Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Generering af større bakteriel biofilmbiomasse ved hjælp af PCR-plade deep well mikropladeenheder

Published: April 22, 2022 doi: 10.3791/63069
Automatic Translation
1, 1, 1,2, 1,2, 1
1Department of Medical Microbiology and Infectious Diseases, University of Manitoba, 2National Microbiology Laboratory, Public Health Agency of Canada

Summary

Denne protokol præsenterer metodologi til at udføre biofilmvækst- og biomassemålinger ved hjælp af selvmonterede PCR-pladeenheder med dyb brønd til statisk biofilmscreening med høj gennemstrømning af 96-brønds fastgjort låg.

Abstract

Bakterielle biofilm er vanskelige at udrydde fra overflader ved hjælp af konventionelle antimikrobielle indgreb. Mikroplademetoder med høj gennemstrømning med høj gennemstrømning bruges ofte til at dyrke bakterielle biofilm til hurtig antimikrobiel modtagelighedstest for at beregne minimale værdier for biofilmudryddelseskoncentration (MBEC). Standard biofilmenheder består af polystyrenplukkede låg monteret på 96-brønds mikroplader og er ideelle til måling af biofilmbiomasse og MBEC-værdier, men disse enheder er begrænset af det tilgængelige pindeoverfladeareal til biomasseakkumulering og omkostninger. Her skitserer vi en protokol til brug af selvmonteret polypropylen 96-brønd dyb brønd PCR-plade fastgjort låg enhed til at dyrke Escherichia coli BW25113 og Pseudomonas aeruginosa PAO1 biofilm. En sammenligning af 24-timers biofilm dannet på standard- og dybbrøndeanordninger af hver art ved hjælp af krystalviolet biomassefarvning og MBEC-bestemmelsesassays er beskrevet. Det større overfladeareal af dybe brøndanordninger forventedes at øge den samlede biofilmdannelse af begge arter 2-4 gange. P. aeruginosa dannede signifikant større biomasse/mm2 på dybe brøndpinde sammenlignet med standardanordningen. E. coli havde større biomasse / mm2 på standard polystyrenanordninger sammenlignet med dybbrøndeenheden. Biofilm udryddelsesassays med desinfektionsmidler såsom natriumhypochlorit (blegemiddel) eller benzalkoniumchlorid (BZK) viste, at begge forbindelser kunne eliminere E. coli og P. aeruginosa biofilm fra begge enheder, men ved forskellige MBEC-værdier. BZK biofilm udryddelse resulterede i variable E. coli MBEC værdier mellem enheder, men blegemiddel demonstrerede reproducerbare MBEC værdier for både arter og enheder. Denne undersøgelse giver en dyb brøndmetode med høj gennemstrømning til dyrkning af større mængder biofilm på polypropylenanordninger til downstream-undersøgelser, der kræver større mængder statisk biofilm.

Introduction

Pseudomonas aeruginosa og Escherichia coli er gramnegative proteobakterier, der almindeligvis undersøges for deres evne til at danne sessile, overflade-vedhæftede cellesamfund kendt som biofilm1. Begge arter kan, når de vokser som biofilm, udskille en matrix af ekstracellulære polymere stoffer (EPS), der primært består af forskellige polysaccharider og proteiner, som også kan omfatte ekstracellulært DNA og/eller lipider, hvilket giver ekstra cellulær beskyttelse og forbedret overlevelse i barske, næringsbegrænsede miljøer2,3. Biofilmfysiologi og dannelse af begge arter er af klinisk relevans, da de repræsenterer de fem mest almindeligt isolerede antimikrobielt resistente patogener fra hospitalspatientblod, urinveje og lungeinfektioner i Canada4,5. Det er også vigtigt at bemærke, at biofilm anslås at udgøre næsten 80 % af alle kroniske og tilbagevendende infektioner forårsaget af disse bakteriearter6. På grund af de udskillede EPS-stoffer og langsommere metabolisk aktivitet7,8 bliver etablerede biofilm vanskeligere at udrydde, når de dannes på overflader såsom implanteret medicinsk udstyr, arvæv og i lungerne hos patienter med cystisk fibrose9,10, hvilket øger deres antimikrobielle resistens.

Bakteriebiofilms genstridige vækstegenskaber gør dem ofte mere modstandsdygtige over for antimikrobiel hæmning og/eller udryddelse2,9. Etablering af in vitro-metoder til undersøgelse af antimikrobiel udryddelse af bakteriel biofilm er således af afgørende betydning for udvælgelsen af effektive forbindelser til udryddelse af infektioner, når de dannes på medicinsk plast (f.eks. katetre i boligen) og medicinske implantater. De hurtigste in vitro biofilm antimikrobielle udryddelsesdyrkningsmetoder undersøger biofilmvækst som en "statisk" biofilmkultur snarere end "kontinuerlige" kulturer, hvor statisk bakterievækst overvåges i tidlige til sene stadier af biofilmdannelse over en kort (24-96 h) tidsramme i samme vækstmedium. Kontinuerlige biofilmmetoder er besværlige for hurtig analyse, da de kræver biofilmvækst vurderet over længere tidsrammer dyrket i kamre, der muliggør kontinuerlig strømning og udskiftning af vækstmedier med færre replikater11. På grund af den tid og de kræfter, der kræves for at vedligeholde og etablere kontinuerlige biofilm, er statiske in vitro-biofilm de mest populære, da de let kan tilpasses til antimikrobiel følsomhedstest med høj gennemstrømning i plastiske 96-brønds mikrotiterplader snarere end udførlige flowkammersystemer, der begrænser antallet af kulturer, der testes samtidigt 12,13 . De enkleste statiske "in-well" biofilmmikropladeassays bruger standard polystyren eller vinyl (300 μL kapacitet) mikrotiterplader til at måle biofilmdannelse på siderne og bunden af hver brønd og ofte som ringe ved luft til flydende overfladegrænseflade. Bakteriel biofilmdannelse i brønden måles ved farvning af den deponerede biomasse, der klæbes til brøndene, efter at vækstmediets væske er fjernet, og biofilmene er vasket12,13. Disse analyser er økonomisk populære, men har ofte reproducerbarhedsproblemer på grund af deres iboende design, da deponerede biofilm er tilbøjelige til at beskadige eller tabe under skylning til cellegenvinding og biomassefarvningsprocedurer11,14.

For at reducere biofilmtab har standard kommercielle biofilmenheder forbedret biofilmmikropladedesign i brønden ved at tilføje et indsætteligt 96-brønds fastgjort polystyrenlåg til standard 96 in-well pladedesign, kaldet "standard biofilm-enheden" heri. Tilføjelsen af et fastgjort låg udvider det tilgængelige overfladeareal i hver mikropladebrønde, hvilket giver mulighed for forbedret overfladeadhærens og dannelse af biofilmbiomasse15,16. Standard biofilm fastgjort låg enheder giver mulighed for større biofilm opsving, fjernelse og skylning til efterfølgende antimikrobielle biofilm modtagelighed og udryddelse test, når fastgjort låg indsættes i nye mikrotiter plader indeholdende lægemiddel eller vækst tilstand udfordringer. I lighed med biofilmmikropladeteknikker i brønden giver de genvundne materialer fra de fjernede og vaskede fastgjorte låganordninger mulighed for celleoverlevelsestest og biofilmbiomassefarvning, der typisk involverer krystalviolette (CV) farvestofformuleringer 17,18,19. Standard biofilmudstyr er også optimalt til screening af biofilm antimikrobielle følsomheder. Disse analyser overvåger biofilmvæksthæmning på to måder: 1) Når antimikrobielle stoffer tilsættes til celler i starten af væksten, kan det bestemme den mindste biofilmhæmningskoncentration (MBIC) værdi. 2) Når etablerede biofilm dannes på pløkkerne efter 24 timer og derefter eksponeres for antibiotika, kan den bestemme minimumsværdien for biofilmudryddelse (MBEC) 17,20. I lighed med biofilmmikropladeenheder i brønden har standard biofilmenheder nogle bemærkelsesværdige begrænsninger, såsom deres høje omkostninger pr. Enhed, de er ikke-autoklaverbare og mindre holdbare over for kemiske opløsningsmidler på grund af det anvendte polystyrenplademateriale. Standard biofilmenheder har også et lavt overfladeareal til pindeforhold, hvilket begrænser de maksimale arbejdsvolumener i hver brønd til 200 μL. Disse faktorer kan gøre standard biofilmenheder mere udfordrende at bruge til undersøgelser, der kræver større mængder biofilm i et format med høj gennemstrømning.

Her beskriver vi en statisk biofilm pegged-lid 96-well metode udviklet i vores laboratorium ved hjælp af kommercielt tilgængelige polypropylen semi-skirted 0,5 ml 96-brønd PCR plader monteret på 96-brønd mikrotiter plader med brønde dybere end standardpladen (Table of Materials). Disse samlede enheder har et maksimalt arbejdsvolumen på 750 μL, når de anvendes til dyrkning af biofilm (i det følgende kendt som "dyb brøndbiofilmenhed"). Fordelene ved at bruge disse dybe brøndbiofilmenheder er deres lavere omkostninger sammenlignet med standard biofilmenheder, de kan steriliseres ved autoklavering, og de øger overfladearealet til biofilmdannelse på den større eksterne PCR-plade "rør / pinde". Med denne metode viser vi anvendelserne af disse enheder til dyrkning og karakterisering af biofilmbiomasse dannet af Escherichia coli BW25113 og P. aeruginosa PAO1. Metoder til bestemmelse af MBEC-værdier ved hjælp af biofilmudryddelsesassays beskrives ved anvendelse af det kvaternære ammoniumforbindelsesdesinfektionsmiddel benzalkoniumchlorid (BZK) og natriumhypochlorit (blegemiddel) antimikrobielle stoffer. Det antiseptiske/desinfektionsmiddel BZK blev valgt, da denne forbindelse ofte bruges til at hæmme biofilm fra forurenede overflader, men det er angiveligt mindre effektivt til at udrydde veletablerede biofilm21. Blegemiddel er et yderst effektivt kemikalie til udryddelse af etablerede biofilm og er en grundpille i kemisk desinfektion 22. Begge desinfektionsmidler giver en nyttig sammenligning af MBEC-værdier for hver biofilmenhed21. En protokol til denne biofilmenhedsvurdering ved hjælp af CV-farvning og biofilmudryddelsesassays til MBEC-bestemmelse er opsummeret i denne artikel. Der er medtaget et protokolflowdiagram for at få et forenklet overblik over arbejdsgangen for disse metoder (figur 1).

Protocol

1. Aseptisk kulturforberedelse til biofilmvækst (dag 0-1)

  1. På dag 0 stribes den eller de ønskede bakteriestammer til test fra en kryokonserveret bestand (i glycerol eller dimethylsulfoxid (DMSO)) direkte på en næringsstofagarplade med antimikrobiel udvælgelse, som stammen kræver. Inkuber agarplader ved den optimale temperatur (37 °C) og tid (18-22 timer) for belastningsvækst.
  2. Den følgende dag (dag 1) podes en koloni fra agarpladen i 5 ml vækstmedier ved optimale vækstbetingelser. Disse kulturer vil blive brugt som dag 2, der starter podninger til biofilmenheder (se trin 2.2; Figur 1).
    BEMÆRK: Til denne undersøgelse blev E. coli K-12 BW21153 og P. aeruginosa PAO1 dyrket i Luria-Bertani (LB) medium ved 37 ° C i 18 timer med rystelser ved 160 omdrejninger pr. Minut (o / min).
    1. Forbered mindst 3 uafhængigt dyrkede stammer for at generere biologiske replikater til biofilmmåling på grund af den statistiske variabilitet af dannelsen af biofilmbiomasse på de fastgjorte låganordninger.

2. Forberedelse og podning af plader (dag 2)

  1. Fyld de ydre brønde på en autoklaveret 96-brønds, 1,1 ml/brønd polypropylenplade med 750 μL/brøndsterilt vand (figur 2A). Fyld de negative kontrolbrønde (uinokulerede mediebrønde; kolonne B) med 750 μL vækstmedier og de resterende brønde med 675 μL vækstmedier.
    BEMÆRK: Trin 2.1 ovenfor og trin nedenfor viser passende volumener til biofilmenheden med dyb brønd. Hvis der anvendes standardbiofilmanordning, skal volumenerne ændres som følger: 75 μL inokulumkultur til 20 μL; 675 μL vækstmedier til 180 μL; 750 μL sterilt vand/vækstmedie til 200 μL; 800 μL CV-plet/eddikesyre/skylleopløsninger til 210 μL. For trin 3.6 nedenfor kan absorbansen ved 500 nm (A550 nm) desuden aflæses direkte i polystyrenmikropladen efter blanding ved brug af standardmikrofilmenhedens mikroplade.
  2. Brug dag 1 overnatningskulturer til at standardisere kulturerne til en optisk densitet ved 600 nm (OD600nm) = 1,0 eller til en McFarland-standard på 0,5-1 enheder.
  3. Opret en 10 gange seriel fortynding af hver standardiseret kultur i reagensglas eller en 96-brønds dyb brøndmikrotiterplade, indtil en 10-3 fortynding er nået.
  4. Inokuler de medier, der indeholder brønde som vist i figur 2B , med 75 μL af den fortyndede 1 x 10-3-3-kultur med henblik på en endelig bakteriel fortynding i brønden på 10-4.
  5. Indsæt forsigtigt en autoklaveret PCR-plade (fastgjort låg) i den podede dybe brøndplade. Inkuber plader under optimale belastningsforhold (37 °C) med omrystning (maks. 160 o/min)) i en inkubator med 50-60 % fugtighed i 24 timer.

3. Bestemmelse af biofilmbiomasse fra enheder, der anvender CV-farvning (dag 3)

  1. Det biofilmslukkede låg fjernes aseptisk fra hver anordning og skylles ved at indsætte det i en autoklaveret dyb brøndplade tilberedt med 800 μL sterilt fosfatbufret saltvand (PBS)/brønd i 30 s for at fjerne planktoniske celler.
  2. Til biomasse CV-farvning overføres det fastgjorte PCR-pladelåg til en ny plade fremstillet med 800 μL/brønd 0,1% (w/v) CV i dH2O og pletter i 5 minutter.
  3. Fjern overskydende pletter ved at skylle det fastgjorte låg i en dyb brøndplade tilberedt med 800 μL/ godt steril PBS. Lad pladerne tørre i 10 minutter i et biosikkerhedsskab med pinde opad.
  4. Overfør det tørrede PCR-pladelåg til en plade, der indeholder 800 μL/brønd 30 % (v/v) eddikesyre, og lad låget plette i 5 minutter.
  5. Fjern det tilbageholdte PCR-pindelåg, og bland opløsningen grundigt ved pipettering. Overfør 200 μL fra de dybe brøndplader til en standard 96 brønd mikroplade og mål absorbansen af affarvningsopløsningen ved en bølgelængde på 550 nm (A550nm) i en ultraviolet (UV) / synlig (Vis) rækkevidde mikropladelæser.
  6. Ved hjælp af de målte A550nm-værdier trækkes den gennemsnitlige blindprøveværdi (negativ kontrol) A550nm fra hver biofilmprøveværdi. Gennemsnit af hver blank-subtraheret A550nm biofilmprøveværdi, der repræsenterer prøvebiologiske replikater.

4. Udfordring af biofilm med antimikrobielle stoffer til beregning af deres antimikrobielle MBEC-værdi på 24 timer (dag 3)

  1. Der fremstilles en antimikrobiel stamopløsning i vand, der er to gange (2x) koncentrationen af den ønskede højeste antimikrobielle koncentration, der skal testes.
  2. Der oprettes en dobbelt fortyndingsserie af den antimikrobielle stamopløsning i 2x koncentrerede vækstmedier, således at der er 8 antimikrobielle koncentrationer.
  3. Som vist i figur 2B fyldes de ydre brønde i en autoklaveret dyb brøndplade med 750 μL/brøndsterilt vand. Fyld kolonne B (negativ kontrol; ingen bakterier) og C (positiv kontrol; ingen antimikrobiel eksponering) af pladen med 750 μL/ brøndvækstmedier. De resterende brønde fyldes med 750 μL/brønd i den antimikrobielle fortyndingsserie som vist i figur 2B.
  4. Fjern og skyl det fastgjorte låg som beskrevet i trin 3.1, og overfør dem til den antimikrobielle udfordringsplade.
  5. Inkuber plader med rystelser (maks. 160 omdr./min.) under passende belastningsforhold og inden for den ønskede eksponeringstidsramme.

5. Genvinding af biofilmbiomasse fra fastgjorte låg (dag 4)

  1. Fjern antimikrobielle eksponerede låg, og skyl som beskrevet i trin 3.1. Overfør det fastgjorte låg til en dyb brøndplade med 750 μL/brøndgenvindingsmedier i de indre brønde og 750 μL/brøndsteril dH2O i de ydre brønde.
    1. For at forberede 70 ml genvindingsmedier kombineres 35 ml 2x koncentreret LB, 0,7 ml 100% tween-20, 3,5 ml 20x universel neutraliserende opløsning og 30,8 ml steril dH2O i en steril flaske.
    2. For at fremstille 20x koncentreret universel neutraliserende opløsning tilsættes 1,0 g L-histidin, 1,0 g L-cystein og 2,0 g reduceret glutathion til et endeligt volumen på 20 ml dH2O. Filtret steriliseres gennem et 0,2 μm filter og opbevares ved 4 °C.
  2. Sæt enheden fra trin 5.1 i en sekundær skraldespand monteret inde i et sonikerende vandbad. Sonikere enhederne i 30 minutter for at løsne biofilmen fra pinde i genoprettelsesmediet.
  3. Efter sonikering skal du fjerne det fastgjorte låg og placere et sterilt fladt pladedæksel låg på den dybe brøndgenvindingsmedieplade. Det fastgjorte låg kan kasseres.
  4. Inkuber plader med genvindingsmedier fra trin 5.3 ved de optimale belastningsvækstbetingelser natten over (16-18 timer).

6. Bestemmelse af enhedens MBEC-værdier (dag 5)

  1. Den følgende dag overføres 200 μL fra hver brønd i den inkuberede dybe brøndplade fra trin 5.4 til en ny 96-brønds mikrotiterplade. Læs OD600nm for hver brønd ved hjælp af en UV/Vis-mikropladelæser.
  2. Træk negative kontrolværdier (uinokuleret blindprøve) fra hver biofilm, der indeholder prøvebrønden.
  3. MBEC-værdien beregnes for hver prøve ved hjælp af OD600nm-værdier , hvor MBEC-værdien er den laveste antimikrobielle koncentration, der resulterede i den laveste OD600nm-værdi (kan ikke skelnes fra den ikke-ininokulerede kontrol) for en specifik antimikrobiel behandlet art/stammeprøve.

Representative Results

Formålet med denne undersøgelse var at tilvejebringe en metode til at udføre større volumen, høj gennemstrømning (96-brønd), statisk biofilm enhedsmålinger ved hjælp af dybe brønd biofilm enheder. Her sammenlignede vi en selvmonteret semi-skirted PCR-plade indsat i en dyb brøndmikroplade, kendt som deep well-enheden, med en almindeligt anvendt standard biofilm fastgjort låganordning for at undersøge deres evner til at danne statiske biofilm. CV-farvet biomasse og biofilm udryddelse assays (MBEC) blev brugt til at vurdere biofilm dannelse af begge enheder.

For at sammenligne biofilmdannelse efter forskellige arter på hver enhed vurderede vi biofilmbiomasser dannet af E. coli BW25113 og P. aeruginosa PAO1 ved hjælp af biofilm CV-farvningsprotokollen17. Selvom CV-farvning generelt rapporteres som A550nm-værdier, konverterede vi på grund af forskellene i vækstvolumener for hver enhed og deres tilgængelige overfladearealer CV-plet A550nm-værdier til molære CV-koncentrationer i opløsning. Molære CV-koncentrationer tegnede sig for volumenforskelle for hvert udstyr og tillod en sammenligning af CV-koncentrationer, der repræsenterer biomasser, der er genvundet fra hvert udstyr. Resultaterne viste, at begge arter producerede signifikant mere biomasse på biofilmenheder med dybe brønde (2,1 fold E. coli; 4,1 gange P. aeruginosa) sammenlignet med standard biofilmanordningen (figur 3A-B). Dette resultat var forventet i betragtning af det større overfladeareal af pcR-pinden med dyb brønd (320,4 mm2) sammenlignet med standardenhedens pindeoverfladeareal (108,9 mm2). Dette fund er også i overensstemmelse med den øgede mængde (750 μL), der anvendes i biofilmenheden med dybe brønde sammenlignet med standardenhedsbrøndene (200 μL). Derfor øgede dybe brøndenheder biofilmbiomasseakkumulering på PCR-rørpinde sammenlignet med mindre pinde med standard biofilmenheder.

Begge biofilmenheder dannede reproducerbare biofilm, da vi sammenlignede biologisk replikerede biofilm dannet af E. coli og P. aeruginosa (figur 3A-B). På trods af at der blev observeret større variabilitet i tekniske replikater CV-farvede M A550nm-værdier for enten stamme dyrket på den dybe brøndenhed, var der ingen statistisk signifikante forskelle, da vi sammenlignede median CV M-værdierne for hver arts biologiske replikater på den dybe brønd eller standardenheder ved hjælp af parvis tovejs analyse af varians (ANOVA) eller Elevens T-test (begge p > 0,05). Dette fund viser, at biofilmdannelse ved dyb brønd og standardanordninger danner reproducerbare biofilm. CV-farvningsresultaterne viste imidlertid også, at når vi redegør for forskelle i pindeoverfladeareal på hver enhed, viste biofilmbiomassedannelsen af E. coli og P. aeruginosa statistisk signifikante forskelle i biomasseakkumulering (tabel 1). Beregning af gennemsnitlig CV-farvet biomasse (M) pr. pløkkeoverfladeareal i mm2 (CV M/mm2) for E. coli viste, at biofilmdannelsen var 1,5 gange lavere på polypropylen dybe brøndanordninger sammenlignet med standard biofilmanordningen (tabel 1). Det modsatte resultat blev imidlertid opnået for P. aeruginosa, som viste 1,4 gange højere CV M / mm2 på polypropylen dybe brøndanordninger sammenlignet med standard biofilmanordninger (tabel 1). På trods af de observerede artsspecifikke forskelle i akkumulering af biofilmbiomasse med hver enhed viste dybbrøndeanordningen stadig større samlet (2-4 gange stigninger) biofilmbiomassedannelse af hver art (figur 3).

For at bestemme anvendelserne af antimikrobiel følsomhedstest af den dybe brøndbiofilmenhed sammenlignede vi to almindeligt anvendte desinfektionsmidler, BZK og blegemiddel, for deres biofilmudryddelsespotentiale. Begge kemikalier anvendes almindeligvis til at forebygge (BZK) og/eller udrydde (blegemiddel)bakterielle biofilm i kliniske og industrielle anvendelser21,22,23. Hver forbindelse blev tilsat i stigende 2 gange koncentrationer til biofilm dannet af E. coli og P. aeruginosa på standard- og dybbrøndebiofilmenhederne22,23 (figur 1, 2B). Den laveste koncentration af BZK eller blegemiddel, der resulterede i OD600nm-værdier, der ikke kunne skelnes fra negative kontrolbrønde, blev defineret som MBEC-værdien. Behandling af biofilm dannet på standard biofilmudstyr med blegemiddel resulterede i de samme blegemiddel MBEC-værdier på 0,625% for E. coli og P. aeruginosa (tabel 1, figur 4A-B). Blegemiddel MBEC-værdier bestemt for E. coli og P. aeruginosa biofilm dannet på dybe brøndanordninger viste 2-4 gange lavere MBEC-værdier af begge arter (E. coli; 0,156%; P. aeruginosa 0,313%) sammenlignet med standardudstyr (tabel 1). En 2 gange forskel i blegemiddel MBEC-værdier mellem arter blev noteret for den dybe brøndanordning, hvor P. aeruginosa krævede en 2 gange højere koncentration af blegemiddel for at udrydde biofilm sammenlignet med E. coli (figur 4A-B, tabel 1). Den 2-foldige blegemiddel MBEC-forskel mellem P. aeruginosa og E. coli i dyb brøndanordning ser ud til at korrelere omvendt med 1,5 gange øget CV-farvet biomassedannelse af P. aeruginosa sammenlignet med E. coli (figur 3A-B). Den større mængde biomasse dannet af P. aeruginosa på dybe brøndanordningspinde kan også forklare, hvorfor en højere blegemiddelkoncentration var nødvendig for at udrydde P. aeruginosa biofilm sammenlignet med E. coli på dybe brønde (figur 3A-B, tabel 1). Derfor viser dyb brønd enhed biofilm udryddelse assays, at begge arter var modtagelige for blegemiddel, men ved lavere (2-4 gange) blegemiddelkoncentrationer sammenlignet med standardanordninger. Dette korrelerer omvendt med det 3 gange større pindeoverfladeareal og volumener af den dybe brøndanordning PCR-pladepinde. Dette tyder på, at større biomasseoverfladeareal ved eksponering for blegemidler kan sænke de blegemiddelkoncentrationer, der er nødvendige for udryddelse af biofilm.

BZK biofilm udryddelsestest viste større variation i genvundet vækst (OD600nm værdier) og MBEC værdier for hver art sammenlignet med blegemiddelresultater (figur 4C-D). Denne variabilitet er ikke uventet baseret på tidligere undersøgelser, der viste, at BZK var mere effektiv til at forhindre dannelse af biofilm end at udrydde veletablerede biofilm24,25,26. Ved hjælp af standardbiofilmenheden viste kun P. aeruginosa-biofilm behandlet med BZK en konsistent MBEC-værdi (2560 μg/ml), der var 8 gange lavere end MBEC-værdien (20480 μg/ml), der blev opnået for denne stamme i den dybe brøndanordning (tabel 1, figur 4C). Disse resultater kan afspejle forskelle i mængden af P. aeruginosa-biomasse, der dannes på dybe godt fastgjorte overflader og plastsammensætninger sammenlignet med standardanordningspindene. BZK-udryddelse af biofilm dannet af E. coli på både den dybe brønd og standardenhederne var lige så ringe, hvilket resulterede i en bred vifte af BZK MBEC-værdier fra 2560-40960 μg / ml for den dybe brøndanordning og 320-10240 μg / ml på standardenheden (figur 4D). For E. coli blev denne variabilitet forklaret ved det lejlighedsvise tilfælde, hvor 1-2 replikatbrønde viste lav, men statistisk signifikant vækst i genoprettelsesmedier, hvilket øgede fejl og reducerede BZK MBEC-bestemmelsesnøjagtigheden med begge enheder (figur 4D, tabel 1). Denne variabilitet fremhæver ineffektiviteten ved at anvende BZK til udryddelse af E. coli-biofilm som tidligere nævnt i undersøgelser24,25,26. I modsætning hertil kunne P. aeruginosa biofilm pålideligt udryddes af BZK ved en defineret koncentration med begge enheder, men med en 8-dobbelt BZK-koncentrationsforskel (figur 4C). Sammenfattende viser BZK-udryddelse MBEC-værdier for biofilm dannet af P. aeruginosa forskellige MBEC-værdier med hver enhed, men begge enheder er lige så dårlige til at skelne mellem E. coli præcise BZK-udryddelsesfænotyper.

Derfor er den dybe brøndbiofilmenhedsmetode, der er beskrevet heri, ligeledes effektiv til dannelse af reproducerbare biofilm sammenlignet med en standard biofilmenhed.

Figure 1
Figur 1. Skematisk oversigt over eksperimentet. Dag 0 isolering af enkeltkolonier fra kryokonserveret bestand; Dag 1 podning af vækstmedier med enkelte kolonier; Dag 2 podning af biofilmplade; Dag 3 CV-farvning eller antimikrobiel udfordring; Dag 4 biofilm sonikering i genopretning medier; og dag 5 læsning OD600nm af genvindingsplade for at bestemme MBEC-værdier. Nogle billeder i figur leveret af Servier Medical Art (smart.servier.com). Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 2
Figur 2. Eksempel på pladelayouts vist for forskellige trin i protokollen. A) Den endelige pladeopsætning til den indledende 24 timers biofilmvækst ved hjælp af dag 1 bakteriekulturer fra to bakteriestammer (E. coli og P. aeruginosa), hver med tre biologiske replikater. Negative kontrolbrønde (grå) anvendes som sterilitetskontrol (ingen bakterier tilsat). B) Pladeopsætning til antimikrobiel udfordring af biofilm. Mørkere farver indikerer stigende antimikrobiel koncentration. Negativ kontrol er brønde uden bakterier tilsat (grå), og positive kontroller er biofilm uden antimikrobiel eksponering (orange). Biofilmpind låg taget fra panel A overføres til denne dybe brøndplade til antimikrobiel eksponering. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 3
Figur 3. Den molære koncentration (M) af CV-farvet E. coli BW25113. A) og P. aeruginosa PAO1 (B) biofilmbiomasse, der er genvundet fra standardanordninger (cirkler) og anordninger med dybe brønde (trekanter). CV-farvning blev målt ved at aflæse CV's absorbans ved 550 nm (A550 nm), og dybe brønd-A550nm-aflæsninger blev justeret med en faktor på 3.809 (800 μL / 210 μL) for at tage højde for volumenforskellene mellem enhederne. CV-molær koncentration (M) blev bestemt af Beer-Lambert-loven (CV-koncentration = A550nm / εl); hvor den 210 μL store banelængde (l) i den 96 brønd flade bund mikrotitre plade blev bestemt til at være 0,56 cm og udryddelseskoefficienten (ε) for CV i vand ved A550nm på 251500 cm-1M-139. Resultaterne repræsenterer 9 tekniske replikater fra tre biologiske replikater af hver stamme dyrket som en biofilm, og hver biologisk replikats medianværdi vises som en vandret bjælke i hvert plot. Statistisk signifikante forskelle i biomasse mellem udstyret blev bestemt mellem biologiske replikatmedianværdier ved hjælp af en to-halet parret t-test (E. coli p = 0,008-0,018 (*); P. aeruginosa p= 0,002-0,009 (**)) vist som søjler med stjerner. Klik her for at se en større version af denne figur. 

Figure 4
Figur 4. Bestemmelse af antimikrobiel MBEC-koncentration. Bestemmelse af antimikrobiel MBEC-koncentration for blegemiddel (A,B) og BZK (C,D) for P. aeruginosa PAO1 (A, C) og E. coli BW25113 (B,D), når de dyrkes på standard (hvide bjælker) og dybbrøndet (grå bjælker) biofilmfast fastgjort udstyr. Resultaterne blev bestemt ved læsning af OD600nm af biofilm genvundet efter sonikering i genopretningsmedier og inkubation natten over. Dyb brønd OD600nm blev justeret med en faktor på 3,75 (750 μL /210 μL) for at tage højde for volumenforskelle mellem enhederne. Resultaterne er repræsentative for tre biologiske replikater, og fejllinjerne viser standardafvigelsen mellem replikater ved hver antimikrobiel koncentration39. Stjerner (*) over hvert søjlediagram angiver statistisk signifikante forskelle i OD600nm-værdier fra tomme kontroller med p-værdier < 0,05 ved hjælp af tohalede studerendes T-testberegninger. Cirkelsymboler (o) over hvert søjlediagram angiver målinger, hvor kun 1 eller 2 replikater havde statistisk signifikante OD600nm-værdier fra tomme kontroller. Klik her for at se en større version af denne figur.

BZK MBEC (μg/ml) Blegemiddel MBEC (% v/v)
Stamme testet Dyb brønd enhed Standard enhed Dyb brønd enhed Standard enhed
E. coli BW25113 2560-40960 320-10240 0.156 0.625
P. aeruginosa PAO1 20480 2560 0.313 0.625
Dyb brønd enhed Standard enhed p-værdi** Fold skift (Dyb brønd / Standard)
Stamme testet Gennemsnitlig CV M*/ mm2 ± SD Gennemsnitlig CV M*/ mm2 ± SD
E. coli BW25113 1,99 x 10-8 ± 3,25 x10-9 3,03 x 10-8 ± 3,31 x 10-9 0.0176 -1.52
P. aeruginosa PAO1 8,01 x 10-8 ± 9,42 x 10-9 5,72 x 10-8 ± 9,42 x 10-9 0.034 1.4

Tabel 1. Et resumé af E. coli BW25113 og P. aeruginosa PAO1 betyder CV-farvet biomasse M / mm2 værdier og biofilm udryddelse MBEC værdier for BZK og blegemiddel på forskellige enheder.
*Gennemsnitlige CV M/mm2-værdier beregnet ved hjælp af median biologiske replikat CV M-værdier (figur 3).
**p-værdier bestemt ved hjælp af To-halet studerendes T-test.

Discussion

Denne undersøgelse beskriver metoder til anvendelse af en statisk biofilmvækstanordning med større volumen på 96 brønde med høj gennemstrømning, der involverer en polypropylen dyb brøndmikroplade udstyret med et halvskørtet PCR-pladelåg til biofilmdannelse (dyb brøndbiofilmenhed; Tabel over materialer). Vi sammenlignede biofilm genereret med denne enhed med en kommercielt tilgængelig polystyrenstandard biofilmenhed (Table of Materials). Metoden med dyb brøndanordning bruger de samme metodologiske trin og løsninger som standardenheden17 ved justerede volumener, der er modificeret til enhederne med dybe brønde, hvilket gør denne enhed ideel til biofilmdannelse og eksperimentel analyse i stor skala. Væksten af E. coli BW25113 og P. aeruginosa PAO1, to gramnegative arter, der vides at danne biofilm, blev undersøgt for deres biomassedannelse og desinfektionsmiddel (BZK / blegemiddel) MBEC-værdier ved anvendelse på begge enheder. Sammenligning af CV-farvet biomasse dannet på pinde fra hver enhed viste, at både E. coli og P. aeruginosa dannede biofilm med højere biomasse på biofilmenheden med dyb brønd sammenlignet med standardanordningen (figur 3A-B). Øget biofilmbiomasse afspejlede det større overfladeareal af dybe brøndpinde sammenlignet med standardindretningens pindeoverfladeareal. Da vi redegjorde for forskelle i pindeoverfladearealer (mm2) med begge enheder, blev der konstateret forskelle i biomassedannelse, hvor E. coli dannede signifikant større CV-biomasse pr. mm2 på polystyrenstandardanordningspinde end med den dybe brøndanordnings PCR-rørpinde (tabel 1). P. aeruginosa dannede større CV-farvet biomasse / pind mm2 sammenlignet med standardenheder (tabel 1). Disse resultater kan fremhæve artsspecifikke forskelle i dannelsen af biofilmbiomasse på de forskellige enheder.

Det skal bemærkes, at blegemiddeludryddelse af E. coli og P. aeruginosa biofilm på dybe brøndindretninger forekom ved 2-4 gange lavere koncentrationer end standardanordning (figur 4A-B, tabel 1). Forskellene i blegemiddel MBEC-værdier, der er identificeret fra hver enhed, påvirkes sandsynligvis af forskelle i enhedens pindeformer (dybe brønde "pinde" er koniske rør og standardpinde er cylindriske), plastsammensætningsforskelle (polypropylen versus polystyren) og volumenforskelle (750 μL versus 200 μL). For eksempel havde P. aeruginosa større CV M-biomasse / mm2 på dybe brøndanordningspinde sammenlignet med standardenheder, men E. coli havde mindre biomasse på dybe brøndpinde (figur 3). Dette tyder på, at de desinfektionsmiddelkoncentrationer, der kræves til udryddelse af biofilm, kan påvirkes af den biomasse, der dannes af hver art, samt det tilgængelige overfladeareal. Derudover kan forskelle i enhedens pindeform påvirke forskellige vækstbetingelser for bestemte arter. I vores undersøgelse kan P. aeruginosa danne større biomasse på dybe brøndpinde på grund af deres større overfladeareal og beluftning, da denne art er en obligatorisk aerobe i modsætning til E. coli, som er en fakultativ anaerobe. Til dato har vi ikke identificeret nogen offentliggjorte undersøgelser, der direkte har sammenlignet E. coli og P. aeruginosa biofilmdannelse sammen på både polypropylen27,28,29 og polystyren30,31 materialer. Rapporter om robust E. coli og P. aeruginosa biofilmdannelse er imidlertid blevet noteret i uafhængige undersøgelser, der undersøger enten polypropylen- eller polystyrenmaterialer. Med hensyn til pseudomoneder kan mange Pseudomonas spp. anvende plast såsom polypropylen som potentielle kulstofkilder32. Derfor er tilgængeligheden af denne polypropylen dyb brønd biofilm enhed et nyttigt fremskridt i statiske biofilmstudier. Polypropylen er kemisk mere holdbart end polystyren og er et klinisk relevant materiale, da det ofte anvendes i medicinske implantater, suturer og masker til brok- eller bækkenoperationer33,34.

Selvom biofilmbiomasse blev dannet af begge enheder, havde den dybe brøndanordning lidt højere variabilitet i biomasse baseret på CV-farvningsmetoden og OD600nm biofilmudryddelse MBEC-værdier for blegemiddel og BZK. Dette kan forklares med 3 hovedfaktorer: 1) Dybe brøndanordninger har større pindeoverfladeareal end standardanordninger, der var vinklede sammenlignet med standardindretningspind. 2) Begge testede arter kan have forskellige evner til at klæbe til polypropylen- og polystyrenmaterialer i hver enhed. 3) Mængderne af vækstmedier, der anvendes i hver enhed (750 μL dyb brønd, 200 μL standard) og afstanden mellem den indsatte pind til brøndens sidevægge er forskellig. Disse problemer er ikke et problem, hvis der kun bruges en type enhed til alle biofilmeksperimenter, men hvis begge enheder vælges, skal de sammenligninger, vi gennemførte heri, udføres for at identificere forskelle36,37. På grund af forskellene i plastmateriale, der anvendes i hver enhed, bør CV-farvet biofilmbiomasse og MBEC-værdier ikke sammenlignes direkte mellem forskellige enheder. Hvis metoder og forsøg udføres på samme udstyr (dyb brønd eller standard), er de opnåede resultater for de testede arter og antimikrobielle stoffer imidlertid sammenlignelige.

Denne protokol viser, at selvmonterede PCR-pladeenheder med dyb brønd er biofilmanordning med større volumen til måling af biofilmdannelse og udryddelse, der også er omkostningseffektiv. Fra et omkostningsperspektiv varierer standard biofilmenheder med et 96 godt fastgjort låg detailhandel til $ 29-36 amerikanske dollars (USD) pr. Enhed (Table of Materials). Polystyren standard biofilm enheder er ikke autoklaverbare og er mindre tolerante over for opløsningsmidler / syrer på grund af dets plastiske kemiske egenskaber. De selvmonterede polypropylen dybe brøndplader, der er beskrevet heri, udstyret med en separat halvskørtet 96 brønd PCR-plade (Table of Materials) koster i alt $ 14 USD pr. Samlet enhed, hvilket er halvdelen af standard biofilmenhedens omkostninger. Det skal bemærkes, at priserne kan variere afhængigt af region, distributør og tilgængelighed, og vores omkostninger efter institutionelle rabatter udarbejdet til $ 9 USD / dyb brøndenhed. Disse selvmonterede PCR-pladeenheder af dyb brønd polypropylen har den ekstra fordel, at de kan autoklaveres til sterilisering og tilbyder 2-4 gange mere biofilmbiomasse end standardenheder.

Afslutningsvis viser denne protokol og de repræsentative resultater fra biofilmvækstsammenligninger af den dybe brønd og standard biofilmenheder, at begge enheder er i stand til at dyrke bakterielle biofilm, men dybe brøndenheder danner 2-4 gange mere biofilm. Den dybe brøndbiofilmenhed tilbyder et levedygtigt og overkommeligt alternativ til biofilmdannelsesforsøg med større volumen med høj gennemstrømning såsom screeningsundersøgelser for lægemiddelmodtagelighed. Denne teknik kan generere biofilm, der er nyttige til downstream-'omics'-ekstraktioner (proteomiske, metabolomiske, transkriptomiske) eller eksperimentelle assays (enzymatiske, fluorescerende), der kan kræve større mængder biofilmmaterialer til analyser. Den dybe brønd biofilm enhed anbefales til laboratorier, der gerne vil studere biofilm i en høj gennemstrømning 96-brønds assay ved hjælp af billigere, større volumen, kemisk holdbare plastmaterialer, der er klinisk relevante.

Disclosures

Forfatterne har ingen afsløringer at give.

Acknowledgments

Finansiering til dette arbejde blev ydet af driftstilskud til DCB fra Natural Science and Engineering Research Council of Canada Discovery Grant (RGPIN-2016-05891) og til MRM og GRG fra Government of Canadian Genomics Research and Development Initiative Grant (GRDI) -programmet (GRDI7 2254557).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10 mL serological pipets, individ wrap paper/plastic (200/CS) Fisher Scientific 13-678-11F disposable serological pipettes for aseptic media/ culture transfer
2 mL serological pipets, individ wrap paper/plastic, 500/CS Fisher Scientific 13-678-11C disposable serological pipettes for aseptic media/ culture transfer
Axygen Aerosol Filter Tips, Sterile, 5 racks/ PK, 1000 tips/rack Fisher Scientific 14-222-766 sterile pipettor tips for media aliquoting
Axygen deep well storage microplates, round wells, 1.1 mL cap, 5/PK, P-DW-11-C Fisher Scientific P-DW-11-C microplate for 96 well deepwell device biofilm cultivation
Axygen Filter tips, 350 µL tips racked, 96/rack, 10 racks, low retention barrier tips Fisher Scientific TF-350-L-R-S sterile pipettor tips for media aliquoting
Basin/reservoir natural PS 50 mL, Sterile, 5/bag, 40 bags, CS200 Avantor/ VWR 89094-676 sterile basins/ reservoirs for microplate preparation
BD Difco Dehydrated Culture Media: Granulated Agar, 500 g Fisher Scientific DF0145-17-0 materials for LB agar preparation
Biotek Synergy Neo2 multimode plate reader Biotek NEO2MB microplate UV/Vis region plate reader
Branson M3800 Ultrasonic Bath, 117 V Avantor/ VWR CPX-952-316R sonicating water bath
crystal violet (CV), ACS grade, 100 g Fisher Scientific C581-100 biofilm biomass stain
Dimethyl sulfoxide (DMSO), 1 L, ACS grade 99.9%, poly bottle, BDH Avantor/ VWR CABDH1115-1LP media components for cryopreservation
Easypet 3, pipet controller Avantor/ VWR CA11027-980 serological pipettor for aseptic media/ culture transfer
Eppendorf Research Plus 8 multi-channel pipettor , 10-100 µL Avantor/ VWR CA89125-338 multichannel pipettes for aseptic media/ culture transfer
Eppendorf Research Plus 8 multi-channel pipettor , 30-300 µL Avantor/ VWR CA89125-340 multichannel pipettes for aseptic media/ culture transfer
Glacial acetic acid, CAS 64-19-7, 2.5L, ACS grade Fisher Scientific A38-212 CV destain
Glass test tubes, 150 mm x 18 mm, 72/Pack, PYREX Fisher Scientific 14957H/ 9820-18 materials for cell culturing
Glycerol, 4 L glass bottle ACS Fisher Scientific BP229-4 media components for cryopreservation
L-Cysteine, 98%, 250 g Avantor/ VWR 97061-204 universal neutralizing solution
L-glutathione reduced, 98%, 25 g Fisher Scientific AAJ6216614 universal neutralizing solution
L-Hisitidine, 98%, 100 g Avantor/ VWR CA97062-598 universal neutralizing solution
MBEC Assay Inoculator with 96 well tray, 100/CS Innovotech 19112 material for 96 well MBEC device biofilm cultivation
McFarland Standard, 0.5 EA Fisher Scientific R20410 cell culture standardization
McFarland Standard, 1.0 EA Fisher Scientific R20411 cell culture standardization
NUNC 96-well microtiter plates, w/lid, 50/CS Fisher Scientific 167008 microplate for 96 well MBEC device biofilm cultivation and OD measurements
PCR plate, semi-skirted 96 well, fast PCR, polypropylene, 25ea/PK Sarstedt 72.1981.202 pegged lid for 96 well deepwell device biofilm cultivation
Petri dish, 100 mm x 15 mm, semi-TK CS/500 Fisher Scientific FB0875712 materials for LB agar preparation
Potassium phosphate dibasic, ACS 500 g Fisher Scientific P288-500 PBS component/ buffer
Sodium chloride, ACS grade, 3 kg Fisher Scientific S2713 media components for LB broth and PBS
sodium phosphate monobasic, 1 kg Fisher Scientific S369-1 PBS component/ buffer
Syringe filters, Sterile, PES 0.45 um, 25 mm, PK50 Avantor/ VWR 28145-505 non-autoclavable solution sterilization
Tin foil, heavy duty, 50 feet Grocery store --- materials for deepwell device sterilization
Tryptone (peptone from casein), 2.2 kg/EA Fisher Scientific B11922 media components for LB broth
Tween-20, 100 mL Fisher Scientific BP337-100 recovery media solution
Ultra-deepwell, 2.5 mL deep well plates (square well), with lid, polypropylene, 10/CS Avantor/ VWR 37001-520 materials for biofilm dilution preparation
Yeast Extract, Fisher Bioreagents, 500 g Fisher Scientific BP1422-500 media components for LB broth

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Verderosa, A. D., Totsika, M., Fairfull-Smith, K. E. Bacterial Biofilm Eradication Agents: A Current Review. Frontiers in Chemistry. 7, 1-17 (2019).
  2. Sharma, D., Misba, L., Khan, A. U. Antibiotics versus biofilm: An emerging battleground in microbial communities. Antimicrobial Resistance and Infection Control. 8 (1), 1-10 (2019).
  3. Fux, C. A., Costerton, J. W., Stewart, P. S., Stoodley, P. Survival strategies of infectious biofilms. Trends in Microbiology. 13 (1), 34-40 (2005).
  4. Lagacé-Wiens, P. R. S., et al. Trends in antimicrobial resistance over 10 years among key bacterial pathogens from Canadian hospitals: results of the CANWARD study 2007-16. The Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 74, Suppl 4 22-31 (2019).
  5. Karlowsky, J. A., et al. In vitro susceptibility of urinary Escherichia coli isolates to first- and second-line empirically prescribed oral antimicrobials: CANWARD surveillance study results for Canadian outpatients, 2007-2016. International Journal of Antimicrobial Agents. 54 (1), 62-68 (2019).
  6. Mah, T. F. Biofilm-specific antibiotic resistance. Future Microbiology. 7 (9), 1061-1072 (2012).
  7. Amato, S. M., et al. The role of metabolism in bacterial persistence. Frontiers in Microbiology. 5, 1-9 (2014).
  8. Flemming, H. -C., Neu, T. R., Wozniak, D. J. The EPS matrix: The "house of biofilm cells.". Journal of Bacteriology. 189 (22), 7945-7947 (2007).
  9. Dela Fuente-Núñez, C., Reffuveille, F., Fernández, L., Hancock, R. E. W. Bacterial biofilm development as a multicellular adaptation: Antibiotic resistance and new therapeutic strategies. Current Opinion in Microbiology. 16 (5), 580-589 (2013).
  10. Høiby, N., et al. The clinical impact of bacterial biofilms. International Journal of Oral Science. 3 (2), 55-65 (2011).
  11. Merritt, J. H., Kadouri, D. E., O'Toole, G. A. Growing and analyzing static biofilms. Current Protocols in Microbiology. 01, Unit 1B.1 (2005).
  12. Coffey, B. M., Anderson, G. G. Biofilm formation in the 96-well microtiter plate. Methods in Molecular Biology. 1149, 631-641 (2014).
  13. O'Toole, G. A. Microtiter dish Biofilm formation assay. Journal of Visualized Experiments. (47), e2437 (2010).
  14. Azeredo, J., et al. Critical review on biofilm methods. Critical Reviews in Microbiology. 43 (3), 313-351 (2017).
  15. Harrison, J. J., Turner, R. J., Ceri, H. High-throughput metal susceptibility testing of microbial biofilms. BMC Microbiology. 5 (53), (2005).
  16. Ceri, H., et al. The MBEC Assay System: Multiple Equivalent Bioffims for Antibiotic and Biocide Susceptibility Testing. Methods in Enzymology. 337, 377-385 (2001).
  17. Harrison, J. J., et al. Microtiter susceptibility testing of microbes growing on peg lids: a miniaturized biofilm model for high-throughput screening. Nature Protocols. 5 (7), 1236-1254 (2010).
  18. vanden Driessche, F., Rigole, P., Brackman, G., Coenye, T. Optimization of resazurin-based viability staining for quantification of microbial biofilms. Journal of Microbiological Methods. 98, (2014).
  19. Sabaeifard, P., Abdi-Ali, A., Gamazo, C., Irache, J. M., Soudi, M. R. Improved effect of amikacin-loaded poly(D,L-lactide-co-glycolide) nanoparticles against planktonic and biofilm cells of Pseudomonas aeruginosa. Journal of Medical Microbiology. 66 (2), 137-148 (2017).
  20. Thieme, L., et al. MBEC Versus MBIC: the Lack of Differentiation between Biofilm Reducing and Inhibitory Effects as a Current Problem in Biofilm Methodology. Biological Procedures Online. 21 (1), 18 (2019).
  21. Jennings, M. C., Ator, L. E., Paniak, T. J., Minbiole, K. P. C., Wuest, W. M. Biofilm-eradicating properties of quaternary ammonium amphiphiles: Simple mimics of antimicrobial peptides. Chembiochem. 15 (15), 2211-2215 (2014).
  22. Lineback, C. B., et al. Hydrogen peroxide and sodium hypochlorite disinfectants are more effective against Staphylococcus aureus and Pseudomonas aeruginosa biofilms than quaternary ammonium compounds. Antimicrobial Resistance & Infection Control. 7 (1), 154 (2018).
  23. Minbiole, K. P. C., et al. From antimicrobial activity to mechanism of resistance: The multifaceted role of simple quaternary ammonium compounds in bacterial eradication. Tetrahedron. 72 (25), 3559-3566 (2016).
  24. Mangalappalli-Illathu, A. K., Korber, D. R. Adaptive resistance and differential protein expression of Salmonella enterica serovar enteritidis biofilms exposed to benzalkonium chloride. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 50 (11), 3588-3596 (2006).
  25. El-Banna, T., Abd El-Aziz, A., Sonbol, F., El-Ekhnawy, E. Adaptation of Pseudomonas aeruginosa clinical isolates to benzalkonium chloride retards its growth and enhances biofilm production. Molecular Biology Reports. 46, 3437-3443 (2019).
  26. Ebrahimi, A., et al. Effects of benzalkonium Chloride on planktonic growth and biofilm formation by animal bacterial pathogens. Jundishapur Journal of Microbiology. 8 (2), 59764 (2015).
  27. Reśliński, A., et al. Evaluation of Staphylococcus aureus and Escherichia coli biofilm formation on the surface of polypropylene mesh. Medycyna doświadczalna i mikrobiologia. 63 (1), 21-27 (2011).
  28. Verhorstert, K. W. J., et al. In vitro bacterial adhesion and biofilm formation on fully absorbable poly-4-hydroxybutyrate and nonabsorbable polypropylene pelvic floor implants. Cite This: ACS Applied Materials & Interfaces. 12, 53646-53653 (2020).
  29. Arkatkar, A., Juwarkar, A. A., Bhaduri, S., Uppara, P. V., Doble, M. Growth of Pseudomonas and Bacillus biofilms on pretreated polypropylene surface. International Biodeterioration & Biodegradation. 64 (6), (2010).
  30. Jones, J. F., et al. Oriented adhesion of Escherichia coli to polystyrene particles. Applied and Environmental Microbiology. 69 (11), 6515-6519 (2003).
  31. Zameer, F., et al. Evaluation of adhesive and anti-adhesive properties of Pseudomonas aeruginosa biofilms and their inhibition by herbal plants. Iranian Journal of Microbiology. 8 (2), 108-119 (2016).
  32. Arkatkar, A., Juwarkar, A. A., Bhaduri, S., Uppara, P. V., Doble, M. Growth of Pseudomonas and Bacillus biofilms on pretreated polypropylene surface. International Biodeterioration and Biodegradation. 64 (6), 530-536 (2010).
  33. Dieterich, M., et al. Implant-Based Breast Reconstruction Using a Titanium-Coated Polypropylene Mesh (TiLOOP Bra). Plastic and Reconstructive Surgery. 132 (1), 8-19 (2013).
  34. Clavé, A., et al. Polypropylene as a reinforcement in pelvic surgery is not inert: comparative analysis of 100 explants. International Urogynecology Journal. 21 (3), 261-270 (2010).
  35. Zameer, F., et al. Evaluation of adhesive and anti-adhesive properties of Pseudomonas aeruginosa biofilms and their inhibition by herbal plants. Iranian Journal of Microbiology. 8 (2), 108-119 (2016).
  36. Chen, R., Liu, X., Han, L., Zhang, Z., Li, Y. Morphology, thermal behavior, rheological, and mechanical properties of polypropylene/polystyrene blends based on elongation flow. Polymers for Advanced Technologies. 31 (11), 2722-2732 (2020).
  37. Vial Loading Trays Polystyrene vs. polypropylene: Which tubes are best for your research. ChemTech International. , Available from: https://chemtech-us.com/polystyrene-vs-polypropylene-which-tubes-are-best-for-your-research/ (2020).
  38. Bock, L. J., Hind, C. K., Sutton, J. M., Wand, M. E. Growth media and assay plate material can impact on the effectiveness of cationic biocides and antibiotics against different bacterial species. Letters in Applied Microbiology. 66 (5), 368-377 (2018).
  39. Prahl, S. Crystal violet. , Available from: https://omic.org/spectra/PhotochemCAD/html/048.html (2017).

Tags

Immunologi og infektion udgave 182 biofilm MBEC biofilmbiomasse biofilmudryddelsesassay Pseudomonas aeruginosa Escherichia coli krystalviolet farvning polystyren polypropylen blegemiddel
Generering af større bakteriel biofilmbiomasse ved hjælp af PCR-plade deep well mikropladeenheder
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Doucet, A. N., Slipski, C. J.,… More

Doucet, A. N., Slipski, C. J., Golding, G. R., Mulvey, M. R., Bay, D. C. Generation of Greater Bacterial Biofilm Biomass using PCR-Plate Deep Well Microplate Devices. J. Vis. Exp. (182), e63069, doi:10.3791/63069 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter