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Immunology and Infection

पीसीआर-प्लेट डीप वेल माइक्रोप्लेट उपकरणों का उपयोग करके ग्रेटर बैक्टीरियल बायोफिल्म बायोमास की पीढ़ी

Published: April 22, 2022 doi: 10.3791/63069
Automatic Translation
1, 1, 1,2, 1,2, 1
1Department of Medical Microbiology and Infectious Diseases, University of Manitoba, 2National Microbiology Laboratory, Public Health Agency of Canada

Summary

यह प्रोटोकॉल बायोफिल्म विकास और बायोमास माप करने के लिए पद्धति प्रस्तुत करता है, जिसमें उच्च-थ्रूपुट 96-अच्छी तरह से पेग किए गए ढक्कन स्थैतिक बायोफिल्म स्क्रीनिंग के लिए स्व-इकट्ठा गहरी अच्छी तरह से पीसीआर-प्लेट उपकरणों का उपयोग किया जाता है।

Abstract

बैक्टीरियल बायोफिल्म्स को पारंपरिक रोगाणुरोधी हस्तक्षेपों का उपयोग करके सतहों से मिटाना मुश्किल है। उच्च-थ्रूपुट 96-अच्छी तरह से माइक्रोप्लेट विधियों का उपयोग अक्सर कम से कम बायोफिल्म उन्मूलन एकाग्रता (MBEC) मूल्यों की गणना करने के लिए तेजी से रोगाणुरोधी संवेदनशीलता परीक्षण के लिए बैक्टीरियल बायोफिल्म्स की खेती करने के लिए किया जाता है। मानक बायोफिल्म उपकरणों में पॉलीस्टीरीन पेग्ड-ढक्कन होते हैं जो 96-अच्छी तरह से माइक्रोप्लेटों में फिट होते हैं और बायोफिल्म बायोमास और एमबीईसी मूल्यों को मापने के लिए आदर्श होते हैं, लेकिन ये उपकरण बायोमास संचय और लागत के लिए उपलब्ध खूंटी सतह क्षेत्र द्वारा सीमित होते हैं। यहां, हम स्व-इकट्ठे पॉलीप्रोपाइलीन 96-अच्छी तरह से गहरी अच्छी तरह से पीसीआर-प्लेट पेग्ड-ढक्कन डिवाइस का उपयोग करने के लिए एक प्रोटोकॉल की रूपरेखा तैयार करते हैं ताकि एस्चेरिचिया कोलाई बीडब्ल्यू 25113 और स्यूडोमोनास एरुगिनोसा पीएओ 1 बायोफिल्म्स विकसित किया जा सके। क्रिस्टल वायलेट बायोमास धुंधला और MBEC निर्धारण assays का उपयोग कर प्रत्येक प्रजाति द्वारा मानक और गहरी अच्छी तरह से उपकरणों पर गठित 24 घंटे biofilms की तुलना का वर्णन कर रहे हैं. गहरी अच्छी तरह से उपकरणों के बड़े सतह क्षेत्र ने उम्मीद की थी कि दोनों प्रजातियों द्वारा समग्र बायोफिल्म गठन में 2-4 गुना वृद्धि हुई है। पी एरुगिनोसा ने मानक डिवाइस की तुलना में गहरे कुएं के खूंटे पर काफी अधिक बायोमास / एमएम 2 का गठन किया। ई कोलाई में गहरे कुएं के उपकरण की तुलना में मानक पॉलीस्टीरीन उपकरणों पर अधिक बायोमास / एमएम 2 था। सोडियम हाइपोक्लोराइट (ब्लीच) या बेंजाल्कोनियम क्लोराइड (बीजेडके) जैसे कीटाणुनाशकों के साथ बायोफिल्म उन्मूलन assays से पता चला है कि दोनों यौगिक दोनों उपकरणों से ई कोलाई और पी एरुगिनोसा बायोफिल्म्स को खत्म कर सकते हैं, लेकिन अलग-अलग एमबीईसी मूल्यों पर। BZK बायोफिल्म उन्मूलन के परिणामस्वरूप उपकरणों के बीच चर ई कोलाई MBEC मूल्यों में परिणाम हुआ, हालांकि, ब्लीच ने प्रजातियों और उपकरणों दोनों के लिए पुनरुत्पादक MBEC मूल्यों का प्रदर्शन किया। यह अध्ययन डाउनस्ट्रीम अध्ययनों के लिए पॉलीप्रोपाइलीन उपकरणों पर बायोफिल्म की बड़ी मात्रा में वृद्धि के लिए एक उच्च थ्रूपुट डीप वेल विधि प्रदान करता है जिसमें उच्च मात्रा में स्थैतिक बायोफिल्म की आवश्यकता होती है।

Introduction

स्यूडोमोनास एरुगिनोसा और एस्चेरिचिया कोलाई ग्राम-नकारात्मक प्रोटिओबैक्टीरिया हैं जो आमतौर पर बायोफिल्म्स 1 के रूप में जाने जाने वाले सेसिल, सतह से जुड़े सेल समुदायों को बनाने की उनकी क्षमता के लिए अध्ययन किए जाते हैं। दोनों प्रजातियां, जब बायोफिल्म्स के रूप में बढ़ती हैं, तो मुख्य रूप से विभिन्न पॉलीसेकेराइड और प्रोटीन से बने एक्स्ट्रासेल्युलर पॉलिमेरिक पदार्थों (ईपीएस) के मैट्रिक्स का स्राव कर सकती हैं, जिसमें एक्स्ट्रासेल्युलर डीएनए और / या लिपिड भी शामिल हो सकते हैं, जो अतिरिक्त सेलुलर सुरक्षा प्रदान करते हैं और कठोर, पोषक तत्व-सीमित वातावरण में बढ़ी हुई उत्तरजीविता प्रदान करते हैं2,3। बायोफिल्म फिजियोलॉजी और दोनों प्रजातियों द्वारा गठन नैदानिक प्रासंगिकता का है, क्योंकि वे कनाडा में अस्पताल के रोगी रक्त, मूत्र पथ और फेफड़ों के संक्रमण से शीर्ष पांच सबसे अधिक अलग-थलग रोगाणुरोधी प्रतिरोधी रोगजनकों का प्रतिनिधित्व करते हैं। यह भी ध्यान रखना महत्वपूर्ण है कि बायोफिल्म्स को इन जीवाणु प्रजातियों के कारण होने वाले सभी पुराने और आवर्तक संक्रमणों का लगभग 80% बनाने का अनुमान है। स्रावित ईपीएस पदार्थों और धीमी चयापचय गतिविधि 7,8 के कारण, स्थापित बायोफिल्म्स को मिटाना अधिक कठिन हो जाता है जब वे प्रत्यारोपित चिकित्सा उपकरणों, निशान ऊतकों और सिस्टिक फाइब्रोसिस रोगियों के फेफड़ों में सतहों पर बनते हैं9,10, उनके रोगाणुरोधी प्रतिरोध को जोड़ते हैं।

बैक्टीरियल बायोफिल्म्स के अड़ियल विकास गुण अक्सर उन्हें रोगाणुरोधी निषेध और / या उन्मूलन 2,9 के लिए अधिक प्रतिरोधी बनाते हैं। इस प्रकार, बैक्टीरियल बायोफिल्म रोगाणुरोधी उन्मूलन का अध्ययन करने के लिए इन विट्रो विधियों की स्थापना संक्रमण को खत्म करने के लिए प्रभावी यौगिकों का चयन करने के लिए सर्वोपरि है जब वे चिकित्सा प्लास्टिक (जैसे, इन-निवास कैथेटर) और चिकित्सा प्रत्यारोपण पर बनते हैं। सबसे तेजी से इन विट्रो बायोफिल्म रोगाणुरोधी उन्मूलन संस्कृति के तरीके "निरंतर" संस्कृतियों के बजाय "स्थिर" बायोफिल्म संस्कृति के रूप में बायोफिल्म विकास की जांच करते हैं, जहां स्थिर जीवाणु विकास की निगरानी एक ही विकास माध्यम में एक छोटी (24-96 ज) समय सीमा पर बायोफिल्म गठन के शुरुआती से देर के चरणों में की जाती है। निरंतर बायोफिल्म विधियां तेजी से विश्लेषण के लिए बोझिल हैं क्योंकि उन्हें कक्षों में उगाए गए लंबे समय तक बायोफिल्म विकास की आवश्यकता होती है जो कम प्रतिकृतियों के साथ विकास मीडिया के निरंतर प्रवाह और प्रतिस्थापन की अनुमति देते हैं। निरंतर बायोफिल्म्स को बनाए रखने और स्थापित करने के लिए आवश्यक समय और प्रयास के कारण, स्थैतिक इन विट्रो बायोफिल्म्स सबसे लोकप्रिय हैं, क्योंकि वे आसानी से प्लास्टिक 96-वेल माइक्रोटिटर प्लेटों में उच्च-थ्रूपुट रोगाणुरोधी संवेदनशीलता परीक्षण के लिए अनुकूलित होते हैं, बजाय विस्तृत प्रवाह कक्ष प्रणालियों के जो संस्कृतियों की संख्या को सीमित करते हैं एक साथ परीक्षण किए गए 12,13 . सबसे सरल स्थैतिक "इन-वेल" बायोफिल्म माइक्रोप्लेट assays मानक polystyrene या vinyl (300 μL क्षमता) माइक्रोटिटर प्लेटों का उपयोग करने के लिए पक्षों और प्रत्येक अच्छी तरह से नीचे biofilm गठन को मापने के लिए और अक्सर तरल सतह इंटरफ़ेस के लिए हवा में छल्ले के रूप में। बैक्टीरियल इन-वेल बायोफिल्म गठन को विकास माध्यम तरल को हटाने और बायोफिल्म्स को धोने के बाद कुओं का पालन करने वाले जमा बायोमास को धुंधला करके मापा जाता है12,13। ये assays आर्थिक रूप से लोकप्रिय हैं, लेकिन अक्सर उनके अंतर्निहित डिजाइन के कारण reproducibility मुद्दों है, के रूप में जमा biofilms सेल वसूली और बायोमास धुंधला प्रक्रियाओं के लिए rinsing के दौरान क्षति या नुकसान के लिए प्रवण हैं11,14.

बायोफिल्म नुकसान को कम करने के लिए, मानक वाणिज्यिक बायोफिल्म उपकरणों ने मानक 96 इन-वेल प्लेट डिजाइन में एक डालने योग्य 96-अच्छी तरह से पेग किए गए पॉलीस्टीरीन ढक्कन को जोड़कर इन-वेल बायोफिल्म माइक्रोप्लेट डिजाइनों में सुधार किया है, जिसे "मानक बायोफिल्म डिवाइस" के रूप में जाना जाता है। एक pegged ढक्कन के अलावा प्रत्येक माइक्रोप्लेट अच्छी तरह से में उपलब्ध सतह क्षेत्र का विस्तार करता है, बढ़ाया सतह पालन और biofilm बायोमास गठन के लिए अनुमति देता है15,16. मानक बायोफिल्म पेग्ड ढक्कन उपकरण बाद के रोगाणुरोधी बायोफिल्म संवेदनशीलता और उन्मूलन परीक्षण के लिए अधिक से अधिक बायोफिल्म वसूली, हटाने और धोने की अनुमति देते हैं जब पेग किए गए ढक्कन को दवा या विकास की स्थिति की चुनौतियों वाले नए माइक्रोटिटर प्लेटों में डाला जाता है। इन-वेल बायोफिल्म माइक्रोप्लेट तकनीकों के समान, हटाए गए और धोए गए पेग किए गए ढक्कन उपकरणों से बरामद सामग्री सेल अस्तित्व परीक्षण और बायोफिल्म बायोमास स्टेनिंग के लिए अनुमति देती है, जिसमें आमतौर पर क्रिस्टल वायलेट (सीवी) डाई फॉर्मूलेशन शामिल होते हैं 17,18,19। मानक बायोफिल्म उपकरण भी बायोफिल्म रोगाणुरोधी संवेदनशीलता की स्क्रीनिंग के लिए इष्टतम हैं। ये assays दो तरीकों से biofilm विकास निषेध की निगरानी करते हैं: 1) जब रोगाणुरोधी को विकास की शुरुआत में कोशिकाओं में जोड़ा जाता है, तो यह न्यूनतम बायोफिल्म निषेध एकाग्रता (MBIC) मूल्य निर्धारित कर सकता है। 2) जब स्थापित बायोफिल्म्स 24 घंटे के बाद खूंटे पर बनते हैं और फिर रोगाणुरोधी के संपर्क में आते हैं, तो यह न्यूनतम बायोफिल्म उन्मूलन एकाग्रता (MBEC) मूल्य 17,20 निर्धारित कर सकता है। इन-वेल बायोफिल्म माइक्रोप्लेट उपकरणों के समान, मानक बायोफिल्म उपकरणों में कुछ उल्लेखनीय सीमाएं होती हैं, जैसे कि प्रति डिवाइस उनकी उच्च लागत, वे गैर-स्व-स्व-दावा योग्य हैं, और पॉलीस्टीरीन प्लेट सामग्री के कारण रासायनिक सॉल्वैंट्स के लिए कम टिकाऊ हैं। मानक बायोफिल्म उपकरणों में खूंटी अनुपात के लिए एक कम सतह क्षेत्र भी होता है, जो प्रत्येक कुएं में अधिकतम काम करने की मात्रा को 200 μL तक सीमित करता है। ये कारक मानक बायोफिल्म उपकरणों को उन अध्ययनों के लिए उपयोग करने के लिए अधिक चुनौतीपूर्ण बना सकते हैं जो उच्च-थ्रूपुट प्रारूप में बायोफिल्म की अधिक मात्रा की मांग करते हैं।

यहां, हम व्यावसायिक रूप से उपलब्ध पॉलीप्रोपाइलीन अर्ध-स्कर्ट 0.5 एमएल 96-अच्छी तरह से पीसीआर प्लेटों का उपयोग करके हमारी प्रयोगशाला में विकसित एक स्थिर बायोफिल्म पेग्ड-ढक्कन 96-अच्छी तरह से विधि का वर्णन करते हैं, जो मानक प्लेट (सामग्री की तालिका) से गहरे कुएं वाले कुओं वाले 96-अच्छी तरह से माइक्रोटिटर प्लेटों में फिट होती हैं। इन इकट्ठे किए गए उपकरणों में 750 μL की अधिकतम काम करने की मात्रा होती है जब इसका उपयोग बढ़ते बायोफिल्म के लिए किया जाता है (यहां "डीप वेल बायोफिल्म डिवाइस" के रूप में जाना जाता है)। इन गहरे अच्छी तरह से बायोफिल्म उपकरणों का उपयोग करने के फायदे मानक बायोफिल्म उपकरणों की तुलना में उनकी कम लागत हैं, उन्हें ऑटोक्लेविंग द्वारा निष्फल किया जा सकता है, और वे बड़े बाहरी पीसीआर-प्लेट "ट्यूब / पेग्स" पर बायोफिल्म गठन के लिए सतह क्षेत्र को बढ़ाते हैं। इस विधि के साथ हम बढ़ते और Escherichia कोलाई BW25113 और पी. aeruginosa PAO1 द्वारा गठित biofilm बायोमास की विशेषता के लिए इन उपकरणों के अनुप्रयोगों को दिखाने. बायोफिल्म उन्मूलन assays का उपयोग कर MBEC मूल्यों को निर्धारित करने के तरीकों को चतुर्भुज अमोनियम यौगिक कीटाणुनाशक benzalkonium क्लोराइड (BZK) और सोडियम hypochlorite (ब्लीच) रोगाणुरोधी का उपयोग कर वर्णित कर रहे हैं। एंटीसेप्टिक / कीटाणुनाशक बीजेडके का चयन किया गया था क्योंकि इस यौगिक का उपयोग अक्सर दूषित सतहों से बायोफिल्म्स को बाधित करने के लिए किया जाता है, लेकिन यह अच्छी तरह से स्थापित बायोफिल्म्स 21 को खत्म करने में कथित तौर पर कम प्रभावी है। ब्लीच स्थापित बायोफिल्म्स के उन्मूलन के लिए एक अत्यधिक प्रभावी रसायन है और रासायनिक कीटाणुशोधन 22 में एक मुख्य आधार है। दोनों कीटाणुनाशक प्रत्येक बायोफिल्म डिवाइस 21 के लिए MBEC मूल्यों की एक उपयोगी तुलना प्रदान करते हैं। इस biofilm डिवाइस मूल्यांकन के लिए CV धुंधला और MBEC निर्धारण के लिए biofilm उन्मूलन assays का उपयोग कर के लिए एक प्रोटोकॉल इस लेख में संक्षेप में है. इन विधियों के लिए वर्कफ़्लो के सरलीकृत अवलोकन के लिए एक प्रोटोकॉल फ़्लोचार्ट शामिल किया गया है (चित्र1).

Protocol

1. Biofilm विकास के लिए एसेप्टिक संस्कृति की तैयारी (दिन 0-1)

  1. दिन 0 पर, एक क्रायो-संरक्षित स्टॉक (ग्लिसरॉल या डाइमिथाइलसल्फोक्साइड (डीएमएसओ) में) से परीक्षण के लिए वांछित जीवाणु तनाव (ओं) को सीधे रोगाणुरोधी चयन के साथ एक पोषक तत्व अगर प्लेट पर लकीर दें क्योंकि तनाव की आवश्यकता होती है। तनाव वृद्धि के लिए इष्टतम तापमान (37 डिग्री सेल्सियस) और समय (18-22 ज) पर आगर प्लेटों को इनक्यूबेट करें।
  2. अगले दिन (दिन 1), इष्टतम विकास की स्थिति में विकास मीडिया के 5 मिलीलीटर में आगर प्लेट से एक कॉलोनी को टीका लगाएं। इन संस्कृतियों का उपयोग बायोफिल्म उपकरणों के लिए टीकाकरण शुरू करने वाले दिन 2 के रूप में किया जाएगा (चरण 2.2 देखें; चित्र1)।
    नोट: इस अध्ययन के लिए, ई कोलाई K-12 BW21153 और P. aeruginosa PAO1 लुरिया-Bertani (LB) माध्यम में 18 घंटे के लिए 18 h के लिए 37 °C पर 160 क्रांतियों प्रति मिनट (rpm) पर मिलाते हुए के साथ उगाया गया था।
    1. कम से कम 3 स्वतंत्र रूप से सुसंस्कृत उपभेदों को तैयार करने के लिए biofilm माप के लिए जैविक प्रतिकृति उत्पन्न करने के लिए पेग ढक्कन उपकरणों पर biofilm बायोमास गठन की सांख्यिकीय परिवर्तनशीलता के कारण.

2. प्लेटों की तैयारी और टीका (दिन 2)

  1. 750 μL / अच्छी तरह से बाँझ पानी (चित्रा 2A) के साथ एक ऑटोक्लेव्ड 96-अच्छी तरह से, 1.1 मिलीलीटर / अच्छी तरह से पॉलीप्रोपाइलीन प्लेट के बाहरी कुओं को भरें। नकारात्मक नियंत्रण कुओं (uninoculated मीडिया कुओं; स्तंभ बी) 750 μL विकास मीडिया और 675 μL विकास मीडिया के साथ शेष कुओं के साथ भरें।
    नोट: ऊपर चरण 2.1 और नीचे दिए गए चरण गहरी अच्छी तरह से biofilm डिवाइस के लिए उपयुक्त वॉल्यूम सूचीबद्ध करें। यदि मानक बायोफिल्म डिवाइस का उपयोग कर रहे हैं, तो वॉल्यूम को निम्नानुसार बदला जाना है: 20 μL करने के लिए इनोकुलम संस्कृति के 75 μL; 180 μL के लिए विकास मीडिया के 675 μL; 200 μL करने के लिए बाँझ पानी / विकास मीडिया के 750 μL; CV दाग / एसिटिक एसिड / कुल्ला समाधान के 800 μL 210 μL करने के लिए। इसके अतिरिक्त, नीचे चरण 3.6 के लिए, 500nm (A550 nm) पर Absorbance सीधे polystyrene माइक्रोप्लेट में पढ़ा जा सकता है जब मानक biofilm डिवाइस माइक्रोप्लेट का उपयोग करते समय मिश्रण के बाद।
  2. दिन 1 रातोंरात संस्कृतियों का उपयोग करते हुए, संस्कृतियों को 600 एनएम (OD600nm) = 1.0 पर ऑप्टिकल घनत्व के लिए या 0.5-1 इकाइयों के मैकफारलैंड मानक के लिए मानकीकृत करें।
  3. टेस्ट ट्यूबों में प्रत्येक मानकीकृत संस्कृति का 10 गुना सीरियल कमजोर पड़ने या 96-अच्छी तरह से गहरी अच्छी तरह से माइक्रोटिटर प्लेट बनाएं जब तक कि 10-3 कमजोर पड़ने तक नहीं पहुंच जाता है।
  4. 10-4 के अंतिम इन-वेल बैक्टीरियल कमजोर पड़ने के लिए 1 x 10-3 पतला संस्कृति के 75 μL के साथ चित्र2B में दिखाए गए कुओं वाले मीडिया को संक्रमित करें।
  5. ध्यान से संक्रमित गहरी अच्छी तरह से प्लेट में एक autoclaved पीसीआर प्लेट (pegged ढक्कन) डालें। इष्टतम तनाव की स्थिति (37 डिग्री सेल्सियस) पर प्लेटों को हिलाने के साथ (अधिकतम 160 आरपीएम) एक इनक्यूबेटर में 24 घंटे के लिए 50-60% आर्द्रता के साथ इनक्यूबेट करें।

3. सीवी धुंधला (दिन 3) का उपयोग कर उपकरणों से Biofilm बायोमास निर्धारण

  1. Aseptically प्रत्येक डिवाइस से biofilm pegged ढक्कन निकालें और एक autoclaved गहरी अच्छी तरह से 800 μL बाँझ फॉस्फेट buffered खारा (PBS) के साथ तैयार प्लेट में डालने के द्वारा कुल्ला /
  2. बायोमास सीवी स्टेनिंग के लिए, 800 μL / अच्छी तरह से 0.1% (डब्ल्यू / वी) सीवी के साथ तैयार एक नई प्लेट में पेग किए गए पीसीआर प्लेट ढक्कन को स्थानांतरित करें dH2O और 5 मिनट के लिए दाग।
  3. 800 μL / अच्छी तरह से बाँझ PBS के साथ तैयार एक गहरी अच्छी तरह से प्लेट में पेग ढक्कन को धोकर अतिरिक्त दाग को हटा दें। प्लेटों को ऊपर की ओर सामना करने वाले खूंटे के साथ एक जैव सुरक्षा कैबिनेट में 10 मिनट के लिए सूखने की अनुमति दें।
  4. सूखे पीसीआर प्लेट ढक्कन को 800 μL / अच्छी तरह से 30% (v / v) एसिटिक एसिड वाली प्लेट में स्थानांतरित करें और ढक्कन को 5 मिनट के लिए डी-स्टेन करने की अनुमति दें।
  5. destained पीसीआर खूंटी ढक्कन निकालें और pipetting द्वारा समाधान अच्छी तरह से मिश्रण. गहरी अच्छी तरह से प्लेटों से एक मानक 96 अच्छी तरह से माइक्रोप्लेट के लिए 200 μL हस्तांतरण और एक पराबैंगनी (यूवी) / दृश्यमान (विस) रेंज माइक्रोप्लेट रीडर में 550 एनएम (A550nm) की तरंग दैर्ध्य पर डी-स्टेनिंग समाधान के अवशोषण को मापने।
  6. मापा A550nm मानों का उपयोग करते हुए, प्रत्येक biofilm नमूना मान से औसत रिक्त (नकारात्मक नियंत्रण) A550nm मान घटाएँ। औसत प्रत्येक रिक्त-घटाया A550nm बायोफिल्म नमूना मूल्य नमूना जैविक प्रतिकृति का प्रतिनिधित्व करते हैं।

4. रोगाणुरोधी के साथ biofilms चुनौतीपूर्ण उनके 24 ज रोगाणुरोधी MBEC मूल्य (दिन 3) की गणना करने के लिए

  1. पानी में एक रोगाणुरोधी स्टॉक समाधान तैयार करें जो परीक्षण करने के लिए वांछित उच्चतम रोगाणुरोधी एकाग्रता की एकाग्रता का दो गुना (2x) है।
  2. 2x केंद्रित विकास मीडिया में रोगाणुरोधी स्टॉक समाधान की दो गुना कमजोर पड़ने की श्रृंखला बनाएं ताकि 8 रोगाणुरोधी सांद्रता हो।
  3. जैसा कि चित्र 2B में दिखाया गया है, 750 μL / अच्छी तरह से बाँझ पानी के साथ एक ऑटोक्लेव्ड गहरी अच्छी तरह से प्लेट के बाहरी कुओं को भरें। 750 μL / अच्छी तरह से विकास मीडिया के साथ प्लेट के कॉलम बी (नकारात्मक नियंत्रण; कोई बैक्टीरिया नहीं) और सी (सकारात्मक नियंत्रण; कोई रोगाणुरोधी जोखिम) भरें। रोगाणुरोधी कमजोर पड़ने की श्रृंखला के 750 μL / अच्छी तरह से शेष कुओं को भरें जैसा कि चित्र 2 B में दिखाया गया है।
  4. निकालें और कदम 3.1 में वर्णित के रूप में pegged ढक्कन कुल्ला और उन्हें रोगाणुरोधी चुनौती प्लेट में स्थानांतरित.
  5. उचित तनाव की स्थिति में और वांछित जोखिम समय सीमा के लिए मिलाते हुए (अधिकतम 160 आरपीएम) के साथ प्लेटों को इनक्यूबेट करें।

5. पेग ढक्कन से बायोफिल्म बायोमास की वसूली (दिन 4)

  1. रोगाणुरोधी उजागर pegged ढक्कन निकालें और कुल्ला के रूप में चरण 3.1 में वर्णित है. आंतरिक कुओं में 750 μL / अच्छी तरह से वसूली मीडिया और बाहरी कुओं में 750 μL / अच्छी तरह से बाँझ dH2O के साथ एक गहरी अच्छी तरह से प्लेट के लिए पेग ढक्कन स्थानांतरित करें।
    1. 70 mL रिकवरी मीडिया तैयार करने के लिए, 2x केंद्रित LB के 35 mL, 100% tween-20 के 0.7 mL, 20x सार्वभौमिक न्यूट्रलाइज़िंग समाधान के 3.5 mL, और एक बाँझ बोतल में बाँझ dH2O के 30.8 mL को संयोजित करें।
    2. 20x केंद्रित सार्वभौमिक न्यूट्रलाइज़िंग समाधान तैयार करने के लिए, 1.0 ग्राम L-हिस्टिडीन, 1.0 g L-cysteine, और 2.0 g कम ग्लूटाथियोन को dH2O के 20 mL की अंतिम मात्रा में जोड़ें। फ़िल्टर 0.2 μm फ़िल्टर के माध्यम से समाधान को निष्फल करें और 4 °C पर स्टोर करें।
  2. एक sonicating पानी स्नान के अंदर फिट एक माध्यमिक बिन में कदम 5.1 से डिवाइस रखो. वसूली मीडिया में खूंटे से biofilm dislodge करने के लिए 30 मिनट के लिए उपकरणों sonicate.
  3. sonication के बाद, pegged ढक्कन को हटाने और गहरी अच्छी तरह से वसूली मीडिया प्लेट पर एक बाँझ फ्लैट प्लेट कवर ढक्कन जगह. पेग किए गए ढक्कन को छोड़ा जा सकता है।
  4. रात भर इष्टतम तनाव विकास की स्थिति (16-18 ज) पर चरण 5.3 से वसूली मीडिया के साथ प्लेटों को इनक्यूबेट करें।

6. डिवाइस MBEC मानों का निर्धारण (दिन 5)

  1. अगले दिन, एक नए 96-अच्छी तरह से माइक्रोटिटर प्लेट के लिए चरण 5.4 से इनक्यूबेटेड गहरी अच्छी तरह से प्लेट के प्रत्येक कुएं से 200 μL स्थानांतरित करें। एक यूवी / विज़ रेंज माइक्रोप्लेट रीडर का उपयोग करके प्रत्येक अच्छी तरह से OD600nm पढ़ें।
  2. नमूना युक्त प्रत्येक biofilm से नकारात्मक नियंत्रण (uninoculated रिक्त) OD600nm मानों को घटाएं।
  3. OD600nm मानों का उपयोग करके प्रत्येक नमूने के लिए MBEC मान की गणना करें, जहां MBEC मान सबसे कम रोगाणुरोधी एकाग्रता है जिसके परिणामस्वरूप एक विशिष्ट रोगाणुरोधी उपचारित प्रजातियों / तनाव नमूने के लिए सबसे कम OD600nm मान (uninoculated नियंत्रण से अप्रभेद्य) मान होता है।

Representative Results

इस अध्ययन का उद्देश्य गहरी अच्छी तरह से बायोफिल्म उपकरणों का उपयोग करके बड़ी मात्रा, उच्च-थ्रूपुट (96-अच्छी तरह से), स्थैतिक बायोफिल्म डिवाइस माप के संचालन के लिए एक विधि प्रदान करना था। यहां, हमने एक गहरी अच्छी तरह से माइक्रोप्लेट में डाले गए एक स्व-इकट्ठे अर्ध-स्कर्ट वाले पीसीआर-प्लेट की तुलना की, जिसे डीप वेल डिवाइस के रूप में जाना जाता है, एक आमतौर पर उपयोग किए जाने वाले मानक बायोफिल्म पेग्ड ढक्कन डिवाइस की तुलना में स्थैतिक बायोफिल्म बनाने के लिए उनकी क्षमताओं की जांच करने के लिए। CV-दाग बायोमास और biofilm उन्मूलन assays (MBEC) दोनों उपकरणों द्वारा biofilm गठन का आकलन करने के लिए इस्तेमाल किया गया था।

प्रत्येक डिवाइस पर विभिन्न प्रजातियों द्वारा बायोफिल्म गठन की तुलना करने के लिए, हमने बायोफिल्म सीवी स्टेनिंग प्रोटोकॉल 17 का उपयोग करके ई कोलाई बीडब्ल्यू 25113 और पी एरुगिनोसा पीएओ 1 द्वारा गठित बायोफिल्म बायोमास का आकलन किया। यद्यपि CV धुंधला आम तौर पर A550nm मूल्यों के रूप में रिपोर्ट किया जाता है, प्रत्येक डिवाइस और उनके उपलब्ध सतह क्षेत्रों की वृद्धि मात्रा में अंतर के कारण हमने CV दाग A550nm मानों को समाधान में दाढ़ CV सांद्रता में परिवर्तित कर दिया। दाढ़ सीवी सांद्रता प्रत्येक डिवाइस की मात्रा अंतर के लिए जिम्मेदार है और प्रत्येक डिवाइस से बरामद बायोमास का प्रतिनिधित्व करने वाले सीवी सांद्रता की तुलना की अनुमति दी। परिणामों से पता चला है कि दोनों प्रजातियों ने मानक बायोफिल्म डिवाइस (चित्रा 3 ए-बी) की तुलना में गहरे अच्छी तरह से बायोफिल्म उपकरणों (2.1 गुना ई कोलाई; 4.1 गुना पी एरुगिनोसा) पर काफी अधिक बायोमास का उत्पादन किया। मानक डिवाइस खूंटी सतह क्षेत्र (108.9 मिमी 2) की तुलना में गहरे कुएं पीसीआर खूंटी (320.4 मिमी 2) के बड़े सतह क्षेत्र को देखते हुए इस परिणाम की उम्मीद की गई थी। यह खोज मानक डिवाइस कुओं (200 μL) की तुलना में गहरे अच्छी तरह से बायोफिल्म डिवाइस में उपयोग की जाने वाली बढ़ी हुई मात्रा (750 μL) के साथ भी संगत है। इसलिए, गहरे कुएं के उपकरणों ने मानक बायोफिल्म उपकरणों के साथ छोटे खूंटे की तुलना में पीसीआर ट्यूब खूंटे पर बायोफिल्म बायोमास संचय में वृद्धि की।

दोनों बायोफिल्म उपकरणों ने पुनरुत्पादक बायोफिल्म्स का गठन किया जब हमने ई कोलाई और पी एरुगिनोसा (चित्रा 3 ए-बी) द्वारा गठित जैविक रूप से दोहराए गए बायोफिल्म्स की तुलना की। गहरी अच्छी तरह से डिवाइस पर उगाए गए तनाव के लिए तकनीकी प्रतिकृति सीवी-सना हुआ एम ए 550एनएम मूल्यों में अधिक परिवर्तनशीलता देखने के बावजूद, कोई सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण अंतर नहीं था जब हमने प्रत्येक प्रजाति के जैविक प्रतिकृति के लिए माध्यिका सीवी एम मूल्यों की तुलना गहरी अच्छी तरह से या मानक उपकरणों पर जोड़ीवार दो-तरफ़ा विचरण के विश्लेषण (एनोवा) या छात्र के टी-परीक्षणों (दोनों पी पी) का उपयोग करके की थी। > 0.05)। इस खोज से पता चलता है कि गहरी अच्छी तरह से और मानक उपकरणों द्वारा बायोफिल्म गठन पुनरुत्पादक बायोफिल्म बनाता है। हालांकि, सीवी-स्टेनिंग परिणामों से यह भी पता चला है कि जब हमने प्रत्येक डिवाइस पर खूंटी सतह क्षेत्र के अंतर को जिम्मेदार ठहराया, तो ई कोलाई और पी एरुगिनोसा द्वारा बायोफिल्म बायोमास गठन ने बायोमास संचय (तालिका 1) में सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण अंतर दिखाया। ई कोलाई के लिए एमएम 2 (सीवी एम / एमएम 2) में प्रति खूंटी सतह क्षेत्र में औसत सीवी-दाग बायोमास (एम) की गणना से पता चला है कि मानक बायोफिल्म डिवाइस (तालिका 1) की तुलना में पॉलीप्रोपाइलीन गहरे अच्छी तरह से उपकरणों पर बायोफिल्म गठन 1.5 गुना कम था। हालांकि, पी एरुगिनोसा के लिए विपरीत परिणाम प्राप्त किया गया था, जिसने मानक बायोफिल्म उपकरणों (तालिका 1) की तुलना में पॉलीप्रोपाइलीन गहरे अच्छी तरह से उपकरणों पर 1.4 गुना अधिक सीवी एम / एमएम 2 का प्रदर्शन किया था। प्रत्येक डिवाइस के साथ बायोफिल्म बायोमास संचय में देखी गई प्रजातियों-विशिष्ट अंतरों के बावजूद, गहरी अच्छी तरह से डिवाइस ने अभी भी प्रत्येक प्रजाति (चित्रा 3) द्वारा बायोफिल्म बायोमास गठन में अधिक से अधिक समग्र (2-4 गुना वृद्धि) का प्रदर्शन किया।

गहरी अच्छी तरह से बायोफिल्म डिवाइस के रोगाणुरोधी संवेदनशीलता परीक्षण अनुप्रयोगों को निर्धारित करने के लिए, हमने दो आमतौर पर उपयोग किए जाने वाले कीटाणुनाशकों, बीजेडके और ब्लीच की तुलना की, उनकी बायोफिल्म उन्मूलन क्षमता के लिए। दोनों रसायनों का उपयोग आमतौर पर (बीजेडके) और / या उन्मूलन (ब्लीच) को रोकने के लिए किया जाता है बैक्टीरियल बायोफिल्म्स नैदानिक और औद्योगिक अनुप्रयोगों में 21,22,23। प्रत्येक यौगिक को मानक और गहरे अच्छी तरह से बायोफिल्म उपकरणों पर ई कोलाई और पी एरुगिनोसा द्वारा गठित बायोफिल्म्स के लिए 2 गुना सांद्रता बढ़ाने में जोड़ा गया था22,23 (आंकड़े 1, 2 बी)। BZK या ब्लीच की सबसे कम सांद्रता जिसके परिणामस्वरूप OD600nm मान जो नकारात्मक नियंत्रण कुओं से अप्रभेद्य थे, उन्हें MBEC मान के रूप में परिभाषित किया गया था। ब्लीच के साथ मानक बायोफिल्म उपकरणों पर गठित बायोफिल्म्स के उपचार के परिणामस्वरूप ई कोलाई और पी एरुगिनोसा के लिए 0.625% के समान ब्लीच एमबीईसी मान (तालिका 1, चित्रा 4 ए-बी)। ब्लीच MBEC मूल्यों ई कोलाई और पी aeruginosa biofilm गहरी अच्छी तरह से उपकरणों पर गठित के लिए निर्धारित दोनों प्रजातियों (ई कोलाई; 0.156%) द्वारा 2-4 गुना कम MBEC मूल्यों से पता चला; मानक उपकरणों (तालिका 1) की तुलना में पी एरुगिनोसा 0.313%। प्रजातियों के बीच ब्लीच एमबीईसी मूल्यों में 2 गुना अंतर गहरे अच्छी तरह से डिवाइस के लिए नोट किया गया था, जहां पी एरुगिनोसा को ई कोलाई की तुलना में बायोफिल्म्स को खत्म करने के लिए ब्लीच की 2 गुना अधिक एकाग्रता की आवश्यकता होती है (चित्रा 4 ए-बी, तालिका 1)। गहरी अच्छी तरह से डिवाइस में पी. एरुगिनोसा और ई. कोलाई के बीच 2-गुना ब्लीच MBEC अंतर ई कोलाई (चित्रा 3 ए-बी) की तुलना में पी. एरुगिनोसा द्वारा 1.5 गुना बढ़े हुए सीवी-दाग बायोमास गठन के साथ व्युत्क्रम रूप से सहसंबंधित प्रतीत होता है। गहरी अच्छी तरह से डिवाइस खूंटे पर पी एरुगिनोसा द्वारा गठित बायोमास की बड़ी मात्रा यह भी समझा सकती है कि गहरे कुओं पर ई कोलाई की तुलना में पी एरुगिनोसा बायोफिल्म्स को खत्म करने के लिए एक उच्च ब्लीच एकाग्रता की आवश्यकता क्यों थी (चित्रा 3 ए-बी, तालिका 1)। इसलिए, गहरी अच्छी तरह से डिवाइस बायोफिल्म उन्मूलन assays से पता चलता है कि दोनों प्रजातियां ब्लीच के लिए अतिसंवेदनशील थीं, लेकिन मानक उपकरणों की तुलना में कम (2-4-गुना) ब्लीच सांद्रता में थीं। यह व्युत्क्रम रूप से 3 गुना अधिक खूंटी सतह क्षेत्र और गहरी अच्छी तरह से डिवाइस पीसीआर प्लेट खूंटे की मात्रा के साथ सहसंबंधित है। इससे पता चलता है कि ब्लीच एक्सपोजर के लिए, अधिक बायोमास सतह क्षेत्र बायोफिल्म उन्मूलन के लिए आवश्यक ब्लीच सांद्रता को कम कर सकता है।

BZK biofilm उन्मूलन परीक्षण ने ब्लीच परिणामों (चित्रा 4C-D) की तुलना में प्रत्येक प्रजाति द्वारा पुनर्प्राप्त विकास (OD600nm मान) और MBEC मूल्यों में अधिक परिवर्तनशीलता दिखाई। यह परिवर्तनशीलता पिछले अध्ययनों के आधार पर अप्रत्याशित नहीं है जो दिखाती है कि बीजेडके अच्छी तरह से स्थापित बायोफिल्म्स 24,25,26 को समाप्त करने की तुलना में बायोफिल्म गठन को रोकने में अधिक प्रभावी था। मानक बायोफिल्म डिवाइस का उपयोग करते हुए, BZK के साथ इलाज किए गए केवल P. aeruginosa biofilms ने एक सुसंगत MBEC मान (2560 μg / mL) दिखाया जो एमबीईसी मान (20480 μg / mL) से 8 गुना कम था जो गहरे कुएं डिवाइस (तालिका 1, चित्रा 4 C) में इस तनाव के लिए प्राप्त किया गया था। ये परिणाम मानक डिवाइस खूंटे की तुलना में गहरी अच्छी तरह से पेग्ड सतहों और प्लास्टिक रचनाओं पर गठित पी एरुगिनोसा बायोमास की मात्रा में अंतर को प्रतिबिंबित कर सकते हैं। गहरे कुएं और मानक उपकरणों दोनों पर ई कोलाई द्वारा गठित बायोफिल्म्स का बीजेडके उन्मूलन समान रूप से खराब था, जिसके परिणामस्वरूप गहरे कुएं के डिवाइस के लिए 2560-40960 μg / mL से BZK MBEC मूल्यों की एक विस्तृत श्रृंखला और मानक डिवाइस पर 320-10240 μg / mL (चित्रा 4 D)। ई कोलाई के लिए, इस परिवर्तनशीलता को कभी-कभी उदाहरण द्वारा समझाया गया था जहां 1-2 प्रतिकृति कुओं ने वसूली मीडिया में कम लेकिन सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण वृद्धि दिखाई, जिसने त्रुटि में वृद्धि की और या तो डिवाइस के साथ बीजेडके एमबीईसी निर्धारण सटीकता को कम कर दिया (चित्रा 4 डी, तालिका 1)। यह परिवर्तनशीलता ई कोलाई बायोफिल्म्स को समाप्त करने में बीजेडके का उपयोग करने की अप्रभावीता पर प्रकाश डालती है जैसा कि पहले अध्ययन 24,25,26 में उल्लेख किया गया था। इसके विपरीत पी एरुगिनोसा बायोफिल्म्स को दोनों उपकरणों के साथ एक परिभाषित एकाग्रता पर बीजेडके द्वारा मज़बूती से मिटाया जा सकता है, लेकिन 8-गुना बीजेडके एकाग्रता अंतर (चित्रा 4 सी) के साथ। संक्षेप में, पी एरुगिनोसा द्वारा गठित बायोफिल्म्स के बीजेडके उन्मूलन एमबीईसी मूल्य प्रत्येक डिवाइस के साथ अलग-अलग एमबीईसी मूल्य दिखाते हैं, हालांकि, दोनों डिवाइस ई कोलाई सटीक बीजेडके उन्मूलन फेनोटाइप को अलग करने में समान रूप से खराब हैं।

इसलिए, यहां वर्णित गहरी अच्छी तरह से बायोफिल्म डिवाइस विधि एक मानक बायोफिल्म डिवाइस की तुलना में पुनरुत्पादक बायोफिल्म बनाने के लिए समान रूप से प्रभावी है।

Figure 1
चित्र 1. प्रयोग का योजनाबद्ध अवलोकन. क्रायोप्रिजर्व्ड स्टॉक से एकल कालोनियों का दिन 0 अलगाव; दिन 1 एकल उपनिवेशों के साथ विकास मीडिया का टीकाकरण; दिन 2 बायोफिल्म प्लेट का टीका; दिन 3 सीवी धुंधला या रोगाणुरोधी चुनौती; दिन 4 biofilm sonication वसूली मीडिया में; और MBEC मानों को निर्धारित करने के लिए पुनर्प्राप्ति प्लेट के OD600nm पढ़ने के लिए दिन 5. Servier मेडिकल आर्ट (smart.servier.com) द्वारा प्रदान की गई आकृति में कुछ छवियां। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्र 2. प्रोटोकॉल के विभिन्न चरणों के लिए दिखाए गए उदाहरण प्लेट लेआउट. ए) प्रारंभिक 24 ज बायोफिल्म विकास के लिए अंतिम प्लेट सेटअप दो जीवाणु उपभेदों (ई कोलाई और पी एरुगिनोसा) से दिन 1 जीवाणु संस्कृतियों का उपयोग करके, प्रत्येक में तीन जैविक प्रतिकृतियां हैं। नकारात्मक नियंत्रण कुओं (ग्रे) का उपयोग बाँझपन नियंत्रण (कोई बैक्टीरिया नहीं जोड़ा गया) के रूप में किया जाता है। बी) बायोफिल्म्स की रोगाणुरोधी चुनौती के लिए प्लेट सेटअप। रंगों को गहरा करना रोगाणुरोधी एकाग्रता में वृद्धि का संकेत देता है। नकारात्मक नियंत्रण कोई बैक्टीरिया नहीं जोड़ा (ग्रे) के साथ कुओं रहे हैं और सकारात्मक नियंत्रण कोई रोगाणुरोधी जोखिम (नारंगी) के साथ biofilms हैं। पैनल ए से लिए गए बायोफिल्म खूंटी ढक्कन रोगाणुरोधी जोखिम के लिए इस गहरी अच्छी तरह से प्लेट में स्थानांतरित कर दिए जाते हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्र 3. CV-दाग ई. कोलाई BW25113 की दाढ़ सांद्रता (M). (ए) और पी एरुगिनोसा पीएओ 1 (बी) बायोफिल्म बायोमास मानक (हलकों) और गहरे कुएं (त्रिकोण) उपकरणों से बरामद किया गया। सीवी स्टेनिंग को 550 एनएम (A550nm) पर CV के अवशोषण को पढ़कर मापा गया था, और उपकरणों के बीच मात्रा के अंतर के लिए खाते में 3.809 (800 μL / 210 μL) के कारक द्वारा गहरी अच्छी तरह से A550nm रीडिंग को समायोजित किया गया था। CV दाढ़ सांद्रता (M) बीयर-लैम्बर्ट कानून (CV एकाग्रता = A550nm / जहां 96 अच्छी तरह से फ्लैट बॉटम माइक्रोटिटर प्लेट में 210 μL की पथरेखा (एल) को 0.56 सेमी और 251500 सेमी-1M-139 के A550nm पर पानी में CV के विलुप्त होने वाले गुणांक (ε) के लिए निर्धारित किया गया था। परिणाम बायोफिल्म के रूप में उगाए गए प्रत्येक तनाव के तीन जैविक प्रतिकृतियों से 9 तकनीकी प्रतिकृतियों का प्रतिनिधित्व करते हैं और प्रत्येक जैविक प्रतिकृति के औसत मूल्य को प्रत्येक भूखंड में क्षैतिज बार के रूप में दिखाया गया है। उपकरणों के बीच बायोमास में सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण अंतर जैविक प्रतिकृति माध्यिका मूल्यों के बीच निर्धारित किया गया था, जो दो-पूंछ वाले युग्मित टी-टेस्ट (ई कोलाई पी = 0.008-0.018 (*) का उपयोग करके निर्धारित किया गया था; P. aeruginosa p = 0.002-0.009 (**)) तारांकन चिह्नों के साथ सलाखों के रूप में दिखाया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें. 

Figure 4
चित्र 4. रोगाणुरोधी MBEC एकाग्रता का निर्धारण. ब्लीच (ए, बी) और बीजेडके (सी, डी) के लिए एंटीमाइक्रोबियल एमबीईसी एकाग्रता का निर्धारण पी एरुगिनोसा पीएओ 1 (ए, सी) और ई कोलाई बीडब्ल्यू 25113 (बी, डी) के लिए जब मानक (सफेद सलाखों) और गहरे अच्छी तरह से (ग्रे सलाखों) बायोफिल्म पेग्ड उपकरणों पर उगाया जाता है। परिणाम वसूली मीडिया में sonication के बाद बरामद biofilm के OD600nm के पढ़ने से निर्धारित किया गया था और रातोंरात इनक्यूबेशन. गहरी अच्छी तरह से OD600nm 3.75 (750 μL / 210 μL) के एक कारक द्वारा समायोजित किया गया था उपकरणों के बीच मात्रा अंतर के लिए खाते के लिए खाते के लिए। परिणाम तीन जैविक प्रतिकृतियों के प्रतिनिधि हैं और त्रुटि सलाखों प्रत्येक रोगाणुरोधी एकाग्रता 39 पर प्रतिकृतियों के बीच मानक विचलन दिखाते हैं। प्रत्येक बार प्लॉट के ऊपर तारांकन (*) दो-पूंछ वाले छात्र के टी-टेस्ट गणनाओं का उपयोग करके पी-मानों < 0.05 के साथ रिक्त नियंत्रणों से OD600nm मानों में सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण अंतर का संकेत देते हैं। प्रत्येक बार प्लॉट के ऊपर सर्कल प्रतीक (ओ) माप को इंगित करते हैं जहां केवल 1 या 2 प्रतिकृतियों में रिक्त नियंत्रणसे सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण OD600nm मान थे। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

BZK MBEC (μg/mL) ब्लीच MBEC (% v/
स्ट्रेन का परीक्षण किया गया गहरी अच्छी तरह से डिवाइस मानक डिवाइस गहरी अच्छी तरह से डिवाइस मानक डिवाइस
ई कोलाई BW25113 2560-40960 320-10240 0.156 0.625
पी. एरुगिनोसा PAO1 20480 2560 0.313 0.625
गहरी अच्छी तरह से डिवाइस मानक डिवाइस p-मान** गुना परिवर्तन (गहरी अच्छी तरह से /
स्ट्रेन का परीक्षण किया गया मतलब CV M* / mm2 ± एसडी मतलब CV M * / mm2 ± एसडी
ई कोलाई BW25113 1.99 x 10-8 ± 3.25 x10-9 3.03 x 10-8 ± 3.31 x 10-9 0.0176 -1.52
पी. एरुगिनोसा PAO1 8.01 x 10-8 ± 9.42 x 10-9 5.72 x 10-8 ± 9.42 x 10-9 0.034 1.4

तालिका 1. ई कोलाई BW25113 और P. aeruginosa PAO1 का सारांश CV-सना हुआ बायोमास M / mm2 मूल्यों और विभिन्न उपकरणों पर BZK और ब्लीच के लिए बायोफिल्म उन्मूलन MBEC मूल्यों का मतलब है।
* माध्य CV M/mm2 मानों की गणना माध्य जैविक प्रतिकृति CV M मानों (चित्रा 3) का उपयोग करके की जाती है।
** पी-मान दो-पूंछ वाले छात्र के टी-टेस्ट का उपयोग करके निर्धारित किए जाते हैं।

Discussion

यह अध्ययन एक बड़ी मात्रा 96-अच्छी तरह से उच्च थ्रूपुट स्थैतिक बायोफिल्म विकास डिवाइस का उपयोग करने के तरीकों का वर्णन करता है जिसमें एक पॉलीप्रोपाइलीन गहरी अच्छी तरह से माइक्रोप्लेट शामिल है जो बायोफिल्म गठन (गहरी अच्छी तरह से बायोफिल्म डिवाइस) के लिए अर्ध-स्कर्ट वाले पीसीआर-प्लेट ढक्कन के साथ फिट होता है; सामग्री की तालिका)। हमने इस डिवाइस के साथ उत्पन्न बायोफिल्म्स की तुलना व्यावसायिक रूप से उपलब्ध पॉलीस्टीरीन मानक बायोफिल्म डिवाइस (सामग्री की तालिका) से की। गहरी अच्छी तरह से डिवाइस विधि मानक device17 के रूप में एक ही methodological चरणों और समाधान का उपयोग करता है समायोजित मात्रा में गहरे अच्छी तरह से उपकरणों के लिए संशोधित, इस डिवाइस को बड़े पैमाने पर biofilm गठन और प्रयोगात्मक विश्लेषण के लिए आदर्श बनाने. ई कोलाई BW25113 और P. aeruginosa PAO1, दो ग्राम-नकारात्मक प्रजातियां जो बायोफिल्म बनाने के लिए जानी जाती हैं, की वृद्धि, दोनों उपकरणों पर उपयोग करके उनके बायोमास गठन और कीटाणुनाशक (BZK / bleach) MBEC मूल्यों के लिए जांच की गई थी। प्रत्येक डिवाइस से खूंटे पर गठित सीवी-दाग बायोमास की तुलना से पता चला है कि ई कोलाई और पी एरुगिनोसा दोनों ने मानक डिवाइस (चित्रा 3 ए-बी) की तुलना में गहरे अच्छी तरह से बायोफिल्म डिवाइस पर उच्च बायोमास के साथ बायोफिल्म्स का गठन किया। बढ़ी हुई बायोफिल्म बायोमास ने मानक डिवाइस खूंटी सतह क्षेत्र की तुलना में गहरे कुएं के खूंटे के बड़े सतह क्षेत्र को प्रतिबिंबित किया। जब हम दोनों उपकरणों के साथ खूंटी सतह क्षेत्रों (मिमी 2) में अंतर के लिए जिम्मेदार थे, तो बायोमास गठन में अंतर नोट किया गया था, जहां ई कोलाई ने गहरे कुएं डिवाइस के पीसीआर-ट्यूब खूंटे (तालिका 1) की तुलना में पॉलीस्टीरीन मानक डिवाइस खूंटे पर प्रति एमएम 2 प्रति सीवी बायोमास का गठन किया था। पी एरुगिनोसा ने मानक उपकरणों की तुलना में अधिक सीवी-सना हुआ बायोमास / खूंटी एमएम 2 का गठन किया (तालिका 1)। ये निष्कर्ष विभिन्न उपकरणों पर बायोफिल्म बायोमास गठन में प्रजातियों-विशिष्ट अंतरों को उजागर कर सकते हैं।

यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि गहरे अच्छी तरह से उपकरणों पर ई कोलाई और पी एरुगिनोसा बायोफिल्म्स का ब्लीच उन्मूलन मानक डिवाइस (चित्रा 4 ए-बी, तालिका 1) की तुलना में 2-4 गुना कम सांद्रता पर हुआ। प्रत्येक डिवाइस से पहचाने गए ब्लीच एमबीईसी मूल्यों में अंतर संभवतः डिवाइस खूंटी आकार में अंतर से प्रभावित होते हैं (गहरी अच्छी तरह से "खूंटे" पतले ट्यूब होते हैं और मानक खूंटे बेलनाकार होते हैं), प्लास्टिक संरचना अंतर (पॉलीप्रोपाइलीन बनाम पॉलीस्टीरीन), और मात्रा अंतर (750 μL बनाम 200 μL)। उदाहरण के लिए, मानक उपकरणों की तुलना में पी. एरुगिनोसा में गहरे कुएं के डिवाइस खूंटे पर अधिक सीवी एम बायोमास / एमएम 2 था, लेकिन ई कोलाई में गहरे कुएं के खूंटे (चित्रा 3) पर कम बायोमास था। इससे पता चलता है कि बायोफिल्म उन्मूलन के लिए आवश्यक कीटाणुनाशक सांद्रता प्रत्येक प्रजाति के साथ-साथ उपलब्ध सतह क्षेत्र द्वारा गठित बायोमास से प्रभावित हो सकती है। इसके अतिरिक्त, डिवाइस खूंटी आकार में अंतर विशेष प्रजातियों के लिए विभिन्न विकास स्थितियों को प्रभावित कर सकता है। हमारे अध्ययन में, पी एरुगिनोसा अपने अधिक सतह क्षेत्र और वातन के कारण गहरे कुएं के खूंटे पर अधिक बायोमास बना सकता है, क्योंकि यह प्रजाति ई कोलाई के विपरीत एक बाध्य एयरोब है, जो एक संकाय एनारोब है। आज तक, हमने किसी भी प्रकाशित अध्ययन की पहचान नहीं की है जिसने सीधे ई कोलाई और पी एरुगिनोसा बायोफिल्म गठन की तुलना पॉलीप्रोपाइलीन 27,28,29 और पॉलीस्टीरीन 30,31 सामग्रियों दोनों पर की है। हालांकि, मजबूत ई कोलाई और पी एरुगिनोसा बायोफिल्म गठन की रिपोर्टों को पॉलीप्रोपाइलीन या पॉलीस्टीरीन सामग्री की जांच करने वाले स्वतंत्र अध्ययनों में नोट किया गया है। स्यूडोमोनाड्स के संबंध में, कई स्यूडोमोनास एसपीपी संभावित कार्बन स्रोतों के रूप में पॉलीप्रोपाइलीन जैसे प्लास्टिक का उपयोग कर सकते हैं32। इसलिए, इस पॉलीप्रोपाइलीन डीप वेल बायोफिल्म डिवाइस की उपलब्धता स्थैतिक बायोफिल्म अध्ययन में एक उपयोगी अग्रिम है। पॉलीप्रोपाइलीन पॉलीस्टीरीन की तुलना में रासायनिक रूप से अधिक टिकाऊ है और एक नैदानिक रूप से प्रासंगिक सामग्री है, क्योंकि इसका उपयोग अक्सर हर्निया या श्रोणि सर्जरी के लिए चिकित्सा प्रत्यारोपण, टांके और meshes में किया जाता है33,34।

यद्यपि बायोफिल्म बायोमास दोनों उपकरणों द्वारा बनाया गया था, गहरी अच्छी तरह से डिवाइस में सीवी स्टेनिंग विधि और OD600nm बायोफिल्म उन्मूलन एमबीईसी मूल्यों के आधार पर बायोमास में थोड़ी अधिक परिवर्तनशीलता थी ब्लीच और बीजेडके के लिए। इसे 3 मुख्य कारकों द्वारा समझाया जा सकता है: 1) डीप वेल उपकरणों में मानक उपकरणों की तुलना में अधिक खूंटी सतह क्षेत्र होता है जो मानक डिवाइस खूंटे की तुलना में कोण थे। 2) परीक्षण की गई दोनों प्रजातियों में प्रत्येक डिवाइस के पॉलीप्रोपाइलीन और पॉलीस्टीरीन सामग्री का पालन करने के लिए अलग-अलग क्षमताएं हो सकती हैं। 3) प्रत्येक डिवाइस (750 μL गहरी अच्छी तरह से, 200 μL मानक) में उपयोग किए जाने वाले विकास मीडिया की मात्रा और अच्छी तरह से साइड दीवारों पर डाले गए खूंटी के बीच की दूरी अलग-अलग होती है। ये मुद्दे एक समस्या नहीं हैं यदि सभी बायोफिल्म प्रयोगों के लिए केवल एक प्रकार के डिवाइस का उपयोग किया जाता है, हालांकि, यदि दोनों उपकरणों का चयन किया जाता है तो हमारे द्वारा यहां आयोजित तुलनाओं को मतभेदों की पहचान करने के लिए किया जाना चाहिए36,37। प्रत्येक डिवाइस में उपयोग की जाने वाली प्लास्टिक सामग्री में अंतर के कारण, सीवी-दाग वाले बायोफिल्म बायोमास और एमबीईसी मूल्यों की तुलना सीधे विभिन्न उपकरणों के बीच नहीं की जानी चाहिए। हालांकि, यदि विधियों और प्रयोगों को एक ही डिवाइस (गहरी अच्छी तरह से या मानक) पर आयोजित किया जाता है, तो परीक्षण की गई प्रजातियों और रोगाणुरोधी के लिए प्राप्त परिणाम तुलनीय हैं।

इस प्रोटोकॉल से पता चलता है कि स्व-इकट्ठा गहरे अच्छी तरह से पीसीआर-प्लेट डिवाइस बायोफिल्म गठन और उन्मूलन को मापने के लिए बड़ी मात्रा में बायोफिल्म डिवाइस हैं जो लागत प्रभावी भी है। एक लागत परिप्रेक्ष्य से, एक 96 अच्छी तरह से pegged ढक्कन के साथ मानक biofilm उपकरणों $ 29-36 अमेरिकी डॉलर (अमरीकी डालर) प्रति डिवाइस (सामग्री की तालिका) पर खुदरा रेंज. Polystyrene मानक biofilm उपकरण autoclavable नहीं हैं और अपने प्लास्टिक रासायनिक गुणों के कारण सॉल्वैंट्स / एसिड के लिए कम सहिष्णु हैं। स्व-इकट्ठे पॉलीप्रोपाइलीन गहरे कुएं प्लेटों को यहां वर्णित किया गया है, जो एक अलग अर्ध-स्कर्ट वाले 96 अच्छी तरह से पीसीआर-प्लेट (सामग्री की तालिका) के साथ फिट है, जिसकी कुल लागत $ 14 अमरीकी डालर प्रति इकट्ठे डिवाइस है, जो मानक बायोफिल्म डिवाइस लागत का आधा है। यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि कीमतें क्षेत्र, वितरक और उपलब्धता के आधार पर भिन्न हो सकती हैं, और संस्थागत छूट के बाद हमारी लागत $ 9 अमरीकी डालर / गहरी अच्छी तरह से डिवाइस पर काम करती है। इन स्व-इकट्ठे गहरे अच्छी तरह से पॉलीप्रोपाइलीन पीसीआर-प्लेट उपकरणों में नसबंदी के लिए ऑटोक्लेवेबल होने का अतिरिक्त लाभ है और मानक उपकरणों की तुलना में 2-4 गुना अधिक बायोफिल्म बायोमास प्रदान करता है।

अंत में, यह प्रोटोकॉल और गहरे कुएं और मानक बायोफिल्म उपकरणों की बायोफिल्म विकास तुलना से प्रतिनिधि निष्कर्ष बताते हैं कि दोनों उपकरण बैक्टीरियल बायोफिल्म की खेती करने में सक्षम हैं, लेकिन गहरे अच्छी तरह से उपकरण 2-4 गुना अधिक बायोफिल्म बनाते हैं। गहरी अच्छी तरह से biofilm डिवाइस इस तरह के दवा संवेदनशीलता स्क्रीनिंग अध्ययन के रूप में बड़ी मात्रा में उच्च थ्रूपुट biofilm गठन प्रयोगों के लिए एक व्यवहार्य और सस्ती विकल्प प्रदान करता है। यह तकनीक डाउनस्ट्रीम '-ओमिक्स' निष्कर्षण (प्रोटिओमिक, मेटाबोलोमिक, ट्रांसक्रिप्टोमिक) या प्रयोगात्मक assays (एंजाइमेटिक, फ्लोरोसेंट) के लिए उपयोगी बायोफिल्म उत्पन्न कर सकती है, जिसके लिए विश्लेषण के लिए बायोफिल्म सामग्री की बड़ी मात्रा की आवश्यकता हो सकती है। गहरी अच्छी तरह से biofilm डिवाइस प्रयोगशालाओं है कि एक उच्च थ्रूपुट 96 में biofilms का अध्ययन करना चाहते हैं के लिए सिफारिश की है अच्छी तरह से परख कम लागत, बड़ी मात्रा, रासायनिक रूप से टिकाऊ प्लास्टिक सामग्री है कि चिकित्सकीय रूप से प्रासंगिक हैं का उपयोग कर.

Disclosures

लेखकों के पास करने के लिए कोई खुलासा नहीं है।

Acknowledgments

इस काम के लिए वित्त पोषण कनाडा डिस्कवरी ग्रांट (RGPIN- 2016-05891) के प्राकृतिक विज्ञान और इंजीनियरिंग अनुसंधान परिषद से डीसीबी को और कनाडाई जीनोमिक्स रिसर्च एंड डेवलपमेंट इनिशिएटिव ग्रांट (GRDI) कार्यक्रम (GRDI7 2254557) की सरकार से MRM और GRG को अनुदान प्रदान करके प्रदान किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10 mL serological pipets, individ wrap paper/plastic (200/CS) Fisher Scientific 13-678-11F disposable serological pipettes for aseptic media/ culture transfer
2 mL serological pipets, individ wrap paper/plastic, 500/CS Fisher Scientific 13-678-11C disposable serological pipettes for aseptic media/ culture transfer
Axygen Aerosol Filter Tips, Sterile, 5 racks/ PK, 1000 tips/rack Fisher Scientific 14-222-766 sterile pipettor tips for media aliquoting
Axygen deep well storage microplates, round wells, 1.1 mL cap, 5/PK, P-DW-11-C Fisher Scientific P-DW-11-C microplate for 96 well deepwell device biofilm cultivation
Axygen Filter tips, 350 µL tips racked, 96/rack, 10 racks, low retention barrier tips Fisher Scientific TF-350-L-R-S sterile pipettor tips for media aliquoting
Basin/reservoir natural PS 50 mL, Sterile, 5/bag, 40 bags, CS200 Avantor/ VWR 89094-676 sterile basins/ reservoirs for microplate preparation
BD Difco Dehydrated Culture Media: Granulated Agar, 500 g Fisher Scientific DF0145-17-0 materials for LB agar preparation
Biotek Synergy Neo2 multimode plate reader Biotek NEO2MB microplate UV/Vis region plate reader
Branson M3800 Ultrasonic Bath, 117 V Avantor/ VWR CPX-952-316R sonicating water bath
crystal violet (CV), ACS grade, 100 g Fisher Scientific C581-100 biofilm biomass stain
Dimethyl sulfoxide (DMSO), 1 L, ACS grade 99.9%, poly bottle, BDH Avantor/ VWR CABDH1115-1LP media components for cryopreservation
Easypet 3, pipet controller Avantor/ VWR CA11027-980 serological pipettor for aseptic media/ culture transfer
Eppendorf Research Plus 8 multi-channel pipettor , 10-100 µL Avantor/ VWR CA89125-338 multichannel pipettes for aseptic media/ culture transfer
Eppendorf Research Plus 8 multi-channel pipettor , 30-300 µL Avantor/ VWR CA89125-340 multichannel pipettes for aseptic media/ culture transfer
Glacial acetic acid, CAS 64-19-7, 2.5L, ACS grade Fisher Scientific A38-212 CV destain
Glass test tubes, 150 mm x 18 mm, 72/Pack, PYREX Fisher Scientific 14957H/ 9820-18 materials for cell culturing
Glycerol, 4 L glass bottle ACS Fisher Scientific BP229-4 media components for cryopreservation
L-Cysteine, 98%, 250 g Avantor/ VWR 97061-204 universal neutralizing solution
L-glutathione reduced, 98%, 25 g Fisher Scientific AAJ6216614 universal neutralizing solution
L-Hisitidine, 98%, 100 g Avantor/ VWR CA97062-598 universal neutralizing solution
MBEC Assay Inoculator with 96 well tray, 100/CS Innovotech 19112 material for 96 well MBEC device biofilm cultivation
McFarland Standard, 0.5 EA Fisher Scientific R20410 cell culture standardization
McFarland Standard, 1.0 EA Fisher Scientific R20411 cell culture standardization
NUNC 96-well microtiter plates, w/lid, 50/CS Fisher Scientific 167008 microplate for 96 well MBEC device biofilm cultivation and OD measurements
PCR plate, semi-skirted 96 well, fast PCR, polypropylene, 25ea/PK Sarstedt 72.1981.202 pegged lid for 96 well deepwell device biofilm cultivation
Petri dish, 100 mm x 15 mm, semi-TK CS/500 Fisher Scientific FB0875712 materials for LB agar preparation
Potassium phosphate dibasic, ACS 500 g Fisher Scientific P288-500 PBS component/ buffer
Sodium chloride, ACS grade, 3 kg Fisher Scientific S2713 media components for LB broth and PBS
sodium phosphate monobasic, 1 kg Fisher Scientific S369-1 PBS component/ buffer
Syringe filters, Sterile, PES 0.45 um, 25 mm, PK50 Avantor/ VWR 28145-505 non-autoclavable solution sterilization
Tin foil, heavy duty, 50 feet Grocery store --- materials for deepwell device sterilization
Tryptone (peptone from casein), 2.2 kg/EA Fisher Scientific B11922 media components for LB broth
Tween-20, 100 mL Fisher Scientific BP337-100 recovery media solution
Ultra-deepwell, 2.5 mL deep well plates (square well), with lid, polypropylene, 10/CS Avantor/ VWR 37001-520 materials for biofilm dilution preparation
Yeast Extract, Fisher Bioreagents, 500 g Fisher Scientific BP1422-500 media components for LB broth

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Doucet, A. N., Slipski, C. J., Golding, G. R., Mulvey, M. R., Bay, D. C. Generation of Greater Bacterial Biofilm Biomass using PCR-Plate Deep Well Microplate Devices. J. Vis. Exp. (182), e63069, doi:10.3791/63069 (2022).

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