Summary
Bu protokol, yetişkin farelerde kırıkları gerçekleştirmek ve iyileşme sürecini izlemek için bir yöntem açıklar.
Abstract
Kırık onarımı, iskeletin in vitro olarak güvenilir bir şekilde modellenemeyen önemli bir işlevidir. Bir fare yaralanması modeli, bir genin, gen ürününün veya ilacın kemik onarımını etkileyip etkilemediğini test etmek için etkili bir yaklaşımdır, çünkü murin kemikleri insan kırığı iyileşmesi sırasında gözlenen aşamaları özetler. Bir fare veya insan bir kemiği kırdığında, enflamatuar bir yanıt başlatılır ve kemiğin kendisini çevreleyen bir kök hücre nişi olan periost aktive edilir ve genişler. Periosteumda bulunan hücreler daha sonra vaskülarize yumuşak bir nasır oluşturmak için farklılaşır. Yumuşak nasırdan sert bir nasır geçişi, işe alınan iskelet progenitör hücreleri mineralize edici hücrelere farklılaştıkça gerçekleşir ve kırık uçların köprülenmesi kemik birliği ile sonuçlanır. Mineralize nasır daha sonra iyileşen kemiğin orijinal şeklini ve yapısını eski haline getirmek için yeniden şekillenir. Kırık iyileşmesi, çeşitli yaralanma modelleri kullanılarak farelerde incelenmiştir. Yine de, tüm bu biyolojik süreci özetlemenin en iyi yolu, her iki korteksi de kapsayan uzun bir kemiğin enine kesitini kırmaktır. Bu protokol, yetişkin farelerde iyileşmeyi değerlendirmek için stabilize edilmiş, enine bir femur kırığının nasıl güvenli bir şekilde gerçekleştirilebileceğini açıklar. Kırık iyileşmesinin farklı aşamalarını karakterize etmek için ayrıntılı hasat ve görüntüleme tekniklerini içeren bir cerrahi protokol de sağlanmaktadır.
Introduction
Kırıklar, kemik yüzeyinin sürekliliğindeki kırılmalar, popülasyonun tüm segmentlerinde meydana gelir. Yaşlanma veya hastalık nedeniyle kırılgan kemikleri olan kişilerde şiddetlenirler ve kırılganlık kırıklarının sağlık bakım maliyetlerinin 5 yıl içinde 25 milyar doları aşması beklenmektedir 1,2,3,4,5. Kırık onarımında yer alan biyolojik mekanizmaların anlaşılması, iyileşme sürecini iyileştirmeyi amaçlayan yeni tedavilerin geliştirilmesinde bir başlangıç noktası olacaktır. Önceki araştırmalar, kırık üzerine, kemiğin iyileşmesini sağlayan dört önemli adımın gerçekleştiğini göstermiştir: (1) hematom oluşumu; (2) fibrokıkırdaklı nasır oluşumu; (3) kemik oluşturmak için yumuşak nasırın mineralizasyonu; ve (4) iyileşmiş kemiğin yeniden şekillenmesi 6,7. Kırığı başarılı bir şekilde iyileştirmek için birçok biyolojik süreç aktive edilir. İlk olarak, bir kırık 6,7'den hemen sonra akut bir pro-inflamatuar yanıt başlatılır. Daha sonra, periost aktive olur ve genişler ve periosteal hücreler, bozulmuş kemik segmentlerinin 6,7,8,9 tarafından bırakılan boşluğu doldurmak için büyüyen bir kıkırdak nasır oluşturmak için kondrositlere farklılaşır. Nöral ve vasküler hücreler, onarımı kolaylaştırmak için gereken ek hücreleri ve sinyal moleküllerini sağlamak için yeni oluşan nasırları istila eder 6,7,8,9,10. Nasır oluşumuna katkıda bulunmanın yanı sıra, periosteal hücreler ayrıca köprüleme nasırında dokunmuş kemiği bırakan osteoblastlara da farklılaşır. Son olarak, osteoklastlar yeni oluşan kemiği orijinal şekline ve lamel yapısına 7,8,9,10,11 geri döndürmek için yeniden şekillendirir. Birçok grup kırık onarımı için fare modelleri geliştirdi. Farelerde daha erken ve en sık kullanılan kırık modellerinden biri, bacak üzerinde belirli bir yükseklikten12 ağırlık bırakıldığı Einhorn yaklaşımıdır. Açı üzerinde kontrol eksikliği ve kırığı indüklemek için uygulanan kuvvet, kemik süreksizliğinin yeri ve boyutunda çok fazla değişkenlik yaratır. Daha sonra, gözlenen spesifik kırık iyileşme yanıtında değişikliklere neden olur. Diğer popüler yaklaşımlar, tibial monokortikal defekt veya stres kırıkları üretmek için cerrahi müdahale, nispeten daha hafif iyileşme yanıtlarını indükleyen prosedürlerdir10,13. Bu modellerdeki değişkenlik öncelikle prosedürü uygulayan kişiden kaynaklanmaktadır14.
Burada, ayrıntılı bir fare femur yaralanması modeli, tekrarlanabilir bir yaralanma sağlamak ve femur kırığı onarımının kantitatif ve kalitatif değerlendirmesine izin vermek için mola üzerinde kontrol sağlar. Spesifik olarak, yetişkin farelerin femurlarında tam bir atılım tanıtılır ve fiziksel yüklemenin kemik iyileşmesinde oynadığı rolü hesaba katmak için kırık uçlarını stabilize eder. Histoloji ve mikrobilgisayarlı tomografi (mikroBT) kullanılarak dokuların toplanması ve iyileşme sürecinin farklı adımlarının görüntülenmesi için yöntemler de ayrıntılı olarak verilmektedir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Açıklanan tüm hayvan deneyleri, Harvard Tıp Alanı Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi tarafından onaylanmıştır. Bu protokolde 12 haftalık C57BL/6J fareler (erkek ve dişi) kullanılmıştır. C57BL / 6J erkek ve dişi fareler, stabilize edici bir pime sığacak kadar geniş femurlarla yaklaşık 12 haftalıkken pik kemik kütlesine ulaşır ve bu da onları bu protokol15 için kullanmak için uygun bir suş haline getirir.
1. Ameliyata hazırlık
- Enfeksiyon riskini en aza indirmek için cerrahi makas, düz forseps, kavisli forseps, cerrahi kelepçeler ve elmas kesme tekerleği dahil olmak üzere cerrahi ekipmanı otoklav edin (bkz.
- Ameliyat sonrası iyileşmeyi kolaylaştırmak için bir ısıtma yastığına temiz bir fare kafesi yerleştirin. Isı yastığını 37-45 °C arasında bir sıcaklığa ulaşacak şekilde ayarlayın.
- Fareyi bir izofluran odası kullanarak anestezi altına yerleştirin. İndüksiyon oksijen akışını 2 L / dak'ya, izofluran indüksiyonunu% 2-4'e, bakım burun konisi oksijenini 2 L / dak'ya ve bakım izofluranını% 1.4'e ayarlayın.
- Farenin nefes alışının sabit olduğunu ve ayak parmağı sıkışmasına tepki vermediğini onaylayın. Kornea çizilmesini önlemek için her göze ince bir oftalmik merhem tabakası uygulayın. Fareyi steril bir ped'e aktarın ve izofluran'ı sürekli olarak adım 1.3'te olduğu gibi aynı oranda vermek için bir burun konisi kullanarak anesteziyi sürdürün.
NOT: 12 haftalık veya daha yaşlı farelerin kullanılması önerilir, çünkü genç farelerden gelen femurlar stabilize edici bir pimi barındırmak için çok ince olabilir. - Fareyi deri altından 0.05 mg/kg vücut ağırlığı yavaş salınımlı buprenorfin ile enjekte edin (bkz.
- Elektrikli bir düzeltici kullanarak, femur konumuna karşılık gelen her iki uylukta 2 x 2 cm'lik bir kareyi tıraş edin.
- Bir iyot tabakası yaymak için steril gazlı bez veya çubuklar kullanarak tıraş edilen bölgeyi dezenfekte edin ve% 70 etanol ile durulayın (Şekil 1A).
2. Ameliyat
- Steril bir neşter kullanarak, tıraş edilmiş, dezenfekte edilmiş bölgede 5 mm'lik bir kesi yapın ve altta yatan fasyayı ortaya çıkarmak için cildi soyun.
- Kasları açığa çıkarmak için femuru doğrudan kaplayan fasyayı hassas bir şekilde tutup kesmek için düz forseps ve ince makas kullanın. Fasyanın 5 mm'lik bir kesimi, altta yatan kaslara erişmek için yeterlidir.
- Bir çift düz forseps kullanarak, kası femurdan en az doku hasarı ile yavaşça ayırın.
- Femur görünür olduğunda, kavisli forsepsleri femur altından ayrılmış kas ve kemik arasında kaydırın. Forsepslerin kas ayrımını korumak için yavaşça açılmasına izin verin ve temiz bir kesimi kolaylaştırmak için femuru sabitleyin.
NOT: Femur, Forseps tutulmadığında Şekil 1B'de gösterildiği gibi açıkta kalmalı ve kas ve deriden ayrılmalıdır. - Düşük güç ayarında el tipi bir testere kullanarak femur milinin ortasında enine bir kesim yapın (Kullanılan bıçak ve Döner Alet Kiti için Malzeme Tablosuna bakınız).
NOT: Femur tamamen kesildikten sonra, iki kırık ucu oluşturulur: proksimal bölüm (kalça kemiğine bağlı) ve distal bölüm (diz üzerine bağlı, boğucu eklem olarak da bilinir). Femuru tek bir hareketle kesmekten kaçının. Bunun yerine, femur tamamen kesilene kadar 3-5 geçiş yapın. Bu, çevreleyen dokunun aşırı ısınmasını ve iyileşmeyi olumsuz yönde etkileyen önemli kemik kalıntıları oluşturmasını önlemek için kritik öneme sahiptir. - Distal bölümün kemik iliği boşluğuna bir kılavuz iğne (23 G x 1 TW IM, 0,6 mm x 25 mm) (bkz. Diz ekleminden iplik geçirmeye iterken iğneyi hafifçe bükmek için parmaklarınızı kullanın (Şekil 1C).
- Kılavuz iğneyi distal uçtan çıkarın ve kılavuz iğneyi kalça ekleminden itmek için aynı yumuşak büküm hareketini kullanarak proksimal uçta tekrarlayın. Kılavuz iğneyi proksimal uçta, ucu deriden çıkmış şekilde bırakın (Şekil 1D).
NOT: Kırık uçlarını stabilize etmek için, önce kırık uçlarından bir yol oluşturmak için bir kılavuz iğne kullanıldı ve daha sonra kırık uçlarını14 sabitlemek için bu yoldan stabilize edici bir pim geçirildi.
- Kılavuz iğneyi distal uçtan çıkarın ve kılavuz iğneyi kalça ekleminden itmek için aynı yumuşak büküm hareketini kullanarak proksimal uçta tekrarlayın. Kılavuz iğneyi proksimal uçta, ucu deriden çıkmış şekilde bırakın (Şekil 1D).
- Sabitleme pimini (iğne, 27 G x 1 1/4, 0,4 mm x 30 mm) ( bkz. Malzeme Tablosu) kılavuz iğnenin ucuna yerleştirin (Şekil 1E). Kılavuz iğne proksimal ucun ilik boşluğundan çıkarken dengeleyici pim girecek şekilde yavaşça itin.
- Kılavuz iğneyi atın. Distal ucu proksimal uçla tutmak ve hizalamak için cımbız kullanın ve 2.6'da yapılan yolu kullanarak diz ekleminden çıkana kadar stabilizatör pimi distal kemik iliği boşluğundan geçirmeye devam edin (Şekil 1F).
NOT: Stabilize edici pim şimdi kalça ve diz eklemlerinden çıkıntı yapıyor olmalıdır.
- Kılavuz iğneyi atın. Distal ucu proksimal uçla tutmak ve hizalamak için cımbız kullanın ve 2.6'da yapılan yolu kullanarak diz ekleminden çıkana kadar stabilizatör pimi distal kemik iliği boşluğundan geçirmeye devam edin (Şekil 1F).
- Cerrahi kelepçeyi kullanarak, proksimal ve distal bölümleri birbirine yaklaştırmak için pimin ucunu çekin, böylece zar zor dokunuyorlar. Gerekirse kırık uçlarını forseps ile yeniden hizalayın ve cerrahi kelepçeyi kullanarak stabilize edici pimin uçlarını kırık bölgesine doğru katlayın (bkz.
- Tel kesiciler kullanarak plastiği iğnenin tabanından çıkarın. Kelepçeyi kullanarak, iç doku hasarını önlemek için pimin her iki ucunu da körelene kadar bükün.
NOT: Kırık uçları artık yerine kilitlenmiştir, böylece fare yaralı bacağa ağırlık verebilir. Kırık uçları ayrılamıyorsa pim sabitlenir. Uçları köreltmek için bir tel kesici de kullanılabilir. Dengeleyici pim, fare ötenazi yapılana kadar çalışmanın tüm süresi boyunca yerinde kalmalıdır. Pimi yerinden çıkarma girişimlerinin kırık tepkisini istikrarsızlaştırması ve hayvana zarar vermesi muhtemeldir. Pin diseksiyonda çıkarılabilir.
- Tel kesiciler kullanarak plastiği iğnenin tabanından çıkarın. Kelepçeyi kullanarak, iç doku hasarını önlemek için pimin her iki ucunu da körelene kadar bükün.
- Kasları femur üzerine yeniden konumlandırmak için düz forseps kullanın. Kavisli forseps kullanarak, cildin uçlarını birbirine sıkıştırın ve yara klipslerini kullanarak açıklığı kapatın.
NOT: Cildi klipslerle çok sıkı bir şekilde kapatmayın, aksi takdirde fare bu bacağa ağırlık vermekten kaçınacaktır. İyileşme sırasında fiziksel yüklemenin sınırlandırılması iyileşme sürecini geciktirebilir. - Diğer bacakta 2.2 ila 2.4 arasındaki adımları tekrarlayın ve femur kırığı gerçekleştirmeden yarayı kapatın.
NOT: Bu sahte ile çalışan femur, kontralateral kontrol görevi görür. - İzofluran maruziyetini geri çekin, fareyi ısıtılmış kafese yerleştirin ve 10-15 dakika içinde bilincini yeniden kazanmalarını sağlayın.
- Farenin aktivitesini ve kesi bölgesini ameliyattan sonraki 5 gün boyunca günlük olarak sıkıntı veya enfeksiyon belirtileri açısından izleyin.
NOT: Hayvan ağrı belirtileri gösteriyorsa, yemek yemiyorsa ve / veya arka bacaklarında yürümekte tereddüt ediyorsa, veteriner personeline danışın ve ek analjezik uygulayın. - Ameliyattan 10 gün sonra yara klipslerini çıkarın.
NOT: Yara 10 gün sonra kapanmış gibi görünmüyorsa, klipsleri çıkarmadan önce veteriner personeline ve IACUC'ye danışın.
3. Doku hasadı
- Fareleri CO2 inhalasyonu ve ardından servikal çıkık yoluyla ötenazileştirin.
NOT: Bu prosedür, Amerikan Veteriner Hekimleri Birliği'nin Ötenazi Paneli ile tutarlıdır. - Makas ve forseps kullanarak, cildi her iki fare bacağından çıkarın, femur kafasını kalça kemiğinden çıkarın ve bacağı serbest bırakmak için bitişik kası kesin.
NOT: Nasır yerinden çıkabileceği veya hasar görebileceği için femur çevresinde çok fazla kas çıkarmaktan kaçının. - Stabilize edici pimden kaçınarak, femuru tibiadan ayırmak için diz ekleminden kesin.
- Stabilize edici pimin uçlarını ortaya çıkarmak için femurun distal ve proksimal kısımlarının etrafını diseke edin.
- Sert bir tel kesici ile, pimin katlanmış künt uçlarını kesin, böylece pimin sadece düz kısmı kalır. Stabilize edici pimi yavaşça ve nazikçe femurdan çıkarmak için forseps kullanın.
NOT: Pin kolayca dışarı kaymazsa, nasır yerinden çıkabileceğinden ve numuneye zarar verebileceğinden kuvvet uygulamayın. Bunun yerine, pimi döndürmeye ve hassas bir şekilde çıkarmaya çalışın. Fiksasyondan sonra pimin çıkarılması da daha kolay olabilir.
4. Histoloji - Alcian Blue / Eosin / Orange G boyama
NOT: Alcian Blue / Orange G / Eozin boyaması, kıkırdak (mavi) ve kemiği (pembe) görselleştirmek için rutin olarak kullanılır. Kıkırdak alanı toplam nasır alanının bir oranı olarak ölçülebilir (Şekil 2A,B).
- Femurları 4 ° C'de gece boyunca% 10 nötr tamponlu formalin içinde sabitleyin.
- Sabit numuneleri fosfat tamponlu salin (PBS) içinde yıkayın.
- Numuneleri 0,5M EDTA, pH 8,0 içine 2 hafta boyunca yavaşça dönen bir çalkalayıcıya yerleştirin. Etkili kireç çözme sağlamak için EDTA çözümünü her geçen gün değiştirin.
NOT: Çalkalayıcı için belirli bir rpm gerekmez; sıvının tüm numuneleri kapsayacak şekilde kapta aktığından emin olun. Tam kireçlenme, femurların röntgeni ile test edilebilir. - Parafin gömme numunelerini işlemek için bunları aşağıdaki çözeltilerde (her biri 1 saat) inkübe edin:% 70 EtOH,% 95 EtOH,% 100 EtOH,% 100 EtOH, Ksilen, Ksilen, Parafin, Parafin.
- Örnekleri bölümleme için parafine gömün.
- Kırık femurların 5-7 μm kalınlığındaki uzunlamasına kesitlerini mikrotom kullanarak kesin.
- Bölümleri 2 Ksilen banyosunda (her biri 5 dakika) inkübe ederek deparaffinize edin.
- Aşağıdaki etanol gradyanında (her biri 2 dakika) inkübe ederek bölümleri rehidre edin:% 100 EtOH,% 100 EtOH,% 80 EtOH,% 70 EtOH.
- Kaydırakları 1 dakika boyunca musluk suyuna yerleştirin.
- Ek Dosya 1'de belirtildiği gibi histoloji için Alcian mavisi, Asit alkol, Amonyum suyu ve Eozin / Turuncu G çözeltilerini yapın.
NOT: Her çözeltinin önerilen hacimleri, boyama için slaytları tamamen suya batırmak için yeterli olmalıdır. - Slaytları 30 sn boyunca Asit alkole yerleştirin ve 40 dakika boyunca Alcian mavisinde inkübe edin.
- Su yaklaşık 2 dakika temizlenene kadar akan musluğun altında yavaşça yıkayın.
- Slaytları hızla 1 s boyunca asit alkole batırın.
- Adım 4.9'da açıklandığı gibi durulayın.
- 15 s boyunca amonyum suyunda inkübe edin.
- Adım 4.9'da açıklandığı gibi durulayın.
- 1 dakika boyunca% 95 EtOH'ye yerleştirin ve 90 saniye boyunca Eosin / Turuncu G'de kuluçkaya yatırın.
- %70 EtOH, %80 EtOH ve %100 EtOH'ye tek bir daldırma ile kızakları hızlı bir şekilde kurutun.
- Slaytları temizlemek için slaytları 1 dakika boyunca Xylene içine yerleştirin.
- Görüntüleme için montaj ortamı ve bir kapak kapağı uygulayın.
NOT: Moleküler analiz için, RNA ve protein nasırdan izole edilebilir. Kasları diseksiyon kapsamı altında dikkatlice diseke edin ve nasırı bir neşter kullanarak altta yatan kemikten ayırın.
5. MikroBT
NOT: İyileşmenin sonraki aşamalarında, sert nasır ve kırık boşluğundaki mineralizasyonu görüntülemek ve ölçmek için mikroBT yapılabilir. C57BL/6J farelerde, nasır genellikle mineralize edilir ve kırıktan 10 gün sonra (dpf) mikroBT ile tespit edilebilir (Şekil 2C).
- Femurları 4 ° C'de gece boyunca% 10 nötr tamponlu formalin içinde sabitleyin.
NOT : MikroBT, EDTA dekalsifikasyonundan önce yapıldığı sürece histoloji için kullanılan aynı femurlar üzerinde yapılabilir (adım 4.3). Her iki teknik için de aynı femurları kullanırken, mikroBT gerçekleştirin, örnekleri alın ve adım 4.3'e gidin. - Sabit numuneleri fosfat tamponlu salin (PBS) içinde yıkayın ve% 70 EtOH'de saklayın.
- 55 kVP enerji seviyesinde ve 145 μA yoğunlukta 7 μm'lik izotropik voksel boyutunda microCT gerçekleştirin (bkz.
- MikroBT dilimlerini nasır içerecek ve kortikal kemiği dışlayacak şekilde konturlayın.
NOT: Nasır zamanla daha mineralize oldukça, eşik nasır hacmini farklı aşamalarda görselleştirmek ve ölçmek için ayarlanabilir. - Nasır konturlarında bulunan kemik hacmini, nasır hacminin bir ölçüsü olarak elde edin.
NOT: Kırılma boşluğu, kırılmanın kapladığı mesafe olarak doğrudan mikroBT dilimleri üzerinde ölçülebilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
C57BL / 6J farelerinde, başarılı bir cerrahi, daha önce bahsedilen iyileşme adımlarını, sahte ameliyat edilen kontralateral femurda çok az lokal enflamatuar yanıt veya periosteal tutulum olmadan tamamlar. Ameliyattan birkaç saat sonra bir hematom oluşur ve periosteum, kondrogenez için iskelet progenitörlerini işe almak için aktive edilir. Prx1 + mezenkimal progenitörler gibi çeşitli hücre popülasyonları, ticari olarak temin edilebilen floresan muhabir fare modelleri kullanılarak onarım işlemi sırasında izlenebilir (Şekil 3). Kırıktan 5 gün sonra (dpf), yumuşak nasır görselleştirmek ve daha sonra kıkırdak alanını ölçmek için Alcian Blue boyama kullanılabilir (Şekil 2A, B). Mineralizasyon mikroBT ile 28 dpf'de tespit edilebilir (Şekil 2C). Mineralize kalsusun hacmi, kırık boşluğunun mesafesi ve mekanik testlerle ölçülen kemik kuvveti, kırık onarımının ölçülebilir sonuçları olarak yaygın olarak kullanılır. Genetik modifikasyon veya ilaç müdahalesi iyileşme sürecini değiştirebilir, bu nedenle onarımın farklı aşamalarında kırıkları karakterize etmek için bir zaman kursu çalışması yapılması önerilir. Tüm nasır moleküler analiz için diseke edilebilir ve kontralateral kemik şaftı kontrol olarak kullanılabilir. Kırık uçları pim ile yeterince hizalanmazsa veya yeterince sabitlenmezse, ortaya çıkan görüntüler kırık bölgesinin tamamında veya bir tarafında nasır oluşumunun olmadığını gösterecektir (Şekil 4).
Resim 1: Sabitleme piminin kırılması ve takılması . (A) C57BL/6J farenin sağ bacağında bir kare traş edilir. (B) Deride ve fasyada bir kesi yapıldıktan sonra, kas, cilt ve kemiği ayırmak için femur altına kavisli forseps sabitlenir. (C) Kesim yapıldıktan sonra, iki kırık ucu oluşturulur: kalça kemiğine bağlı femurun proksimal bölümü ve dize bağlı distal bölüm. Kılavuz iğne (yeşil) distal bölüme yerleştirilir ve diz ekleminden itilir. (D) Kılavuz iğne distal bölümden çıkarılır, proksimal bölüme yerleştirilir ve kalça ekleminden itilir. (E) Dengeleyici pim (gri iğne), kalça ekleminden çıkıntı yapan kılavuz iğneye yerleştirilir. (F) Stabilize edici pim, proksimal bölümden, distal bölüme ve C'deki kılavuz iğne tarafından yapılan yol kullanılarak diz ekleminden itilir.
Şekil 2: Femur kırığının histolojisi ve mikroCT'si . (A) Femur kırıklarının formalin-sabit parafin kesitleri 5, 10 ve 28 dpf'de toplandı ve Alcian Blue/Eozin/Orange G. Scale bar = 500 μm ile boyandı. (B) Kıkırdak alanı 5, 10 ve 28 dpf'de ImageJ yazılımı kullanılarak ölçüldü. (C) 28 dpf'de mineralizasyon gözlendi ve nasır hacmi ve kırık boşluğu mikroBT ile ölçülebildi. Ölçek çubuğu = 1.000 μm. Ortalama ± SEM olarak gösterilen veriler. Mineralize nasır hacmi, kırık bölgesinde kortikal kemiğin etrafında konturlama yapılarak ölçüldü. Koyu gri alan görüntüdeki mineralize nasırı tanımlarken, kortikal kemik (açık gri) ölçüme dahil edilmez. Ortalama ± SEM olarak gösterilen veriler. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Kırılma sonrası Prx1+ periosteal hücrelerinin genişlemesini görselleştirmek için kullanılan floresan muhabir modeli. Prx1CreER; Rosa26tdDomates fareleri, tdDomates ekspresyonunu indüklemek için 80 mg / kg vücut ağırlığı tamoksifen ile beş gün boyunca günlük olarak enjekte edildi. Son enjeksiyondan üç gün sonra, femur kırığı başlatıldı ve fareler, Prx1 eksprese eden hücrelerin ve soylarının (Prx1 +) kırık nasır ve genleşmiş periost içinde nerede bulunduğunu izlemek için 7 veya 14 dpf'de kurban edildi. Ölçek çubuğu = 500 μm. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: Cerrahi sorunlar nedeniyle düzensiz iyileşme örneği. Kırık uçları düzgün bir şekilde hizalanmadı ve stabilize edici pim bu örnekte femurun proksimal bölümünden delindi. Bu hatalar, kesik bölgesinde değil, femurda delindiği yerde (sarı kutu) nasır oluşumuna neden oldu. Ölçek çubuğu = 500 μm. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Ek Dosya 1: Histoloji için gerekli çözümlerin bileşimi. Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu protokolde detaylandırılan yaralanma modeli, spontan kırıkların iyileşmesi sırasında gözlenen dört önemli adımın tümünü kapsar: (1) hematom oluşumu ile pro-inflamatuar yanıt, (2) yumuşak nasır oluşturmak için periosteden iskelet progenitörlerinin işe alınması, (3) nasırın osteoblastlarla mineralizasyonu ve (4) kemiğin osteoklastlarla yeniden şekillendirilmesi.
Bu makalede açıklanan cerrahi prosedür, en az 12 haftalık yetişkin fareler için optimize edilmiştir. Stabilize edici pim olarak 27 G x 1 1/4 (0,4 mm x 30 mm) iğne kullanılır, çünkü bu yaşta kemik iliği boşluğunun genişliği için ideal boyuttur. Gerekirse, daha ince bir stabilize edici pim kullanılırsa, protokol genç hayvanlar için değiştirilebilir. Stabilize edici pim, cerrahinin başarısının önemli bir parçasıdır, çünkü instabilitenin kırık iyileşmesini önemli ölçüde etkilediği bilinmektedir16. Diğer stabilizasyon yöntemleri gözden geçirilmiştir ve hepsi avantajları ve sınırlamaları ile birlikte gelir17,18,19. İdeal stabilizasyon, araştırma sorusuna ve deneysel hedefe göre seçilmelidir. Burada tarif edilen stabilizasyonun bir sınırlaması, pimin büyüme plakalarından ve eklemlerden geçmesidir. Eklem veya büyüme plakası kıkırdağının katkısı endişe vericiyse, başka bir stabilize edici yöntem düşünmenizi öneririz.
Bu ameliyatı yaparken cerrahi teknikte ve hayvanlar arasında değişkenlik söz konusudur. Bu nedenle, özellikle nicel okumalar için bol sayıda sayı kullanılması ve gruplar arasında benzer kırık tiplerinin karşılaştırılması önerilir. 2 mm'nin üzerindeki boşlukları önlemek için femur kesitlerini birbirine yakın tutmak çok önemlidir. Bölümler arasındaki boşluklardaki değişkenlik, nasır boyutunu ve onarımın zamanlamasını önemli ölçüde etkileyebilir. Bölümler de düzgün bir şekilde hizalanmalıdır. Gevşek ve yanlış hizalanmış kırıklar, örnekler arasında daha önemli değişkenliğe neden olur ve iyileşmeyi bozabilir.
Ağırlık taşıma, kemik iyileşmesinin zamanlaması için de çok önemlidir ve fareler arasında değişkenlik yaratabilir. Çoğu fare, ameliyattan birkaç saat sonra yaralı bacağa minimum ağırlık verir, ancak ertesi güne kadar normal yürümelidir. Farenin normal hareket ettiğini ve yükün her iki bacağa eşit olarak dağıtıldığını doğrulamak, özellikle kontralateral femuru sahte olarak çalıştırılan bir kontrol olarak kullanırken çok önemlidir. Ek olarak, ameliyat kontralateral bacağı etkileyen sistemik bir iltihabı tetikleyebilir. Bu nedenle, bu tekniği kurarken sahte olarak çalıştırılan femurların ameliyat edilmeyen farelerle karşılaştırılması önerilir. Ameliyat edilmeyen kontrollere sahip olmak, RNA veya protein ekspresyonu üzerindeki etkiler gibi ölçülebilir sonuçlar için de tercih edilebilir.
Kırık geometrisinin tutarlılığı diğer yöntemlerle zor olabilir20, ancak testere kullanmak cerrah için daha fazla kontrol sağlar ve takip eden kırıklardaki değişkenliği azaltır. Testere yaklaşımı, proksimal fare femurlarının metafiz kırıklarını oluşturmak için de başarıyla kullanılmıştır21.
Erkek ve dişi fareler arasında kırık iyileşmesine verdikleri yanıttaki farklılıklar nadiren gözlenir. Bununla birlikte, cinsiyet, yaş ve ilaç müdahalesi ile bir faktör haline gelebilir, bu nedenle aynı cinsiyetten hayvanları karşılaştırmak veya örnekleri birleştirmeden önce cinsiyet farklılıklarını sorgulamak için istatistikler yapmak şiddetle tavsiye edilir. Ayrıca, bu protokol C57BL6 / J fareleri için tasarlanmıştır. Diğer fare suşlarını kullanan araştırmacılar, herhangi bir cinsiyet farkını tanımlamak için erkek ve dişi farelerde iyileşmeyi karşılaştırmalıdır.
Bu femur kırığı cerrahisinin, farelerdeki önemli iyileşme adımlarını özetlemek için etkili bir model olduğuna ve insanlarda genetik modifikasyonların veya terapötik müdahalelerin kırık iyileşmesi üzerindeki etkilerini test etmek için kullanılabileceğine inanıyoruz.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacağı herhangi bir çıkar çatışması yoktur.
Acknowledgments
Dr. Vicki Rosen'e projedeki finansal desteği ve rehberliği için teşekkür ederiz. Harvard Tıp Fakültesi'ndeki veterinerlik ve IACUC personeline steril teknik, hayvan refahı ve bu protokolü geliştirmek için kullanılan materyaller hakkında istişarelerde bulundukları için teşekkür ederiz.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 23 G x 1 TW IM (0.6 mm x 2 5mm) needle | BD precision | 305193 | Use as guide needle |
| 27 G x 1 ¼ (0.4 mm x 30 mm) | BD precision | 305136 | Use as stabilizing pin |
| 9 mm wound autoclip applier/remover/clips kit | Braintree Scientific, INC | ACS-KIT | |
| Alcian Blue 8 GX | Electron Microscopy Sciences | 10350 | |
| Ammonium hydroxide | Millipore Sigma | AX1303 | |
| Circular blade X926.7 THIN-FLEX | Abrasive technologies | CELBTFSG633 | |
| DREMEL 7700-1/15, 7.2 V Rotary Tool Kit | Dremel | 7700 1/15 | |
| Eosin Y | ThermoScientific | 7111 | |
| Fine curved dissecting forceps | VWR | 82027-406 | |
| Hematoxulin Gill 2 | Sigma-Aldrich | GHS216 | |
| Hydrochloric acid | Millipore Sigma | HX0603-4 | |
| Isoflurane | Patterson Veterinary | 07-893-1389 | |
| Microsurgical kit | VWR | 95042-540 | |
| Orange G | Sigma-Aldrich | 1625 | |
| Phloxine B | Sigma-Aldrich | P4030 | |
| Povidone-Iodine Swabs | PDI | S23125 | |
| SCANCO Medical µCT35 | Scanco | ||
| Slow-release buprenorphine | Zoopharm |
References
- Black, D. M., Rosen, C. J.
- Curtis, E. M., Moon, R. J., Harvey, N. C., Cooper, C. The impact of fragility fracture and approaches to osteoporosis risk assessment worldwide. Bone. 104, 29-38 (2017).
- Laurent, M. R., Dedeyne, L., Dupont, J., Mellaerts, B., Dejaeger, M., Gielen, E. Age-related bone loss and sarcopenia in men. Maturitas. 122, 51-56 (2019).
- NOF - Just for men. National Osteoporosis Foundation. , Available from: https://cdn.nof.org/wp-content/uploads/2015/12/Osteoporosis-Fast-Facts.pdf (2019).
- Williams, S. A., et al. Economic burden of osteoporotic fractures in US managed care enrollees. The American Journal of Managed Care. 26, 142-149 (2020).
- Sheen, J. R., Garla, V. V.
- Holmes, D.
- Duchamp de Lageneste, O., et al. Periosteum contains skeletal stem cells with high bone regenerative potential controlled by Periostin. Nature Communications. 9, 773 (2018).
- Bahney, C. S., et al.
- Li, Z., et al. Fracture repair requires TrkA signaling by skeletal sensory nerves. Journal of Clinical Investigation. 129, 5137-5150 (2019).
- Colnot, C., Thompson, Z., Miclau, T., Werb, Z., Helms, J. A. Altered fracture repair in the absence of MMP9. Development. 130, 4123-4133 (2003).
- Bonnarens, F., Einhorn, T. A. Production of a standard closed fracture in laboratory animal bone. Journal of Orthopaedic Research. 2, 97-101 (1984).
- Hu, K., Olsen, B. R. Osteoblast-derived VEGF regulates osteoblast differentiation and bone formation during bone repair. Journal of Clinical Investigation. 126, 509-526 (2016).
- Collier, C. D., et al. Characterization of a reproducible model of fracture healing in mice using an open femoral osteotomy. Bone Reports. 12, 100250 (2020).
- Glatt, V., Canalis, E., Stadmeyer, L., Bouxsein, M. L. Age-related changes in trabecular architecture differ in female and male C57BL/6J mice. Journal of Bone and Mineral Research. 22, 1197-1207 (2007).
- Garcia, P., et al. A new technique for internal fixation of femoral fractures in mice: impact of stability on fracture healing. Journal of Biomechanics. 41, 1689-1696 (2008).
- Holstein, J. H., et al. Advances in the establishment of defined mouse models for the study of fracture healing and bone regeneration. Journal of Orthopaedic Trauma. 23, 31-38 (2009).
- Garcia, P., et al. Rodent animal models of delayed bone healing and non-union formation: a comprehensive review. European Cells & Materials. 26 (1-12), 12-14 (2013).
- Histing, T., et al. Ex vivo analysis of rotational stiffness of different osteosynthesis techniques in mouse femur fracture. Journal of Orthopaedic Research. 27, 1152-1156 (2009).
- Williams, J. N., Li, Y., Valiya Kambrath, A., Sankar, U. The Generation of closed femoral fractures in mice: A model to study bone healing. Journal of Visualized Experiments. (138), e58122 (2018).
- Haffner-Luntzer, M., et al. A novel mouse model to study fracture healing of the proximal femur. Journal of Orthopaedic Research. 38, 2131-2138 (2020).
