Summary
이것은 말초 신경을 위한 무선 전원 인터페이스의 외과적 이식 및 작동을 위한 프로토콜입니다. 우리는 쥐의 좌골 신경이나 횡격막 신경에 배치된 신경 자극기의 예를 통해 이 접근법의 유용성을 입증합니다.
Abstract
말초 신경 계면은 실험 신경 과학 및 재생 의학에서 다양한 응용 분야에 자주 사용됩니다. 이러한 인터페이스는 센서, 액추에이터 또는 둘 다일 수 있습니다. 말초 신경 인터페이스의 전통적인 방법은 외부 시스템에 연결하거나 작동 시간을 제한하는 배터리 전원에 의존해야 합니다. 최근 무선, 무배터리 및 완전 이식 가능한 말초 신경 인터페이스가 개발됨에 따라 새로운 등급의 장치는 유선 또는 배터리 구동식 전구체와 동등하거나 이를 능가하는 기능을 제공할 수 있습니다. 이 논문은 (i) 외과적으로 이식하고 (ii) 성인 쥐에서 이 시스템에 무선으로 전원을 공급하고 제어하는 방법을 설명합니다. 좌골 신경 및 횡격막 신경 모델은 이 접근법의 다양성을 강조하기 위해 예로 선택되었습니다. 이 논문은 말초 신경 계면이 복합 근육 활동 전위(CMAP)를 유발하고, 치료용 전기 자극 프로토콜을 전달하고, 말초 신경 손상 복구를 위한 도관을 통합하는 방법을 보여줍니다. 이러한 장치는 단일 용량 또는 반복 용량 치료 자극에 대한 확장된 치료 옵션을 제공하며 다양한 신경 위치에 적용할 수 있습니다.
Introduction
외상성 말초신경 손상(PNI)은 미국에서 발생하며 연간 약 200,000건의 발생률이 발생합니다1. PNI를 겪는 대부분의 환자는 영구적인 기능 장애를 남깁니다. 최악의 경우 근육 마비를 초래하고 치료 불응성 신경병증성 통증을 유발할 수 있으므로 환자는 치료로 사지 절단을 기꺼이 받을 수 있다2. PNI 결과를 개선하는 데 가장 큰 장애물은 축삭 재생이 재성장해야 하는 거리에 비해 너무 느리다는 것입니다. 예를 들어, 성인 인간 축삭은 하루에 1mm씩 자라지만 근위부에 병변이 있는 경우 >1000mm의 거리에서 재생해야 할 수 있습니다.
현재 임상 진료에서 PNI의 ~50%는 외과적 치료가 필요하다3. 성공적인 신경 재생을 위해서는 축삭돌기가 (i) 병변 부위를 가로질러 성장하고(즉, 갭 교차) (ii) 신경 경로를 따라 재생되어 최종 장기 목표(즉, 원위 재성장)에 도달해야 합니다(그림 1). 신경 재생을 촉진하는 것으로 입증된 FDA 승인 약물은 없습니다. PNI 임상 관리의 현상 유지는 지난 수십 년 동안 점진적으로 변화해 왔으며 축삭 재생이 이동해야 하는 거리를 줄이기 위한 원위 운동 신경 이식과 같은 수술 방법에 대한 기술적 개선으로 제한되어 있습니다.4 또는 근위 신경이 수축되어 직접 다시 봉합할 수 없는 경우를 위한 "기성품" 합성 신경 도관5. 그러나 수술 후 신경에 가해지는 치료적 전기 자극에 대한 4건의 무작위 임상시험이 있었는데, 이는 앨버타 대학의 K. Ming Chan 박사가 주도한 단일 센터 연구로, 근육 6,7,8 또는 피부의 신경 재신경이 크게 개선되었음을 보여주었다9. 이 전기 자극 프로토콜에 대한 기초 작업은 설치류(10,11)에서 수행되었으며, 전기 자극은 갭 크로싱(갭 크로싱)(그림 1)을 강화함으로써 특이적으로 작동하지만 원위 재성장(12,13,14,15)은 강화하지 않는 것으로 나타났다(12,13,14,15).
4개의 전기 자극 무작위 임상 시험 모두에 사용된 경피적 와이어 전극의 외과적 배치는 그 효과가 1시간11분 동안 연속적으로 20Hz에서 뉴런 세포체를 탈분극하기에 충분한 전류의 전달에 의존하기 때문에 필요했습니다. 임상에서 이 전기 자극 프로토콜은 통증으로 인해 피부의 표면 자극 전극을 통해 필요한 강도에서 대부분의 환자에게 견딜 수 없습니다. 수술실(OR)에서 환자를 이송하는 동안 깊은 상처 감염 또는 신경에서 와이어가 우발적으로 변위되는 것과 같이 수술 후 경피 전극을 실행하는 것과 관련된 사소하지 않은 위험이 있습니다. 또한 수술실 시간 자체의 높은 비용은 수술 후 급성 회복 중이 아닌 해당 환경에서 시도하는 것을 꺼리게 합니다. 기존 말초 신경 계면의 이러한 단점을 해결하기 위해 배터리가 필요 없고 완전히 이식 가능한 새로운 종류의 무선식 말초 신경 계면이 등장하고 있습니다.
이 새로운 종류의 무선 이식형 전자 시스템은 전기 자극 투여의 용이성과 유연성을 높이고 광범위한 임상 구현을 방해하는 장벽을 허물 준비가 되어 있습니다. 이 논문은 (i) 외과적으로 이식하고 (ii) 성인 쥐 좌골 신경 및 횡격막 신경 모델에서 이 시스템에 무선으로 전원을 공급하고 제어하는 방법을 설명합니다. 말초 신경 계면이 어떻게 CMAP를 유발하고, 치료용 전기 자극 프로토콜을 전달하며, 말초 신경 복구를 위한 통로 역할을 할 수 있는지 보여줍니다. 여기의 프로토콜은 광유전학적 매개 신경 조절(optogenetic mediated neuromodulation)16, 조절된 약물 방출(controlled drug release)17, 또는 시간에 따른 전기 자극의 반복적인 한판 승부(18,19)를 위한 광 펄스를 전달할 수 있는 이 기술의 다른 변형체에 적용될 수 있다.
Protocol
이 프로토콜에 설명된 모든 절차는 NIH Guide for the Care and Use of Laboratory Animals에 따라 수행되며 Northwestern University의 IACUC(Institutional Animal Care and Use Committee)의 승인을 받았습니다. 이 프로토콜은 Northwestern University의 Center for Comparative Medicine 및 IACUC의 동물 관리 지침을 따릅니다. 프로토콜을 조정할 때 IACUC와 상의해야 합니다.
1. 무선 전자 자극기 제작(그림 2)
- 구리/폴리이미드/구리(18μm 두께의 상단 및 하단 구리, 75μm 두께의 폴리이미드)를 무선 주파수 전력 수확기 코일(즉, 무선 수신기 안테나)의 기판으로 사용합니다.
- 직접 레이저 절제를 사용하여 상단 및 하단 구리 층의 전극 구멍을 패턴화하고 장치를 형성합니다. 구멍을 통해 실버 페이스트를 사용하여 상단 및 하단 레이어를 전기적으로 연결합니다.
- 납땜을 통해 다이오드 및 커패시터와 같은 상업용 포장으로 전자 부품을 부착합니다.
- 생체 흡수성 동적 공유 폴리 우레탄 (b-DCPU, 200 μm 두께) 캡슐화 된 몰리브덴 (Mo; 15 μm 두께, 구불구불한 구조)을 신축성 연장 전극19로 사용하십시오.
- 폴리(젖산-코글리콜산)(PLGA) 필름(300μm 두께)을 사용하여 장치와 신경 사이의 계면에 대한 커프 전극을 형성합니다.
- 무선 수신기 안테나와 신축성 있는 연장 전극을 연결한 후 무선 수신기 안테나를 캡슐화하고 상용화된 방수 에폭시 또는 폴리디메티실록산(PDMS)으로 연결합니다. 완전히 조립된 장치에 대해서는 그림 2 (오른쪽)를 참조하십시오.
- 파형 발생기를 사용하여 1차 코일(즉, 전송 코일)을 통해 단상 전기 임펄스를 생성하여 장치의 무선 작동을 확인합니다.
참고: 단상 및 이중상 자극에 의한 말초 축삭돌기의 모집 및 축삭 재생의 유도를 조사한 결과, 선행 연구에서는 파형 특성20의 차이로 인해 무시할 수 있는 효과가 보고되었으며, 이 그룹은 생쥐21 및 랫트18에서 동일한 단상 전류 매개변수로 치료적 전기 자극 향상을 달성할 수 있었습니다. 또한, 선행 연구에서는 생체 내 및 생체 적합성 을 조사했으며 열 효과 또는 재료 자체로 인한 조직 손상의 증거를 찾지 못했습니다. 이러한 발견과 본 연구에서 치료적 전기 자극의 제한된 기간으로 인해 이 프로토콜에서는 biphasic이 아닌 monophasic 자극이 사용되었습니다. - 결과 직류 출력 볼륨을 측정합니다.tage 커프 전극에 연결된 오실로스코프로.
2. 이식을 위한 장치 준비
- 임플란트 장치를 멸균된 페트리 접시에 넣고 파라필름으로 밀봉합니다.
- 한 면당 30분 동안 장치에 UV 광선을 조사합니다.
3. 전기 자극을 위한 무선, 배터리가 필요 없는 말초 신경 계면의 쥐 오른쪽 좌골 신경 이식 수술 절차(그림 3)
알림: 멸균 상태를 유지하십시오. 동물 시술실의 지정된 수술 구역 내에서 수술을 시행합니다. 외과의는 수술 중에 안면 마스크, 코트, 모자 및 멸균 장갑을 착용합니다. 두 번 이상의 수술을 시행하는 경우 동물 간에 멸균 장갑을 교체하고 각 수술에 깨끗하고 멸균된 수술 기구를 사용하십시오. 열 멸균(오토클레이브 또는 유리 구슬 멸균기)으로 수술 사이에 도구를 멸균합니다. 무게가 200-250g인 성인 Sprague-Dawley 쥐를 사용하십시오.
- 산소(3L/min)에 이소플루란 가스 마취(1-3% 유도, 2-2% 유지)를 사용하여 마취를 유도하고 멜록시캠(1-2mg/kg)을 피하 투여합니다. 건조를 방지하기 위해 지정된 안과 연고로 쥐의 눈을 덮으십시오.
- 후속 절차를 위해 소독된 수술 테이블에 쥐를 엎드린 자세로 놓습니다. 남은 수술 시간 동안 호흡 속도(~2/s), 조직 색상 및 마취 깊이를 15분마다 평가하고 그에 따라 이소플루란 수치를 유지합니다. 페달 반사(단단한 발가락 꼬집음에 대한 반응 없음)를 확인하여 적절한 마취 깊이를 확인합니다. 분홍색과 촉촉한 상태를 유지해야 하는 점막을 모니터링합니다.
- 오른쪽 다리와 등 하반부를 포함한 수술 부위를 면도합니다. 베타딘 패드로 면도한 수술 부위를 문지른 다음 70% 의료용 에탄올 면봉으로 문지르고 피부 소독을 위해 이 스크럽 과정을 세 번 반복합니다.
- 조직 가위를 사용하여 오른쪽 대퇴골 뼈와 평행한 피부를 1.5 – 2cm 절개한 다음 뒷면(절개 부위 바로 내측)의 피하 결합 조직을 뭉툭하게 분리하여 리시버 코일을 위한 피하 주머니를 청소합니다(그림 4A). 피부 절개 부위와 평행하게 오른쪽 둔근을 연속적으로 절개(1.2-1.5cm)합니다.
- 끝이 뭉툭한 금속 해부 프로브로 좌골 신경을 부드럽게 분리합니다(그림 4B).
알림: 좌골 신경은 대퇴 이두근 깊숙한 곳에 위치하고 있으며 대퇴골과 평행하게 뻗어 있습니다. 해부 범위가 제안됩니다. - 신경에 긴장을 가하거나 경로를 왜곡하지 않고 고립된 오른쪽 좌골 신경을 커프를 감싸서 좌골 신경에 배터리가 필요 없는 무선 장치를 이식합니다(그림 4C). 추가 전기 자극을 위해 수신기 코일이 놓인 피부에 표시하십시오.
- 흡수성 봉합사를 사용하여 둔근 절개 부위를 봉합합니다(그림 4D).
알림: 리시버 코일의 위쪽 절반은 둔근 위에 있고 그 아래에 있는 커프 인터페이스입니다. - 상처 클립(또는 매립된 봉합사)으로 피부 절개 부위를 닫습니다. 그림 4E). 스킨 가장자리를 일치시킵니다.
- 마취 상태에서 200μs의 펄스 폭으로 수술 후 1시간 동안 20Hz 전기 자극을 연속적으로 제공합니다(그림 4F). 마취에서 완전히 회복된 동물을 집으로 돌려보냅니다.
참고: 자세한 프로토콜은 아래에 설명되어 있습니다. 수신기 코일은 그림 4F의 피부 위에 나와 있습니다. - 수술 후 치료
- 쥐를 침구가 없는 회복 케이지에 넣고 종이 타월을 깐 다음 케이지의 절반을 적절한 온도 조절 열원(승인된 가열 패드)에 놓습니다.
- 보행할 수 있을 때까지 쥐를 주의 깊게 모니터링하십시오. 보행이 가능하고 안정된 것으로 평가되면 쥐를 집 케이지로 돌려보내고 사회적 재통합을 관찰합니다.
- 급성 회복 후 쥐의 절개 부위 감염 및 보호, 몸부림, 긁기 및 자해를 포함하되 이에 국한되지 않는 신경인성 통증 증상을 모니터링합니다. 수술 후 5일의 회복 기간 동안 매일 쥐를 모니터링하고, 5일째에 쥐를 희생하지 않은 경우 그 후 최소 3일에 한 번씩 모니터링합니다.
- 멜록시캄(1-2mg/kg)을 수술 후 2-3일 동안 하루에 한 번 피하 투여하며, 동물의 통증/불편함 정도에 따라 다릅니다. 지속적인 통증이 의심되면 수술 후 이 기간 이후에도 멜록시캄을 계속 투여하고, 불응성이 있는 것으로 판명되면 수의사와 상의하여 조기에 쥐를 안락사시킨다.
- 수술 후 10-12일 후에 피부 봉합사 또는 상처 클립을 제거합니다.
4. 무선 자극기의 쥐 좌측 횡격막 신경 이식 수술 절차(그림 5A)
알림: 섹션 3에서와 같이 멸균 상태를 유지하십시오. 무게가 200-250g인 성인 Sprague-Dawley 쥐를 사용하십시오. 사용하기 전에 모든 수술 도구를 소독하십시오.
- 산소(3L/min)에 이소플루란 가스 마취(1-3% 유도, 2-2% 유지)를 사용하여 마취를 유도하고 멜록시캠(1-2mg/kg)을 피하 투여합니다. 건조를 방지하기 위해 지정된 안과 연고로 쥐의 눈을 덮으십시오.
- 후속 절차를 위해 소독된 수술 테이블 위에 쥐를 누운 자세로 놓습니다. 남은 수술 기간 동안 호흡 속도, 조직 색상 및 마취 깊이를 15분마다 평가하고 그에 따라 이소플루란 수치를 유지합니다. 페달 반사(단단한 발가락 꼬집음에 대한 반응 없음)를 확인하여 적절한 마취 깊이를 확인합니다. 분홍색과 촉촉한 상태를 유지해야 하는 점막을 모니터링합니다.
- 목의 복부 쪽의 수술 부위를 면도합니다. 베타딘 패드로 면도한 수술 부위를 문지른 다음 70% 의료용 에탄올 면봉으로 문지르고 피부 소독을 위해 이 스크럽 과정을 세 번 반복합니다.
- bupivacaine(2mg/kg, 총 부피 0.5mL를 초과하지 않는 식염수로 희석)을 목의 정중선에 피하 투여하여 가장 표재층을 대상으로 합니다. 피부와 표재성 경추 근막을 통해 3cm 정중선을 절개하여 흉골 설근과 흉쇄유돌근을 노출시킵니다(그림 5B).
알림: 해부 범위가 제안됩니다. - 프로브로 부드럽게 뭉툭한 절개를 사용하여 흉쇄유돌기를 들어 올리고 혈관 루프를 사용하여 측면으로 수축시킵니다(그림 5C). 부드럽게 omohyoid를 풀고 수축시킵니다. 다음으로, 미주 신경과 오모히오이드 근육 아래의 경동맥 다발을 부드럽게 풀어주고 내측으로 수축시킵니다.
참고: 여기서 주요 차별은 미주 신경과 횡격막 신경 사이입니다. 아래 구조물을 노출시켜야 하는 경우 오모히오이드를 자릅니다. - 횡격막 신경을 분리합니다(그림 5D).
참고: 횡격막 신경은 전방 비늘 근육의 표면을 따라 달리며 상완신경총에 수직으로 교차하는 눈에 띄게 작은 종신경으로 실행됩니다. 좌골 신경과 달리 목의 횡격막 신경 주변의 해부학적 구조는 더 복잡합니다. 최상의 결과를 위해 이식 전에 전기생리학적 확인(4.7단계)을 수행하십시오. - 기록 전극을 흉곽에 꼬리 쪽으로, 분리된 횡격막 신경의 동측에 피하로 배치합니다(그림 5E). 횡격막 신경에 자극기를 놓고 동기 신호 전달을 통해 확인합니다(그림 6).
알림: ~3-6mA의 자극 강도와 0.02ms의 자극 지속 시간으로 최대 반응을 불러일으키는 것이 일반적입니다. - 횡격 부위에 대해 근위 신경 말단에 전기 자극이 가해졌을 때 유발된 반응이 완전히 소멸되는 것을 보여줌으로써 횡격막 신경의 완전한 절개를 확인합니다(그림 6).
- 횡격막 신경 주위의 커프와 신경에 수직으로 위치한 접촉 전극을 사용하여 이식 가능한 장치의 수신기 코일을 양측 흉쇄유돌근에 대해 깊은 흉골에 배치하여 횡격막 신경에 배터리가 필요 없는 무선 장치를 이식합니다(그림 5F).
- 간단한 달리기 흡수성 봉합사로 표재성 경부 근막을 닫습니다(그림 5G). 깊은 진피에 중단된 거꾸로 흡수성 봉합사로 피부를 닫습니다. 동물이 마취에서 완전히 회복된 후에만 집으로 돌려보내십시오.
- 수술 후 치료의 경우 3.10단계를 따르십시오.
5. 치료용 전기 자극의 무선 전달
- 전신 마취 하에 쥐에게 1시간 동안 전기 자극을 가합니다. 무선 자극을 위해 파형/함수 발생기(전압: 1-15Vpp)와 옵션 증폭기를 동물 위에 배치하여 외부 유도 코일(즉, 전송 코일)(5회 회전의 2차원 나선형 코일, 직경: 2cm)에 전력을 공급하여 이식된 수신기 코일과 우수한 유도 결합을 보장합니다. 1시간 동안 20Hz에서 단상 200μs 펄스를 전달합니다.
- 전기 자극 전달을 확인하고 정량화하려면 경골 전방 근육에서 CMAP를 기록하고 자극 전압을 조정하여 좌골 신경의 최대 활성화를 전달합니다. 모든 녹음에 동심원 바늘 전극을 사용하십시오.
알림: 기능에서 생성된 최대 볼륨tage는 최대 응답을 불러일으키기에 충분하지 않으며 증폭기를 사용하십시오.
6. 안락사
- 기본 방법
- 케이지를 CO2 전달 챔버 아래에 놓고 8-12LPM(또는 챔버 크기에 따라 적절한 유량)의 속도로 설정합니다. 쥐가 의식을 잃었는지 모니터링한 다음 최소 1분 동안 호흡을 멈춥니다.
- 2차 방법
- 자궁 경부 탈구 또는 양측 개흉술을 수행합니다.
Representative Results
좌골 신경 손상 모델에서 임플란트는 경골 신경 가지의 종단 간 복구 전에 오른쪽 좌골 신경 주위에 배치됩니다(그림 3, 그림 4A 및 그림 7A). 30G 동심 바늘 전극을 우측 경골 전방 근육에 배치하여 최대 강도 전기 자극에 필요한 자극 매개변수를 정의합니다. 이러한 실험에는 반응 크기가 최대로 안정될 때까지 자극 강도를 높이는 것이 포함됩니다. 경골 전방은 좌골 신경의 비골 가지에 의해 신경이 분포되어 있기 때문에 경골 신경 절개 손상에서 보호됩니다. 따라서 경골 전방에서 기록하면 전기 자극 치료를 지속적으로 모니터링 할 수 있습니다.
와이어 전극에 의해 오른쪽 좌골 신경(5mA, 0.02ms)으로 전달되는 단일 자극 펄스의 경우 동측 경골 전방에 기록된 5.4mV 음의 피크 진폭으로 최대 CMAP 응답이 유도됩니다(그림 7B, 검은색 흔적). 배터리가 필요 없는 무선 임플란트에 의해 전달되는 유사한 자극 펄스의 경우 4.6mV 음의 피크 진폭으로 유사한 CMAP 응답이 유도됩니다(그림 7B, 주황색 트레이스). 이는 무선 신경 자극이 유선 기반 신경 자극을 통해 CMAP의 평균 88%를 달성한다는 최근 보고와 일치하며21 이는 임상 연구에서 치료 효과에 필요한 임계값을 훨씬 상회합니다 6,7,8,9. 표시된 예에서 무선 자극기와 유선 자극기의 대기 시간이 더 긴 것은 기록된 근육에서 더 멀리 떨어져 있기 때문입니다.
횡격막 신경 모델에서 임플란트는 절개 전에 오른쪽 횡격막 신경 주위에 배치됩니다(그림 5). 최대 강도 전기 자극에 필요한 자극 매개변수를 정의하기 위해 30G 동심 바늘 전극을 오른쪽(동측) 전방 늑골 가장자리에 피하로 배치하여 오른쪽 반격막에서 기록합니다. 실험에는 반응 크기가 최대로 정체될 때까지 자극 전압을 올리는 것이 포함됩니다. 횡격막 신경은 주변 신경 혈관 구조에서 분리하기 어려울 수 있기 때문에 경련 반응을 일으켜 그 정체를 확인할 수 있습니다(그림 6, 주황색 흔적). 자극의 특이성은 신경 전극 커프에 대한 말단의 횡격막 신경의 절개와 경련 반응의 후속 소멸을 통해 추가로 확인할 수 있습니다(그림 6; 검은색 흔적).
반복적인 저주파 전기 자극 요법은 축삭 재생을 향상시키는 확립된 프로토콜을 사용하여 1시간 동안 좌골 신경에 전달될 수 있습니다(6,7,8,9,10,11; 그림 8). 무선 임플란트의 커프 인터페이스를 오른쪽 좌골 신경에 배치하고 30G 동심 바늘 전극을 오른쪽 경골 전방 근육에 배치하여 치료를 모니터링했습니다. 그림 8A는 1시간 20Hz 전기 자극의 시작(0분)에 기록된 근전도에서 4개의 순차적 스파이크를 보여줍니다. 도 8b는 피크 진폭의 약간의 감소와 함께 1시간 전기 자극의 40분에 기록된 4개의 다른 스파이크를 보여주며, 이는 와이어-기반 전기 자극 요법15,21에 의해 나타난 피로 패턴과 일치한다.
말초 신경 재생 정도는 신경 병변 부위에 원위부에 적용되는 역행 추적자를 사용하여 평가할 수 있습니다. 말초 축삭돌기는 여러 개의 부수적 새싹을 싹 틔우기 때문에, 척수에 있는 운동 뉴런 소마의 역행 추적 및 개수는 신경 자체 내에서 재생되는 축삭돌기를 세는 것보다 재생 뉴런의 수를 더 정확하게 평가할 수 있게 한다31. 이를 증명하기 위해 좌골 신경 줄기가 압착 손상으로 절제되었습니다. 3주간의 회복 후, 좌골 신경의 두 가지, 즉 비골 신경(녹색)과 경골 신경(빨간색)에 각각 두 가지 형광 역행 염료를 투여했습니다(그림 9A). 그림 9B-D는 경골 신경(그림 9B) 또는 비골 신경(그림 9C)을 형성하는 요추 척수 전방 뿔의 하부 운동 뉴런의 불이 켜진 하위 그룹을 보여줍니다. 오버레이 이미지는 척수의 앞쪽 뿔에 있는 표지된 뉴런의 두 개의 뚜렷한 열을 보여주며, 이는 공간 분포와 병변 부위 원위부의 축삭을 재생한 운동 뉴런의 수 측면에서 정량화할 수 있습니다(그림 9D).
그림 1: 신경 재생 모델. (A) 간극 교차는 신경 복구 후 축삭이 근위부에서 원위 신경 말단으로 성장할 때 신경 복구 후 초기에 발생합니다. (B) 원위 재성장의 지속 기간은 표적 말단 기관(예: 피부, 근육)까지의 거리 및 축삭돌기 재성장 속도와 관련이 있습니다. 신경 회복을 개선하기 위한 대부분의 치료법은 이러한 과정 중 하나 또는 둘 다를 목표로 합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 무선 전자 자극기 제작의 그림. 왼쪽은 원형 무선 주파수 전력 수확기 코일, 신축성 있는 확장 전극, 관심 신경을 감싸는 신경 커프를 포함한 장치 구조의 세부 레이어입니다. 오른쪽은 장치의 세 부분을 보여 주는 단순화된 그림입니다. 약어: PLGA = 폴리(젖산-코-글리콜산); b-DCPU = 생체 흡수성 동적 공유 폴리 우레탄. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 쥐의 좌골 신경 모델에서 배터리가 필요 없는 무선 신경 계면 이식. (A) 그림은 쥐의 오른쪽 좌골 신경에 완전히 이식 가능한 시스템을 묘사합니다. (B) 상단 패널은 좌골 신경에 위치한 전극 계면이 오른쪽 경골 신경의 종단 간 복구에 바로 근접한 것을 보여줍니다. 하단 패널은 근위부 말단과 원위 신경 그루터기 사이의 틈 수리를 연결하는 확장된 신경 커프가 있는 전극 인터페이스를 보여줍니다. 약어: PLGA = 폴리(젖산-코-글리콜산). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: 좌골 신경 이식 절차. (A) 피부, 피하 결합 조직 및 둔근을 절개하여 햄스트링을 노출시킵니다. (B) 고립된 좌골 신경(검은색 화살표). (C) 신경 커프, 와이어(흰색 별표) 및 임플란트가 보이는 이식 후 장치(별표). (D) 봉합사에 의한 결합 조직의 폐쇄. (E) 상처 클립에 의한 절개 봉합. (F) 피부 위의 코일에 의해 생성된 무선 전기 자극. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5: 횡격막 신경 이식 절차. (A) 앙와위 자세에서 목의 복부 모습. (B) 흉골 설근을 노출시키기 위해 피부와 피하 결합 조직을 절개합니다. (C) 오모설근(omohyoid muscle)과 흉쇄유돌근(sternocleidomastoid muscle) 사이의 전위 공간을 통해 해부. (D) 상완신경총에서 분리된 횡격막신경(화살표). (E) 횡격막 신경의 횡격막 근전도 확인. 검은색 화살표, 기록 전극. 빨간색 화살표, 자극기. (F) 이식. (G) 깊은 피부 봉합으로 피부를 닫습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 6: 횡격막에서 유발된 복합 근육 활동 전위에 의한 완전한 횡격막 신경 절개 손상 확인. 횡격막 신경 절개술(ORANGE) 이전에는 횡격막의 전기 자극이 횡격막에 복합 근육 활동 전위를 유발했는데, 이는 횡격막 신경 절개술(BLACK)에 의해 폐지되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 7: 무선 전기 자극과 유선 기반 전기 자극을 비교한 대표적인 신경 전도 연구. (A) 좌골 신경의 무선(BLACK) 및 유선(ORANGE) 장치 배치 그림. 기록 전극은 경골 전방에 배치되었습니다. (B) 유선 임플란트(ORANGE) 대 무선 임플란트(BLACK)에 의해 유발되는 복합 근육 활동 전위. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 8: 임플란트 후 1시간 동안 20Hz의 반복적인 전기 자극을 받은 TA 근육의 EMG 기록. (A) e-stim의 최소 1에서 EMG의 흔적. (B) e-stim의 최소 40에서 EMG의 흔적. 약어: EMG = 근전도; TA = 경골 전방; e-stim = 전기 자극; min = 분. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 9: 좌골 신경 재생의 대표 이미지. (A) 좌골 신경 손상 및 형광 역행 표지의 그림. 좌골 신경 축삭돌기는 압착 손상에 의해 절제되었습니다. 3주간의 회복 후, 원위 가지인 비골 신경(녹색)과 경골 신경(빨간색)에 역행 라벨이 붙었습니다. (비-디) ipsilesional anterior horn 내의 neuronal soma를 보여주는 요추 척수의 이미지. 스케일 바 = 30 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
Discussion
이 논문은 쥐의 좌골 신경과 횡격막 신경 모델에서 무선, 배터리 무선, 완전 이식 가능한 말초 신경 인터페이스의 외과적 이식 및 작동 단계를 설명합니다. 우리는 이 새로운 종류의 생의학 임플란트가 전임상 및 임상 연구에서 축삭 재생을 향상시키는 것으로 나타난 치료적 전기 자극 패러다임을 전달하는 데 어떻게 사용될 수 있는지 보여줍니다(검토를 위해22 참조). 이 프로토콜은 복잡하지 않고, 마우스(21)와 같은 더 작은 동물 모델뿐만 아니라, 광전자 및 미세유체 말초 신경 인터페이스(18,23,24,25,26,27,28,29,30)를 포함하는 기능을 갖는 다른 무선의, 무배터리, 완전 이식형 장치로 외삽될 수 있다. 또한 설치류 좌골 신경을 이용한 접근법이 시연되었는데, 이는 가장 흔한 실험 모델(31)이다.
이 접근법의 다양성은 말초신경 손상(peripheral nerve injury)32의 모델로 거의 사용되지 않는 횡격막신경(phrenic nerve)과의 접점에 적응할 때 나타났는데, 이는 아마도 매우 잘 알려지지 않은 임상적 문제이기 때문일 것이다 33,34,35. 횡격막 신경 손상 진단 및 재활은 COVID-19 팬데믹 기간 동안 중요한 문제가 되었습니다 36,37,38. 횡격막 축삭돌기의 재생과 횡격막 마비로부터의 회복이 이 짧은 저주파 전기 자극 패러다임에 의해 증강될 수 있는지 여부는 현재 알려져 있지 않습니다. 그러나 횡격막 근육 페이싱을 위한 횡격막 신경 전기 자극은 높은 경추 척수 손상으로 인한 사지 마비 환자의 호흡 부전에 대해 확립된 옵션이다 39,40,41,42,43. 중증 질환 후 인공호흡기 이탈을 포함한 다른 적응증도 연구되고 있다44.
이식된 시스템의 원활한 작동을 보장하기 위해 몇 가지 중요한 단계를 강조해야 합니다. 첫째, 납 절연 제거, 꼬임 또는 파손을 방지하기 위해 장치를 취급할 때 장치의 얇은 전자 부품에 너무 많은 힘을 가하지 않는 것이 중요합니다. 다음으로, 위에 놓인 피부에 무선 주파수 전력 수확기 코일의 위치를 정확하게 표시하는 것이 중요합니다. 셋째, 구즈넥 클램프를 사용하여 이식된 장치의 전력 수확기 코일 위에 외부 무선 주파수 전원 공급 장치의 전송 코일을 조심스럽게 정렬하면 안정적인 작동이 가능합니다. 마지막으로, 근육 경련을 육안으로 관찰하는 것 외에도 전기 자극을 확인하기 위해 주기적인 신경 생리학적 모니터링이 권장됩니다. 목에 있는 횡격막 신경의 더 복잡한 해부학적 구조의 경우, 전기생리학적 확인은 올바른 신경이 분리되었음을 입증하는 데 도움이 됩니다(그림 6).
본 논문 18,19,21에 나타낸 무선, 배터리가 필요 없는 전기 자극기 외에도, 많은 다른 장치들이 잠재적으로 동일한 절차를 공유한다. 예를 들어, 교감신경 및 부교감신경계(30,45,46)로부터의 신호를 만성적으로 기록하기 위해 설인두 및 미주신경에 이식하도록 설계된 전극들이 횡격막 신경과 유사한 수술 영역을 공유하기 때문에, 이 프로토콜은 이들의 이식을 위해 적응될 수 있다. 리스토어(ReStore)와 같은 말초 신경을 위한 무선 장기 생체 적합성 자극기는 제자리에 머물면서 필요에 따라 신경을 자극할 수 있는 훌륭한 도구이다 25,47,48,49,50. 관련 다채널 무선 녹음 임플란트도51건으로 보고되었습니다. 전반적으로, 우리는 이러한 수술 및 전기 자극 프로토콜이 전기 자극 또는 기록과 관련된 모든 무선 말초 신경 인터페이스의 표준으로 채택될 수 있다고 믿습니다.
Disclosures
저자는 이해 상충이 없습니다.
Acknowledgments
이 작업은 SHyNE Resource(NSF ECCS-1542205), IIN 및 Northwestern의 MRSEC 프로그램(NSF DMR-1720139)의 지원을 받은 Northwestern University의 NUANCE Center의 NUFAB 시설을 사용했습니다. 이 연구는 노스웨스턴대학교 재료연구센터에서 미국 국립과학재단(National Science Foundation)의 MRSEC 프로그램(DMR-1720139)이 지원하는 MatCI Facility를 활용했습니다. C.K.F는 NIH의 유니스 케네디 슈라이버 아동 건강 및 인간 발달 연구소(보조금 번호 R03HD101090)와 미국 신경근 재단(개발 보조금)의 지원을 인정합니다. Y.H.는 NSF의 지원을 인정합니다(보조금 번호. CMMI1635443). 이 연구는 노스웨스턴 대학의 Querrey Simpson Institute for Bioelectronics의 지원을 받았습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Amplifier | Electronics & Innovation | 201L | |
| Arbitrary Waveform Generator | RIGOL | DG1032Z | 30 MHz, 2 Channel, 200 MS/s, 14bit Resolution, 8 Mpts |
| Bupivacaine | Pfizer | 655317 | Marcaine, 0.5% |
| Copper/polyimide/copper | Pyralux | AP8535R | 18 µm thick top and bottom copper, 75 µm thick polyimide |
| EMG recording device | Natus | Nicolet VikingQuest | |
| EPOXY MARINE | Loctite | ||
| Isoflurane, USP | Butler Schein Animal Health | 1040603 | ISOTHESIA |
| Meloxicam | covetrus | 5mg/ml | |
| Needle electrodes | Technomed USA Inc. | TE/B50600- 001 | |
| PDMS (Silicone Elastomer Kit) | DOW | SYLGARD™ 184 | |
| ProtoLaser U4 | LPKF | U4 | |
| Puralube Vet Ointment Sterile Ocular Lubricant | Puralube | 83592 | |
| Waveform generator | Agilent Technologies | Agilent 33250A |
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