Summary
Denne protokollen beskriver en metode for å utføre brudd på voksne mus og overvåke helbredelsesprosessen.
Abstract
Bruddreparasjon er en viktig funksjon av skjelettet som ikke kan modelleres pålitelig in vitro. En museskademodell er en effektiv tilnærming for å teste om et gen, genprodukt eller stoff påvirker beinreparasjon fordi murinbein rekapitulerer stadiene som observeres under menneskelig bruddheling. Når en mus eller et menneske bryter et bein, startes en inflammatorisk respons, og periosteum, en stamcellenisje rundt selve beinet, aktiveres og utvides. Celler som ligger i periosteum skiller seg deretter ut for å danne en vaskulær myk callus. Overgangen fra myk callus til en hard callus oppstår når de rekrutterte skjelettforfedercellene skiller seg ut i mineraliseringsceller, og sammenslåingen av de oppsprukne endene resulterer i beinforeningen. Den mineraliserte callus gjennomgår deretter ombygging for å gjenopprette den opprinnelige formen og strukturen til det helbredede beinet. Bruddheling har blitt studert hos mus ved hjelp av ulike skademodeller. Likevel er den beste måten å rekapitulere hele denne biologiske prosessen å bryte gjennom tverrsnittet av et langt bein som omfatter begge kortikalene. Denne protokollen beskriver hvordan en stabilisert, tverrgående lårbensbrudd trygt kan utføres for å vurdere helbredelse hos voksne mus. En kirurgisk protokoll med detaljerte høstings- og bildeteknikker for å karakterisere de forskjellige stadiene av bruddheling er også gitt.
Introduction
Frakturer, brudd i kontinuiteten i beinoverflaten, forekommer i alle segmenter av befolkningen. De blir alvorlige hos personer som har skjøre bein på grunn av aldring eller sykdom, og helsekostnadene ved skjørhetsfrakturer forventes å overstige $ 25 milliarder på 5 år 1,2,3,4,5. Å forstå de biologiske mekanismene som er involvert i bruddreparasjon ville være et utgangspunkt i å utvikle nye terapier med sikte på å forbedre helbredelsesprosessen. Tidligere forskning har vist at ved brudd oppstår fire betydelige trinn som gjør det mulig for bein å helbrede: (1) dannelse av hematomet; (2) dannelse av en fibrokartilaginøs callus; (3) mineralisering av den myke callus å danne bein; og (4) ombygging av det helbredede beinet 6,7. Mange biologiske prosesser aktiveres for å helbrede bruddet med hell. For det første initieres en akutt proinflammatorisk respons umiddelbart etter et brudd 6,7. Deretter blir periosteum aktivert og utvides, og periosteale celler skiller seg ut i kondrocytter for å danne en brusk callus som vokser for å fylle gapet igjen av de forstyrrede beinsegmentene 6,7,8,9. Nevrale og vaskulære celler invaderer den nyopprettede callus for å gi flere celler og signalmolekyler som trengs for å lettereparasjonen 6,7,8,9,10. I tillegg til å bidra til callusdannelse, skiller periosteale celler seg også i osteoblaster som legger ned vevd bein i broskallet. Til slutt omdanner osteoklaster det nydannede beinet for å gå tilbake til sin opprinnelige form og lamellarstruktur 7,8,9,10,11. Mange grupper utviklet musemodeller for bruddreparasjon. En av de tidligere og oftest brukte bruddmodellene hos mus er Einhorn-tilnærmingen, hvor en vekt faller på benet fra en bestemt høyde12. Mangelen på kontroll over vinkelen og kraften som påføres for å indusere bruddet skaper mye variasjon i plasseringen og størrelsen på benavbruddet. Deretter resulterer det i variasjoner i den spesifikke bruddhelingsresponsen som observeres. Andre populære tilnærminger er kirurgisk inngrep for å produsere en tibial monokortisk defekt eller stressfrakturer, prosedyrer som induserer relativt mildere helbredende responser10,13. Variasjon i disse modellene skyldes hovedsakelig personen som utfører prosedyren14.
Her gir en detaljert femurskademodell for mus kontroll over pausen for å gi en reproduserbar skade og muliggjøre kvantitativ og kvalitativ vurdering av femurbruddreparasjon. Spesielt blir et komplett gjennombrudd i lårbenene til voksne mus introdusert og stabiliserer bruddendene for å ta hensyn til rollen fysisk lasting spiller i beinheling. Metodene for høsting av vev og avbildning av de ulike trinnene i helbredelsesprosessen ved hjelp av histologi og mikrocomputert tomografi (microCT) er også gitt i detalj.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dyreforsøk som er beskrevet ble godkjent av Institutional Animal Care and Use Committee i Harvard Medical Area. 12 uker gamle C57BL/6J mus (menn og kvinner) ble brukt i denne protokollen. C57BL/6J hann- og hunnmus oppnår topp benmasse rundt 12 ukers alder med lårben bred nok til å passe til en stabiliserende pinne, noe som gjør dem til en passende belastning å bruke for denne protokollen15.
1. Forberedelse til operasjonen
- Autoklaver det kirurgiske utstyret, inkludert kirurgisk saks, rette tang, buede tang, kirurgiske klemmer og diamantskjæreskive (se Materialtabell) for å minimere risikoen for infeksjon.
- Plasser et rent musebur på en varmepute for å lette postkirurgisk gjenoppretting. Still inn varmeputen for å nå en temperatur mellom 37-45 °C.
- Plasser musen under anestesi ved hjelp av et isoflurankammer. Sett induksjonsoksygenstrømmen på 2 L/min, isofluraninduksjonen på 2-4%, vedlikeholdsnesegleoksygenet ved 2 L/min, og vedlikeholdsisofluranen er 1,4%.
- Bekreft at musens pust er stabil, og at de ikke reagerer på en tåklemme. Påfør et tynt lag oftalmisk salve på hvert øye for å forhindre hornhinnen riper. Overfør musen til en steril pute og vedlikehold anestesi ved hjelp av en nesekegle for å levere isofluran kontinuerlig i samme hastighet som i trinn 1.3.
MERK: Bruk av 12 uker gamle mus eller eldre anbefales, da lårben fra yngre mus kan være for tynne til å imøtekomme en stabiliserende pinne. - Injiser musen subkutant med 0,05 mg/kg kroppsvekt av langsomt frigjørende buprenorfin (se materialtabellen).
- Bruk en elektrisk trimmer, barber en 2 x 2 cm firkant på begge lårene som tilsvarer plasseringen av lårbenet.
- Desinfiser det barberte området ved hjelp av steril gasbind eller vattpinner for å spre et lag jod etterfulgt av en skylling med 70% etanol (figur 1A).
2. Kirurgi
- Bruk en steril skalpell, lag et 5 mm snitt i det barberte, desinfiserte området og skrell bort huden for å eksponere den underliggende fascia.
- Bruk rette tang og fin saks for å forsiktig gripe og kutte fasciaen som direkte dekker lårbenet for å eksponere muskelen. Et 5 mm kutt av fascia er tilstrekkelig til å få tilgang til den underliggende muskelen.
- Bruk ett par rette tang, forsiktig skille muskelen fra lårbenet med minimal vevsskade.
- Når lårbenet er synlig, skyver du de buede tangene under lårbenet mellom den separerte muskelen og beinet. La tangene sakte åpne for å opprettholde muskelseparasjon og sikre lårbenet for å lette et rent kutt.
MERK: Lårbenet må holde seg eksponert og adskilt fra muskelen og huden når tangene ikke holdes, som vist i figur 1B. - Lag et tverrsnitt midt i lårbenskaftet ved hjelp av en håndholdt sag på laveffektsinnstillingen (se Materialtabell for bladet og roterende verktøysett som brukes).
MERK: Når lårbenet er helt kuttet, opprettes to bruddender: den proksimale delen (festet til hoftebenet) og den distale delen (festet til kneet, også kjent som stifle-leddet). Unngå å kutte lårbenet i en enkelt bevegelse. I stedet, gjør 3-5 passerer til lårbenet er helt kuttet gjennom. Dette er avgjørende for å unngå overoppheting av det omkringliggende vevet og generere betydelig benrester, noe som påvirker helbredelsen negativt. - Sett inn en føringsnål (23 G x 1 TW IM, 0,6 mm x 25 mm) (se Materialtabell) i marghulen i den distale delen. Bruk fingrene til å vri kanylen forsiktig mens du skyver for å tre gjennom kneleddet (figur 1C).
- Fjern føringsnålen fra den distale enden og gjenta på den proksimale enden, bruk den samme milde vridningsbevegelsen for å skyve ledenålen gjennom hofteleddet. La ledenålen ligge i den proksimale enden, med spissen kommet ut av huden (figur 1D).
MERK: For å stabilisere bruddendene ble en føringsnål først brukt til å lage en bane gjennom bruddendene, og deretter ble en stabiliserende pinne gjenget gjennom denne banen for å sikre bruddendene14.
- Fjern føringsnålen fra den distale enden og gjenta på den proksimale enden, bruk den samme milde vridningsbevegelsen for å skyve ledenålen gjennom hofteleddet. La ledenålen ligge i den proksimale enden, med spissen kommet ut av huden (figur 1D).
- Sett inn stabiliseringspinnen (nål, 27 G x 1 1/4, 0,4 mm x 30 mm) (se Materialbord) i tuppen av føringsnålen (figur 1E). Skyv forsiktig slik at den stabiliserende pinnen kommer inn når føringsnålen går ut av marghulen i den proksimale enden.
- Kast føringsnålen. Bruk pinsett til å holde og justere den distale enden med den proksimale enden og fortsett å tre stabiliseringspinnen gjennom det distale marghulen til den går ut av kneleddet ved hjelp av banen som er laget i 2.6 (figur 1F).
MERK: Den stabiliserende pinnen skal nå stikke ut fra hoften og kneleddene.
- Kast føringsnålen. Bruk pinsett til å holde og justere den distale enden med den proksimale enden og fortsett å tre stabiliseringspinnen gjennom det distale marghulen til den går ut av kneleddet ved hjelp av banen som er laget i 2.6 (figur 1F).
- Bruk den kirurgiske klemmen til å trekke spissen av pinnen for å bringe de proksimale og distale delene tett sammen, slik at de knapt berører. Omjuster bruddendene med tang om nødvendig, og brett endene av stabiliseringspinnen mot bruddstedet ved hjelp av den kirurgiske klemmen (se Materialtabellen).
- Fjern plasten fra bunnen av nålen ved hjelp av trådkuttere. Bruk klemmen til å vri begge ender av pinnen til de er stumpe for å unngå indre vevsskader.
MERK: Bruddendene er nå låst slik at musen kan legge vekt på det skadde benet. Pinnen er sikret hvis bruddendene ikke kan skilles. En trådkutter kan også brukes til å stumpe endene. Den stabiliserende pinnen må holde seg på plass i hele studiens varighet til musen er euthanized. Forsøk på å løsne pinnen vil sannsynligvis destabilisere bruddresponsen og forårsake skade på dyret. Pinnen kan fjernes ved disseksjon.
- Fjern plasten fra bunnen av nålen ved hjelp av trådkuttere. Bruk klemmen til å vri begge ender av pinnen til de er stumpe for å unngå indre vevsskader.
- Bruk rette tang for å omplassere muskelen på lårbenet. Bruk buede tang, klem endene av huden sammen og lukk åpningen ved hjelp av sårklemmer.
MERK: Ikke lukk huden for tett med klipsene, ellers vil musen unngå å legge vekt på dette benet. Hvis du begrenser fysisk belastning under gjenoppretting, kan det forsinke helbredelsesprosessen. - Gjenta trinn 2.2 til 2.4 på det andre benet og lukk såret uten å utføre lårbensbruddet.
MERK: Denne sham-opererte lårbenet fungerer som kontralateral kontroll. - Trekk isofluraneksponeringen, plasser musen i det oppvarmede buret, og sørg for at de gjenvinner bevisstheten innen 10-15 min.
- Overvåk musens aktivitet og snittsted daglig i 5 dager etter operasjonen for tegn på nød eller infeksjon.
MERK: Hvis dyret viser tegn på smerte, ikke spiser, og / eller nøler med å gå på bakbenene, kontakt veterinærpersonell og administrer ekstra smertestillende midler. - Fjern sårklemmene 10 dager etter operasjonen.
MERK: Hvis såret ikke ser ut til å ha lukket seg etter 10 dager, må du ta kontakt med veterinærpersonen og IACUC før du fjerner klipsene.
3. Vevshøsting
- Euthanize musene via CO2 innånding etterfulgt av cervical dislokasjon.
MERK: Denne prosedyren er i samsvar med panelet om eutanasi av American Veterinary Medical Association. - Bruk saks og tang, fjern huden fra begge musebenene, disloker lårhodet fra hoftebenet, og kutt tilstøtende muskel for å frigjøre benet.
MERK: Unngå å fjerne for mye muskler rundt lårbenet, da callus kan løsnes eller skades. - Unngå stabiliseringspinnen, kutt gjennom kneleddet for å skille lårbenet fra tibia.
- Disseker rundt de distale og proksimale delene av lårbenet for å eksponere endene av stabiliseringspinnen.
- Med en hard trådkutter kutter, kutt de brettede stumpe endene av pinnen slik at bare den rette delen av pinnen forblir. Bruk tang til å skyve stabiliseringspinnen langsomt ut av lårbenet.
MERK: Hvis pinnen ikke lett glir ut, må du ikke bruke kraft, da dette kan løsne callusen og skade prøven. Prøv i stedet å rotere pinnen og fjern den delikat. Fjerning av pinnen kan også være lettere etter fiksering.
4. Histologi - Alcian Blue / Eosin / Orange G farging
MERK: Alcian Blue/Orange G/Eosin farging brukes rutinemessig til å visualisere brusk (blå) og beinet (rosa). Bruskområdet kan kvantifiseres som en andel av det totale callus-området (figur 2A,B).
- Fest lårben i 10% nøytral bufret formalin over natten ved 4 °C.
- Vask de faste prøvene i fosfatbufret saltvann (PBS).
- Plasser prøver i 0,5 M EDTA, pH 8.0 på en sakte roterende shaker i 2 uker. Endre EDTA-løsningen annenhver dag for å sikre effektiv avkalking.
MERK: Ingen spesifikk turtall er nødvendig for shakeren; påse at væsken strømmer i beholderen for å dekke alle prøvene. Fullstendig avkalking kan testes ved røntgen av lårbenene. - For å behandle prøvene for parafininnbygging inkuberer du dem i følgende løsninger (1 t hver): 70% EtOH, 95% EtOH, 100% EtOH, 100% EtOH, Xylene, Xylen, Paraffin, Paraffin.
- Bygg inn prøvene i parafin for seksjonering.
- Klipp 5-7 μm tykke langsgående deler av de oppsprukne lårbenene ved hjelp av en mikrotomi.
- Deparaffiner seksjonene ved å inkubere dem i 2 bad av Xylen (5 min hver).
- Rehydrer seksjonene ved å inkubere i følgende etanolgradient (2 min hver): 100% EtOH, 100% EtOH, 80% EtOH, 70% EtOH.
- Plasser sklier i vann fra springen i 1min.
- Lag løsningene til Alcian blå, Acid alkohol, Ammonium vann, og Eosin / Orange G for histologi som nevnt i Supplementary File 1.
MERK: De foreslåtte volumene til hver løsning bør være tilstrekkelig til å senke skliene helt ned for fargingen. - Plasser sklier i syrealkohol i 30 s og inkuber i alciansk blå i 40 min.
- Vask forsiktig under rennende kran til vannet er klart i ca. 2 min.
- Dypp lysbildene raskt i Syrealkohol i 1 s.
- Skyll som beskrevet i trinn 4.9.
- Inkuber i ammoniumvann i 15 s.
- Skyll som beskrevet i trinn 4.9.
- Plasser i 95% EtOHfor 1 min og inkuber i Eosin / Orange G i 90 s.
- Dehydrer lysbildene raskt med en enkelt dukkert i 70% EtOH, 80% EtOH og 100% EtOH.
- Plasser lysbildene i Xyllene i 1 min for å fjerne lysbildene.
- Bruk monteringsmedier og en deksleslip for avbildning.
MERK: For molekylær analyse kan RNA og protein isoleres fra callus. Disseker muskelen forsiktig under et dissekeringsomfang og skille callus fra det underliggende beinet ved hjelp av en skalpell.
5. MikroCT
MERK: I de senere stadiene av helbredelse kan mikroCT utføres for å bilde og kvantifisere mineraliseringen i den harde callus og bruddgapet. I C57BL/6J-mus mineraliseres og påvises callus vanligvis av microCT etter 10 dager etter brudd (dpf) (figur 2C).
- Fest lårben i 10% nøytral bufret formalin over natten ved 4 °C.
MERK: MicroCT kan utføres på de samme lårbenene som brukes til histologi så lenge det gjøres før EDTA-avkalking (trinn 4.3). Når du bruker de samme lårbenene for begge teknikkene, utfør microCT, hent prøvene og gå til trinn 4.3. - Vask de faste prøvene i fosfatbufret saltvann (PBS) og oppbevar i 70% EtOH.
- Utfør mikroCT med en isotrop voxelstørrelse på 7 μm på et energinivå på 55 kVP og en intensitet på 145 μA (se materialtabellen).
- Konturer mikroCT-skivene for å inkludere callus og utelukke det kortikale beinet.
MERK: Etter hvert som callus blir mer mineralisert med tiden, kan terskelen justeres for å visualisere og måle callusvolumet på forskjellige stadier. - Oppnå benvolumet i callus konturene som et mål på callusvolumet.
MERK: Bruddgapet kan måles direkte på mikro-CT-skiver som avstanden som er okkupert av pausen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I C57BL/6J-mus fullfører en vellykket operasjon de helbredende trinnene som er nevnt tidligere, med liten eller ingen lokal inflammatorisk respons eller periostealt involvering i den sham-opererte kontralaterale lårbenet. Et hematom dannes noen timer etter operasjonen, og periosteum aktiveres for å rekruttere skjelettforfedere til kondrogenese. Ulike cellepopulasjoner, for eksempel Prx1+ mesenchymale forfedre, kan spores under reparasjonsprosessen ved hjelp av kommersielt tilgjengelige fluorescerende reportermusmodeller (figur 3). Ved 5 dager etter brudd (dpf) kan alcianblå farging brukes til å visualisere den myke callus og deretter kvantifisere bruskområdet (figur 2A, B). Mineralisering kan påvises ved microCT ved 28 dpf (figur 2C). Volumet av den mineraliserte callus, avstanden til bruddgapet og beinstyrken målt ved mekanisk testing brukes ofte som kvantifiserbare utfall av bruddreparasjon. Genetisk modifikasjon eller legemiddelintervensjon kan endre gjenopprettingsforløpet, så det anbefales å utføre en tidsforløpstudie for å karakterisere brudd på ulike stadier av reparasjon. Hele callus kan dissekeres for molekylær analyse, og den kontralaterale beinakselen kan brukes som kontroll. Hvis bruddendene ikke er justert eller tilstrekkelig sikret med pinnen, vil de resulterende bildene vise mangel på callusformasjon på hele eller den ene siden av bruddstedet (figur 4).
Figur 1: Brudd og innsetting av stabiliseringspinnen. (A) En firkant barberer seg på høyre ben på en C57BL/6J-mus. (B) Etter at et snitt er gjort i huden og fascia, er buede tang sikret under lårbenet for å skille muskel, hud og bein. (C) Etter at kuttet er gjort, opprettes to bruddender: den proksimale delen av lårbenet festet til hoftebenet og den distale delen festet til kneet. Føringsnålen (grønn) settes inn i den distale delen og skyves gjennom kneleddet. (D) Føringsnålen fjernes fra den distale delen, settes inn i den proksimale delen og skyves gjennom hofteleddet. (E) Stabiliseringspinnen (grå nål) settes inn i føringsnålen som stikker ut fra hofteleddet. (F) Den stabiliserende pinnen skyves gjennom den proksimale delen, inn i den distale delen, og gjennom kneleddet ved hjelp av banen laget av ledenålen i C. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Histologi og mikroCT av lårbensbrudd. (A) Formalinfaste parafindeler av lårbensfrakturer ble samlet inn ved 5, 10 og 28 dpf og farget med Alcian Blue/Eosin/Orange G. Scale bar = 500 μm. (B) Bruskområdet ble kvantifisert ved hjelp av ImageJ-programvare ved 5, 10 og 28 dpf. (C) Ved 28 dpf ble mineralisering observert, og callusvolumet og bruddgapet kunne måles ved microCT. Skalastang = 1000 μm. Data vist som Gjennomsnittlig ± SEM. Det mineraliserte callusvolumet ble målt ved konturering rundt det kortikale beinet på bruddstedet. Det mørkegrå området avgrenser den mineraliserte callusen på bildet, mens det kortikale beinet (lysegrått) ikke er inkludert i målingen. Data vist som Mean ± SEM. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Fluorescerende reportermodell som brukes til å visualisere utvidelse av Prx1+ periosteale celler etter brudd. Prx1CreER; Rosa26tdTomato mus ble injisert daglig i fem dager med 80 mg / kg kroppsvekt av tamoxifen for å indusere tdTomato uttrykk. Tre dager etter den endelige injeksjonen ble lårbensbrudd igangsatt, og mus ble ofret ved 7 eller 14 dpf for å spore hvor Prx1-uttrykkende celler og deres avkom (Prx1 +) ligger innenfor brudd callus og utvidet periosteum. Skalastang = 500 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Eksempel på uregelmessig helbredelse på grunn av kirurgiske problemer. Bruddendene ble ikke riktig justert, og stabiliseringspinnen gjennomboret gjennom den proksimale delen av lårbenet i dette eksemplet. Disse feilene resulterte i callusformasjon der lårbenet ble gjennomboret (gul boks) i stedet for på kuttstedet. Skalastang = 500 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Tilleggsfil 1: Sammensetning av løsningene som kreves for histologi. Klikk her for å laste ned denne filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Skademodellen som er beskrevet i denne protokollen omfatter alle de fire signifikante trinnene som observeres under helbredelsen av spontane brudd, inkludert (1) proinflammatorisk respons med dannelsen av hematom, (2) rekruttering av skjelettforfedre fra periosteum for å danne myk callus, (3) mineralisering av callus av osteoblaster og (4) ombygging av beinet av osteoklaster.
Den kirurgiske prosedyren beskrevet i dette manuskriptet er optimalisert for voksne mus minst 12 uker gamle. En 27 G x 1 1/4 (0,4 mm x 30 mm) nål brukes som stabiliserende pinne fordi den er den ideelle størrelsen for bredden på marghulen i denne alderen. Om nødvendig kan protokollen endres for yngre dyr hvis en tynnere stabiliseringspinne brukes. Stabiliseringspinnen er en viktig del av operasjonens suksess siden ustabilitet er kjent for å påvirke bruddheling16 betydelig. Andre stabiliseringsmetoder er gjennomgått og alle har sine fordeler og begrensninger 17,18,19. Den ideelle stabiliseringen bør velges ut fra problemstillingen og det eksperimentelle målet. En begrensning ved den beskrevne stabiliseringen her er at pinnen går gjennom vekstplatene og leddene. Hvis bidraget fra ledd- eller vekstplatebruskheten er bekymringsfullt, foreslår vi at du vurderer en annen stabiliserende metode.
Variasjon i kirurgisk teknikk og mellom dyr er en bekymring når du utfører denne operasjonen. Derfor anbefales det å bruke rikelig med tall, spesielt for kvantitative avlesninger, og å sammenligne lignende typer brudd på tvers av grupper. Det er viktig å feste lårbensdelene tett sammen for å unngå hull over 2 mm. Variasjon i hull mellom seksjoner kan ha betydelig innvirkning på størrelsen på callus og tidspunktet for reparasjon. Seksjonene bør også være riktig justert. Løse og feiljusterte brudd vil føre til større variasjon på tvers av prøver og kan svekke helbredelsen.
Vektbærende er også avgjørende for tidspunktet for beinheling og kan introdusere variasjon mellom mus. De fleste mus legger minimal vekt på det skadede beinet noen timer etter operasjonen, men bør gå normalt neste dag. Å bekrefte at musen beveger seg normalt og belastningen fordeles jevnt på begge beina er avgjørende, spesielt når du bruker den kontralaterale lårbenet som en sham-operert kontroll. I tillegg kan operasjonen utløse en systemisk betennelse som påvirker det kontralaterale benet. Det anbefales derfor å sammenligne sham-opererte lårben med ikke-opererte mus når du etablerer denne teknikken. Å ha ikke-opererte kontroller kan også være å foretrekke for kvantifiserbare resultater som effekter på RNA eller proteinuttrykk.
Konsistens av bruddgeometrien kan være utfordrende med andre metoder20, men bruk av en sag gir mer kontroll for kirurgen og lindrer variasjonen i påfølgende brudd. Sagtilnærmingen har også blitt brukt til å skape metafyseale brudd på de proksimale muse lårbenene med hell21.
Forskjeller mellom mannlige og kvinnelige mus i deres respons på bruddheling observeres sjelden. Imidlertid kan sex bli en faktor med alder og narkotikaintervensjon, så det anbefales sterkt å sammenligne dyr av samme kjønn eller utføre statistikk for å forhøre kjønnsforskjeller før du kombinerer prøver. Videre ble denne protokollen designet for C57BL6 / J-mus. Etterforskere som bruker andre musestammer, bør sammenligne helbredelse hos mannlige og kvinnelige mus for å identifisere eventuelle kjønnsforskjeller.
Vi mener at denne lårbruddsoperasjonen er en effektiv modell for å rekapitulere de betydelige helbredende trinnene hos mus og kan brukes til å teste effekten av genetiske modifikasjoner eller terapeutiske inngrep på bruddgjenoppretting hos mennesker.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen interessekonflikter å avsløre.
Acknowledgments
Vi takker Dr. Vicki Rosen for økonomisk støtte og veiledning med prosjektet. Vi vil også takke veterinær- og IACUC-ansatte ved Harvard School of Medicine for konsultasjon om steril teknikk, dyrevelferd og materialene som brukes til å utvikle denne protokollen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 23 G x 1 TW IM (0.6 mm x 2 5mm) needle | BD precision | 305193 | Use as guide needle |
| 27 G x 1 ¼ (0.4 mm x 30 mm) | BD precision | 305136 | Use as stabilizing pin |
| 9 mm wound autoclip applier/remover/clips kit | Braintree Scientific, INC | ACS-KIT | |
| Alcian Blue 8 GX | Electron Microscopy Sciences | 10350 | |
| Ammonium hydroxide | Millipore Sigma | AX1303 | |
| Circular blade X926.7 THIN-FLEX | Abrasive technologies | CELBTFSG633 | |
| DREMEL 7700-1/15, 7.2 V Rotary Tool Kit | Dremel | 7700 1/15 | |
| Eosin Y | ThermoScientific | 7111 | |
| Fine curved dissecting forceps | VWR | 82027-406 | |
| Hematoxulin Gill 2 | Sigma-Aldrich | GHS216 | |
| Hydrochloric acid | Millipore Sigma | HX0603-4 | |
| Isoflurane | Patterson Veterinary | 07-893-1389 | |
| Microsurgical kit | VWR | 95042-540 | |
| Orange G | Sigma-Aldrich | 1625 | |
| Phloxine B | Sigma-Aldrich | P4030 | |
| Povidone-Iodine Swabs | PDI | S23125 | |
| SCANCO Medical µCT35 | Scanco | ||
| Slow-release buprenorphine | Zoopharm |
References
- Black, D. M., Rosen, C. J.
- Curtis, E. M., Moon, R. J., Harvey, N. C., Cooper, C. The impact of fragility fracture and approaches to osteoporosis risk assessment worldwide. Bone. 104, 29-38 (2017).
- Laurent, M. R., Dedeyne, L., Dupont, J., Mellaerts, B., Dejaeger, M., Gielen, E. Age-related bone loss and sarcopenia in men. Maturitas. 122, 51-56 (2019).
- NOF - Just for men. National Osteoporosis Foundation. , Available from: https://cdn.nof.org/wp-content/uploads/2015/12/Osteoporosis-Fast-Facts.pdf (2019).
- Williams, S. A., et al. Economic burden of osteoporotic fractures in US managed care enrollees. The American Journal of Managed Care. 26, 142-149 (2020).
- Sheen, J. R., Garla, V. V.
- Holmes, D.
- Duchamp de Lageneste, O., et al. Periosteum contains skeletal stem cells with high bone regenerative potential controlled by Periostin. Nature Communications. 9, 773 (2018).
- Bahney, C. S., et al.
- Li, Z., et al. Fracture repair requires TrkA signaling by skeletal sensory nerves. Journal of Clinical Investigation. 129, 5137-5150 (2019).
- Colnot, C., Thompson, Z., Miclau, T., Werb, Z., Helms, J. A. Altered fracture repair in the absence of MMP9. Development. 130, 4123-4133 (2003).
- Bonnarens, F., Einhorn, T. A. Production of a standard closed fracture in laboratory animal bone. Journal of Orthopaedic Research. 2, 97-101 (1984).
- Hu, K., Olsen, B. R. Osteoblast-derived VEGF regulates osteoblast differentiation and bone formation during bone repair. Journal of Clinical Investigation. 126, 509-526 (2016).
- Collier, C. D., et al. Characterization of a reproducible model of fracture healing in mice using an open femoral osteotomy. Bone Reports. 12, 100250 (2020).
- Glatt, V., Canalis, E., Stadmeyer, L., Bouxsein, M. L. Age-related changes in trabecular architecture differ in female and male C57BL/6J mice. Journal of Bone and Mineral Research. 22, 1197-1207 (2007).
- Garcia, P., et al. A new technique for internal fixation of femoral fractures in mice: impact of stability on fracture healing. Journal of Biomechanics. 41, 1689-1696 (2008).
- Holstein, J. H., et al. Advances in the establishment of defined mouse models for the study of fracture healing and bone regeneration. Journal of Orthopaedic Trauma. 23, 31-38 (2009).
- Garcia, P., et al. Rodent animal models of delayed bone healing and non-union formation: a comprehensive review. European Cells & Materials. 26 (1-12), 12-14 (2013).
- Histing, T., et al. Ex vivo analysis of rotational stiffness of different osteosynthesis techniques in mouse femur fracture. Journal of Orthopaedic Research. 27, 1152-1156 (2009).
- Williams, J. N., Li, Y., Valiya Kambrath, A., Sankar, U. The Generation of closed femoral fractures in mice: A model to study bone healing. Journal of Visualized Experiments. (138), e58122 (2018).
- Haffner-Luntzer, M., et al. A novel mouse model to study fracture healing of the proximal femur. Journal of Orthopaedic Research. 38, 2131-2138 (2020).
