Summary
Detta är ett protokoll för kirurgisk implantation och drift av ett trådlöst drivet gränssnitt för perifera nerver. Vi demonstrerar användbarheten av detta tillvägagångssätt med exempel från nervstimulatorer placerade på antingen råttischiasnerven eller frenisnerven.
Abstract
Perifera nervgränssnitt används ofta inom experimentell neurovetenskap och regenerativ medicin för en mängd olika tillämpningar. Sådana gränssnitt kan vara sensorer, ställdon eller båda. Traditionella metoder för perifer nervgränssnitt måste antingen vara bundna till ett externt system eller förlita sig på batterikraft som begränsar tidsramen för drift. Med den senaste utvecklingen av trådlösa, batterifria och helt implanterbara perifera nervgränssnitt kan en ny klass av enheter erbjuda funktioner som matchar eller överträffar deras trådbundna eller batteridrivna prekursorer. Denna artikel beskriver metoder för att (i) operera in och (ii) trådlöst driva och kontrollera detta system hos vuxna råttor. Ischias- och frenisnervsmodellerna valdes ut som exempel för att belysa mångsidigheten i detta tillvägagångssätt. Artikeln visar hur det perifera nervgränssnittet kan framkalla sammansatta muskelaktionspotentialer (CMAP), leverera ett terapeutiskt elektriskt stimuleringsprotokoll och införliva en ledning för reparation av perifer nervskada. Sådana enheter erbjuder utökade behandlingsalternativ för terapeutisk stimulering med engångsdos eller upprepad dosering och kan anpassas till en mängd olika nervplatser.
Introduction
Traumatiska perifera nervskador (PNI) förekommer i USA med en årlig incidens på cirka 200 000 per år1. De flesta patienter som drabbas av PNI får bestående funktionsnedsättningar. I värsta fall kan detta leda till muskelförlamning och utlösa behandlingsrefraktär neuropatisk smärta som är så svår att patienterna är villiga att genomgå en amputation av extremiteterna som behandling2. Det största hindret för att förbättra PNI-resultaten är att axonregenereringen är för långsam i förhållande till de avstånd de måste växa igen. Till exempel växer ett vuxet mänskligt axon med 1 mm/dag men kan behöva regenerera över avstånd >1000 mm vid en lesion i en proximal extremitet.
I nuvarande klinisk praxis kräver ~50 % av PNI:erna kirurgisk reparation3. För framgångsrik nervregenerering måste axoner (i) växa över lesionsstället (dvs. gapkorsning) och sedan (ii) regenerera längs nervbanan för att nå ett mål för slutorganet (dvs. distal återväxt) (Figur 1). Det finns inga FDA-godkända läkemedel som visat sig påskynda nervregenerering. Status quo för PNI:s kliniska hantering har endast förändrats stegvis under de senaste decennierna och är begränsad till tekniska förbättringar av kirurgiska metoder såsom distala motoriska nervöverföringar för att minska avståndet som regenererande axoner måste färdas4, eller syntetiska nervledningar "från hyllan" för fall där den proximala nerven dras tillbaka och inte direkt kan sys ihop igen5. Det har dock gjorts fyra randomiserade kliniska prövningar på terapeutisk elektrisk stimulering applicerad på nerver postoperativt, som var enkelcenterstudier ledda av Dr. K. Ming Chan vid University of Alberta som visar signifikant förbättrad reinnervering av muskel 6,7,8 eller hud9. Det grundläggande arbetet för detta elektriska stimuleringsprotokoll utfördes på gnagare10,11, där det har visats att elektrisk stimulering fungerar specifikt genom att förbättra gap crossing (Figur 1) men inte distal återväxt 12,13,14,15.
Den kirurgiska placeringen av transkutana trådelektroder som användes i alla fyra randomiserade kliniska prövningar med elektrisk stimulering var nödvändig eftersom dess effekter beror på leveransen av tillräcklig ström för att depolarisera neuroncellkroppen vid 20 Hz kontinuerligt i 1 timme11. I klinisk praxis är detta elektriska stimuleringsprotokoll inte tolerabelt för de flesta patienter vid de intensiteter som krävs via ytstimulerande elektroder på huden på grund av smärta. Det finns icke-triviala risker förknippade med att köra transkutana elektroder postoperativt, såsom djup sårinfektion eller oavsiktlig förskjutning av ledningar från nerverna under patienttransport från operationssalen (OR). Dessutom är den höga kostnaden för operationstid i sig ett hinder för att försöka i den miljön snarare än under akut postoperativ återhämtning. En ny klass av trådlösa, batterifria och helt implanterbara perifera nervgränssnitt växer fram för att ta itu med denna brist i befintliga perifera nervgränssnitt.
Denna nya klass av trådlösa implanterbara elektroniska system är redo att öka enkelheten och flexibiliteten för elektrisk stimuleringsdosering och bryta ner de barriärer som förhindrar en bredare klinisk implementering. Denna artikel beskriver metoder för att (i) kirurgiskt implantera och (ii) trådlöst driva och kontrollera detta system i vuxna råttischias- och freninnervsmodeller. Den visar hur det perifera nervgränssnittet kan framkalla CMAP, leverera ett terapeutiskt elektriskt stimuleringsprotokoll och till och med fungera som en kanal för reparation av perifera nerver. Protokollen här kan anpassas för andra varianter av denna teknik som kan leverera ljuspulser för optogenetisk medierad neuromodulering16, kontrollerad läkemedelsfrisättning17 eller upprepade anfall av elektrisk stimulering över tid18,19.
Protocol
Alla procedurer som beskrivs i detta protokoll utförs i enlighet med NIH:s guide för vård och användning av försöksdjur och har godkänts av Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) vid Northwestern University. Detta protokoll följer riktlinjerna för djurvård från Northwestern University's Center for Comparative Medicine och IACUC. Det är nödvändigt att samråda med IACUC när protokollen anpassas.
1. Tillverkning av trådlösa elektroniska stimulatorer (figur 2)
- Använd koppar/polyimid/koppar (18 μm tjock topp- och bottenkoppar, 75 μm tjock polyimid) som substrat för radiofrekvensskördarspolen (dvs. trådlös mottagarantenn).
- Använd direkt laserablation för att mönstra hål för elektroderna på de övre och nedre kopparskikten och forma enheten. Anslut de övre och nedre lagren elektriskt med silverpasta genom hålen.
- Fäst de elektroniska komponenterna med handelsförpackningar, såsom diod och kondensator, via lödning.
- Använd den bioresorberbara dynamiska kovalenta polyuretanen (b-DCPU; 200 μm tjock) inkapslade molybden (Mo; 15 μm tjock; serpentinstruktur) som töjbara förlängningselektroder19.
- Forma manschettelektroden för gränssnittet mellan enheten och nerven med hjälp av poly(mjölk-co-glykolsyra) (PLGA) film (300 μm tjock).
- Efter att ha anslutit den trådlösa mottagarantennen och den töjbara förlängningselektroden, kapsla in den trådlösa mottagarantennen och anslutningen med kommersialiserad vattentät epoxi eller polydimethysiloxan (PDMS). Se figur 2 (höger) för den färdigmonterade enheten.
- Bekräfta enhetens trådlösa drift med hjälp av en vågformsgenerator för att generera monofasiska elektriska impulser via primärspolen (dvs. transmissionsspolen).
OBS: Vid undersökning av rekrytering av perifera axoner och induktion av axonal regenerering genom monofasiska och bifasiska stimuli har tidigare studier rapporterat en försumbar effekt på grund av skillnaderna i vågformskarakteristik20, och denna grupp har kunnat uppnå terapeutisk förbättring av elektrisk stimulering med samma monofasiska strömparametrar hos möss21 och råttor18. Dessutom har man i tidigare studier undersökt biokompatibilitet in vivo och in vitro och inte funnit några tecken på vävnadsskador från upphettningseffekter eller själva materialen. På grund av dessa fynd och den begränsade varaktigheten av terapeutisk elektrisk stimulering i den aktuella studien användes monofasiska, snarare än bifasiska, stimuli i detta protokoll. - Mät den resulterande likströmsutspänningen med ett oscilloskop anslutet till manschettelektroden.
2. Förberedelse av enheten för implantation
- Placera implantatanordningarna i en steril petriskål och försegla den med parafilm.
- Bestråla enheterna med UV-ljus i 30 minuter per sida.
3. Kirurgiskt ingrepp av råtta höger ischiasnervimplantation av trådlöst, batterifritt perifert nervgränssnitt för elektrisk stimulering (figur 3)
OBS: Upprätthåll sterila förhållanden. Utför operationer inom det avsedda kirurgiska området i ett djuringreppsrum. Kirurgen kommer att ta på sig en ansiktsmask, rock, keps och sterila handskar under operationen. Om mer än en operation utförs, byt sterila handskar mellan djuren och använd rena, sterila kirurgiska instrument för varje operation. Sterilisera verktyg mellan operationerna genom värmesterilisering (autoklav eller glaspärlsterilisator). Använd vuxna Sprague-Dawley-råttor som väger 200-250 g.
- Inducera anestesi med isoflurangasanestesi (3 % induktion, 1-3 % underhållsbehandling) i syrgas (2 l/min), med subkutan administrering av meloxikam (1-2 mg/kg). Täck råttornas ögon med en ögonsalva för att förhindra uttorkning.
- Placera råttorna på mage på desinficerade operationsbord för efterföljande ingrepp. För den återstående kirurgiska varaktigheten, bedöm andningsfrekvensen (bör vara ~2/s), vävnadsfärg och anestesidjup inte mindre än var 15:e minut och upprätthåll isoflurannivåerna i enlighet med detta. Bekräfta lämpligt anestesidjup genom att kontrollera pedalreflexen (brist på svar på ett hårt tånyp). Övervaka slemhinnorna, som ska förbli rosa och fuktiga.
- Raka operationsområdet, inklusive höger ben och nedre halvan av ryggen. Skrubba det rakade operationsområdet med en betadindyna, följt av en 70 % medicinsk etanolpinne, och upprepa denna skrubbprocess tre gånger för huddesinfektion.
- Gör ett snitt på 1,5 – 2 cm i huden parallellt med höger lårben med hjälp av en vävnadssax, följt av trubbig separation av subkutan bindväv på baksidan (direkt medialt till snittet) för att rensa en subkutan ficka för mottagarspolen (Figur 4A). Gör ett efterföljande snitt (1,2-1,5 cm) på höger sätesmuskel parallellt med hudsnittet.
- Isolera försiktigt ischiasnerven med metalldissektionssonder med trubbiga ändar (Figur 4B).
OBS: Ischiasnerven ligger djupt till biceps femoris och löper parallellt med lårbenet. Ett dissekeringsomfång föreslås. - Implantera den trådlösa, batterifria enheten på ischiasnerven (Figur 4C) genom att linda manschetten runt den isolerade högra ischiasnerven, utan att sätta nerven under spänning eller förvränga dess väg 18,19,20. Märk ut på huden var mottagarspolen är placerad för ytterligare elektrisk stimulering.
- Suturera sätesmuskelsnittet med hjälp av absorberbara suturer (Figur 4D).
OBS: Den övre halvan av mottagarspolen sitter ovanför sätesmuskeln och manschetten under den. - Stäng hudsnittet med sårklämmor (eller begravd sutur; Figur 4E). Matcha hudkanterna.
- Ge 1 timmes kontinuerlig postoperativ 20 Hz elektrisk stimulering med 200 μs pulsbredd under anestesi (Figur 4F). Återföra djuren till sina hemburar när de har återhämtat sig helt från anestesi.
OBS: Det detaljerade protokollet beskrivs nedan. Mottagarspolen visas ovanför huden i figur 4F. - Postoperativ behandling
- Placera råttan i en uppvakningsbur utan strö, fodrad med hushållspapper, med halva buren placerad på en lämplig temperaturreglerad värmekälla (godkänd värmedyna).
- Övervaka råttan noggrant tills den är ambulerande. När råttan är ambulerande och bedöms vara stabil ska den sättas tillbaka i buren och ses efter social återintegrering.
- Efter akut återhämtning, övervaka råttorna med avseende på infektion vid snittstället och för symtom på neurogen smärta, inklusive men inte begränsat till vaktning, vridning, kliande och självstympning. Övervaka råttorna dagligen under den 5 dagar långa återhämtningsperioden efter operationen, och minst en gång var tredje dag efter det om råttorna inte avlivas på dag 5.
- Administrera meloxikam (1-2 mg/kg) subkutant en gång dagligen i två till tre dagar efter operationen, beroende på djurets uppvisade smärta/obehag. Vid misstanke om ihållande smärta ska meloxikam fortsätta postoperativt efter denna period, och om det visar sig vara refraktärt ska råttan avlivas tidigt i samråd med veterinärteamet.
- Ta bort hudsuturerna eller sårklämmorna 10-12 dagar efter operationen.
4. Kirurgiskt ingrepp av vänster frenisk nervimplantation av trådlösa stimulatorer på råtta (Figur 5A)
OBS: Upprätthåll sterila förhållanden, som i avsnitt 3. Använd vuxna Sprague-Dawley-råttor som väger 200-250 g. Sterilisera alla kirurgiska verktyg före användning.
- Inducera anestesi med isoflurangasanestesi (3 % induktion, 1-3 % underhållsbehandling) i syrgas (2 l/min), med subkutan administrering av meloxikam (1-2 mg/kg). Täck råttans ögon med avsedd ögonsalva för att förhindra uttorkning.
- Placera råttorna på rygg på desinficerade operationsbord för efterföljande ingrepp. Under den återstående kirurgiska varaktigheten, bedöm andningsfrekvens, vävnadsfärg och anestesidjup inte mindre än var 15:e minut och upprätthåll isoflurannivåerna i enlighet med detta. Bekräfta lämpligt anestesidjup genom att kontrollera pedalreflexen (brist på svar på ett hårt tånyp). Övervaka slemhinnorna, som ska förbli rosa och fuktiga.
- Raka operationsområdet på den ventrala aspekten av halsen. Skrubba det rakade operationsområdet med en betadindyna, följt av en 70 % medicinsk etanolpinne, och upprepa denna skrubbprocess tre gånger för huddesinfektion.
- Administrera bupivakain (2 mg/kg, utspätt i koksaltlösning med högst 0,5 ml) subkutant vid mittlinjen på halsen, med inriktning på det ytligaste skiktet. Gör ett snitt på 3 cm i mitten genom huden och den ytliga cervikala fascian för att exponera sternohyoid- och sternocleidomastoideusmusklerna (Figur 5B).
OBS: Ett dissekeringsomfång föreslås. - Höj sternocleidomastoideusen med en lätt trubbig dissektion med en sond och dra tillbaka den i sidled med hjälp av en kärlögla (Figur 5C). Lossa försiktigt och dra tillbaka omohyoiden. Frigör sedan försiktigt vagusnerven och halspulsådret under omohyoidmuskeln.
OBS: Den största skillnaden här är mellan vagusnerven och frenisnerven. Skär av omohyoiden om det är nödvändigt för att exponera de underliggande strukturerna. - Isolera frenusnerven (Figur 5D).
OBS: Den freniska nerven löper längs ytan av den främre skalenmuskeln och löper som en anmärkningsvärt liten längsgående nerv som korsar vinkelrätt mot plexus brachialis. Till skillnad från ischiasnerven är anatomin runt frenisnerven vid halsen mer komplex. Utför elektrofysiologisk bekräftelse (steg 4.7) före implantation för bästa resultat. - Placera registreringselektroden subkutant, precis kaudalt mot bröstkorgen, ipsilateralt mot den isolerade freniska nerven (Figur 5E). Placera stimulatorerna på frenisnerven och bekräfta via synkron signalering (Figur 6).
OBS: Att framkalla en maximal respons med en stimulusintensitet på ~3-6 mA och stimulusvaraktighet på 0.02 ms är typiskt. - Verifiera fullständig transsektion av frenusnerven genom att visa fullständigt avskaffande av den framkallade responsen när en elektrisk stimulus appliceras på den proximala nervänden i förhållande till transsektionsstället (Figur 6).
- Implantera en trådlös, batterifri enhet på frenusnerven (Figur 5F) genom att placera mottagarspolen på den implanterbara enheten på sternohyoiden, djupt i förhållande till de bilaterala sternocleidomastoideusmusklerna, med manschetten runt frenusnerven och kontaktelektroderna placerade vinkelrätt mot nerven.
- Stäng den ytliga cervikala fascian med enkla absorberbara suturer (Figur 5G). Stäng huden med avbrutna inverterade absorberbara suturer i den djupa dermis. Återför djuren till sina hemburar först när de har återhämtat sig helt från narkosen.
- För postoperativ behandling, följ steg 3.10.
5. Trådlös tillförsel av terapeutisk elektrisk stimulering
- Applicera elektrisk stimulering i 1 timme på råttorna under narkos. För den trådlösa stimuleringen, placera en vågforms-/funktionsgenerator (voltage: 1-15 Vpp) och valfri amplifier ovanför djuret för att ge elektrisk ström till en extern induktiv spole (dvs. transmissionsspole) (tvådimensionell spiralspole med 5 varv; diameter: 2 cm) för att säkerställa god induktiv koppling med den implanterade mottagarspolen. Leverera monofasiska 200 μs-pulser vid 20 Hz under 1 timmes varaktighet.
- För att verifiera och kvantifiera elektrisk stimulering, registrera CMAPs från tibial anterior muskel och justera stimuleringsspänningen för att leverera supramaximal aktivering av ischiasnerven. Använd koncentriska nålelektroder för alla inspelningar.
OBS: Om funktionsgenererad maximal voltage är otillräcklig för att framkalla en maximal respons, använd en amplifier.
6. Eutanasi
- Primär metod
- Placera buren under en CO2 -tillförselkammare, inställd på en hastighet av 8-12 LPM (eller lämplig flödeshastighet baserat på kammarens storlek). Övervaka råttorna för medvetslöshet och sedan i minst 1 minut efter andningsuppehåll.
- Sekundär metod
- Utför cervikal dislokation eller bilateral torakotomi.
Representative Results
I ischiasnervskademodellen placeras implantatet runt den högra ischiasnerven före end-to-end-reparation av tibialnervgrenen (Figur 3, Figur 4A och Figur 7A). En 30 G koncentrisk nålelektrod placeras i den högra främre tibialismuskeln för att definiera de stimulusparametrar som behövs för maximal intensitet av elektrisk stimulering. Dessa experiment inkluderar att höja stimuleringsintensiteten tills responsstorleken planar ut maximalt. Eftersom tibialis anterior innerveras av den fibulära grenen av ischiasnerven, skonas den vid tibialnervens transektionsskada. Registrering från tibialis anterior möjliggör således kontinuerlig övervakning av den elektriska stimuleringsbehandlingen.
För en enda stimuluspuls som levereras av en trådelektrod till höger ischiasnerv (5 mA, 0,02 ms) erhålls ett maximalt CMAP-svar med en 5,4 mV negativ toppamplitud registrerad på ipsilateral tibialis anterior (Figur 7B; svart spår). För en jämförbar stimuluspuls som levereras av det trådlösa, batterifria implantatet erhålls ett jämförbart CMAP-svar med en negativ toppamplitud på 4,6 mV (figur 7B; orange spår). Detta stämmer överens med en nyligen publicerad rapport om att trådlös nervstimulering i genomsnitt uppnår 88 % av CMAP från trådbaserad nervstimulering21, långt över den tröskel som krävs för terapeutiska effekter i kliniska studier 6,7,8,9. I exemplet som visas berodde den längre latensen för den trådlösa stimulatorn jämfört med trådbunden stimulator på dess större avstånd från den registrerade muskeln.
I frenicnervmodellen placeras implantatet runt den högra freniska nerven före transsektion (figur 5). För att definiera de stimulusparametrar som behövs för maximal intensitet av elektrisk stimulering placeras en 30 G koncentrisk nålelektrod subkutant vid den högra (ipsilaterala) främre revbensmarginalen för att registrera från höger hemidiafragma. Experimenten går ut på att höja stimuleringsspänningen tills responsmagnituden planar ut maximalt. Eftersom frenusnerven kan vara svår att isolera från omgivande neurovaskulära strukturer, kan dess identitet bekräftas genom att framkalla en ryckrespons (Figur 6; orange spår). Stimuleringens specificitet kan verifieras ytterligare genom transsektion av frenusnerven distalt om nervelektrodmanschetten med efterföljande eliminering av ryckresponsen (Figur 6; svart spår).
Repetitiv, lågfrekvent elektrisk stimuleringsterapi kan levereras till ischiasnerven i 1 timme med hjälp av ett etablerat protokoll som förbättrar axonregenerering (6,7,8,9,10,11; Figur 8). Manschettgränssnittet för det trådlösa implantatet placerades på höger ischiasnerv och den koncentriska nålelektroden på 30 G placerades på den högra främre tibialismuskeln för att övervaka behandlingen. Figur 8A visar fyra sekventiella spikar i den registrerade elektromyografin i början (0 min) av den elektriska stimuleringen på 1 h 20 Hz. Figur 8B visar fyra andra toppar registrerade vid 40 minuter av den elektriska stimuleringen på 1 timme med en liten minskning av toppamplituden, vilket överensstämmer med det trötthetsmönster som noterats med trådbaserad elektrisk stimuleringsterapi15,21.
Graden av perifer nervregenerering kan bedömas med hjälp av retrograda spårämnen som appliceras distalt på nervlesionsstället. Eftersom perifera axoner gror multipla kollaterala groddar, möjliggör retrograd spårning och räkning av den motoriska nervcellen soma i ryggmärgen en mer exakt bedömning av antalet regenererande neuroner än att räkna regenererande axoner i själva nerven31. För att demonstrera detta transekterades ischiasnervstammen av en krosskada. Efter 3 veckors återhämtning administrerades två olika fluorescerande retrograda färgämnen på två grenar av ischiasnerven: fibularnerven (grön) respektive tibialnerven (röd) (Figur 9A). Figur 9B-D visar upplysta undergrupper av nedre motorneuroner i ländryggsryggmärgens främre horn som bildar antingen tibialnerven (Figur 9B) eller vadbensnerven (Figur 9C). Överlagringsbilden visar två distinkta kolumner av märkta neuroner i ryggmärgens främre horn, som kan kvantifieras i termer av rumslig fördelning och antalet motoriska neuroner som har regenererat ett axon distalt om lesionsstället (Figur 9D).
Figur 1: Modell för nervregenerering. (A) Gap crossing sker tidigt efter nervreparation när axoner växer från proximal till distal nervände efter reparation. (B) Varaktigheten av distal återväxt är relaterad till avståndet till målorganet (t.ex. hud, muskel) och hastigheten för axonåterväxt. De flesta terapier för att förbättra nervreparation riktar sig mot en eller båda av dessa processer. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Illustration av en trådlös elektronisk stimulatortillverkning. Till vänster, detaljerade lager av enhetens struktur, inklusive en cirkulär radiofrekvensskördarspole, en töjbar förlängningselektrod och en nervmanschett som lindas runt en nerv av intresse. Till höger, en förenklad illustration som visar tre delar av enheten. Förkortningar: PLGA = poly(mjölk-co-glykolsyra); b-DCPU = bioresorberbar dynamisk kovalent polyuretan. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: Implantation av trådlöst, batterifritt nervgränssnitt i ischiasnervmodellen hos råtta. (A) Illustrationen visar ett helt implanterbart system i den högra ischiasnerven hos en råtta. (B) Den övre panelen visar ett elektrodgränssnitt placerat på ischiasnerven precis proximalt till reparationen av den högra tibialnerven. Den nedre panelen visar ett elektrodgränssnitt med en förlängd nervmanschett som överbryggar gapreparation mellan den proximala änden och den distala nervstumpen. Förkortning: PLGA = poly(mjölk-co-glykolsyra). Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 4: Procedur för implantation av ischiasnerven. (A) Snitt på huden, subkutan bindväv och sätesmuskeln för att exponera hamstring. (B) Isolerad ischiasnerv (svart pil). (C) Anordning efter implantation med nervmanschett, trådar (vit asterisk) och synligt implantat (stjärna). (D) Förslutning av bindväven genom sutur. (E) Förslutning av snittet med sårklämmor. (F) Trådlös elektrisk stimulering genererad av en spole ovanför huden. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 5: Procedur för implantation av frenisk nerv. (A) Ventral vy av nacken i ryggläge. B) Snitt på huden och subkutan bindväv för att blotta sternohyoidmuskeln. C) Dissekering genom det potentiella utrymmet mellan omohyoidmuskeln och sternocleidomastoideusmuskeln. (D) Frenisk nerv (pil), isolerad från plexus brachialis. (E) Diafragmatisk elektromyografisk bekräftelse av frenusnerven. Svart pil, inspelningselektrod. Röd pil, stimulatorer. f) Implantation. (G) Förslutning av huden med djupa dermala stygn. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 6: Bekräftelse av fullständig frenisk nervtranssektionsskada genom framkallade sammansatta muskelaktionspotentialer från diafragman. Före frenisk nervtranssektion (ORANGE) framkallade elektrisk stimulering av frenusnerven sammansatta muskelaktionspotentialer på det ipsilaterala membranet, vilket avskaffades genom frenisk nervtranssektion (BLACK). Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 7: Representativa nervledningsstudier som jämför trådlös och trådbaserad elektrisk stimulering. (A) Illustration av trådlösa (SVART) och trådbundna (ORANGE) enheters placering på ischiasnerven. Inspelningselektroden placerades i tibialis anterior. (B) Sammansatta muskelaktionspotentialer framkallade av trådbundet implantat (ORANGE) kontra trådlöst implantat (SVART). Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 8: EMG-inspelning från TA-muskel med 20 Hz repetitiv elektrisk stimulering i 1 timme från implantat. (A) Spår av EMG vid min 1 av e-stim. (B) Spår av EMG vid min 40 av e-stim. Förkortningar: EMG = elektromyografi; TA = tibialis anterior; e-stimulering = elektrisk stimulering; min = minut. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 9: Representativa bilder av ischiasnervens regenerering. (A) Illustration av ischiasnervskada och fluorescerande retrograd märkning. Ischiasnervaxonerna transekterades av krosskador. Efter 3 veckors återhämtning märktes dess distala grenar - vadbensnerven (i grönt) och tibialnerven (i rött) - retrogradt. (B-D) Bilder av en ländryggmärg som visar neuronal soma i det ipsilesionella främre hornet. Skalstreck = 30 μm. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Discussion
Denna artikel beskriver stegen i den kirurgiska implantationen och driften av ett trådlöst, batterifritt och helt implanterbart perifert nervgränssnitt i råttischias- och frenisnervsmodellen. Vi visar hur denna nya klass av biomedicinska implantat kan användas för att leverera ett terapeutiskt elektriskt stimuleringsparadigm som visat sig förbättra axonregenerering i prekliniska och kliniska studier (för granskning, se22). Detta protokoll är okomplicerat och kan extrapoleras till mindre djurmodeller, såsom möss21, såväl som andra trådlösa, batterifria och helt implanterbara enheter med funktionalitet som inkluderar optoelektroniska och mikrofluidiska perifera nervgränssnitt 18,23,24,25,26,27,28,29,30. Metoden med ischiasnerven hos gnagare demonstreras också, vilket är den vanligaste experimentella modellen31.
Mångsidigheten i detta tillvägagångssätt har visat sig när det är anpassat för att samverka med frenusnerven, som sällan används som modell för perifer nervskada32, kanske för att det är ett mycket underkänt kliniskt problem 33,34,35. Diagnos och rehabilitering av freniska nervskador har blivit en viktig fråga under covid-19-pandemin 36,37,38. Det är för närvarande okänt om regenerering av freniska axoner och återhämtning från diafragmaförlamning kan förstärkas av detta korta, lågfrekventa elektriska stimuleringsparadigm. Emellertid är frenisk nervelektrisk stimulering för stimulering av diafragmamuskeln ett etablerat alternativ för andningssvikt hos patienter med tetraplegi från hög cervikal ryggmärgsskada 39,40,41,42,43. Andra indikationer undersöks, bland annat avvänjning i respirator efter kritisk sjukdom44.
Flera kritiska steg bör betonas för att säkerställa att det implanterade systemet fungerar väl. För det första är det viktigt att undvika att applicera för mycket kraft på de tunna elektroniska komponenterna i enheterna när du hanterar dem för att förhindra blyavisolering, veck eller brott. Därefter är det viktigt att noggrant markera platsen för radiofrekvensskördarspolen på den överliggande huden. För det tredje, noggrann inriktning av transmissionsspolen på den externa radiofrekvensströmförsörjningen över kraftskördarspolen på den implanterade enheten med en svanhalsklämma möjliggör stabil drift. Slutligen, för att bekräfta elektrisk stimulering utöver visuell observation av muskelryckningar, rekommenderas periodisk neurofysiologisk övervakning. När det gäller den mer komplexa anatomin hos frenusnerven i nacken hjälper elektrofysiologisk bekräftelse till att visa att rätt nerv har isolerats (Figur 6).
Förutom de trådlösa, batterifria elektriska stimulatorerna som visas i detta dokument 18,19,21, delar många andra enheter potentiellt samma procedurer. Till exempel, eftersom elektroder som är utformade för att implantera på glossofaryngeal- och vagusnerverna för att kroniskt registrera signaler från sympatiska och parasympatiska nervsystem 30,45,46 delar ett liknande kirurgiskt område med frenisnerven, kan detta protokoll anpassas för deras implantation. Trådlösa långsiktiga biokompatibla stimulatorer för perifera nerver, som ReStore, är utmärkta verktyg för att hålla sig på plats och stimulera nerver efter behov 25,47,48,49,50. Relevanta flerkanaliga trådlösa inspelningsimplantat har också rapporterats51. Sammantaget tror vi att dessa kirurgiska och elektriska stimuleringsprotokoll kan anpassas som en standard för alla trådlösa perifera nervgränssnitt relaterade till elektrisk stimulering eller inspelning.
Disclosures
Författarna har inga intressekonflikter.
Acknowledgments
Detta arbete använde NUFAB-anläggningen vid Northwestern Universitys NUANCE Center, som har fått stöd från SHyNE-resursen (NSF ECCS-1542205), IIN och Northwesterns MRSEC-program (NSF DMR-1720139). Detta arbete använde sig av MatCI-faciliteten som stöds av MRSEC-programmet från National Science Foundation (DMR-1720139) vid Materials Research Center vid Northwestern University. C.K.F bekräftar stöd från Eunice Kennedy Shriver Institute of Child Health and Human Development vid NIH (anslag nr R03HD101090) och American Neuromuscular Foundation (utvecklingsbidrag). Y.H. bekräftar stöd från NSF (anslag nr. CMMI1635443). Detta arbete stöddes av Querrey Simpson Institute for Bioelectronics vid Northwestern University.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Amplifier | Electronics & Innovation | 201L | |
| Arbitrary Waveform Generator | RIGOL | DG1032Z | 30 MHz, 2 Channel, 200 MS/s, 14bit Resolution, 8 Mpts |
| Bupivacaine | Pfizer | 655317 | Marcaine, 0.5% |
| Copper/polyimide/copper | Pyralux | AP8535R | 18 µm thick top and bottom copper, 75 µm thick polyimide |
| EMG recording device | Natus | Nicolet VikingQuest | |
| EPOXY MARINE | Loctite | ||
| Isoflurane, USP | Butler Schein Animal Health | 1040603 | ISOTHESIA |
| Meloxicam | covetrus | 5mg/ml | |
| Needle electrodes | Technomed USA Inc. | TE/B50600- 001 | |
| PDMS (Silicone Elastomer Kit) | DOW | SYLGARD™ 184 | |
| ProtoLaser U4 | LPKF | U4 | |
| Puralube Vet Ointment Sterile Ocular Lubricant | Puralube | 83592 | |
| Waveform generator | Agilent Technologies | Agilent 33250A |
References
- Scholz, T., et al. Peripheral nerve injuries: an international survey of current treatments and future perspectives. Journal of Reconstructive Microsurgery. 25 (6), 339-344 (2009).
- Ayyaswamy, B., et al. Quality of life after amputation in patients with advanced complex regional pain syndrome: a systematic review. EFORT Open Reviews. 4 (9), 533-540 (2019).
- Kim, D. H., et al. Management and outcomes in 353 surgically treated sciatic nerve lesions. Journal of Neurosurgery. 101 (1), 8-17 (2004).
- Mackinnon, S. E. Donor distal, recipient proximal and other personal perspectives on nerve transfers. Hand Clinics. 32 (2), 141-151 (2016).
- Safa, B., Buncke, G. Autograft substitutes: conduits and processed nerve allografts. Hand Clinics. 32 (2), 127-140 (2016).
- Barber, B., et al. Intraoperative Brief Electrical Stimulation of the Spinal Accessory Nerve (BEST SPIN) for prevention of shoulder dysfunction after oncologic neck dissection: a double-blinded, randomized controlled trial. Journal of Otolaryngology - Head & Neck Surgery. 47 (1), 7 (2018).
- Power, H. A., et al. Postsurgical electrical stimulation enhances recovery following surgery for severe cubital tunnel syndrome: a double-blind randomized controlled trial. Neurosurgery. 86 (6), 769-777 (2020).
- Gordon, T., et al. Brief post-surgical electrical stimulation accelerates axon regeneration and muscle reinnervation without affecting the functional measures in carpal tunnel syndrome patients. Experimental Neurology. 223 (1), 192-202 (2010).
- Wong, J. N., et al. Electrical stimulation enhances sensory recovery: a randomized controlled trial. Annals of Neurology. 77 (6), 996-1006 (2015).
- Nix, W. A., Hopf, H. C. Electrical stimulation of regenerating nerve and its effect on motor recovery. Brain Research. 272 (1), 21-25 (1983).
- Al-Majed, A. A., et al. Brief electrical stimulation promotes the speed and accuracy of motor axonal regeneration. Journal of Neuroscience. 20 (7), 2602-2608 (2000).
- Witzel, C., et al. Electrical nerve stimulation enhances perilesional branching after nerve grafting but fails to increase regeneration speed in a murine model. Journal of Reconstructive Microsurgery. 32 (6), 491-497 (2016).
- Witzel, C., Rohde, C., Brushart, T. M. Pathway sampling by regenerating peripheral axons. Journal of Comparative Neurology. 485 (3), 183-190 (2005).
- Brushart, T. M., et al. Electrical stimulation promotes motoneuron regeneration without increasing its speed or conditioning the neuron. Journal of Neuroscience. 22 (15), 6631-6638 (2002).
- Franz, C. K., Rutishauser, U., Rafuse, V. F. Intrinsic neuronal properties control selective targeting of regenerating motoneurons. Brain. 131, Pt 6 1492-1505 (2008).
- Park, S. I., et al. stretchable, fully implantable miniaturized optoelectronic systems for wireless optogenetics. Nature Biotechnology. 33 (12), 1280-1286 (2015).
- Koo, J., et al. Wirelessly controlled, bioresorbable drug delivery device with active valves that exploit electrochemically triggered crevice corrosion. Science Advances. 6 (35), (2020).
- Koo, J., et al. Wireless bioresorbable electronic system enables sustained nonpharmacological neuroregenerative therapy. Nature Medicine. 24 (12), 1830-1836 (2018).
- Choi, Y. S., et al. Stretchable, dynamic covalent polymers for soft, long-lived bioresorbable electronic stimulators designed to facilitate neuromuscular regeneration. Nature Communications. 11 (1), 5990 (2020).
- Hingne, P. M., Sluka, K. A. Differences in waveform characteristics have no effect on the antihyperalgesia produced by transcutaneous electrical nerve stimulation (TENS) in rats with joint inflammation. Journal of Pain. 8, 251-255 (2007).
- Guo, H., et al. Advanced materials in wireless, implantable electrical stimulators that offer rapid rates of bioresorption for peripheral axon regeneration. Advanced Functional Materials. 31 (29), 2102724 (2021).
- Zuo, K. J., et al. Electrical stimulation to enhance peripheral nerve regeneration: Update in molecular investigations and clinical translation. Experimental Neurology. 332, 113397 (2020).
- Zhang, Y., et al. Battery-free, fully implantable optofluidic cuff system for wireless optogenetic and pharmacological neuromodulation of peripheral nerves. Science Advances. 5 (7), (2019).
- Montgomery, K. L., et al. Wirelessly powered, fully internal optogenetics for brain, spinal and peripheral circuits in mice. Nature Methods. 12 (10), 969-974 (2015).
- Seo, D., et al. Wireless recording in the peripheral nervous system with ultrasonic neural dust. Neuron. 91 (3), 529-539 (2016).
- Neely, R. M., et al. Recent advances in neural dust: towards a neural interface platform. Current Opinion in Neurobiology. 50, 64-71 (2018).
- Mickle, A. D., et al. A wireless closed-loop system for optogenetic peripheral neuromodulation. Nature. 565 (7739), 361-365 (2019).
- Khalifa, A., et al. The microbead: a 0.009 mm(3) implantable wireless neural stimulator. IEEE Transactions on Biomedical Circuits and Systems. 13 (3), 971-985 (2019).
- Jeong, J. W., et al. Wireless optofluidic systems for programmable in vivo pharmacology and optogenetics. Cell. 162 (3), 662-674 (2015).
- Yao, G., et al. Effective weight control via an implanted self-powered vagus nerve stimulation device. Nature Communications. 9 (1), 5349 (2018).
- Repair Brushart, M. Nerve Repair. , Oxford University Press. (2012).
- Laskowski, M. B., Sanes, J. R. Topographically selective reinnervation of adult mammalian skeletal muscles. Journal of Neuroscience. 8 (8), 3094-3099 (1988).
- Boon, A. J., et al. Sensitivity and specificity of diagnostic ultrasound in the diagnosis of phrenic neuropathy. Neurology. 83 (14), 1264-1270 (2014).
- Farr, E., D'Andrea, D., Franz, C. K. Phrenic nerve involvement in neuralgic amyotrophy (Parsonage-Turner syndrome). Sleep Medicine Clinics. 15 (4), 539-543 (2020).
- Mandoorah, S., Mead, T.
- Patel, Z., et al. Diaphragm and phrenic nerve ultrasound in COVID-19 patients and beyond: imaging technique, findings, and clinical applications. Journal of Ultrasound in Medicine. , (2021).
- Farr, E., et al. Short of breath for the long haul: diaphragm muscle dysfunction in survivors of severe COVID-19 as determined by neuromuscular ultrasound. medRxiv. , (2020).
- Fernandez, C. E., et al. Imaging review of peripheral nerve injuries in patients with COVID-19. Radiology. 298 (3), 117-130 (2021).
- Elefteriades, J. A., et al. Long-term follow-up of bilateral pacing of the diaphragm in quadriplegia. New England Journal of Medicine. 326 (21), 1433-1444 (1992).
- Elefteriades, J. A., et al. Long-term follow-up of pacing of the conditioned diaphragm in quadriplegia. Pacing and Clinical Electrophysiology: PACE 2002. 25 (6), 897-906 (2002).
- Glenn, W. W., et al. Ventilatory support by pacing of the conditioned diaphragm in quadriplegia. New England Journal of Medicine. 310 (18), 1150-1155 (1984).
- Garrido-Garcia, H., et al. Treatment of chronic ventilatory failure using a diaphragmatic pacemaker. Spinal Cord. 36 (5), 310-314 (1998).
- Romero, F. J., et al. Long-term evaluation of phrenic nerve pacing for respiratory failure due to high cervical spinal cord injury. Spinal Cord. 50 (12), 895-898 (2012).
- Vashisht, R., Chowdhury, Y. S.
- McCallum, G. A., et al. Chronic interfacing with the autonomic nervous system using carbon nanotube (CNT) yarn electrodes. Scientific Reports. 7 (1), 11723 (2017).
- Zhang, Y., et al. Climbing-inspired twining electrodes using shape memory for peripheral nerve stimulation and recording. Science Advances. 5 (4), 1066 (2019).
- Sivaji, V., et al. ReStore: A wireless peripheral nerve stimulation system. Journal of Neuroscience Methods. 320, 26-36 (2019).
- Tanabe, Y., et al. High-performance wireless powering for peripheral nerve neuromodulation systems. PLoS One. 12 (10), 0186698 (2017).
- MacEwan, M. R., et al. Therapeutic electrical stimulation of injured peripheral nerve tissue using implantable thin-film wireless nerve stimulators. Journal of Neurosurgery. 130 (2), 486-495 (2019).
- Lee, B., et al. An implantable peripheral nerve recording and stimulation system for experiments on freely moving animal subjects. Scientific Reports. 8 (1), 6115 (2018).
- Deshmukh, A., et al. Fully implantable neural recording and stimulation interfaces: Peripheral nerve interface applications. Journal of Neuroscience Methods. 333, 108562 (2020).
