Summary
Burada primer fare karaciğeri sinüzoidal endotel hücresi (LSEC) izolasyonu için bir protokol özetlenmekte ve gösterilmektedir. Protokol, karaciğer kollajenaz perfüzyonu, düşük hızlı santrifüjleme ile parankimal olmayan hücre saflaştırılması ve CD146 manyetik boncuk seçimine dayanmaktadır. Ayrıca bu izole LSEC'leri akış sitometrisi ve taramalı elektron mikroskobu kullanarak fenotipler ve karakterize ediyoruz.
Abstract
Karaciğer sinüzoidal endotel hücreleri (LSEC'ler), dolaşım ve karaciğer parankimi arasındaki arayüzde yer alan özelleşmiş endotel hücreleridir. LSEC'ler, fenestra varlığı ve bazal membranın yokluğu ile karakterize edilen farklı bir morfolojiye sahiptir. LSEC'ler, metabolik disregülasyon, inflamasyon, fibroz, anjiyogenez ve karsinogenez dahil olmak üzere karaciğerdeki birçok patolojik bozuklukta önemli rol oynamaktadır. Bununla birlikte, LSEC'lerin izolasyonu ve karakterizasyonu hakkında çok az şey yayınlanmıştır. Burada, bu protokol LSEC'in hem sağlıklı hem de alkolsüz yağlı karaciğer hastalığı (NAFLD) farelerinden izolasyonunu tartışmaktadır. Protokol, fare karaciğerinin kollajenaz perfüzyonuna ve LSEC'leri saflaştırmak için manyetik boncukların parankimal olmayan hücrelerin pozitif seçimine dayanmaktadır. Bu çalışma, akış sitometrisi ile spesifik belirteçler kullanarak LSEC'leri karakterize eder ve elektron mikroskobu taraması ile karakteristik fenotipik özellikleri tanımlar. Bu protokolü takiben izole edilen LSEC'ler, yapışma ve geçirgenlik testleri de dahil olmak üzere fonksiyonel çalışmaların yanı sıra belirli bir ilgi yolu için aşağı akış çalışmaları için kullanılabilir. Ek olarak, bu LSEC'ler ayrı ayrı havuzlanabilir veya kullanılabilir, RNA-seq kütlesi veya tek hücreli, proteomik veya fosfo-proteomik ve diğerlerinin yanı sıra dizileme (ATAC-seq) kullanarak Transpozaz-Erişilebilir Kromatin Testi dahil olmak üzere multi-omik veri üretimine izin verir. Bu protokol, LSEC'lerin sağlık ve hastalıktaki diğer karaciğer hücreleri ile iletişimini inceleyen araştırmacılar için yararlı olacak ve LSEC'lerin akut ve kronik karaciğer hasarının patojenik mekanizmalarındaki rolünün derinlemesine anlaşılmasını sağlayacaktır.
Introduction
Karaciğer sinüzoidal endotel hücreleri (LSEC'ler) hepatik sinüzoid duvarları kaplar ve karaciğerde en bol bulunan parankimal olmayan hücrelerdir1. LSEC'ler, vücudun başka yerlerindeki diğer kılcal endotel hücrelerinden fenestra varlığı ve klasik bir bazal membran veya diyaframeksikliği ile ayırt edilir 2,3. Bu nedenle, LSEC'ler, lipitler ve lipoproteinler de dahil olmak üzere çeşitli dolaşımdaki makromolekülleri ortadan kaldırmak için geçirgenliklerini ve endositik kapasitelerini artıran ayırt edici fenotipik ve yapısal özelliklere sahiptir. LSEC'ler, yıldız hücreleri ve bağışıklık hücreleri gibi parankimal ve parankimal olmayan hücreler arasındaki çapraz konuşmada çok önemli bir rol oynar. LSEC'ler, yıldız hücrelerini ve Kupffer hücrelerini sessiz bir durumda tutarak karaciğer homeostazını korumada anahtardır4. LSEC'ler, dolaşımdaki lökositlerin adezyona ve transendotel göçüne aracılık ederek hepatik immün hücre popülasyonlarının bileşimini modüle eder 5,6. İskemi-reperfüzyon hasarı (IRI)8, alkolsüz steatohepatit (NASH)9 ve hepatosellüler karsinom (HCC) dahil olmak üzere akut ve kronik karaciğer hasarı7 sırasında, LSEC'ler defenestrasyon ve bazal membran oluşumu ile karakterize kapillarizasyon olarak bilinen fenotipik değişikliklere uğrar10. LSEC'lerdeki bu fenotipik değişiklikler, LSEC'lerin disfonksiyonu ve protrombotik, proenflamatuar ve profibrojenik özelliklerin kazanılması ile ilişkilidir.
LSEC'lerin fare karaciğerinden izolasyonu için çeşitli yöntemler geliştirilmiştir11. Bazı teknikler, parankimal olmayan ve parankimal hücrelerin ayrılmasına ve ardından LSEC'leri parankimal olmayan fraksiyonlardan arındırmak için yoğunluk gradyanı santrifüjlenmesine bağlıdır. Bu yöntemin sınırlaması, LSEC'lerin izolasyonunun son adımlarında kirletici makrofajların varlığıdır ve bu da izole edilmiş LSEC'lerin saflığını etkileyebilir12. Bu protokol, fare karaciğerinin kollajenaz perfüzyonuna ve LSEC'leri saflaştırmak için CD146 + manyetik boncukların parankimal olmayan hücrelerin pozitif seçimine dayanmaktadır. Bu yöntem kullanılarak izole edilen LSEC'ler yüksek saflık ve korunmuş morfoloji ve canlılık gösterir. Bu LSEC'ler, geçirgenlik ve adezyon testi de dahil olmak üzere fonksiyonel çalışmaların yanı sıra ilgilenilen yollar için aşağı akış çalışmaları için de optimumdur. Dahası, hem klinik araştırma hem de keşif biliminde büyük veri kümeleri oluşturmaya olan ilginin artmasıyla birlikte, alkolsüz steatohepatit (NASH) veya diğer koşullara sahip hem sağlıklı hem de hastalıklı karaciğerlerden izole edilen bu yüksek kaliteli LSEC'ler, çoklu omik veri üretimine ve sağlık ile hastalık arasında karşılaştırmaya izin vererek ayrı ayrı toplanabilir veyakullanılabilir13,14 . Ek olarak, izole LSEC'ler, LSEC'lerdeki aktif sinyal yolunu ve farklı zararlı uyaranlar altında ve çeşitli terapötik müdahalelere yanıt olarak diğer karaciğer hücreleriyle hücresel iletişimlerini deşifre etmek için organoidler gibi iki boyutlu ve üç boyutlu in vitro modeller geliştirmek için kullanılabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Hayvan protokolleri, Mayo Clinic'in Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi (IACUC) tarafından onaylandığı şekilde yürütülmüştür. Jackson Laboratuvarı'ndan sekiz haftalık C57BL/6J erkek fareler satın alındı. Fareler, diyete ücretsiz erişimi olan sıcaklık kontrollü 12: 12 saatlik bir aydınlık-karanlık döngü tesisinde barındırıldı.
1. Kollajen kaplı kültür tabağı veya tabağının hazırlanması
- 50 mL 0.02 mol / L asetik asit yapmak için, 49.4 mLH2O'ya 0.6 mL buzul asetik asit ekleyin.
- 0.02 mol / L asetik asit içinde 50 μg / mL kollajen tip I yapın. Seyreltme, partinin konsantrasyonuna bağlıdır.
- 10 cm'lik kültür kaplarını 3 mL kollajen çözeltisi ile kaplayın. 1 saat boyunca oda sıcaklığında (RT) inkübe edin.
NOT: Kültür için farklı bir tabak veya tabak kullanırken, kaplama çözeltisinin hacminin kültür alanına göre ayarlanması gerekir, genellikle 6-10 μg /cm2 kullanın. - Kaplanmış yüzeydeki fazla sıvıyı çıkarın ve 3 kez Fosfat tamponlu salin (PBS) ile yıkayın. Bulaşıkların havalanarak kurumasını bekleyin.
- Kollajen çözeltisi steril değilse, kollajen kaplı bulaşıkları steril bir doku kültürü başlığında 10 dakika boyunca ultraviyole (UV) ışığa maruz bırakarak sterilize edin.
2. Ekipman kurulumu
- Isıtılmış ve nemlendirilmiş devridaim perfüzyon aparatını Şekil 1B'de gösterildiği gibi kurun.
- Perfüzyon sistemini 5 dakika boyunca% 10 ağartıcı kullanarak ve ardından 10 dakika daha steril su kullanarak durulayın.
- Kollajenaz çözeltisini perfüze etmeden önce durulama sıvısını mümkün olduğunca boşaltın.
- Kollajenaz çözeltisini perfüzyon sisteminden ( Şekil 1B'de gösterildiği gibi) 37 ° C'de ön ısıtmak için infüze edin. Pompa hızını hız kontrol kadranında gösterildiği gibi 1 hızına ayarlayın (40 mL/dk'ya eşit).
- Bu hızı tüm prosedür boyunca aynı tutun. LSEC izolasyonunun yapıldığı gün boyunca kapalı devrede çalıştırılan kollajenaz çözeltisini yeniden kullanın.
NOT: LSEC'lerin biyolojik durumunu bozabilecek mekanik basıncı önlemek için pompa hızı 1'e sabitlenmiştir.
3. Cerrahi prosedür
- Fareyi tartın.
- 90 mg / kg vücut ağırlığı ketamin ve 10 mg / kg vücut ağırlığı intraperitoneal olarak ksilazin (IP) enjekte edin.
- Fare ağrılı uyaranlara karşı reaktif olmadığında, Şekil 1B'de gösterildiği gibi fareyi cerrahi yüzeye sabitleyin.
- Fare karnına% 70 etanol püskürtün. Cerrahi makas kullanarak, karnın alt kısmından başlayarak ksifoid sürece kadar ~ 5 cm uzunluğunda bir kesi yapın.
- Daha sonra, karın organlarını tamamen açığa çıkarmak için karnın her iki tarafında küçük iris makası kullanarak iki yanal kesim yapın.
- Karnı kaldırmak ve düzleştirmek için intravenöz (IV) kateterin kılıfını hayvanın sırtının altına yerleştirin.
- Düzenli bir kavisli pansuman forseps kullanarak, bağırsakları ve mideyi hayvanın soluna doğru yavaşça çekin.
- Açıkta kalan sol böbreğin hemen altındaki inferior vena kavanın (IVC) altına 5-0 cerrahi sütür yerleştirin. Dikişe gevşek bir bağlantı bağlayın.
- Hepatik PV'den dalak veni dallanma noktasının hemen üstüne hepatik portal venin (PV) etrafına 5-0 cerrahi sütür daha yerleştirin. Dikişe gevşek bir bağlantı bağlayın.
- PV sütürünü gerginlik olarak kullanarak, 20 G IV kateteri 1 cm aşağıdaki hepatik PV'ye yerleştirin ve burada sağa ve sola hepatik PV'ye dallanır.
- Kateteri damardan yukarı kaydırın, ancak dallanma bölgesinin altında tutun. Kanın damlamaya başlayana kadar kateterden aşağı inmesine izin verin.
- Tampon A'nın bir kısmı (Tablo 1) cerrahi alanın üzerine yerleştirilmiş bir intravenöz (IV) şişedeyken, bir IV hattı kullanın ve kateterin üzerine takın. Sisteme hava girmesini önlerken karaciğeri bu çözelti ile yıkayın.
- Böbreğin altındaki inferior vena kavanın etrafındaki dikişi bağlayın. Bu, karaciğerin retro perfüzyona izin verecektir.
- Hayvanın kanamasına izin vermek için IVC'yi dikişin altında kesin.
NOT: Karaciğerin tıkanmasını önlemek için bu adım hızlı bir şekilde gerçekleştirilmelidir. - IV kateteri PV sütür ile sabitleyin.
- Rahatsız ettikten sonra, mideyi, bağırsakları, dalağı ve karaciğere bağlı diğer bağırsakları kesin.
- Diyaframı ve ana damarları göğüs boşluğundan kesin. Karaciğeri hayvandan çıkarın ve perfüzyon tepsisine yerleştirin.
- IV hattını dikkatlice çıkarın ve kollajenaz çözeltisini devridaim odasına bağlayın.
NOT: 3.16-3.18 adımlarının 5 dakika içinde yapılması gerekir, bu nedenle karaciğer Tampon A ile çok uzun süre perfüze edilmeyecektir. - Kapsül benekli hale gelene ve yumuşak görünene kadar karaciğerin perfüzyonuna izin verin (10-15 dakika veya daha fazla, süre farklı kollajenaz partilerine bağlı olarak değişir).
- Karaciğer perfüzyon halindeyken, bir nekropsi torbasına atmadan önce hayvanın öldüğünden emin olun.
- Sindirildikten sonra, karaciğeri odadan çıkarın ve yaklaşık 20 mL serumsuz Dulbecco'nun Modifiye Kartal Ortamı (DMEM) içeren 10 cm'lik bir Petri kabına yerleştirin.
- Karaciğeri birkaç pipet ucuyla yavaşça ayırın ve safra ağacını atın.
- Karaciğer süspansiyonunu 70 μm'lik bir hücre süzgecinden 50 mL'lik bir konik tüpe filtreleyin.
- RT'de 2 dakika boyunca 50 x g'de hücre süspansiyonunu santrifüj edin. Parankimal olmayan hepatik hücreler içeren süpernatantı toplayın.
NOT: Hepatositler pelet içinde çökeltilir, bu da daha önce tarif edildiği gibi gradyan santrifüjleme kullanılarak daha da saflaştırılabilir15.
4. Parankimal olmayan hepatik hücrelerin ayrılması ve LSEC'lerin saflaştırılması
NOT: CD146+ LSEC'leri, üreticinin talimatlarını izleyerek immünomanyetik boncukları kullanarak saflaştırın.
- Süpernatantı 300 x g'de 4 ° C'de 5 dakika boyunca santrifüj yapın.
- Hücre peletini toplayın ve 1 mL izolasyon tamponunda yeniden askıya alın (Tablo 1), üreticinin talimatlarını izleyerek otomatik bir hücre sayacı kullanarak hücre numarasını belirleyin.
- Hücre süspansiyonunu 300 x g'de 4 ° C'de 10 dakika boyunca santrifüj edin, süpernatantı tamamen aspire edin.
- Pelet, toplam 10 7 hücre başına 90 μL izolasyon tamponu ileyeniden askıya alın.
- Toplam 107 hücre başına 10 μL CD146 manyetik boncuk ekleyin. İyice karıştırın ve 4 ° C'de 15 dakika kuluçkaya yatırın.
- Hücreleri yıkamak için, 107 hücre başına 1-2 mL izolasyon tamponu ekleyin, 10 dakika boyunca 300 x g'de santrifüj yapın ve ardından süpernatantı tamamen aspire edin.
- 500 μL izolasyon tamponunda 10adede kadar 9 hücreyi yeniden askıya alın (Tablo 1).
NOT: Daha yüksek hücre sayıları için, arabellek hacmini uygun şekilde ölçeklendirin. - Ayırma kolonunu hazırlayın, 3 mL izolasyon tamponu ile durulayın.
- Hücre süspansiyonunu 70 μm ön ayırma filtreleriyle istiflenmiş sütuna uygulayın.
- Kolonu 3 mL izolasyon tamponu ile 3 kez yıkayın.
NOT: Kolonu yıkarken, kolon haznesi boşalır boşalmaz izolasyon tamponu eklenmelidir. - Kolonu separatörden çıkarın ve 15 mL'lik bir santrifüj tüpüne yerleştirin. Pipet kolon üzerine 5 mL izolasyon tamponu yerleştirin.
- Manyetik boncuk etiketli hücreleri kurtarmak için, hücreleri temizlemek için pistonu sütuna sıkıca itin.
- 4 °C'de 5 dakika boyunca 300 x g'da santrifüj. LSEC'ler mikroskobik inceleme ve aşağı akış analizi için hazırdır.
5. LSEC'lerin immünofenotiplenmesi ve akım sitometrisi ile saflık değerlendirmesi
- Üreticinin yönergelerini izleyerek otomatik hücre sayacı kullanarak yalıtılmış LSEC'lerin hücre numaralarını belirleyin.
- Hücreleri 5 dakika boyunca 300 x g'da santrifüj edin, süpernatantı tamamen aspire edin.
- 1 x 106 hücre/tüp alın ve 90 μL boyama tamponu ile yeniden askıya alın (Tablo 1).
- 10 μL/tüp fare FcR bloğu ve 1 μL canlılık boyası ekleyin, 10 dakika boyunca 4 °C'de inkübe edin.
- CD45, CD146 ve stabilin-2 antikorlarının bir kombinasyonu ile hücreleri lekeleyin, 1:50'de boyama tamponu ile seyreltilir. 20 dakika boyunca 4 °C'de inkübe edin.
- Hücreleri 5 mL boyama tamponu ile yıkayın ve 10 dakika boyunca 300 x g'de santrifüj yapın, ardından süpernatantı tamamen aspire edin.
- Hücreleri 300 μL boyama tamponu ile yeniden askıya alın ve akış sitometresinden geçirin.
6. LSEC'lerin kültürü ve sınavı
- Tohum 1 x 106 hücreli bir plakada 6 hücreli bir kuyucuk ve kültür,% 5 fetal sığır serumu (FBS),% 1 endotel hücreleri büyüme takviyesi ve% 1 primosin çözeltisinden oluşan endotel hücreleri büyüme ortamı ile kültürleyin.
- İzole LSEC'leri ışık mikroskobu ile inceleyin. 10x büyütme ile parlak alan görüntüleri elde edin.
7. LSEC'lerin morfolojisi ve taramalı elektron mikroskobu ile fenestrae incelemesi
- Hücre kültürü eklerini (3 μm gözenek boyutu) kollajen çözeltisi ile önceden kaplayın.
- 37 ° C sıcak ve nemlendirilmiş atmosferde 24 delikli bir plakada endotel hücreleri büyüme ortamı ile kesici uç üzerinde kültür izole LSEC'ler (120.000 hücre). Hücrelerin yerleşmesine ve 2 saat boyunca yapışmasına izin verin.
- Hücre fiksasyonu için, 37 ° C'de önceden ısıtılmış eşdeğer bir hacim ekleyin Trump'ın hücre kültürü ortamına sabitleyicisi.
- 10 dakika boyunca kuluçkadan sonra,% 50 seyreltilmiş Trump'ın fiksatifini seyreltilmemiş Trump'ın fiksatif ile değiştirin.
- Trump fiksatif içindeki hücreleri 2 saat sabitleyin, daha sonra% 1 osmiyum tetroksitlerde 1 saat inkübe edin.
- Numunelerin dehidrasyonuna, kritik nokta kurutma cihazında kurutulmasına, montajına, püskürtme kaplamasına ve taramalı elektron mikroskobu kullanılarak incelenmesine devam edin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Deneysel şemalar ve ekipman kurulumu:
Bu protokolde, fare karaciğeri kapalı bir perfüzyon devresi kullanılarak sindirildi, daha sonra parankimal olmayan hücreler ve hepatositler 2 dakika boyunca 50 x g'de düşük hızlı santrifüjleme ile ayrıldı. Primer LSEC'ler parankimal olmayan fraksiyondan CD146 manyetik boncuk seçimi kullanılarak izole edildi. Deneysel şemalar Şekil 1A'da gösterilmiştir. Kanül PV yoluyla yerleştirilirken, inferior vena kava karaciğer yoluyla kollajenazın tek yönlü perfüzyonunu sağlamak için bağlandı (Şekil 1B). Şirket içi perfüzyon odası, 37-40 ° C sıcak ve nemlendirilmiş bir aparat havası sağlamak için bir ısıtma ve nemlendirme sistemi ile donatılmıştır. Perfüze edilmiş kollajenaz kapalı bir sistemde dolaşır ve izolasyonu daha uygun maliyetli hale getirmek için izolasyon günü boyunca iki veya üç fare için tekrar kullanılabilir.
İzole LSEC'lerin saflığının ve yüzey belirteçlerinin akış sitometrisi ile değerlendirilmesi:
İzole LSEC'lerin saflığı, iyi karakterize edilmiş spesifik LSEC yüzey belirteçleri CD146 ve stabilin-216,17,18 kullanılarak değerlendirildi. Lekeli hücreler bir akış sitometresinde analiz edildi; veriler FlowJo yazılımı kullanılarak analiz edilmiştir.
LSEC popülasyonu kapılıydı (Şekil 2A) ve aşağıdaki geçit stratejisi için teklileri analiz etti; Yaşayabilir hücreler, hücreleri spesifik belirteçlerle etiketlemeden önce canlılık boyaması kullanılarak tanımlandı (Şekil 2B). Daha sonra CD45- popülasyonu, herhangi bir bağışıklık hücresi kontaminasyonunu dışlamak için kapatıldı. İzole LSEC'ler %94,8 canlılığa ulaşmıştır (Şekil 2C). CD45 hücrelerinin yüzdesi %89.7 (Şekil 2D), %92.3'ü CD146 ve stabilin-2 çift pozitif (CD45-CD146+stabilin-2+) LSEC idi (Şekil 2E).
İzole LSEC'lerin morfolojisi:
İzole edilen LSEC'ler, 1 x 10 6 hücre / kuyuda 6 kuyucuklu bir plakaya tohumlandı, tam bir büyüme ortamında kültürlendi ve6 saatlik kültürden sonra ışık mikroskobu ile incelendi (Şekil 3A). LSEC'ler, elektron mikroskobunu (SEM) tarayarak LSEC'lerin fenestralarını görselleştirmek için 3 μm gözenek boyutunda bir kültür eki üzerine kaplandı. Fiksasyon ve işlemden sonra, Şekil 3B'de gösterildiği gibi fenestrae tanımlanmıştır. Daha önce bildirildiği gibi, LSEC'ler kültürdeki fenestralarını bir gecede kaybederler19; Bu nedenle, in vitro dediferansiyasyonu önlemek için aşağı akış çalışmaları için izolasyondan sonra hücrelerin mümkün olan en kısa sürede işlenmesi önerilir.
Resim 1: Deneysel şemalar ve ekipman kurulumu. (A) Deneysel şemalar Biorender kullanılarak tasarlanmıştır. (B) Ekipman kurulumu ve süreci. Karaciğer toplandı ve kapalı bir kollajenaz perfüzyon aparatında perfüze edildi. Karaciğer daha sonra bir tabağa aktarıldı ve ayrıştı. Karaciğer süspansiyonu toplandı. Parankimal olmayan hücre fraksiyonu, 2 dakika boyunca 50 x g'de santrifüjleme ile ayrıldı. LSEC'ler manyetik boncuklar kullanılarak saflaştırıldı. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: İzole LSEC'lerin saflığının ve yüzey belirteçlerinin akış sitometrisi ile değerlendirilmesi. Gösterildiği gibi veri analizi ve geçit stratejisi, (A) kapılı LSEC'ler ve (B) ileri saçılmaya (FSC) / yan saçılmaya (SSC) dayalı tekletler. İzole LSEC'ler bir canlılık boyası ve CD45, CD146 ve stabilin-2 antikorlarının bir kombinasyonu ile boyandı. Singleletler kapılı ve analiz edildi, (C) canlı LSEC'ler (D) CD45 populasyonuna kapılandı ve (E) CD146 ve stabilin-2 ekspresyonu için analiz edildi. Tüm kapılar floresan eksi bir (FMO) ile belirlendi. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: İzole LSEC'lerin morfolojisi. (A) Kültürlü LSEC'lerin parlak alan resmi. İzole LSEC'ler 6 saat boyunca tam büyüme ortamında kültürlendi ve ışık mikroskobu ile incelendi (Ölçek çubuğu 100 μm). (B) LSEC, taramalı elektron mikroskobu (SEM) ile incelendi. Beyaz oklar LSEC fenestrae'yi gösterir (Ölçek çubuğu, sol panel 5 μm, sağ panel 1 μm). Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
| KRH stok çözümü (10x) | |
| Reaktif | Konsantrasyon |
| Arjantin | 1,15 milyon |
| HEPES (serbest asit) | 0,2 milyon |
| Kartal | 0.05 milyon |
| KH2PO4 | 0,01 milyon |
| Arabellek A | |
| Reaktif | Konsantrasyon |
| KRH çözeltisi, PH=7.4 | 1 adet |
| cesaret | 0,5 mM |
| PH'yi 7,4'e ayarlayın, kullanmadan önce 0,2 μm'lik bir filtreden süzün. | |
| Oda sıcaklığında 6 aya kadar saklanır. | |
| Tampon B | |
| KRH çözeltisi, PH=7.4 | 1 adet |
| CaCl2 | 1 mM |
| PH'yi 7,4'e ayarlayın, kullanmadan önce 0,2 μm'lik bir filtreden süzün. | |
| Oda sıcaklığında 6 aya kadar saklanır. | |
| Kollajenaz çözeltisi | |
| Reaktif | Konsantrasyon |
| Arabellek B, PH=7,4 | 125 mL |
| Kollajenaz | 35–40 mg, 100 mg'a kadar BSA ekleyin |
| Percoll çözeltisi | |
| Reaktif | Konsantrasyon |
| Arjantin | 22,5 mL |
| PBS (10x), PH=7,4 | 2,5 mL |
| İzoalsiyon/Boyama Tamponu | |
| Reaktif | Konsantrasyon |
| MACS durulama tamponu | 1250 mL |
| BSA hisse senedi | 125 mL |
Tablo 1: Arabellek tarifi. Tablo, bu çalışmada kullanılan tamponların ve çözeltilerin bileşimini içermektedir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu makalede, iki aşamalı kollajenaz perfüzyonu ve ardından manyetik aktive hücre sıralamadan (MACS) oluşan fare karaciğerinden LSEC izolasyonu için bir protokol açıklanmaktadır. Bu protokol aşağıdaki üç adımdan oluşur: (1) Karaciğer hücresi dispersiyonunu sağlamak için kalsiyum içermeyen bir tampon ile PV yoluyla perfüzyon ve ardından kollajenaz içeren bir tampon; (2) Düşük hızlı santrifüjleme ile hepatositlerin dışlanması; ve (3) anti-CD146 manyetik boncuklar kullanarak parankimal olmayan hücrelerden (NPC'ler) LSEC'lerin MACS tabanlı pozitif seçimi. Tüm prosedür 3 saat içinde tamamlanabilir. Ayrıca, tüm sarf malzemeleri de dahil olmak üzere bu prosedürün maliyeti, fare başına yaklaşık 150 USD'dir, bu da bu LSEC izolasyon yönteminin genel olarak verimli ve uygun maliyetli olduğunu göstermektedir. Primer fare hepatositlerinin izolasyonu için de (1) ve (2) numaralı adımları kullanıyoruz, bu da mevcut makalenin kapsamı dışındadır.
Portal kanülasyon ve karaciğer perfüzyonunda birkaç kritik adım vardır: (i) Kateter konumlandırması: Kateter ucu, genellikle karaciğerin hilumunda tanımlanan yetişkin bir farenin PV bifurkasyonuna en az 3 mm distal yerleştirilmelidir. Kateter ucunun PV'ye derin yerleştirilmesi, karaciğerin bazı loblarının perfüzyonunu tehlikeye atacaktır. Bir lobun zayıf perfüzyonu, lobun renk değişiminin olmaması olarak kendini gösterir ve kateterin distal PV'ye hafifçe yeniden konumlandırılmasıyla hemen fark edilirse düzeltilebilir. Bu manevra muhtemelen lob perfüzyonunu optimize edebilir. (ii) Hava kabarcıkları: Pompa ile PV arasındaki infüzyon yolu hava kabarcıklarından tamamen arındırılmış halde tutulmalıdır. PV'ye dakika hava girişi, eksik karaciğer perfüzyonuna neden olan bir hava embolisine neden olabilir. İç iğneyi çıkardıktan sonra kateterdeki havayı ortadan kaldırmak için, Tampon A, infüzyon hattını katetere bağlamadan önce herhangi bir havayı dışarı atmak için kabarcığa proksimal bir şırınga enjekte edilir. (iii) Kollajenaz mukavemeti: Perfüzyon sırasında kollajenaz aktivitesini korumak için, PV'ye enjekte edilen Tampon B'nin hassas kollajenaz ve pH konsantrasyonuna sahip olduğundan ve yaklaşık 37 ° C'de tutulduğundan emin olmak önemlidir. Şekil 1'de gösterildiği gibi, tüm perfüzyon sistemini 37 ° C'lik sıcak ve nemlendirilmiş bir atmosferde tutmak için özelleştirilmiş bir oda kullanılır; Ek olarak, tam sindirim elde etmek için kollajenaz perfüzyonu sırasında oksijen kaynağı korunur. Alternatif bir seçenek, kollajenaz çözeltisi20'yi önceden ısıtmak için bir su banyosu ve kollajenaz çözeltisinin kesilen IVC21 yoluyla karaciğerden dışarı aktığı açık bir kollajenaz perfüzyon sistemini içerir.
Protokol, yeterli bir perfüzyon akışını sağlamak için nispeten cesur kateterler (20 G) kullanmasına rağmen, daha ince bir kateter önceki raporlara dayanarak da iyi çalışacaktır22,23,24. Bununla birlikte, özellikle fareler belirli hastalık modelleri için kullanıldığında veya PV anomalileri varsa, PV'yi başarılı bir şekilde kanüle etmek bazen zordur. PV kanülasyonu başarısız olursa, bir enzim kiti ve nazik doku ayrışıcısı kullanılarak mekanik ve enzimatik karaciğer sindirimi, parankimal olmayan hücre (NPC) süspansiyonu elde etmek için (1) ve (2) numaralı adımlar için alternatif bir yöntemdir. Karaciğer perfüzyonu olmadan bu alternatif ayrışma yöntemindeki hücre veriminin ve canlılığının orijinal yöntemle karşılaştırılabilir olduğunu doğruladık (veriler gösterilmemiştir). Karaciğer sindirimi için portal ven perfüzyonu başkaları ve biz 13,16,20 tarafından kullanılmıştır. Ayrıca, bu yöntem, karaciğer sindirimi sırasında mekanik kuvvetin neden olduğu LSEC'lerin fenotipik veya fonksiyonel değişikliklerinin teorik riskini önler. Bu nedenle, bu protokolde gösterilen PV perfüzyon tabanlı yöntemin kullanılması şu ana kadar şiddetle tavsiye edilmektedir.
Burada, mevcut protokolü kullanırken optimum LSEC verimi ve saflığı gösterilmektedir. Mevcut protokolü kullanarak hem sağlıklı farelerden hem de diyete bağlı NASH'lı farelerden fare başına yaklaşık 2-5 x 106 hücre elde ettik. Saflığa gelince, immünomanyetik ayırma (CD146) için kullanılan aynı yüzey işaretleyicisinin pozitifliği, izolasyon tekniğimizin doğruluğunu desteklemektedir. Ek olarak, lenfatik damar endotelyal hyaluronik asit reseptörü 1 (LYVE-1), CD32b ve stabilin-2 gibi iyi bilinen birkaç LSEC yüzey belirteci vardır. Bu belirteçler etrafında tartışmalar hala mevcuttur; örneğin, i) LYVE-1 lenfatik endotel hücrelerinde de bulunur ve ii) periportal bölgedeki LSEC'lerde CD32b ekspresyonu18 yoktur. Bu nedenle, bu izole LSEC'lerin saflığını akış sitometrisi ile incelemek için, stabilin-2, CD146'ya ek olarak belirlenmiş bir spesifik LSEC belirteci olarak kullanılmıştır. Bu metodolojiyi kullanarak, izole LSEC'lerin %>94 canlılığa ve %90 > saflığa sahip olduğunu doğruladık (Şekil 2). İzole edilen hücrelerin LSEC'e özgü fenotipi, hücrelerin çoğunun LSEC'lerin karakteristik morfolojik özelliği olan fenestraya sahip olduğu SEM kullanılarak daha da doğrulanmıştır (Şekil 3B).
LSEC'lerin izolasyon metodolojileri arasında, immünomanyetik boncuk seçimi, LSEC'leri NPC fraksiyonu24,25,26,27'den izole etmek için en çok kullanılan tekniktir. Buna karşılık, diğer yöntemler arasında santrifüjlü elütriasyon ve seçici adezyon bazlı ayırma22,28,29 bulunur. İmmünomanyetik olmayan yöntemlerin yüksek LSEC verimi sağladığı gösterilmiştir (fare başına yaklaşık 9 x 106 hücre)11. Bu nedenle, izole LSEC'lerin nispeten daha düşük bir verimi, mevcut protokolün bir sınırlaması olabilir. Öte yandan, immünomanyetik olmayan seleksiyona dayalı yöntemler yüksek teknik uzmanlık gerektirir ve bazen hücre verimi ve saflıkları üzerinde tutarsız sonuçlar gösterir11, immünomanyetik seleksiyona dayalı yöntem ise mevcut diğer yöntemlere göre tutarlı verim ve saflık avantajına sahiptir. Ayrıca, immünomanyetik boncuk seçimine dayalı hücre izolasyonu için, kullanılan hücre yüzey belirteçlerinin özgüllüğü her zaman endişe vericidir. Örneğin, daha önce immünomanyetik LSEC ayrımı için bir belirteç olarak kullanılan CD31, PV endotel ve kapillarize LSEC'ler3 üzerinde baskın olarak eksprese edilir. CD146'nın doğal öldürücü hücreler ve hepatik yıldız hücreleri30,31 üzerinde de eksprese edildiği bildirilmiş olmasına rağmen, bu protokol kullanılarak izole edilen LSEC'lerin yüksek saflığı, endotel belirteci CD146'nın özgüllüğü ile ilgili endişeleri hafifletmektedir. LSEC izolasyonu için çeşitli metodolojilerin artılarının ve eksilerinin karşılaştırılması başka bir yerde tartışılmaktadır11,18,32. Hücre verimlerinin ve saflıklarının diğer yöntemler ve bu yöntem arasında karşılaştırılması, mevcut makalenin kapsamı dışındadır ve gelecekteki araştırmaları garanti eder.
Sonuç olarak, en yaygın kullanılan ve kabul gören yaklaşımlardan birine dayanan birincil fare LSEC izolasyon protokolünü sunuyoruz. İzole LSEC'ler yüksek saflık ve korunmuş fonksiyon gösterir. Dahası, bu protokol etkilidir ve sağlıklı fare karaciğerinin yanı sıra farklı hastalık fare modellerinden gelen karaciğere de uygulanabilir. Bu farelerden elde edilen yüksek kaliteli LSEC'ler, multiomik veri seti nesli13,14 için kullanılabilir. Bu nedenle, bu yaklaşım LSEC'in işlevini düzenleyen moleküler mekanizmaların tanımlanmasını kolaylaştırır ve sağlık ve hastalıkta karaciğerde hücreler arası iletişimdeki rollerini anlamamızı geliştirir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Tüm yazarların açıklayacağı herhangi bir çatışma yoktur.
Acknowledgments
Bu çalışma, NIH Ulusal Diyabet ve Sindirim ve Böbrek Hastalıkları Enstitüsü (1RO1DK122948'den SHI'ye) ve NIH Silvio O. Conte Sindirim Hastalıkları Araştırma Çekirdek Merkezleri P30 hibe mekanizması (DK084567) tarafından desteklenmiştir. Japonya Bilimi Geliştirme Derneği (JSPS) Denizaşırı Araştırma Bursu tarafından KF'ye de destek sağlandı. Ayrıca Dr. Gregory J. Gores ve Steven Bronk'a kollajenaz perfüzyon aparatının orijinal tasarımı ve optimizasyonu için teşekkür ederiz.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2.0-inch 20 G Intra Venous (IV) catheter | Terumo, SOmerset, NJ, USA | SR-OX2051CA | |
| 2–3-inch perfuion tray with a hole in the center | customized; made in house | ||
| 405/520 viability dye | Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany | 130-110-205 | |
| 4-inch regular curved dressing forceps | Fisher Brand | FS16-100-110 | |
| 5-0 Perma-Hand silk suture | Ethicon, Raritan, NJ, USA | A182H | |
| Anti-stabilin-2 (Mouse) mAb-Alexa Fluorà 488 | MBL International, Woburn, MA, USA | D317-A48 | |
| BSA stock | Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany | 130-091-376 | |
| Anti-CD146 (LSEC)-PE, anti-mouse | Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany | 130-118-407 | |
| CD146 (LSEC) MicroBeads, mouse | Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany | 130-092-007 | |
| Anti-CD45-Viogreen, anti-mouse | Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany | 130-110-803 | |
| Collagen type I | Corning, Corning, NY, USA | 354236 | |
| Collagenase II | Gibco, Waltham, MA, USA | 17101-015 | |
| Endothelial cells growth medium | ScienCell Research Laboratories, Carlsbad, CA, USA | 211-500 | |
| FcR blocking reagent, mouse | Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany | 130-092-575 | |
| FlowJo software, version 10.6 | Becton, Dickinson and Company | ||
| Hardened Fine scissors | F.S.T, Foster city, CA, USA | 14091-11 | |
| Heated (37 °C) and humidified recirculating perfusion apparatus equipped with Oxygen injection at a rate of 10psi. | customized; made in house | ||
| Hitachi S 4700 scanning electron microscope | Hitachi Inc, Pleasanton, CA, USA | SEM096 | |
| LS columns | Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany | 130-042-401 | |
| MACS pre-separation filters (70 μm) | Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany | 130-095-823 | |
| MACS rinsing buffer | Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany | 130-091-222 | |
| MACS Smart Strainer (70 μm) | Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany | 130-098-462 | |
| MACSQunt flow cytometer | Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany | ||
| Millicell Cell Culture Insert | Millipore Sigma, Burlington, MA, USA | PITP01250 | |
| Nexcelom cell counter | Nexcelom bioscience, Lawrence, MA, USA | Cellometer Auto T4 Plus | |
| Percoll | GE Healthcare, Chicago, IL, USA | 17-0891-01 | |
| Surgical scissors | F.S.T, Foster city, CA, USA | 14001-12 | |
| Very small curved dressing forceps | F.S.T, Foster city, CA, USA | 11063-07 |
References
- Morin, O., Goulet, F., Normand, C. Liver sinusoidal endothelial cells: isolation, purification, characterization and interaction with hepatocytes. Revisiones Sobre Biologia Celular: RBC. 15, 1-85 (1988).
- Ibrahim, S. H. Sinusoidal endotheliopathy in nonalcoholic steatohepatitis: therapeutic implications. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 321 (1), 67-74 (2021).
- Poisson, J., et al. Liver sinusoidal endothelial cells: Physiology and role in liver diseases. Journal of Hepatology. 66 (1), 212-227 (2017).
- Marrone, G., Shah, V. H., Gracia-Sancho, J. Sinusoidal communication in liver fibrosis and regeneration. Journal of Hepatology. 65 (3), 608-617 (2016).
- Shetty, S., Lalor, P. F., Adams, D. H. Liver sinusoidal endothelial cells - gatekeepers of hepatic immunity. Nature Reviews Gastroenterology & Hepatology. 15 (9), 555-567 (2018).
- Smedsrød, B., Pertoft, H., Gustafson, S., Laurent, T. C. Scavenger functions of the liver endothelial cell. Biochemical Journal. 266 (2), 313-327 (1990).
- DeLeve, L. D. Liver sinusoidal endothelial cells in hepatic fibrosis. Hepatology. 61 (5), 1740-1746 (2015).
- Dar, W. A., Sullivan, E., Bynon, J. S., Eltzschig, H., Ju, C. Ischaemia reperfusion injury in liver transplantation: Cellular and molecular mechanisms. Liver International. 39 (5), 788-801 (2019).
- Furuta, K., Guo, Q., Hirsova, P., Ibrahim, S. H. Emerging Roles of Liver Sinusoidal Endothelial Cells in Nonalcoholic Steatohepatitis. Biology. 9 (11), Basel. 395 (2020).
- Wu, L. Q., et al. Phenotypic and functional differences between human liver cancer endothelial cells and liver sinusoidal endothelial cells. Journal of Vascular Research. 45 (1), 78-86 (2008).
- Meyer, J., Gonelle-Gispert, C., Morel, P., Bühler, L. Methods for isolation and purification of murine liver sinusoidal endothelial cells: A systematic review. PLoS One. 11 (3), 0151945 (2016).
- Meyer, J., Lacotte, S., Morel, P., Gonelle-Gispert, C., Buhler, L. An optimized method for mouse liver sinusoidal endothelial cell isolation. Experimental Cell Research. 349 (2), 291-301 (2016).
- Furuta, K., et al. Lipid-induced endothelial vascular cell adhesion molecule 1 promotes nonalcoholic steatohepatitis pathogenesis. Journal of Clinical Investigation. 131 (6), (2021).
- Guo, Q., et al. Integrin β(1)-enriched extracellular vesicles mediate monocyte adhesion and promote liver inflammation in murine NASH. Journal of Hepatology. 71 (1), 1193-1205 (2019).
- Hirsova, P., Ibrahim, S. H., Bronk, S. F., Yagita, H., Gores, G. J. Vismodegib suppresses TRAIL-mediated liver injury in a mouse model of nonalcoholic steatohepatitis. PLoS One. 8 (7), 70599 (2013).
- Schrage, A., et al. Murine CD146 is widely expressed on endothelial cells and is recognized by the monoclonal antibody ME-9F1. Histochemistry and Cell Biology. 129 (4), 441-451 (2008).
- Olsavszky, V., et al. Exploring the transcriptomic network of multi-ligand scavenger receptor Stabilin-1- and Stabilin-2-deficient liver sinusoidal endothelial cells. Gene. 768, 145284 (2021).
- DeLeve, L. D., Maretti-Mira, A. C. Liver sinusoidal endothelial cell: An update. Seminars in Liver Disease. 37 (4), 377-387 (2017).
- DeLeve, L. D., Wang, X., Hu, L., McCuskey, M. K., McCuskey, R. S. Rat liver sinusoidal endothelial cell phenotype is maintained by paracrine and autocrine regulation. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 287 (4), 757-763 (2004).
- Cabral, F., et al. Purification of hepatocytes and sinusoidal endothelial cells from mouse liver perfusion. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (132), e56993 (2018).
- Ishiguro, K., Yan, I. K., Patel, T. Isolation of tissue extracellular vesicles from the liver. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (150), e58649 (2019).
- Topp, S. A., Upadhya, G. A., Strasberg, S. M. Cold preservation of isolated sinusoidal endothelial cells in MMP 9 knockout mice: effect on morphology and platelet adhesion. Liver Transplantation. 10 (8), 1041-1048 (2004).
- Katz, S. C., Pillarisetty, V. G., Bleier, J. I., Shah, A. B., DeMatteo, R. P. Liver sinusoidal endothelial cells are insufficient to activate T cells. Journal of Immunology. 173 (1), 230-235 (2004).
- Liu, W., et al. Sample preparation method for isolation of single-cell types from mouse liver for proteomic studies. Proteomics. 11 (17), 3556-3564 (2011).
- Do, H., Healey, J. F., Waller, E. K., Lollar, P. Expression of factor VIII by murine liver sinusoidal endothelial cells. Journal of Biological Chemistry. 274 (28), 19587-19592 (1999).
- Schrage, A., et al. Enhanced T cell transmigration across the murine liver sinusoidal endothelium is mediated by transcytosis and surface presentation of chemokines. Hepatology. 48 (4), 1262-1272 (2008).
- Chou, C. H., et al. Lysophosphatidic acid alters the expression profiles of angiogenic factors, cytokines, and chemokines in mouse liver sinusoidal endothelial cells. PLoS One. 10 (3), 0122060 (2015).
- Deleve, L. D. Dacarbazine toxicity in murine liver cells: a model of hepatic endothelial injury and glutathione defense. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 268 (3), 1261-1270 (1994).
- Smedsrød, B., Pertoft, H., Eggertsen, G., Sundström, C. Functional and morphological characterization of cultures of Kupffer cells and liver endothelial cells prepared by means of density separation in Percoll, and selective substrate adherence. Cell and Tissue Research. 241 (3), 639-649 (1985).
- Despoix, N., et al. Mouse CD146/MCAM is a marker of natural killer cell maturation. European Journal of Immunology. 38 (10), 2855-2864 (2008).
- Strauss, O., Phillips, A., Ruggiero, K., Bartlett, A., Dunbar, P. R. Immunofluorescence identifies distinct subsets of endothelial cells in the human liver. Scientific Reports. 7, 44356 (2017).
- Halpern, K. B., et al. Paired-cell sequencing enables spatial gene expression mapping of liver endothelial cells. Nature Biotechnology. 36 (10), 962-970 (2018).
