および慢性肝障害7の間、LSECは毛細血管化として知られる表現型変化を受け、防御および基底膜10の形成を特徴とする。LSECにおけるこれらの表現型変化は、LSECの機能不全および血栓形成促進性、炎症促進性、および線維形成促進性の獲得と関連している。
マウス肝臓からLSECを単離するためのいくつかの方法が開発されている11。いくつかの技術は、非実質細胞および実質細胞を分離し、続いて密度勾配遠心分離を行い、LSECを非実質画分から精製することに依存する。この方法の限界は、LSECs単離の最終ステップにおける汚染性マクロファージの存在であり、これは単離されたLSECs12の純度に影響を与え得る。このプロトコールは、LSECを精製するためのマウス肝臓およびCD146+磁気ビーズ陽性の非実質細胞のコラゲナーゼ灌流に基づいている。この方法を用いて単離されたLSECは、高純度で保存された形態および生存率を示す。これらのLSECは、透過性および接着アッセイを含む機能研究、ならびに関心のある経路の下流研究に最適です。さらに、臨床研究と発見科学の両方で大きなデータセットを生成することへの関心の高まりに伴い、非アルコール性脂肪性肝炎(NASH)または他の状態の健康な肝臓と病気の両方の肝臓から分離されたこれらの高品質のLSECを個別にプールまたは使用することができ、マルチオミクスデータ生成と健康と病気の比較が可能になります13,14.さらに、単離されたLSECは、LSECにおける活性化されたシグナル伝達経路および異なる有害刺激下で、および様々な治療介入に応答して他の肝細胞との細胞間通信を解読するために、オルガノイドのような2次元および3次元のインビトロモデルを開発するために使用することができる。
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Protocol
動物のプロトコルは、メイヨークリニックの施設動物ケアおよび使用委員会(IACUC)によって承認されたとおりに実施されました。8週齢のC57BL/6J雄マウスをジャクソン研究所から購入した。マウスを、食事への自由なアクセスを有する温度制御された12:12-h明暗サイクル施設に飼育した。
コラーゲンコート培養皿またはプレートの調製
- 50 mL の 0.02 mol/L 酢酸を作るには、49.4 mL のH2O に 0.6 mL の氷酢酸を加えます。
- 0.02 mol/L酢酸で50 μg/mLのコラーゲンタイプIを作る。希釈はロットの濃度に依存する。
- 10cm培養皿を3mLのコラーゲン溶液でコーティングする。室温(RT)で1時間インキュベートする。
注:培養に別の皿またはプレートを使用する場合、コーティング溶液の量は培養面積に基づいて調整する必要があり、通常は6〜10μg/cm2を使用してください。 - コーティングされた表面から余分な流体を除去し、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)で3回洗浄した。皿を風乾させます。
- コラーゲン溶液が滅菌されていない場合は、滅菌組織培養フード内で紫外線(UV)光に10分間曝露してコラーゲンコーティング皿を滅菌する。
2. 設備のセットアップ
- 図1Bに示すように加熱加湿再循環灌流装置を設置する。
- 灌流システムを10%漂白剤で5分間すすぎ、続いて滅菌水をさらに10分間すすいでください。
- コラゲナーゼ溶液を灌流する前に、できるだけすすぎ液を排出してください。
- コラゲナーゼ溶液を灌流系を通して注入し( 図1Bに示すように)、37°Cで予温する。 速度制御ダイヤルに示されているように、ポンプ速度を速度1に設定します(40mL/分に等しい)。
- この速度は、手順全体を通して同じに保ちます。LSEC単離の日中に閉回路で実行されるコラゲナーゼ溶液を再利用する。
注:ポンプ速度は、LSECの生物学的状態を乱す可能性のある機械的圧力を避けるために1に固定されています。
3. 外科的処置
- マウスの重量を量ります。
- 90mg/kg体重のケタミンと10mg/kg体重のキシラジンを腹腔内に注射する(IP)。
- マウスが痛みを伴う刺激に反応しなくなったら、 図1Bに示すように、マウスを手術面に固定します。
- マウス腹部に70%エタノールを噴霧する。外科用はさみを使用して、腹部の下部から剣状突起まで〜5cmの長さの切開を行う。
- 次に、腹部の両側に小さな虹彩はさみを使用して2つの横方向の切り傷を作り、腹部の器官を完全に露出させます。
- 静脈内(IV)カテーテルのシースを動物の背中の下に置き、腹部を持ち上げて水平にします。
- 通常の湾曲したドレッシング鉗子を使用して、腸と胃を動物の左側に静かに引き離します。
- 露出した左腎臓のすぐ下の下大静脈(IVC)の下に5-0の外科的縫合糸を置く。縫合糸に緩いヒッチを結びます。
- 肝門脈(PV)の周囲に別の5-0外科用縫合糸を、肝PVから分岐する脾静脈のすぐ上に置く。縫合糸に緩いヒッチを結びます。
- PV縫合糸を張力として用いて、20G IVカテーテルを1cm下の肝PVに挿入し、左右の肝PVに分岐させる。
- カテーテルを静脈上にスライドさせますが、分岐領域の下に保管してください。血液が滴り落ち始めるまでカテーテルを下るのを許します。
- 静脈内(IV)ボトル内のバッファーA(表1)の一部を手術領域の上に置いた状態で、IVラインを使用してカテーテルに取り付けます。システムへの空気の侵入を避けながら、この溶液で肝臓を洗い流してください。
- 腎臓の下の下大静脈の周りに縫合糸を結びます。これにより、肝臓はレトロな灌流が可能になります。
- 動物が出血できるように縫合糸の下のIVCをカットします。
注:この手順は、肝臓の鬱血を避けるために迅速に実行する必要があります。 - IVカテーテルをPV縫合糸で固定する。
- 灌流したら、胃、腸、脾臓、および肝臓に付着した他の内臓を切り取ります。
- 横隔膜と主要血管を胸腔から切り取ります。動物から肝臓を取り出し、それを灌流トレイの上に置きます。
- IVラインを慎重に取り外し、再循環チャンバ内のコラゲナーゼ溶液をフックアップする。
注:ステップ3.16-3.18は5分以内に行う必要があるため、肝臓はバッファAで長時間灌流されません。 - カプセルが斑点になり、濁って見えるまで肝臓に灌流させます(10〜15分以上、期間はコラゲナーゼのロットによって異なります)。
- 肝臓が灌流されている間、剖検バッグに処分する前に動物が死亡していることを確認してください。
- 消化したら、肝臓をチャンバーから取り出し、約20mLの無血清ダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)を含む10cmのシャーレに入れます。
- いくつかのピペットチップで肝臓を優しく拾い上げ、胆道の木を捨てます。
- 肝臓懸濁液を70μmのセルストレーナーを通して50mLの円錐管に濾過する。
- 細胞懸濁液を50 x g でRTで2分間遠心分離し、非実質肝細胞を含む上清を回収する。
注:肝細胞はペレット中に沈殿し、これは先に記載したようにグラジエント遠心分離を用いてさらに精製することができる15。
4. 非実質肝細胞の分離とLSECの精製
メモ:CD146+ LSECは、製造元の指示に従って、免疫磁気ビーズを使用して精製してください。
- 上清を300 x g で4°Cで5分間遠心分離する。
- 細胞ペレットを収集し、1mLの単離緩衝液に再懸濁し(表1)、製造業者の指示に従って自動セルカウンタを用いて細胞数を決定する。
- 細胞懸濁液を300 x g で4°Cで10分間遠心分離し、上清を完全に吸引する。
- ペレットを全細胞107個あたり90μLの単離緩衝液で再懸濁する 。
- 全細胞107 個あたり10μLのCD146磁気ビーズを加える。よく混ぜ合わせ、4°Cで15分間インキュベートする。
- 細胞を洗浄するには、107 細胞あたり1〜2mLの単離緩衝液を添加し、300 x g で10分間遠心分離し、上清を完全に吸引する。
- 最大109 個の細胞を500 μLの単離バッファーに再懸濁する(表1)。
メモ: セル番号が大きい場合は、それに応じてバッファボリュームをスケールアップします。 - 分離カラムを準備し、3mLの単離緩衝液ですすいでください。
- 細胞懸濁液を、70 μm の予備分離フィルターで積み重ねたカラムに塗布します。
- カラムを3 mLの単離バッファーで3回洗浄する。
注: カラムを洗浄するときは、カラムリザーバが空になったらすぐに分離バッファーを追加する必要があります。 - カラムを分離器から取り出し、15 mL 遠沈管の上に置きます。カラム上に5 mLの単離バッファーをピペットする。
- 標識された細胞を磁気ビーズで回収するには、プランジャーをカラムにしっかりと押し込んで細胞を洗い流します。
- 300 x g で 4 °C で 5 分間遠心分離機を遠心分離し、顕微鏡検査と下流分析の準備ができています。
5. LSECのイムノフェノタイピングとフローサイトメトリーによる純度評価
- 製造元の指示に従って、自動セルカウンタを使用して、分離されたLSECのセル番号を決定します。
- 細胞を300 x g で5分間遠心分離し、上清を完全に吸引する。
- 1 x106 細胞/チューブを取り、90 μLの染色バッファーで再懸濁する(表1)。
- マウスFcRブロック10 μL/チューブと生存率色素1 μLを加え、4°Cで10分間インキュベートする。
- 染色バッファーで1:50に希釈したCD45、CD146、およびスタビリン-2抗体の組み合わせで細胞を染色する。4°Cで20分間インキュベートする。
- 細胞を5mLの染色緩衝液で洗浄し、300 x g で10分間遠心分離し、上清を完全に吸引する。
- 細胞を300 μLの染色バッファーで再懸濁し、フローサイトメーターに通します。
6. LSECの文化と検討
- 6ウェルプレートに1 x106 細胞/ウェルの種子を、5%ウシ胎児血清(FBS)、1%内皮細胞増殖サプリメント、および1%プリモシン溶液からなる内皮細胞増殖培地で培養する。
- 単離されたLSECを光学顕微鏡で調べる。10倍の倍率で明視野画像を取得します。
7. 走査型電子顕微鏡によるLSECの形態とフェネストレー検査
- 細胞培養インサート(孔径3μm)をコラーゲン溶液で予めコーティングする。
- 単離したLSEC(120,000細胞)を内皮細胞増殖培地と共にインサート上で37°C加湿雰囲気下で24ウェルプレート中で培養した。細胞が落ち着いて2時間接着するのを許します。
- 細胞固定のために、37°Cで予温したトランプの固定液を等価量の細胞培養培地に加える。
- 10分間インキュベートした後、50%希釈されたトランプの固定液を希釈されていないトランプの固定液と交換する。
- トランプ固定液で細胞を2時間固定し、次いで1%四酸化オスミウム中で1時間インキュベートする。
- 試料脱水、臨界点乾燥装置での乾燥、実装、スパッタ塗布、走査型電子顕微鏡を用いた検査などを進める。
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Representative Results
実験回路図と装置のセットアップ:
このプロトコールでは、マウス肝臓を閉鎖灌流回路を用いて消化し、次いで、非実質細胞および肝細胞を、50 x g で2分間の低速遠心分離によって分離した。一次LSECは、非実質画分からのCD146磁気ビーズ選択を用いて単離した。実験模式を 図1Aに示す。カニューレをPVを通して配置し、下大静脈を縛り付けて、肝臓を通るコラゲナーゼの一方向灌流を確実にした(図1B)。社内灌流チャンバには、37〜40°Cの暖かく加湿された装置空気を確保するために、加熱加湿システムが装備されています。灌流コラゲナーゼは閉鎖系を循環し、単離日中に2〜3匹のマウスに再利用して、単離をより費用対効果の高いものにすることができます。
フローサイトメトリーによる単離LSECの純度と表面マーカーの評価:
単離されたLSECの純度は、十分に特徴付けられた特異的LSEC表面マーカーCD146およびスタビリン−216、17、18を採用することによって評価した。染色された細胞をフローサイトメーターで分析した;データはFlowJoソフトウェアを使用して分析されました。
LSEC集団をゲーティングし(図2A)、以下のゲーティング戦略についてシングルレットを分析した。生存細胞は、細胞を特異的マーカーで標識する前に生存率色素染色を用いて定義した(図2B)。次いでCD45−集団をゲーティングし、任意の免疫細胞汚染を排除した。単離されたLSECは94.8%の生存率に達した(図2C)。CD45-細胞の割合は89.7%(図2D)であり、細胞の92.3%はCD146およびスタビリン-2ダブルポジティブ(CD45-CD146+スタビリン-2+)LSECであった(図2E)。
単離されたLSECの形態:
単離したLSECを1 x 106細胞/ウェルの6ウェルプレートに播種し、完全増殖培地で培養し、培養6時間後に光学顕微鏡で調べた(図3A)。LSECを3μmの孔サイズの培養インサートに播種し、走査型電子顕微鏡(SEM)によってLSECsフェネストラーを視覚化した。固定および処理の後、フェネストレーが同定された、図3Bに示される。以前に報告されたように、LSECは一晩で文化の中でフェネストラを失う19;したがって、インビトロでの脱分化を避けるために、下流の研究のために単離後できるだけ早く細胞を処理することが推奨される。
図1:実験回路図と装置のセットアップ (A)実験回路図は、バイオレンダリングを使用して設計されました。(B)機器のセットアップとプロセス。肝臓を採取し、閉鎖型コラゲナーゼ灌流装置で灌流した。次いで肝臓を皿に移し、解離させた。肝臓懸濁液を回収した。非実質細胞画分を50 x g で2分間遠心分離することによって分離し、LSECを磁気ビーズを用いて精製した。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図2:フローサイトメトリーによる単離LSECs純度および表面マーカーの評価。 (A)ゲートLSEC、および(B)前方散乱(FSC)/側方散乱(SSC)に基づく単一セットを示すデータ分析およびゲーティング戦略。単離されたLSECを、生存率色素およびCD45、CD146、およびスタビリン−2抗体の組み合わせで染色した。一重項をゲーティングして分析し、(C)生存可能なLSECを(D)CD45集団上でゲーティングし、(E)CD146およびスタビリン−2発現について分析した。全てのゲートは、蛍光マイナス1(FMO)により決定した。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図3:単離された LSECの形態(A)培養LSECの明視野像。単離されたLSECを完全増殖培地中で6時間培養し、光学顕微鏡(スケールバー100μm)によって調べた。(b)LSECを走査型電子顕微鏡(SEM)により調べた。白い矢印はLSECフェネストレー(スケールバー、左パネル5μm、右パネル1μm)を示す。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
| KRH ストック ソリューション (10 倍速) | |
| 試薬 | 濃度 |
| ナクル | 1.15メートル |
| ヘップス(遊離酸) | 0.2メートル |
| ティッカー | 0.05メートル |
| KH2PO4 | 0.01メートル |
| バッファ A | |
| 試薬 | 濃度 |
| KRH溶液、pH=7.4 | 1倍速 |
| ティッカー | 0.5ミリアンペア時 |
| PHを7.4に調整し、使用前に0.2μmのフィルターでろ過してください。 | |
| 室温で最大6ヶ月間保存する。 | |
| バッファ B | |
| KRH溶液、pH=7.4 | 1倍速 |
| カクル2 | 1 ミリオン |
| PHを7.4に調整し、使用前に0.2μmのフィルターでろ過してください。 | |
| 室温で最大6ヶ月間保存する。 | |
| コラゲナーゼ溶液 | |
| 試薬 | 濃度 |
| バッファ B、PH=7.4 | 125ミリリットル |
| コラゲナーゼ | 35~40 mg、BSAを最大100 mgまで加える |
| パーコールソリューション | |
| 試薬 | 濃度 |
| パーコール | 22.5キロリットル |
| PBS (10 倍)、PH=7.4 | 2.5キロリットル |
| アイソアルト/染色バッファー | |
| 試薬 | 濃度 |
| MACSリンスバッファー | 1250キロバイト |
| BSAストック | 125ミリリットル |
表 1: バッファーのレシピ 表は、この研究で使用された緩衝液および溶液の組成を含む。
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Discussion
現在の原稿では、2段階のコラゲナーゼ灌流とそれに続く磁気活性化細胞選別(MACS)からなるマウス肝臓からのLSEC単離のためのプロトコルを記述している。このプロトコルは、以下の3つのステップからなる:(1)PVをカルシウムを含まない緩衝液で灌流し、続いてコラゲナーゼ含有緩衝液を用いて肝細胞分散を達成する。(2)低速遠心分離による肝細胞の排除;(3)抗CD146磁気ビーズを用いた非実質細胞(NPC)からのLSECのMACSベースのポジティブセレクション。全体の手順は3時間以内に完了することができます。さらに、すべての消耗品を含むこの手順のコストは、マウスあたり約150米ドルであり、このLSEC分離方法が全体的に効率的で費用対効果が高いことを示唆しています。原発性マウス肝細胞の単離にもステップ(1)と(2)を用いているが、これは現在の原稿の範囲を超えている。
門脈カニューレおよび肝臓灌流にはいくつかの重要なステップがある:(i)カテーテル位置決め:カテーテル先端は、通常肝臓の丘陵部で同定される成体マウスのPV分岐部に対して3mm以上遠位に配置するべきである。PV内のカテーテル先端の深い配置は、肝臓のいくつかの葉の灌流を損なう。葉の貧弱な灌流は、葉の色の変化がないとして現れ、遠位PVへのカテーテルのわずかな再配置によってすぐに気づいた場合、矯正することができる。この操作は、おそらくローブ灌流を最適化することができる。(ii)気泡:ポンプとPVとの間の注入経路は、気泡から完全に遊離しておくべきである。PVへの微小な空気の侵入は空気塞栓症を引き起こし、不完全な肝臓灌流をもたらす。内針を除去した後にカテーテル内の空気を除去するために、バッファーAは、注入ラインをカテーテルに接続する前に、任意の空気を排出するために、気泡の近位にシリンジを注入する。(iii)コラゲナーゼ強度:灌流中にコラゲナーゼ活性を維持するためには、PVに注入された緩衝液Bがコラゲナーゼの正確な濃度およびpHを有し、約37°Cに保たれていることを保証することが不可欠である。 図1に示すように、カスタマイズされたチャンバーを使用して、灌流システム全体を37°Cの暖かく加湿された雰囲気に保ちます。さらに、酸素供給は、完全な消化を達成するためにコラゲナーゼ灌流中に維持される。代替の選択肢は、コラゲナーゼ溶液20を予め温めるための水浴、およびコラゲナーゼ溶液が切断IVC21を通して肝臓から排出されるその場での開放型コラゲナーゼ灌流システムを含む。
このプロトコルは、適切な灌流流を確保するために比較的大胆なカテーテル(20G)を使用するが、より薄いカテーテルも以前の報告22、23、24に基づいてうまく機能する。しかし、特にマウスが特定の疾患モデルに使用されている場合、またはPV異常がある場合、PVを正常にカニューレ化することは困難な場合があります。PVカニューレーションが失敗した場合、酵素キットおよび穏やかな組織解離剤を用いた機械的および酵素的肝臓消化は、ステップ(1)および(2)が非実質細胞(NPC)懸濁液を得るための代替方法である。我々は、肝臓灌流を伴わない解離のこの代替方法における細胞収量および生存率が元の方法に匹敵することを確認した(データは示さず)。肝臓消化のための門脈灌流は、他の人や私たちによって採用されています13,16,20.さらに、この方法は、肝臓消化中の機械的力によって誘発されるLSECs表現型または機能的変化の理論的リスクを回避する。したがって、このプロトコルに描かれているPV灌流ベースの方法の使用は、これまでのところ強く推奨されている。
ここでは、現在のプロトコルを採用した場合の最適なLSEC収率と純度が示されています。我々は、現在のプロトコールを用いて、健康なマウスおよび食事誘導性NASHを有するマウスの両方から、マウス当たり約2〜5 x106 個の細胞を得た。純度に関しては、免疫磁気分離に使用したのと同じ表面マーカー(CD146)の陽性が、当社の単離技術の精度を支えています。さらに、リンパ管内皮ヒアルロン酸受容体1(LYVE-1)、CD32b、およびスタビリン-2など、いくつかのよく認識されたLSEC表面マーカーが存在する。これらのマーカーの周りにはまだ論争が存在します。例えば、i)LYVE−1はリンパ管内皮細胞にも存在し、そしてii)門脈周囲領域のLSECはCD32b発現18を欠いている。したがって、フローサイトメトリーを用いてこれらの単離LSECの純度を調べるために、CD146に加えて確立された特異的LSECマーカーとしてスタビリン−2を採用した。この方法論を用いて、単離されたLSECが>94%の生存率および>90%の純度を有することを確認した(図2)。単離された細胞のLSEC特異的表現型をSEMを用いてさらに確認し、そこではほとんどの細胞がLSECの特徴的な形態学的特徴であるフェネストラ(図3B)を有する。
LSECs単離方法論の中で、免疫磁気ビーズ選択は、NPC画分24、25、26、27からLSECを単離するために最も使用される技術である。対照的に、他の方法には、遠心簸および選択的接着ベースの分離22、28、29が含まれる。非免疫磁気法は、LSEC(マウスあたり約9 x106細胞)の高収率をもたらすことが示されています11。したがって、絶縁LSECの収率が比較的低いことは、現在のプロトコルの制限になる可能性があります。一方、非免疫磁気選択ベースの方法は、高い技術的専門知識を必要とし、細胞収率および純度に関して一貫性のない結果を示すことがある11が、免疫磁気選択ベースの方法は、他の既存の方法よりも一貫した収率および純度の利点を保持する。さらに、免疫磁気ビーズ選択ベースの細胞単離のために、使用される細胞表面マーカーの特異性は常に懸念事項である。例えば、免疫磁気LSEC分離のマーカーとして以前に使用されていたCD31は、PV内皮および毛細管化LSEC3上に優勢に発現される。CD146はナチュラルキラー細胞や肝星細胞30、31でも発現することが報告されているが、このプロトコールを用いて単離された高純度のLSECは、内皮マーカーCD146の特異性に関する懸念を緩和する。LSEC分離のための様々な方法論の長所と短所の比較は、他の場所で議論されている11、18、32。他の方法とこの方法との間の細胞収量および純度の比較は、現在の原稿の範囲を超えており、将来の調査を保証する。
結論として、我々は、最も広く使用され、受け入れられているアプローチの1つに基づく主要なマウスLSEC分離プロトコルを提示する。絶縁型LSECは、高純度で保存された機能を示します。さらに、このプロトコルは、健康なマウス肝臓ならびに異なる疾患マウスモデルからの肝臓に効率的かつ適用可能である。これらのマウスからの高品質のLSECは、マルチオミクスデータセット第13、14世代に使用することができる。したがって、このアプローチは、LSECの機能を調節する分子機構の同定を容易にし、健康および疾患における肝臓における細胞間通信におけるそれらの役割の理解を改善する。
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Disclosures
すべての著者は、開示する矛盾はありません。
Acknowledgments
この研究は、NIHの国立糖尿病・消化器・腎臓病研究所(1RO1DK122948からSHI)とNIHシルヴィオ・O・コンテ消化器疾患研究コアセンターP30助成金機構(DK084567)の支援を受けた。また、日本学術振興会(JSPS)在外特別研究員によるKFへの支援も行いました。また、グレゴリー・J・ゴアズ博士とスティーブン・ブロンク博士がコラゲナーゼ灌流装置を独自に設計し、最適化したことにも感謝の意を表します。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2.0-inch 20 G Intra Venous (IV) catheter | Terumo, SOmerset, NJ, USA | SR-OX2051CA | |
| 2–3-inch perfuion tray with a hole in the center | customized; made in house | ||
| 405/520 viability dye | Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany | 130-110-205 | |
| 4-inch regular curved dressing forceps | Fisher Brand | FS16-100-110 | |
| 5-0 Perma-Hand silk suture | Ethicon, Raritan, NJ, USA | A182H | |
| Anti-stabilin-2 (Mouse) mAb-Alexa Fluorà 488 | MBL International, Woburn, MA, USA | D317-A48 | |
| BSA stock | Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany | 130-091-376 | |
| Anti-CD146 (LSEC)-PE, anti-mouse | Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany | 130-118-407 | |
| CD146 (LSEC) MicroBeads, mouse | Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany | 130-092-007 | |
| Anti-CD45-Viogreen, anti-mouse | Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany | 130-110-803 | |
| Collagen type I | Corning, Corning, NY, USA | 354236 | |
| Collagenase II | Gibco, Waltham, MA, USA | 17101-015 | |
| Endothelial cells growth medium | ScienCell Research Laboratories, Carlsbad, CA, USA | 211-500 | |
| FcR blocking reagent, mouse | Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany | 130-092-575 | |
| FlowJo software, version 10.6 | Becton, Dickinson and Company | ||
| Hardened Fine scissors | F.S.T, Foster city, CA, USA | 14091-11 | |
| Heated (37 °C) and humidified recirculating perfusion apparatus equipped with Oxygen injection at a rate of 10psi. | customized; made in house | ||
| Hitachi S 4700 scanning electron microscope | Hitachi Inc, Pleasanton, CA, USA | SEM096 | |
| LS columns | Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany | 130-042-401 | |
| MACS pre-separation filters (70 μm) | Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany | 130-095-823 | |
| MACS rinsing buffer | Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany | 130-091-222 | |
| MACS Smart Strainer (70 μm) | Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany | 130-098-462 | |
| MACSQunt flow cytometer | Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany | ||
| Millicell Cell Culture Insert | Millipore Sigma, Burlington, MA, USA | PITP01250 | |
| Nexcelom cell counter | Nexcelom bioscience, Lawrence, MA, USA | Cellometer Auto T4 Plus | |
| Percoll | GE Healthcare, Chicago, IL, USA | 17-0891-01 | |
| Surgical scissors | F.S.T, Foster city, CA, USA | 14001-12 | |
| Very small curved dressing forceps | F.S.T, Foster city, CA, USA | 11063-07 |
References
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