Il test basato sulla microscopia per studiare e analizzare gli endosomi di riciclaggio utilizzando il traffico di SNARE
Summary
Gli endosomi di riciclaggio fanno parte della rete tubulare endosomiale. Qui presentiamo un metodo per quantificare le dinamiche del riciclaggio degli endosomi utilizzando GFP-STX13 come marcatore di organelli.
Abstract
Gli endosomi di riciclaggio (RE) sono organelli tubolari-vescicolari generati da endosomi precoci / di selezione in tutti i tipi di cellule. Questi organelli svolgono un ruolo chiave nella biogenesi dei melanosomi, un organello correlato al lisosoma prodotto dai melanociti. Le RE trasportano il carico specifico dei melanociti ai melanosomi prematuri durante la loro formazione. Il blocco nella generazione di RE, osservato in diversi mutanti della sindrome di Hermansky-Pudlak, provoca ipopigmentazione di pelle, capelli e occhi. Pertanto, studiare la dinamica (riferirsi a numero e lunghezza) delle RE è utile per comprendere la funzione di questi organelli in condizioni normali e di malattia. In questo studio, miriamo a misurare la dinamica RE utilizzando uno SNARE STX13 residente.
Introduction
La biosintesi dei pigmenti di melanina si verifica nei melanosomi, un organello correlato al lisosoma specifico per i melanociti (LRO) che coesiste con i lisosomi convenzionali. Il sistema endocitico svolge un ruolo chiave nella biogenesi dei melanosomi, necessari per il colore della pelle e la fotoprotezione contro le radiazioni ionizzanti1,2,3. Durante questo processo, gli enzimi di sintesi della melanina vengono smistati su endosomi precoci / di selezione e quindi trasportati a melanosomi prematuri attraverso endosomi tubulari o vescicolari chiamati endosomi di riciclaggio (RE)4,5,6,7,8,9,10. Il targeting e la fusione di questi organelli regolano la maturazione dei melanosomi pigmentati completamente funzionali7,11,12,13,14. Difetti nella formazione di questi organelli o nella selezione del carico a questi organelli causano albinismo oculocutaneo e altri fenotipi clinici, osservati nella sindrome di Hermansky-Pudlak15,16.
Qui descriviamo una semplice tecnica basata sulla microscopia per studiare e analizzare i RE. In questo metodo, abbiamo sfruttato una proteina transmembrana, Qa-SNARE Syntaxin (STX)13 che risiede sul riciclaggio degli endosomi17 e cicli tra endosomi di selezione e melanosomi nei melanociti12,18. Inoltre, la delezione del dominio normativo non strutturato N-terminale (vale a dire SynN o STX13Δ129) consente allo SNARE di rimanere bloccato nei melanosomi, che misura la via di traffico in avanti verso il melanosoma12. Abbiamo utilizzato un noto marcatore endosomiale di riciclaggio Rab GTPasi (Rab)11 nei nostri studi14,19. L’imaging a fluorescenza delle proteine GFP-STX13WT, GFP-STX13Δ129, mCherry-Rab11 e TYRP1 nei melanociti wild type seguito dalla quantificazione della loro localizzazione relativa fornirà la natura e la dinamica delle RE oltre al loro targeting ai melanosomi. Pertanto, questa è una tecnica semplice che può essere utilizzata per visualizzare e misurare la dinamica delle RE nei melanociti.
Protocol
Representative Results
Discussion
Gli endosomi di riciclaggio sono una coorte di organelli endocitici e mediano il riciclaggio del carico sulla superficie cellulare in tutti i tipi di cellule21,22,23,24,25. In tipi di cellule specializzate come i melanociti, questi organelli deviano in parte la loro rotta di traffico verso i melanosomi per la loro biogenesi3,16,26.…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato sostenuto dal Dipartimento di Biotecnologie (BT/PR32489/BRB/10/1786/2019 a SRGS); Consiglio di ricerca scientifica e ingegneristica (CRG/2019/000281 alla SRGS); DBT-NBACD (BT/HRD-NBA-NWB/38/2019-20 a SRGS) e programma di partnership IISc-DBT (a SRGS). L’infrastruttura del dipartimento era supportata da DST-FIST, DBT e UGC. AMB è stato supportato da DBT-JRF (DBT/2015/IISc/NJ-02).
Materials
| anti-TYRP1 antibody (TA99) | ATCC | HB-8704 | |
| Fluoromount-G | Southern Biotech | 0100-01 | |
| Lipofectamine 2000 | ThermoFisher Scientific | 11668-500 | |
| Matrigel matrix | BD Biosciences | 356231 | |
| OPTI-MEM | ThermoFisher Scientific | 022600-050 | |
| Phorbol-12-myristate-13-acetate | Sigma-Aldrich | P8139 | |
| RPMI Medium 1640 | ThermoFisher Scientific | 31800-022 |
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