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Biology

सेलुलर संकेतों का विश्लेषण करने के लिए एकीकृत टूलकिट: बल, गति, आकृति विज्ञान, और प्रतिदीप्ति

Published: March 5, 2022 doi: 10.3791/63095
Automatic Translation
*1, *2,3, *2,3, 2, 3, 3, 4, 5, 6, 3,7, 8, 2,3, 3,4,7
1Biomedical Sciences, Pat Capps Covey College of Allied Health Professions, University of South Alabama, 2Department of Physiology and Cell Biology, College of Medicine, University of South Alabama, 3Center for Lung Biology, College of Medicine, University of South Alabama, 4William B. Burnsed Jr. Mechanical, Aerospace, and Biomedical Engineering Department, College of Engineering, University of South Alabama, 5Mitchell Cancer Institute, College of Medicine, University of South Alabama, 6Department of Chemical and Biomedical Engineering, West Virginia University, 7Department of Pharmacology, College of Medicine, University of South Alabama, 8Department of Physiology & Pharmacology, College of Osteopathic Medicine, Sam Houston State University
* These authors contributed equally

Summary

सेलुलर सिग्नल (iTACS) प्लेटफ़ॉर्म का विश्लेषण करने के लिए एकीकृत टूलकिट अनुयायी कोशिकाओं में विभिन्न प्रकार के रासायनिक और यांत्रिक संकेतों को एक साथ मापने की प्रक्रिया को स्वचालित करता है। iTACS समुदाय-संचालित विकास को सुविधाजनक बनाने और शोधकर्ताओं को उनकी शैक्षिक पृष्ठभूमि की परवाह किए बिना सभी प्लेटफ़ॉर्म सुविधाओं का उपयोग करने में सक्षम बनाने के लिए डिज़ाइन किया गया है।

Abstract

सेलुलर बलों और गति का मात्रात्मक मूल्यांकन पिछले चार दशकों में काफी उन्नत हुआ। इन प्रगतियों ने सेल संस्कृति प्रणालियों में व्यावहारिक यांत्रिक सिग्नलिंग प्रक्रियाओं की जांच करने के लिए रूपरेखा प्रदान की। हालांकि, क्षेत्र वर्तमान में तीन समस्याओं का सामना कर रहा है: अधिग्रहित डेटा के गुणवत्ता मानकीकरण की कमी, डेटा विश्लेषण और विज़ुअलाइज़ेशन में तकनीकी त्रुटियां, और शायद सबसे महत्वपूर्ण बात यह है कि प्रौद्योगिकी आम सेल जीव विज्ञान प्रयोगशालाओं के लिए पहुंच से काफी हद तक बाहर है। इन सीमाओं को दूर करने के लिए, हमने सेलुलर सिग्नल (iTACS) का विश्लेषण करने के लिए एक नया प्रयोगात्मक मंच - एकीकृत टूलकिट विकसित किया। iTACS में दो घटक होते हैं: अधिग्रहण और प्रशिक्षण मॉड्यूल (AcTrM) और विश्लेषण और विज़ुअलाइज़ेशन मॉड्यूल (AnViM)। AcTrM μManager पर आधारित है - एक NIH-ImageJ-आधारित माइक्रोस्कोप नियंत्रण सॉफ्टवेयर - और उपयोगकर्ता आत्म-प्रशिक्षण और सामान्य छवि अधिग्रहण प्रोटोकॉल के स्वचालन की सुविधा प्रदान करता है। AnViM NIH-ImageJ पर आधारित है और डेटा विश्लेषण के उपयोगकर्ता के अनुकूल स्वचालन और परिणामों के व्यावहारिक विज़ुअलाइज़ेशन की सुविधा प्रदान करता है। इन प्रयोगों में हाइड्रोजेल पर अनुयायी कोशिकाओं को संवर्धित करना, हाइड्रोजेल में एम्बेडेड इमेजिंग फिड्यूशियल मार्करों, और अंत में इन छवियों से कोशिकाओं के एक व्यापक यांत्रिक लक्षण वर्णन को निकालना शामिल है। वर्तमान में, iTACS उपयोगकर्ता को आकृतियों, गति, साइटोस्केलेटल बलों और व्यक्तिगत कोशिकाओं और उनके पड़ोसी क्षेत्र के प्रतिदीप्ति सहित गुणों की एक विस्तृत सरणी का विश्लेषण और ट्रैक करने में सक्षम बनाता है। गुणवत्ता मानकीकरण मुद्दे को AcTrM में एक संदर्भ छवि-निर्देशित refocusing तकनीक के साथ संबोधित किया गया था। डेटा विश्लेषण में तकनीकी मुद्दों को AnViM में एक बहु-आयामी छवि विभाजन प्रक्रिया, सीमा स्थितियों की पहचान करने के लिए एक उपयोगकर्ता के अनुकूल दृष्टिकोण, और एक उपन्यास सेलुलर संपत्ति-आधारित डेटा विज़ुअलाइज़ेशन के साथ संबोधित किया गया था। AcTrM प्रयोगात्मक सेल यांत्रिकी रिग्स में बुनियादी प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप के सीधे परिवर्तन की सुविधा के लिए डिज़ाइन किया गया है, और AnViM उपयोगकर्ताओं को इंजीनियरिंग पृष्ठभूमि की आवश्यकता के बिना सेलुलर यांत्रिक संकेतों को मापने में सक्षम करने के लिए सुसज्जित है। iTACS समुदाय-संचालित विकास क्षमताओं के साथ एक ओपन-सोर्स सूट के रूप में अनुसंधान समुदाय के लिए उपलब्ध होगा।

Introduction

आमतौर पर उपयोग किए जाने वाले ऑप्टिकल इमेजिंग और डेटा विश्लेषण उपकरण हार्डवेयर और सॉफ़्टवेयर प्रौद्योगिकियों को नियोजित करते हैं जो लगभग पुरातन हैं। इलेक्ट्रॉनिक उपकरणों, कम्प्यूटेशनल दृष्टिकोणों और गणितीय विश्लेषण में प्रगति के अनुवाद और कार्यान्वयन में अंतराल सामान्य प्रयोगात्मक सेल जीव विज्ञान उपकरणों में सेलुलर फिजियोलॉजी के हमारे ज्ञान में विकास की गति पर एक प्रमुख बाधा है। वर्तमान में, सेल जीव विज्ञान शोधकर्ताओं को पहुंच के भीतर आणविक जीव विज्ञान उपकरण मिलते हैं, लेकिन इंजीनियरिंग सिद्धांतों पर आधारित उपकरण पहुंच से बाहर होने के लिए। ऐसा ही एक इंजीनियरिंग-सिद्धांत-आधारित उपकरण मोनोलेयर स्ट्रेस माइक्रोस्कोपी (एमएसएम) 1,2 है। जबकि MSM को दुनिया भर में विभिन्न प्रयोगशालाओं में अनुकूलित और अध्ययन किया गया है, इसका उपयोग मुख्य रूप से इंजीनियरिंग विशेषज्ञता 3,4,5,6,7,8,9 के साथ प्रयोगशालाओं तक सीमित है।

एनआईएच-इमेजजे सेल जीव विज्ञान शोधकर्ताओं के बीच सबसे लोकप्रिय ओपन-सोर्स टूल में से एक है। उपयोगकर्ता समुदाय के योगदान-संचालित प्रगति इसकी लोकप्रियता के लिए केंद्रीय रही है11,12. ImageJ में ऐसी विशेषताएं हैं जो उपयोगकर्ताओं को एक उन्नत प्रोग्रामिंग भाषा और सरलीकृत स्क्रिप्टिंग दृष्टिकोण के मिश्रण के साथ एप्लिकेशन विकसित करने की अनुमति देती हैं। ये विशेषताएं बुनियादी प्रोग्रामिंग ज्ञान वाले उपयोगकर्ताओं को सॉफ़्टवेयर में किसी भी नए योगदान को लागू करने, अनुकूलित करने और आगे बढ़ाने की सुविधा प्रदान करती हैं। एनआईएच-इमेजजे के इन गुणों पर निर्माण करते हुए, हमने सेलुलर सिग्नल (आईटीएसीएस) का विश्लेषण करने के लिए एकीकृत टूलकिट विकसित किया है, जो वांछित हार्डवेयर और सॉफ़्टवेयर उपकरणों के कम लागत वाले एकीकरण को अनुयायी कोशिकाओं 11,12 में रासायनिक और यांत्रिक संकेतों की एक विस्तृत विविधता के माप को स्वचालित करने में सक्षम बनाता है।

iTACS में दो घटक शामिल हैं: अधिग्रहण और प्रशिक्षण मॉड्यूल (AcTrM) और विश्लेषण और विज़ुअलाइज़ेशन मॉड्यूल (AnViM)। AcTrM μManager पर बनाया गया है - एक NIH-ImageJ-आधारित छवि अधिग्रहण आवेदन - उपयोगकर्ताओं को पारंपरिक ऑप्टिकल गुणों के समय-अंतराल माप और कई नमूनों में अनुयायी कोशिकाओं के विभिन्न भौतिक गुणों को स्थापित करने में सक्षम बनाने के लिए। AcTrM ग्राफिकल इंटरफ़ेस में शामिल संक्षिप्त दिशाओं के माध्यम से उपयोगकर्ता प्रशिक्षण की सुविधा प्रदान करता है। इसके अलावा, इसमें संदर्भ छवि-आधारित ऑटोफोकसिंग की एक उपन्यास विशेषता है जिसे भौतिक बलों के वास्तविक समय के माप की सुविधा के लिए डिज़ाइन किया गया है और अधिग्रहित डेटा के गुणवत्ता मानकीकरण को सक्षम किया गया है।

AnViM ImageJ plugins, त्वरित सॉफ़्टवेयर, और फ़ाइल हैंडलिंग स्क्रिप्ट पर बनाया गया है जो उपयोगकर्ताओं को सेलुलर आकार, आकार, अभिविन्यास, गति और गति की दिशा, बाह्य कोशिकीय मैट्रिक्स (ईसीएम) पर लगाए गए कर्षणों सहित 50 से अधिक गुणों का मात्रात्मक रूप से आकलन करने में सक्षम बनाता है, और पड़ोसी कोशिकाओं पर, व्यक्तिगत अनुयायी कोशिकाओं और उनके पड़ोसी क्षेत्र दोनों के संकुचन और कतरनी क्षणों पर। AnViM उपयोगकर्ताओं को अंतर्निहित तकनीकी पृष्ठभूमि 11 में महारत हासिल किए बिना सेलुलर भौतिक गुणों को मापने की सुविधा प्रदान करता है। इसके अलावा, यह एक इंटरैक्टिव या बैच प्रोसेसिंग मोड में डेटा विश्लेषण को सक्षम बनाता है। यह स्थानिक भिन्नता और रेखांकन को प्रकट करने वाले गर्मी मानचित्र उत्पन्न करता है जो व्यक्तिगत कोशिकाओं के गुणों की अस्थायी भिन्नता को दर्शाता है।

एक विशिष्ट प्रयोग में, उपयोगकर्ता शीर्ष सतह पर उपयुक्त बाह्य कोशिकीय मैट्रिक्स प्रोटीन और दो प्रकार के एम्बेडेड फ्लोरोसेंट मार्करों के साथ एक लोचदार हाइड्रोजेल पर कोशिकाओं को संस्कृतियों। अनिवार्य रूप से, कोशिकाओं को संवर्धित करने से पहले और बाद में इन फ्लोरोसेंट मार्करों की छवियां व्यक्तिगत कोशिकाओं के भीतर और आसपास की ताकतों को मापने के लिए पर्याप्त हैं2,13। AnViM इन परिणामों को अनुयायी क्लस्टर की अलग-अलग कोशिकाओं पर मैप करता है और व्यावहारिक छवियों और रेखांकन उत्पन्न करता है।

Protocol

नोट: iTACS प्लेटफ़ॉर्म का उपयोग करके जांच किए गए नमूने एक नरम सब्सट्रेट का पालन करने वाली कोशिकाएं हैं। यांत्रिक और रासायनिक संकेतों का आकलन करने के लिए प्रोटोकॉल को दो अनुक्रमिक भागों में विभाजित किया गया है: अधिग्रहण और प्रशिक्षण मॉड्यूल (AcTrM) और विश्लेषण और विज़ुअलाइज़ेशन मॉड्यूल (AnViM)।

1. अधिग्रहण और प्रशिक्षण मॉड्यूल (AcTrM)

नोट:: AcTrM डेटा अधिग्रहण और उपयोगकर्ता स्व-प्रशिक्षण की प्रक्रिया को स्वचालित करता है। किसी भी डेटा अधिग्रहण से पहले, एक नरम सब्सट्रेट तैयार करें जो उन बलों को मापने के लिए आवश्यक जानकारी प्रदान करने में सक्षम है जो कोशिकाएं उस पर लगाती हैं।

  1. हाइड्रोजेल तैयारी
    नोट: यहां लक्ष्य एक 1,250 पीए कतरनी मापांक, लगभग 100 μm मोटाई, और 22 मिमी व्यास polyacrylamide (पीएए) हाइड्रोजेल तैयार करना है।
    1. Yeung et al. की विधि का पालन करके polyacrylamide समाधान तैयार करें और Trepat et al.14,15 द्वारा वर्णित चरणों के बाद हाइड्रोजेल डाली। प्रक्रिया का एक अपवाद यह है कि कोशिकाओं के ठीक नीचे एम्बेडेड मोती व्यास में 0.5 μm हैं और पीले प्रतिदीप्ति का उत्सर्जन करते हैं।
    2. 2 μm मोतियों को कवरग्लास में संलग्न करने के चरण को छोड़ दें यदि देखने वाले क्षेत्र में एक बड़ा सेल-मुक्त क्षेत्र होने की उम्मीद है।
      नोट: हाइड्रोजेल तैयारी प्रोटोकॉल अब काफी field16 में स्थापित है। बाद के विवरण के दौरान, 0.5 μm मोतियों को 'शीर्ष मोतियों' के रूप में संदर्भित किया जाता है, और 2 μm मोतियों को 'नीचे मोतियों' के रूप में संदर्भित किया जाता है। हालांकि, नीचे मोती वैकल्पिक हैं जहां छवि वाले क्षेत्र में एक बड़ा सेल-मुक्त क्षेत्र होता है। इस तरह के एक सेल मुक्त क्षेत्र से शीर्ष मनका पैटर्न नीचे मनका पैटर्न के उद्देश्य की सेवा करेगा।
    3. माइक्रोस्कोप चरण पर एम्बेडेड फ्लोरोसेंट मोतियों के साथ हाइड्रोजेल माउंट करें।
    4. प्लेट के तापमान को स्थिर-स्थिति प्राप्त करने के लिए 15-20 मिनट की अनुमति दें।
      नोट: प्लेट की शीर्ष सतह को एक्स्ट्रासेल्युलर मैट्रिक्स प्रोटीन के साथ कार्यात्मक किया जाता है, लेकिन कोशिकाओं को अभी तक हाइड्रोजेल पर बीज नहीं दिया गया है।
  2. संदर्भ छवि अधिग्रहण
    1. भाग 1: एक स्थिति सूची बनाना
      नोट:: मैन्युअल इनपुट इस चरण में निम्न AcTrM सर्वोत्तम मनका वितरण के साथ स्थानों को चुनने के लिए संकेत देता है शामिल हैं। इस चरण में पहले से बनाई गई कोई भी फ़ाइलों का उपयोग नहीं किया जाता है. इस चरण में उत्पादित प्रमुख नए फ़ोल्डरों में 't0imgs', 'tnimgs', और 'textfiles' फ़ोल्डर शामिल हैं, और उत्पादित फ़ाइल में स्थिति सूची फ़ाइल शामिल है। AcTrM का उपयोग कर किसी स्थिति सूची के निर्माण का मार्गदर्शन निम्न चरणों के दृश्य विवरण के लिए चित्र 2 देखें। प्रदर्शित उदाहरण 20x आवर्धन पर डेटा प्राप्त करता है।
      1. प्रारंभ μManager 2.0 - बीटा.
      2. IMBL संसाधन विंडो में AcTrM.bsh बटन पर क्लिक करके AcTrM चलाएँ।
      3. अधिग्रहण गुण परिभाषित करें शीर्षक वाली विंडो में, उचित उद्देश्य का चयन करें, पार्श्व स्थिति की सटीकता के लिए सहिष्णुता (यानी, XY) वसूली, किसी न किसी और परिष्कृत refocusing (यानी, z) ऑपरेशन के चरण आकार, और फोकस वसूली के लिए स्वीकार्य छवि सहसंबंध गुणांक का मूल्य।
        नोट: पार्श्व स्थिति पुनर्प्राप्ति के लिए एक बेहतर सहिष्णुता स्थिति वसूली को धीमा कर देगी, लेकिन डेटा विश्लेषण के दौरान पर्याप्त सहिष्णुता को स्थिति सुधार की आवश्यकता होगी और फोकस रिकवरी में कठिनाई हो सकती है। एक छोटा कदम आकार refocusing ऑपरेशन धीमा कर देगा, लेकिन एक बहुत ही उच्च कदम आकार फोकस को याद करने के अवसरों के साथ तेजी से आंदोलन का कारण बन सकता है।
      4. AcTrM - चरण 0 विंडो में, स्थिति सूची बनाने के लिए ताज़ा अधिग्रहण का चयन करें।
        नोट:: AcTrM शीर्षक विंडो - चरण 1 सभी कुंजी अगले चरणों को सूचीबद्ध करता है। इन चरणों में चरण को स्थानांतरित करना, फोकस को समायोजित करना और μManager में बटन पर क्लिक करना शामिल है। ये चरण डेटा अधिग्रहण के लिए उपयुक्त पदों की सूची के निर्माण में मार्गदर्शन करते हैं।
      5. AcTrM - चरण 1 विंडो में सूचीबद्ध मैन्युअल समायोजन के लिए नमूनों को विज़ुअलाइज़ करने के लिए लाइव इन माइक्रोमैनेजर पर क्लिक करें।
      6. इस विंडो पर सूचीबद्ध चरणों का पालन करें।
      7. अब मोतियों की छवि प्राप्त करें। शीर्ष मोतियों के लिए उपयुक्त चैनल का चयन करें।
      8. नीचे के मोतियों को भी देखना सुनिश्चित करें। ऐसा करने के लिए, नीचे मोतियों के लिए चैनलों का चयन करें। नीचे के मोतियों की एक धुंधली छवि देखी जाती है।
        नोट:: चैनलों को मुख्य μManager विंडो पर पूर्व निर्धारित ड्रॉपडाउन मेनू से स्विच किया जा सकता है। यदि प्रयोग में नीचे के मोतियों का उपयोग किया जाता है, तो सुनिश्चित करें कि वे चयनित स्थिति में मौजूद हैं। ये मोती धुंधले दिखाई देंगे।
      9. उपयुक्त स्थिति का चयन करने पर, स्थिति को सहेजने के लिए स्टेज पोजीशन लिस्ट विंडो में मार्क इन पर क्लिक करें।
        नोट: सबसे अच्छी स्थिति को शीर्ष सतह (यानी, शीर्ष मोतियों) के ठीक नीचे एम्बेडेड शीर्ष मोतियों के घने और समान वितरण द्वारा परिभाषित किया गया है और कवर ग्लास (यानी, नीचे के मोतियों) (पूरक चित्रा S1) से जुड़े कम से कम दो मोतियों द्वारा परिभाषित किया गया है। फोकस रिकवरी तेज होती है यदि नीचे के मोती बड़े, आउट-ऑफ-फोकस रिंग्स के रूप में दिखाई देते हैं। हालांकि, यदि प्रयोगों को ध्यान या पार्श्व स्थिति वसूली की आवश्यकता के साथ एक स्थिति में किया जाता है, तो नीचे मोतियों की छवि से संबंधित निर्देशों को अनदेखा करें।
      10. सूची में अतिरिक्त पदों को शामिल करने के लिए चित्र 2 में वर्णित चरणों 6-9 का पालन करें।
        नोट: कुछ अतिरिक्त पदों का चयन करें ताकि उन्मूलन का एक दौर प्लेट पर चुने गए सर्वोत्तम पदों के लिए अनुमति दे सके।
    2. भाग 2: संदर्भ छवियों का अधिग्रहण
      नोट:: इस चरण में कोई मैन्युअल इनपुट शामिल नहीं है। इस चरण में उपयोग की गई पहले बनाई गई कुंजी फ़ाइलों में 'textfiles/*.pos' शामिल हैं. इस चरण में उत्पादित प्रमुख नई फ़ाइलों और फ़ोल्डरों में 't0imgs' और 'tnimgs' फ़ोल्डरों के भीतर शामिल हैं। AcTrM का उपयोग कर संदर्भ छवियों के अधिग्रहण का मार्गदर्शन करने वाले निम्न चरणों के दृश्य विवरण के लिए चित्र 3 और अनुपूरक आकृति S2 देखें. AcTrM - चरण 2 विंडो भी सभी प्रमुख चरणों को सूचीबद्ध करता है।
      1. AcTrM - चरण 2 विंडो में सूचीबद्ध चरणों का पालन करते हुए, बहु-आयामी अधिग्रहण विंडो में विकल्प बनाएँ। उदाहरण के लिए, लंबे समय तक चूक करने के लिए, कई छवियों को इंगित करें, चरण चैनल के रूप में पहले चैनल का चयन करें, और फिर शीर्ष मोतियों के लिए अगले का चयन करें और उसके बाद एक नीचे मोतियों के लिए है। Multi-Dimensional Acquisition विंडो में Close पर क्लिक करें, और फिर ActrM - Step 2 विंडो में OK पर क्लिक करें।
      2. AcTrM - चरण 3 विंडो में, संदर्भ-छवि-आधारित XYZ स्थिति पुनर्प्राप्ति संलग्न करने के लिए चुनें। विकल्प आमतौर पर हाँ है। हालांकि, यदि छवियों को फोकस या चरण बहाव के लिए कोई जगह नहीं है, तो AcTrM में विकल्प - चरण 3 विंडो नहीं होगी।
      3. AcTrM - XYZ पुनर्प्राप्ति विकल्प विंडो में, किसी न किसी XYZ वसूली के लिए चैनल सेट करें, चाहे परिष्कृत XYZ पुनर्प्राप्ति, क्षेत्र, और परिष्कृत XYZ पुनर्प्राप्ति के लिए चैनल और पुन: ध्यान केंद्रित करना शुरू करने की दिशा (अनुपूरक चित्रा S4). पूरा होने पर, AcTrM संदर्भ छवियों को प्राप्त करेगा।
        नोट: चैनल के लिए विशिष्ट विकल्प नीचे मोती चैनल होगा। XYZ पुनर्प्राप्ति सबसे अच्छा काम करता है जब वर्तमान कार्यान्वयन में पूर्ण छवि के साथ किया जाता है। संदर्भ छवियों में आमतौर पर हाइड्रोजेल की एक प्रेषित प्रकाश छवि, शीर्ष मोतियों की एक फ्लोरोसेंट छवि और नीचे मोतियों की एक फ्लोरोसेंट छवि शामिल होगी। प्रत्येक छवि सेट की सामग्री बहु-आयामी अधिग्रहण विंडो में किए गए विकल्पों के आधार पर भिन्न हो सकती है। फिर भी, सॉफ़्टवेयर चित्र 2 में निर्धारित प्रत्येक स्थिति पर सेट संदर्भ छवि प्राप्त करेगा। इस चरण के अंत में, तीन फ़ोल्डर चुने गए निर्देशिका में बनाए जाते हैं: 't0imgs', 'tnimgs', और 'textfiles'. 't0imgs' फ़ोल्डर में μManager द्वारा पहचाने गए प्रारूप में संदर्भ छवियां होती हैं और बाद के चरणों में उपयोग की जाती हैं; 'tnimgs' फ़ोल्डर में 'c0_p0_t0.tif', 'c1_p0_t0.tif' आदि फ़ाइल नामों के साथ अलग-अलग TIFF छवियां होती हैं। यहाँ, 'c' चैनल के लिए खड़ा है, 'p' का अर्थ स्थिति के लिए है, और 't' का अर्थ समय है। इन अक्षरों के बाद क्रमशः चैनल संख्या, स्थिति संख्या और फ्रेम संख्या हैं। फ़ोल्डर 'textfiles' XML स्वरूप में स्थिति सूची और छवि अधिग्रहण और स्थिति पुनर्प्राप्ति के लिए उपयोगकर्ता विकल्प शामिल हैं।
  3. सेल सीडिंग और विकास
    नोट: iTACS प्लेटफ़ॉर्म में अनुयायी कोशिकाओं के यांत्रिक व्यवहार के सामान्य इन विट्रो मूल्यांकन में उपयोग किए जाने वाले नमूना तैयारी प्रोटोकॉल को समायोजित करने का लचीलापन है, जिसमें विरल कोशिकाएं, पूरी तरह से confluent monolayer, नेटवर्क गठन परख, और छेद या महत्वपूर्ण अंतराल के साथ मोनोलेयर शामिल हैं।
    1. संस्कृति चूहे फुफ्फुसीय माइक्रोवैस्कुलर एंडोथेलियल कोशिकाओं को एक फ्लास्क 17,18 में संगम करने के लिए।
    2. ट्रिप्सिन का उपयोग करके कोशिकाओं को अलग करें। एक संस्कृति माध्यम में कोशिकाओं को फिर से निलंबित कर दिया गया जिसमें 10% भ्रूण गोजातीय सीरम शामिल है, एक एकाग्रता 1 x 106 कोशिकाओं / एमएल के लिए।
    3. आंशिक रूप से सूखी हाइड्रोजेल सतह पर पुन: निलंबित कोशिकाओं की एक 5 μL बूंद रखें और इसे सेल संस्कृति इनक्यूबेटर में रखें।
      नोट: 10% भ्रूण गोजातीय सीरम युक्त संस्कृति माध्यम में 2 दिनों के बाद, उस बूंद में कोशिकाएं कोशिकाओं का एक भीड़ भरा द्वीप बनाती हैं1।
  4. शेष प्रयोग के लिए स्वचालित छवि अधिग्रहण
    नोट:: इस चरण के लिए मैन्युअल इनपुट निम्न AcTrM छवि अधिग्रहण को पुनरारंभ करने के लिए संकेत देता है शामिल हैं। इस चरण द्वारा उपयोग की जाने वाली पहले से बनाई गई कुंजी में 'textfiles/*.pos' और 't0imgs' फ़ोल्डर में नीचे मनका छवि फ़ाइलें शामिल हैं। इस चरण में उत्पादित प्रमुख नई फ़ाइलों में अद्यतन स्थिति सूची फ़ाइलें और छवियां 'tnimgs / * _t * .tif' शामिल हैं।
    1. सुनिश्चित करें कि माइक्रोस्कोप पर्यावरण नियंत्रण प्रणाली स्थिर ऊतक संस्कृति स्थितियों तक पहुंचती है।
    2. धीरे से माइक्रोस्कोप चरण पर सुसंस्कृत कोशिकाओं वाली प्लेट माउंट करें।
    3. तापमान और आर्द्रता को स्थिर करने के लिए 15-20 मिनट की अनुमति दें।
      नोट:: AcTrM का उपयोग कर शेष प्रयोग के लिए छवियों के अधिग्रहण का मार्गदर्शन निम्न चरणों के दृश्य विवरण के लिए चित्र4 देखें।
    4. प्रारंभ μManager 2.0 - बीटा.
    5. IMBL संसाधन विंडो में AcTrM.bsh बटन पर क्लिक करके AcTrM चलाएँ।
      नोट:: अधिग्रहण गुण निर्धारित करें विंडो में किए गए विकल्पों पर ध्यान न दें, लेकिन पिछले चरण में किए गए विकल्पों का उपयोग करें।
    6. AcTrM - चरण 0 विंडो में, रुका हुआ अधिग्रहण जारी रखें का चयन करें।
    7. पहले चरण में बहु-आयामी अधिग्रहण विंडो में पहचाने गए आवर्धन और निर्देशिका का चयन करें जहां डेटा फ़ोल्डर ('t0imags', 'tnimgs', और 'textfiles') सहेजे गए थे।
      नोट:: विंडो का शीर्षक उपयुक्त निर्देशिका का चयन करने के लिए उपयोगकर्ता का मार्गदर्शन करता है।
    8. प्लेट विंडो को पुनर्स्थापित करने में, रीपोजिशनिंग के लिए उपयोग किए जाने वाले चैनल के साथ प्लेट (तीन नॉनकोलीनियर पोजीशन) को पुनर्स्थापित करने के लिए विकल्पों का चयन करें।
      नोट: सहेजी गई छवियों को कैमरे में देखा जाएगा। यदि ओवरलैपिंग छवियां लाल, हरे और काले रंग की छवि के रूप में प्रदर्शित होती हैं, तो मैन्युअल समायोजन करें।
    9. अधिग्रहण के साथ आगे बढ़ने के लिए Accept पर क्लिक करें।
      नोट: यह चरण प्लेट संरेखण की अपरिवर्तनीयता से मामूली बदलाव को दूर करता है जब प्लेट माइक्रोस्कोप चरण पर remounted है। AcTrM का पालन करें लाल (आमतौर पर नीचे मोतियों की) में दिखाए गए संदर्भ छवि की एक समग्र छवि दिखाकर तीन पदों में से प्रत्येक पर संरेखण को तेज करने के लिए संकेत देता है और वर्तमान में हरे रंग में दिखाए गए उद्देश्य के माध्यम से देखी गई छवि। लाल रंग के करीब पर्याप्त रूप से हरे रंग को प्राप्त करना सॉफ़्टवेयर के लिए कम काम छोड़ देता है। जब ओवरलैप सही होता है, तो समग्र छवि पीली और काली दिखाई देती है। पर्याप्त रूप से बंद आमतौर पर तब होता है जब एक ही नीचे के मोती लाल और हरे रंग की छवियों दोनों में दिखाई देते हैं, और संबंधित लाल और हरे रंग के आउट-ऑफ-फोकस छल्ले एक-दूसरे को छू रहे हैं। प्लेट repositioning पूरा होने के बाद, AcTrM प्रत्येक चयनित स्थिति के लिए मंच लेता है और क्या वर्तमान में कैमरे के माध्यम से देखा जाता है के साथ संदर्भ छवि मिलान द्वारा XYZ स्थिति को पुनर्प्राप्त करता है। पहले पार्श्व (XY) स्थिति का मिलान किया जाता है, और फिर फ़ोकस (Z) का मिलान किया जाता है। किसी न किसी वसूली स्थिति और ध्यान की परिष्कृत वसूली के बाद है. प्रयोग की वर्तमान स्थिति के अद्यतन पूरक चित्र S3 में दिखाए गए चार-भाग विंडो के माध्यम से स्क्रीन पर प्रदर्शित होते हैं। अधिग्रहित छवियों को 'tnimgs' फ़ोल्डर में '*_t1.tif', '*_t2.tif' के बाद सहेजा जाता है, जो छवि सेट के लिए समय गणना को इंगित करता है। XYZ पुनर्प्राप्ति किसी अद्यतन की गई स्थिति की पहचान करता है, तो नई स्थिति सूची जनरेट किया गया है और 'textfiles' फ़ोल्डर में सहेजा गया है।

2. विश्लेषण और विज़ुअलाइज़ेशन मॉड्यूल (AnViM)

  1. स्वचालित डेटा विश्लेषण सेट करना
    नोट:: इस चरण में मैन्युअल इनपुट 'tnimgs' फ़ोल्डर के स्थान की पहचान शामिल है। इस चरण में उपयोग की गई पहले से बनाई गई कुंजी में 'tnimgs/*.tif' शामिल हैं. इस चरण में उत्पादित प्रमुख नई फ़ाइलों और फ़ोल्डरों में 'विश्लेषण' फ़ोल्डर को एक ही पैरेंट फ़ोल्डर में 'tnimgs' और प्रत्येक स्थिति 'analysis/p*' के लिए फ़ोल्डर्स के रूप में शामिल किया गया है। प्रत्येक 'विश्लेषण/पी*' के भीतर, यह चरण 'phs' और 'tny' फ़ोल्डरों के भीतर एक नई '* .tif' छवि फ़ाइलें बनाता है। इन छवियों को कोशिकाओं और शीर्ष मोतियों की क्रॉप और डी-ड्रिफ्टेड छवियां हैं। बनाई गई अन्य फ़ाइलों में 'विश्लेषण / विश्लेषणचॉइस.txt' शामिल हैं जो विश्लेषण विकल्पों को सूचीबद्ध करता है, 'विश्लेषण / पी * / स्किपएनालिसिस.txt', जो उन उदाहरणों को सूचीबद्ध करता है जहां विश्लेषण को महत्वपूर्ण पहले से मौजूद बहाव के कारण छोड़ दिया जाता है, और 'विश्लेषण / पी * / part_shift_values_pixel_degree.dat' जो अनुमानित बहाव मूल्यों को सूचीबद्ध करता है। AnViM 'tnimgs' फ़ोल्डर में कच्चे डेटा को परिवर्तित नहीं करता है। AnViM का उपयोग करके स्वचालित डेटा विश्लेषण की स्थापना का मार्गदर्शन करने वाले निम्न चरणों के दृश्य विवरण के लिए चित्र 5 देखें.
    1. फिजी सॉफ़्टवेयर प्रारंभ करें और MSM ड्रॉप-डाउन मेनू में पहले विकल्प का चयन करें जिसे MSM के रूप में लेबल किया गया है - पूर्व-प्रसंस्करण।
    2. फ़ाइल ब्राउज़र संवाद का उपयोग करते हुए, 'tnimgs' फ़ोल्डर वाले फ़ोल्डर का चयन करें, जिसमें विश्लेषण किया गया डेटा होता है।
    3. छवियों के लिए चैनल को परिभाषित करें। अनुपूरक चित्रा S5 से दिशानिर्देशों का पालन करते हुए, कोशिकाओं की संचरित प्रकाश छवि (कोशिकाओं की चरण कंट्रास्ट छवि), नीचे मोती छवि और शीर्ष मोती छवि की चैनल संख्याओं की पहचान करें। निम्न तीन चेकबॉक्स ('स्थिति फ़ोल्डर में फ़ाइलों को ले जाएँ', 'कठोर गति के लिए अतिरिक्त सुधार करें', और 'क्रॉप डेटा और स्थिति फ़ोल्डर में सहेजें') आमतौर पर चेक किए जाते हैं. अंत में, भारी बहाव वाले डेटा, पिक्सेल आकार, और छवि के किनारों को अस्वीकार करने के लिए सहिष्णुता को परिभाषित करें जहां कोशिकाएं पार करती हैं।
    4. चमक को बढ़ाने के लिए संकेत का जवाब दें और नीचे मनका छवियों के विपरीत तो मोती प्रमुखता से दिखाई देते हैं. मेनू में स्लाइडर बार का उपयोग करके इसे समायोजित करें और ठीक पर क्लिक करें।
    5. अब शिफ्ट से छुटकारा पाने के लिए स्थिति सुधार करें, यदि कोई हो। एक बार हो जाने के बाद, एक विश्लेषण फ़ोल्डर बनाया जाता है।
      नोट: कंट्रास्ट एन्हांसमेंट आमतौर पर आवश्यक नहीं है, लेकिन यह प्रावधान उन प्रयोगों के लिए उपलब्ध है जहां लेजर के संपर्क को कम करने की आवश्यकता होती है। उस विकल्प के बाद, AnViM 'tnimgs' फ़ोल्डर से 'विश्लेषण' फ़ोल्डर में फ़ाइलों की प्रतिलिपि बनाता है। प्रत्येक स्थिति के अनुरूप फ़ाइलें 'विश्लेषण/p0, विश्लेषण/p1' आदि फ़ोल्डरों में सहेजी जाती हैं। इन स्थिति फ़ोल्डरों में से प्रत्येक के भीतर, AnViM 'cels', 'defs', और 'refs' फ़ोल्डर बनाता है जिसमें मूल संचरित प्रकाश छवि, शीर्ष मोती छवियां, और नीचे मोती छवियां होती हैं, क्रमशः (पूरक चित्रा S6)। AnViM तब नीचे मोतियों की छवियों में कठोर गति का विश्लेषण करता है और एक 'phs' फ़ोल्डर बनाता है जिसमें कोशिकाओं की एक सही संचारित प्रकाश छवि और एक 'tny' फ़ोल्डर होता है जिसमें अद्यतन शीर्ष मोती छवियां होती हैं। अंत में, चैनलों, संचालन, सहिष्णुता, पिक्सेल आकार, और सीमा-पार के उपयोगकर्ता विकल्प 'analysisChoices.txt' फ़ाइल (पूरक चित्रा S6) में सहेजे जाते हैं।
  2. हाइड्रोजेल और मोनोलेयर के विरूपण का परिमाणीकरण
    नोट: यह ध्यान रखना महत्वपूर्ण है कि छवियों के अनुक्रम से आंदोलन का परिमाणीकरण एक तेजी से विकसित होने वाला field19 है। प्रौद्योगिकी को लगातार सुविधाओं के लिए अनुकूलित किया जाता है, जिसमें गति, सटीकता, कच्ची छवियों के भीतर विशिष्ट विशेषताएं और विशिष्ट विरूपण पैटर्न शामिल हैं। इसलिए, यह संभावना है कि कुछ उपयोगकर्ता यहां प्रस्तुत एक की तुलना में एक अलग विरूपण परिमाणीकरण दृष्टिकोण का उपयोग कर सकते हैं।
    1. भाग 1: हाइड्रोजेल विरूपण का परिमाणीकरण
      नोट:: इस चरण में मैन्युअल इनपुट डेटा निर्देशिका की पहचान और ग्रिड रिज़ॉल्यूशन का चयन शामिल हैं। इस चरण में उपयोग की गई पहले से बनाई गई कुंजी में 'p*/tny/*.tif' शामिल हैं. इसमें उत्पादित प्रमुख नई फ़ाइलों में 'पी * / विस्थापन / * _disp.dat' शामिल हैं जो हाइड्रोजेल की शीर्ष सतह के विस्थापन वैक्टर को सूचीबद्ध करता है। AnViM के माध्यम से, शीर्ष मोतियों छवियों पर कण छवि Velocimetry विश्लेषण के माध्यम से संलग्न करने के लिए निम्नलिखित चरणों के दृश्य विवरण के लिए चित्रा 6 देखें20.
      1. फिजी सॉफ़्टवेयर प्रारंभ करें, और MSM ड्रॉप-डाउन मेनू से, MSM - Gel विरूपण का चयन करें.
      2. यहां से, उस विकल्प का चयन करें जो प्रयोग के लिए उपयुक्त है।
      3. फ़ाइल ब्राउज़र संवाद का उपयोग करते हुए, विश्लेषण किए गए डेटा वाले 'विश्लेषण' फ़ोल्डर की पैरेंट निर्देशिका का चयन करें.
      4. जेल विरूपण विंडो की गणना के लिए पैरामीटर में, उपयुक्त क्रॉस-सहसंबंध विंडो आकार, शोर स्तर, और थ्रेशोल्ड (अनुपूरक आकृति S7)20 का चयन करें।
        नोट:: परिणाम प्रत्येक स्थिति फ़ोल्डर 'विश्लेषण/p0, विश्लेषण/p1', आदि के भीतर एक नव निर्मित 'विस्थापन' निर्देशिका में सहेजे जाते हैं। यह वह जगह है जहां सभी आउटपुट फ़ाइलें संग्रहीत की जाती हैं।
    2. भाग 2: मोनोलेयर विरूपण का परिमाणीकरण
      नोट:: इस चरण में मैन्युअल इनपुट डेटा निर्देशिका की पहचान और ग्रिड रिज़ॉल्यूशन का चयन शामिल हैं। इस चरण में उपयोग की गई पहले से बनाई गई कुंजी में 'p*/tny/*.tif' शामिल हैं. इसमें उत्पादित प्रमुख नई फ़ाइलों में 'पी */ वेग / * _vel.dat' शामिल हैं जो कोशिकाओं के गति वैक्टर को सूचीबद्ध करती हैं। AnViM के माध्यम से संलग्न करने के लिए चरणों के दृश्य विवरण के लिए चित्रा 7 देखें, शीर्ष मोतियों छवियों पर कण छवि Velocimetry विश्लेषण20. प्रक्रिया हाइड्रोजेल विरूपण को परिमाणित करने के लिए अपनाई गई प्रक्रिया के समान है और MSM ड्रॉप-डाउन मेनू से MSM - सेलुलर मोशन का चयन करती है। परिणाम प्रत्येक स्थिति फ़ोल्डर 'विश्लेषण / p0', 'विश्लेषण / p1', आदि के भीतर एक नव निर्मित 'वेग' निर्देशिका में सहेजे जाते हैं।
  3. सेल-ईसीएम और सेल-सेल बलों का परिमाणीकरण
    नोट:: इस चरण में मैन्युअल इनपुट डेटा निर्देशिका की पहचान करना, हाइड्रोजेल कठोरता को इंगित करना, और सेलुलर क्लस्टर विभाजन का प्रत्युत्तर देना शामिल है, जो नो-सेल क्षेत्र से कक्षों का पता लगाने के लिए संकेत देता है। इस चरण में उपयोग की गई पहले से बनाई गई कुंजी में 'p*/displacement/*_disp.dat' शामिल हैं. इस चरण में उत्पादित प्रमुख नई फ़ाइलों में शामिल हैं: 'पी * / कर्षण / * _trac.dat', जो हाइड्रोजेल पर कोशिकाओं द्वारा लगाए गए बलों को सूचीबद्ध करता है; 'पी */ कर्षण / * _domain.dat', जो कोशिकाओं वाले ग्रिड बिंदुओं के स्थान को सूचीबद्ध करता है; और इनपुट फ़ाइलें 'p*/traction.in, p*/clusterInput.txt' और 'p*/prestress.in' जो इस चरण के लिए उपयोगकर्ता विकल्प रिकॉर्ड करती हैं। सेल-ईसीएम और सेल-सेल बलों के पहले मात्रात्मक मूल्यांकन के बाद, तकनीक के लिए कई विविधताएं विकसित की गई हैं1,15। विविधताएं सब्सट्रेट, कोशिकाओं, प्रयोगात्मक स्थितियों, या संख्यात्मक उपकरणों के विशेष मामलों पर ध्यान केंद्रित करती हैं7,8,21,22। AnViM, फूरियर ट्रांसफॉर्म ट्रैक्शन माइक्रोस्कोपी, और हाइड्रोजेल विरूपण डेटा 1,2,15 पर मोनोलेयर तनाव माइक्रोस्कोपी विश्लेषण के माध्यम से संलग्न करने के लिए दृश्य विवरण के लिए चित्रा 8 देखें।
    1. फिजी सॉफ़्टवेयर प्रारंभ करें, और MSM ड्रॉप-डाउन मेनू से, MSM - सेल-ECM और सेल-सेल फोर्सेस (ड्रॉपडाउन मेनू में तीसरा विकल्प) का चयन करें।
    2. फ़ाइल ब्राउज़र संवाद का उपयोग करते हुए, 'विश्लेषण' फ़ोल्डर 'tnimgs' और 'विश्लेषण' वाले 'विश्लेषण' वाले फ़ोल्डर्स की पैरेंट निर्देशिका का चयन करें जिसमें विश्लेषण किए गए डेटा शामिल हैं। Select पर क्लिक करें।
    3. सेलुलर बलों की गणना के लिए पैरामीटर विंडो में, कतरनी मापांक, हाइड्रोजेल की मोटाई और प्रत्याशित शोर स्तर दर्ज करें। ठीक का चयन करें। यह इसे MATLAB फ़ंक्शन के माध्यम से कर्षण निष्पादित करने देता है।
      नोट:: इन इनपुट के बाद, AnViM सेल-ECM बलों की गणना करता है।
    4. उसके बाद, इंगित करें कि मोनोलेयर confluent है या नहीं। यदि पूरी सेल छवि कोशिकाओं के साथ कवर की गई है, तो उत्तर हाँ है। उस स्थिति में, सेल-सेल बलों की गणना पूरे फ्रेम में की जाएगी। दूसरी ओर, यदि छवि के एक हिस्से में कोशिकाएं नहीं हैं, तो उत्तर नहीं है। उस स्थिति में, कक्षों वाले छवि क्षेत्र के विभाजन को सुविधाजनक बनाने के लिए AnViM संकेतों का पालन करें।
    5. यदि उत्तर नहीं है, तो सॉफ़्टवेयर द्वारा ऐसा करने का संकेत दिए जाने पर गैर-कक्ष ऑब्जेक्ट के चारों ओर मैन्युअल रूप से एक बहुभुज आरेखित करें, और तब विभाजन के लिए एक उपयुक्त विधि (ओं) का चयन करें. सॉफ्टवेयर कोशिकाओं के रंग (काले या सफेद) के लिए पूछना होगा।
    6. सॉफ़्टवेयर में स्वचालित रूप से स्पॉट भरें विकल्प की जाँच करें और ठीक पर क्लिक करें।
      नोट:: एक गैर confluent monolayer सेगमेंटिंग के लिए चरण 'अनुभाग 2.4' के पहले भाग में कवर किया जाएगा। सेल-ईसीएम बलों को प्रत्येक स्थिति फ़ोल्डर के भीतर एक नव निर्मित निर्देशिका 'कर्षण' में '* _trac.dat' फ़ाइलों में संग्रहीत किया जाता है, और सेल-ईसीएम बल गणना सॉफ़्टवेयर के इनपुट को 'traction.in' फ़ाइल (पूरक चित्रा S8) में सहेजा जाता है। सेल-सेल बलों को प्रत्येक स्थिति फ़ोल्डर के भीतर एक नवनिर्मित निर्देशिका 'prestress' में '*_prestress.dat' फ़ाइलों में संग्रहीत किया जाता है, और सेल-सेल बल गणना सॉफ़्टवेयर के लिए इनपुट फ़ाइल 'prestress.in' (अनुपूरक चित्रा S9) में सहेजा जाता है।
  4. अलग-अलग कक्षों पर ग्रिड बिंदु मानों का मानचित्रण
    नोट: iTACS के वर्तमान फोकस में से एक क्षेत्र में मापा यांत्रिक संकेतों की व्याख्या करने के लिए एक सीधा दृष्टिकोण पेश करने के लिए है। यह दृष्टिकोण एक क्लस्टर की पड़ोसी कोशिकाओं के बीच यांत्रिक बातचीत की जांच के लिए फायदेमंद है18. कुल मिलाकर, अब तक परिमाणित गुण सेलुलर क्लस्टर में नियमित रूप से स्पेस किए गए ग्रिड बिंदुओं पर हैं। यह डेटा अलग-अलग कोशिकाओं की रूपात्मक सीमा के भीतर चयनित गुणों के माध्यिका, माध्य और मानक विचलन की पहचान करता है और उन्हें सेलुलर भौतिक गुणों / संकेतों के रूप में असाइन करता है। इनमें से, मानक विचलन का उपयोग परिवर्तनशीलता को इंगित करने के लिए किया जाता है, माध्य और माध्यिका के बीच के अंतर का उपयोग वितरण की प्रकृति को इंगित करने के लिए किया जाता है, और चयनित गुणों के लिए कोशिकाओं की समग्र स्थिति को इंगित करने के लिए माध्य मान का उपयोग किया जाता है।
    1. भाग 1: उस छवि क्षेत्र का विभाजन जिसमें कक्ष हैं
      नोट:: इस चरण के लिए मैन्युअल इनपुट डेटा निर्देशिका की पहचान करना और कोई-कक्ष क्षेत्र से कक्षों का पता लगाने के लिए विभाजन संकेतों के लिए प्रत्युत्तर देना शामिल है। इस चरण में उपयोग की जाने वाली पहले से बनाई गई कुंजी में 'p*/phs/*.tif' शामिल हैं. इस चरण में उत्पादित प्रमुख नई फ़ाइलों में 'p*/phs/bwImages/*.tif' शामिल हैं, जो नो-सेल क्षेत्रों से सेल क्षेत्रों को अलग करने वाली बाइनरी छवियां हैं, 'p*/phs/textResults/frameNum_percentHealed.txt', जो प्रत्येक उदाहरण में कोशिकाओं द्वारा कवर किए गए प्रतिशत छवि क्षेत्र को सूचीबद्ध करता है, और 'p*/clusterInput.txt', जो AcTrM इंटरफ़ेस में दर्ज उपयोगकर्ता विकल्पों को रिकॉर्ड करता है। कक्षों वाले छवि क्षेत्र को विभाजित करने के लिए निम्न चरणों के दृश्य विवरण के लिए चित्र 9 देखें. सेल-सेल बलों की गणना करने से पहले इस भाग को पूरा किया जाना चाहिए। उस स्थिति में, इन चरणों को दोहराया जाना चाहिए नहीं। साथ ही, यदि ये चरण सेल-सेल बल परिकलन से पहले आयोजित किए जाते हैं, तो उन्हें बल परिकलन की शुरुआत में अनुरोध नहीं किया जाता है।
      1. फ़िजी सॉफ़्टवेयर प्रारंभ करें, और MSM ड्रॉप-डाउन मेनू से, सेगमेंटेशन - सेलुलर क्लस्टर का चयन करें।
      2. फ़ाइल ब्राउज़र संवाद का उपयोग करते हुए, स्थिति निर्देशिका 'विश्लेषण/p0', 'analysis/p1', आदि का चयन करें, जिसमें नियमित रूप से स्पेस किए गए ग्रिड बिंदुओं पर परिमाणित गुण होते हैं।
      3. इंगित करें कि क्या मोनोलेयर confluent है।
        नोट:: नीचे दिए गए चरणों को केवल तभी लागू किया जाता है जब मोनोलेयर confluent नहीं है। AnViM का पालन करें जो कक्षों वाले छवि क्षेत्रों की पहचान करने के लिए उपन्यास बहु-आयामी दृष्टिकोण को लागू करने के लिए संकेत देता है। इस प्रक्रिया में चार तरीके शामिल हैं - प्रत्येक एक अलग तरीके से विभाजन के करीब पहुंच रहा है। संयोजन में उपयोग की जाने वाली इन विधियों में से एक या कई कोशिकाओं की छवियों की एक विस्तृत विविधता को कवर करते हैं। इसलिए, यह पता लगाने के लिए विभिन्न दृष्टिकोणों का प्रयास करें कि कौन सा संयोजन उनके डेटा के लिए सबसे अच्छा काम करता है।
      4. इष्टतम विभाजन प्राप्त करने के लिए 'डोमेन कनेक्शन कारक' और 'स्मीयर कारक' समायोजित करें।
        नोट:: 'स्मीयर कारक' कक्षों वाले क्षेत्रों को बड़ा बनाता है।
      5. इंगित करें कि कक्ष बाइनरी छवि में काले या सफ़ेद दिखाई देते हैं या नहीं.
      6. सीमा छवि को साफ़ करने के लिए निर्देश विंडो में, चुनें कि छवि को स्वचालित रूप से या मैन्युअल रूप से साफ़ करना है या नहीं.
        नोट:: छवियों की अवांछित सुविधाओं का विश्लेषण किया जा करने के लिए सेल क्लस्टर से डिस्कनेक्ट किए गए पिक्सेल पर कक्षों और सफेद धब्बे द्वारा कब्जा कर लिया पिक्सेल पर काले धब्बे हैं। विश्लेषण केवल उन क्षेत्रों पर किया जा सकता है जो जुड़े हुए हैं। इसलिए कई डिस्कनेक्ट किए गए क्षेत्रों का अलग से विश्लेषण किया जाना चाहिए।
    2. भाग 2: छवियों में अलग-अलग कोशिकाओं का विभाजन
      नोट:: इस चरण के लिए मैन्युअल इनपुट डेटा निर्देशिका की पहचान करना और छवि के भीतर अलग-अलग कक्षों का पता लगाने के लिए विभाजन संकेतों का प्रतिसाद देना शामिल है। इस चरण में उपयोग की जाने वाली पहले से बनाई गई कुंजी में 'p*/phs/*.tif' और 'p*/phs/bwImages/*.tif' शामिल हैं। उत्पादित प्रमुख नई फ़ाइलों में 'p*/phs/textResults/*.csv' शामिल हैं, जिनमें सेलुलर रूपात्मक गुण होते हैं। मोनोलेयर के अलग-अलग कक्षों को विभाजित करने के लिए निम्न चरणों के दृश्य विवरण के लिए चित्र 10 देखें।
      1. फिजी सॉफ़्टवेयर प्रारंभ करें, और MSM ड्रॉप-डाउन मेनू से, सेगमेंटेशन - व्यक्तिगत सेल का चयन करें.
      2. फ़ाइल ब्राउज़र संवाद का उपयोग करते हुए, स्थिति निर्देशिका 'विश्लेषण/p0', 'analysis/p1', आदि का चयन करें, जिसमें नियमित रूप से स्पेस किए गए ग्रिड बिंदुओं पर परिमाणित गुण होते हैं।
      3. इनपुट पैरामीटर चुनें विंडो में, अधिकतम पहलू अनुपात, सेल सीमा की तुलना में सेल केंद्र कितना बाहर खड़ा है, और कक्षों का पता लगाने का मार्गदर्शन करने के लिए दो धुंधला पैरामीटर (अनुपूरक चित्रS10) की प्रमुखता को इंगित करें।
      4. प्रत्येक स्थिति के लिए छवि स्टैक पर, सबसे छोटे सामान्य सेल पर एक बहुभुज खींचें। इसका उपयोग क्षेत्र की गणना करने के लिए किया जाता है। इससे छोटी किसी भी चीज को सॉफ्टवेयर द्वारा सेल के रूप में नहीं माना जाएगा।
      5. इसके बाद सबसे बड़े सामान्य सेल के चारों ओर एक बहुभुज खींचें और इंगित करें कि सेल केंद्र या सेल-सेल इंटरफ़ेस उज्ज्वल है या नहीं।
        नोट: AnViM तब उस फ़्रेम के भीतर कक्षों पर जानकारी वाले प्रत्येक फ़्रेम के लिए 'phs/textResults/0001.csv', 'phs/textResults/0002.csv' आदि फ़ाइलें बनाता है. इस स्तर पर, इस फ़ाइल में कोशिकाओं के बारे में रूपात्मक जानकारी शामिल है, जिसमें क्षेत्र, केंद्रक, परिधि, अभिविन्यास, परिपत्रता, पहलू अनुपात, गोलाकारता, ठोसता, नो-सेल क्षेत्र से दूरी शामिल है। इन गुणों में लंबाई इकाई पिक्सेल है, और कोण डिग्री में है। अंत में, इस फ़ाइल को बाद के चरणों में सेलुलर पिक्सेल तीव्रता, गति और बलों को शामिल करने के लिए अद्यतन किया जाता है।
    3. भाग 3: कक्षों पर पिक्सेल तीव्रता का मानचित्रण
      नोट:: इस चरण में मैन्युअल इनपुट डेटा निर्देशिका की पहचान करना और मैपिंग गुण और पैरामीटर का चयन करना शामिल है। इस चरण में उपयोग की जाने वाली पहले से बनाई गई कुंजी में 'p*/phs/*.tif' (या 'p*/fluo/*.tif') और 'p*/phs/bwImages/*.tif' शामिल हैं। इस चरण में उत्पादित प्रमुख नई फ़ाइलों में 'p*/phs/textResults/*.csv' शामिल हैं, जो सेलुलर रूपात्मक गुणों को सूचीबद्ध करता है। अलग-अलग कक्षों और उनके पड़ोसी क्षेत्र द्वारा शामिल क्षेत्र में पिक्सेल तीव्रता का आकलन करने और उन्हें कोशिकाओं के गुणों के रूप में परिभाषित करने के लिए निम्न चरणों के दृश्य विवरण के लिए चित्र11 देखें।
      1. फिजी सॉफ़्टवेयर प्रारंभ करें, और MSM ड्रॉप-डाउन मेनू से, कक्षों पर मानचित्र - तीव्रता का चयन करें.
      2. फ़ाइल ब्राउज़र संवाद का उपयोग करते हुए, स्थिति निर्देशिका 'विश्लेषण/p0', 'analysis/p1', आदि का चयन करें, जिसमें नियमित रूप से स्पेस किए गए ग्रिड बिंदुओं पर परिमाणित गुण होते हैं।
      3. जब सॉफ़्टवेयर द्वारा संकेत दिया जाता है, तो सेल विभाजन का पता लगाएँ या सेलुलर प्रतिदीप्ति को परिमाणित करें का चयन करें. पड़ोसी क्षेत्र के आकार को परिभाषित करें। पड़ोसी क्षेत्र के गुण एकत्रित करें और कक्ष बक्सों के गुण एकत्रित करें दोनों की जाँच करें. OK पर क्लिक करें।
      4. सेलुलर तीव्रता विंडो को रिकॉर्ड करने के उद्देश्य में, इंगित करें कि तीव्रता मानचित्रण के लिए किस प्रकार की छवि का उपयोग किया जाना है, पड़ोसी क्षेत्र का आकार, और क्या डेटा व्यक्तिगत कोशिकाओं या दोनों कोशिकाओं और उनके पड़ोसी क्षेत्रों (पूरक चित्रा S11) के लिए एकत्र किया जाता है।
        नोट:: एक चरण-कंट्रास्ट छवि की पिक्सेल तीव्रता मैपिंग सेल विभाजन ईवेंट का पता लगाने की अनुमति देता है। फ्लोरोसेंट छवि तीव्रता का मानचित्रण फ्लोरोसेंटली टैग किए गए साइटोप्लाज्मिक अणुओं में उतार-चढ़ाव का पता लगाने में सक्षम करेगा। उपर्युक्त चरणों का आउटपुट अलग-अलग कक्षों के लिए माध्य, माध्यिका, मानक विचलन, न्यूनतम और अधिकतम पिक्सेल तीव्रता मान है. इन संख्याओं को 'phs/textResults/0001.csv', 'phs/textResults/0002.csv' आदि फ़ाइलों में नए स्तंभों के रूप में दर्ज किया जाता है।
    4. भाग 4: कोशिकाओं पर बलों और गति का मानचित्रण
      नोट:: इस चरण के लिए मैन्युअल इनपुट डेटा निर्देशिका की पहचान करना और मैपिंग गुण और पैरामीटर का चयन करना शामिल है। इस चरण में उपयोग की जाने वाली कुंजी में पहले से बनाई गई फ़ाइलों में 'p*/phs/textResults/*.csv', 'p*/velocity/*_vel.dat', 'p*/displacement/*_disp.dat', 'p*/traction/*_trac.dat', 'p*/prestress/*_prestress.dat', और 'p*/phs/bwImages/*.tif' शामिल हैं। इस चरण के दौरान कोई नई फ़ाइलें नहीं बनाई जाती हैं। इसके बजाय, नई जानकारी (सेलुलर बल और गति गुण) 'p*/phs/textResults/*.csv' फ़ाइलों में जोड़े जाते हैं। अलग-अलग कोशिकाओं और उनके पड़ोसी क्षेत्र द्वारा शामिल क्षेत्र में बलों और गति का आकलन करने और उन्हें कोशिकाओं के गुणों के रूप में परिभाषित करने के लिए चरणों के दृश्य विवरण के लिए चित्र12 देखें।
      1. कक्षों पर MSM ड्रॉप-डाउन मेनू मानचित्र से चुनें - गति / बल डेटा (अनुपूरक चित्रा S12)।
      2. उसके बाद, चरण 2.4.3 में सूचीबद्ध चरणों का पालन करें।
        नोट: नए कॉलम 'phs / textResults / 0001.csv', 'phs / textResults / 0002.csv' आदि फ़ाइलों में जोड़े जाते हैं और गति का माध्य, माध्यिका और मानक विचलन, वेग का अभिविन्यास, औसत साइटोस्केलेटल तनाव, तनाव अनिसोट्रॉपी, हाइड्रोजेल में तनाव ऊर्जा, उच्चतम तनाव का अभिविन्यास, और सेल-ईसीएम कर्षण का परिमाण (पूरक चित्रा S13) शामिल हैं।
  5. परिणामों का विज़ुअलाइज़ेशन
    1. भाग 1: प्रयोग भर में सेलुलर पहचान की ट्रैकिंग
      नोट:: इस चरण के लिए मैन्युअल इनपुट डेटा निर्देशिका की पहचान करना और विज़ुअलाइज़ करने के लिए मैप किए गए गुणों का चयन करना शामिल है। इस चरण में उपयोग की गई पहले से बनाई गई कुंजी में 'p*/phs/textResults/*.csv' शामिल हैं. इस चरण के दौरान उत्पादित प्रमुख नई फ़ाइलों में 'p*/phs/textResults/cellTimeTrace_*.csv' शामिल हैं, जिसमें सेलुलर डेटा का समय ट्रेस होता है। प्रयोग की पूरी अवधि में अलग-अलग कक्षों के गुणों को ट्रैक करने के लिए निम्न चरणों के दृश्य विवरण के लिए चित्र 13 देखें।
      1. फिजी सॉफ़्टवेयर प्रारंभ करें, और MSM ड्रॉप-डाउन मेनू से, परिणाम - ट्रैक डेटा का चयन करें.
      2. फ़ाइल ब्राउज़र संवाद का उपयोग करते हुए, स्थिति निर्देशिका 'विश्लेषण/p0', 'analysis/p1', आदि का चयन करें, जिसमें ट्रैक किए जाने वाले सेलुलर गुण शामिल हैं. जब किया जाता है तो Select पर क्लिक करें।
      3. ट्रैकिंग विंडो के लिए प्रारंभिक बिंदु चुनें विंडो में, निगरानी के लिए प्रारंभिक फ़्रेम चुनें, और एक साथ ट्रैक किए गए फ़्रेमों की संख्या (अनुपूरक चित्रS14) चुनें. हमेशा फ़्रेम संख्या 2 से प्रारंभ करें क्योंकि फ़्रेम संख्या 1 के लिए वेग निर्धारित नहीं किया जा सकता है। जब आप ऐसा कर लें, तो OK पर क्लिक करें।
      4. ट्रैक्स बनाने के लिए चर की जाँच करें विंडो में, चर नाम लिखकर या चेकबॉक्स (अनुपूरक आकृति S15) से शब्दों का चयन करके चर चुनें. फिर, ठीक पर क्लिक करें।
        नोट:: ट्रैकिंग जनरेट करता है 'phs/textResults/cellTimeTrace_*.csv' फ़ाइलें प्रत्येक स्तंभ के साथ एक अद्वितीय कक्ष संख्या और प्रत्येक क्रमिक पंक्ति लगातार समय आवृत्ति का प्रतिनिधित्व करते हैं।
    2. भाग 2: मूल्यांकन किए गए सेलुलर गुणों के समय पटरियों का उत्पादन
      नोट:: इस चरण के लिए मैन्युअल इनपुट डेटा निर्देशिका की पहचान करना और विज़ुअलाइज़ करने के लिए मैप किए गए गुणों का चयन करना शामिल है। इस चरण में उपयोग की जाने वाली पहले से बनाई गई कुंजी में 'p*/phs/textResults/cellTimeTrace_*.csv' शामिल हैं. इस चरण के दौरान उत्पादित प्रमुख नई फ़ाइलों में 'p*/phs/trackedDataPlots/*.tif' शामिल हैं, जिसमें टाइम ट्रैक प्लॉट और 'p*/phs/trackedDataPlots/*.csv' शामिल हैं, जिनमें प्लॉट डेटा होता है। मूल्यांकन किए गए सेलुलर गुणों के समय ट्रैक जनरेट करने के लिए निम्न चरणों के दृश्य विवरण के लिए चित्र 14 देखें।
      1. फिजी सॉफ़्टवेयर प्रारंभ करें, और MSM ड्रॉप-डाउन मेनू से, परिणाम - प्लॉट का चयन करें.
      2. फ़ाइल ब्राउज़र संवाद का उपयोग करते हुए, स्थिति निर्देशिका 'विश्लेषण/p0', 'analysis/p1', आदि का चयन करें, जिसमें ट्रैक किए गए सेलुलर गुण शामिल हैं।
      3. चुनें कि हाँ या नहीं बटन पर क्लिक करके अटूट पटरियों वाले कक्षों तक प्लॉटिंग को सीमित करना है या नहीं.
        नोट:: यह विकल्प उन कक्षों पर ध्यान नहीं देता है, जिन्हें एक या अधिक समय आवृत्तियों में नहीं पाया जा सका.
      4. एक साथ प्लॉट किए जाने वाले चर की संख्या चुनें और ठीक पर क्लिक करें।
        नोट:: वर्तमान में, AnViM एक ही प्लॉट में प्रदर्शित करने के लिए तीन चर की एक अधिकतम अनुमति देता है।
      5. ड्रॉप-डाउन मेनू का उपयोग करके प्लॉटिंग के लिए अलग-अलग चर चुनें.
        नोट:: ये चरण एक टैग की गई छवि फ़ाइल स्वरूप (TIFF) फ़ाइल और 'phs/trackedDataPlots/' फ़ोल्डर में एक अल्पविराम-अलग डेटा फ़ाइल बनाएँ। फ़ाइल नाम चर नामों से बना होता है जो एक अंडरस्कोर द्वारा अलग किए जाते हैं और एक सेल नंबर के साथ समाप्त होते हैं।
    3. भाग 3: मूल्यांकन किए गए सेलुलर गुणों के गर्मी मानचित्रों का उत्पादन
      नोट:: इस चरण में मैन्युअल इनपुट डेटा निर्देशिका की पहचान करना और विज़ुअलाइज़ करने के लिए मैप किए गए गुणों का चयन करना शामिल है. इस चरण में उपयोग की जाने वाली पहले से बनाई गई कुंजी में 'p*/phs/textResults/cellTimeTrace_*.csv' शामिल हैं. इस चरण में उत्पन्न प्रमुख नई फ़ाइलों में 'p*/phs/segmentedImages/cellPropMaps/*.tif' शामिल हैं, जो सेलुलर गुणों के हीटमैप हैं। मूल्यांकन किए गए सेलुलर गुणों के ऊष्मा मानचित्र उत्पन्न करने के लिए चरणों के दृश्य विवरण के लिए चित्र 15 देखें.
      1. MSM ड्रॉप-डाउन मेनू परिणाम - चित्र से चुनें.
      2. चरण 2.5.2 में वर्णित चरणों का पालन करें।
        नोट:: आउटपुट 'phs/segmentedImages/cellPropMaps/' फ़ोल्डर में TIFF फ़ाइल फ़ाइलों के रूप में संग्रहीत किया जाता है। फ़ाइल नाम एक अंडरस्कोर द्वारा अलग किए गए समय आवृत्ति संख्या और चर नाम हैं।

Representative Results

हम यहां प्रदर्शित उदाहरण के लिए दो प्रमुख आउटपुट प्रस्तुत करते हैं। पहला आउटपुट सेल नंबर 1 (चित्रा 16) के लिए सेलुलर गति और साइटोस्केलेटल तनाव का समय ट्रेस है। गुणों के बीच दृश्य संबंध को सुविधाजनक बनाने के लिए गुण एक साझा ऊर्ध्वाधर अक्ष पर दिखाए जाते हैं, और क्षैतिज अक्ष समय आवृत्ति संख्या को इंगित करता है। इस प्रयोग में, 15 मिनट के अंतराल पर क्रमिक फ्रेम प्राप्त किए गए थे। दूसरा आउटपुट प्रयोग में गर्मी मानचित्र 1 ज की एक सरणी है (चित्रा 17)। यहां दिखाए गए गुणों में प्रसार क्षेत्र, अभिविन्यास, परिपत्रता, गति, गति की दिशा, अधिकतम तनाव अभिविन्यास, साइटोस्केलेटल तनाव, सब्सट्रेट कर्षण और व्यक्तिगत कोशिकाओं की तनाव अनिसोट्रॉपी शामिल हैं।

Figure 1
चित्रा 1: सेलुलर सिग्नल (iTACS) का विश्लेषण करने के लिए एकीकृत टूलकिट की संरचना। iTACS के दो प्रमुख घटक अधिग्रहण और प्रशिक्षण मॉड्यूल (AcTrM) और विश्लेषण और विज़ुअलाइज़ेशन मॉड्यूल (AnViM) हैं। AcTrM विभिन्न हाइड्रोजेल तैयारी तकनीकों का उपयोग कर सकता है जो वर्तमान में हाइड्रोजेल तैयार करने के लिए मौजूद हैं जिन्हें माइक्रोस्कोप चरण, किसी भी सेल सीडिंग और एक विकास प्रोटोकॉल पर दृढ़ता से आयोजित किया जा सकता है जो एक फोकल प्लेन में कोशिकाओं को बरकरार रखता है। AnViM हाइड्रोजेल और मोनोलेयर विरूपण, सेल-ईसीएम बलों और सेल-सेल बलों को मापने के लिए विभिन्न तकनीकों का उपयोग कर सकता है। बल माप प्रोटोकॉल के इन सभी उपयोगकर्ता-पसंदीदा घटकों को आईटीएसीएस में समायोजित किया जा सकता है, और उन्हें धराशायी बक्से के साथ पहचाना गया है। ठोस बक्से के साथ पहचाने जाने वाले घटक सेलुलर बल माप प्रौद्योगिकी में उपन्यास योगदान हैं। AnViM में विज़ुअलाइज़ेशन अलग-अलग कक्षों में गुणों के माध्य मान और परिवर्तनशीलता पर केंद्रित है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्रा 2: संदर्भ छवि अधिग्रहण - भाग 1. AcTrM का उपयोग कर स्थिति सूची बनाने के लिए चरण. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्रा 3: संदर्भ छवि अधिग्रहण - भाग 2. AcTrM का उपयोग कर संदर्भ छवियों को प्राप्त करने के लिए कदम। चरण 2, 4 और 6 के विस्तृत विचार क्रमशः अनुपूरक आंकड़े S2, S3, और S4 में प्रस्तुत किए गए हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्रा 4: शेष प्रयोग के लिए स्वचालित छवि अधिग्रहण। AcTrM का उपयोग कर सेलुलर व्यवहार का आकलन करने के लिए छवि अधिग्रहण को फिर से शुरू करने के लिए चरण। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 5
चित्रा 5: स्वचालित डेटा विश्लेषण सेट अप करना. AnViM का उपयोग करके स्वचालित छवि विश्लेषण शुरू करने के लिए कदम। सॉफ़्टवेयर AcTrM द्वारा उपयोग किए जाने वाले छवि प्रारूप को पहचानता है। चरण 3 और 5 में पैनलों का एक विस्तृत दृश्य क्रमशः अनुपूरक चित्र S5 और अनुपूरक चित्र S6 में प्रस्तुत किया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 6
चित्रा 6: हाइड्रोजेल और मोनोलेयर के विरूपण का परिमाणीकरण - भाग 1। AnViM के माध्यम से , त्सेंग के कण छवि Velocimetry कार्यान्वयन, Q. et al., PNAS (2012)20 हाइड्रोजेल की शीर्ष सतह के विरूपण को मापने के लिए कदम। उपयोगकर्ता हाइड्रोजेल विरूपण को मापने के लिए AnViM अन्य दृष्टिकोणों के भीतर भी लागू कर सकते हैं। चरण 3 का एक विस्तृत दृश्य अनुपूरक चित्र S7 में प्रस्तुत किया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 7
चित्रा 7: हाइड्रोजेल और मोनोलेयर के विरूपण का परिमाणीकरण - भाग 2। AnViM के माध्यम से , त्सेंग के कण छवि Velocimetry कार्यान्वयन को संलग्न करने के लिए कदम, Q. et al., PNAS (2012)20 व्यक्तिगत कोशिकाओं की स्थानीय गति को मापने के लिए। उपयोगकर्ता सेलुलर गति को मापने के लिए AnViM के भीतर अन्य दृष्टिकोणों को भी लागू कर सकते हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 8
चित्रा 8: सेल-ईसीएम और सेल-सेल बलों का परिमाणीकरण। AnViM के माध्यम से संलग्न करने के लिए छवि विश्लेषण करने के लिए कदम, Trepat et al., प्रकृति भौतिकी (2009)15 हाइड्रोजेल पर कोशिकाओं द्वारा लगाए गए बलों को मापने के लिए, और टैम्बे एट अल के मोनोलेयर तनाव माइक्रोस्कोपी कार्यान्वयन, प्रकृति सामग्री (2011)1 व्यक्तिगत कोशिकाओं के भीतर और पड़ोसी कोशिकाओं के बीच बलों को मापने के लिए। उपयोगकर्ता सेल-ईसीएम और सेल-सेल बलों को मापने के लिए AnViM के भीतर अन्य दृष्टिकोणों को भी लागू कर सकते हैं। चरण 6 का एक विस्तृत दृश्य अनुपूरक चित्र S8 और अनुपूरक चित्र S9 में प्रस्तुत किया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 9
चित्रा 9: अलग-अलग कक्षों पर ग्रिड बिंदु मानों का मानचित्रण - भाग 1. एक उपन्यास बहु-आयामी दृष्टिकोण का उपयोग करके कोशिकाओं वाले छवि क्षेत्रों को विभाजित करने के लिए चरण। इस दृष्टिकोण का उपयोग कोशिकाओं के चरण विपरीत, ब्राइटफील्ड, या प्रतिदीप्ति छवियों को विभाजित करने के लिए किया जा सकता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 10
चित्रा 10: अलग-अलग कक्षों पर ग्रिड बिंदु मानों का मानचित्रण - भाग 2. AnViM में विकसित एक उपन्यास बहु-आयामी दृष्टिकोण का उपयोग करके एक मोनोलेयर की अलग-अलग कोशिकाओं को विभाजित करने के लिए कदम। इस दृष्टिकोण का उपयोग कोशिकाओं के चरण विपरीत, ब्राइटफील्ड, या प्रतिदीप्ति छवियों को विभाजित करने के लिए किया जा सकता है। चरण 2 का एक विस्तृत दृश्य अनुपूरक चित्र S10 में प्रस्तुत किया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 11
चित्र11: अलग-अलग कक्षों पर ग्रिड बिंदु मानों का मानचित्रण - भाग 3. व्यक्तिगत कोशिकाओं के भीतर और AnViM का उपयोग करके व्यक्तिगत कोशिकाओं के पड़ोसी क्षेत्र के भीतर क्षेत्र में पिक्सेल तीव्रता का आकलन करने के लिए कदम। मूल्यांकन की गई तीव्रता में संचारित प्रकाश तीव्रता और प्रतिदीप्ति तीव्रता शामिल है। यह भाग अलग-अलग कोशिकाओं के भीतर और व्यक्तिगत कोशिकाओं के पड़ोसी क्षेत्र के भीतर पिक्सेल तीव्रता के औसत मान और मानक विचलन को मैप करता है। चरण 2 का एक विस्तृत दृश्य अनुपूरक चित्र S11 में प्रस्तुत किया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 12
चित्रा 12: अलग-अलग कक्षों पर ग्रिड बिंदु मानों का मानचित्रण - भाग 4. अलग-अलग कोशिकाओं के भीतर और AnViM का उपयोग करके व्यक्तिगत कोशिकाओं के पड़ोसी क्षेत्र के भीतर ग्रिड बिंदुओं के बलों और गति गुणों का आकलन करने के लिए कदम। यह भाग अलग-अलग कोशिकाओं के भीतर और व्यक्तिगत कोशिकाओं के पड़ोसी क्षेत्र के भीतर गुणों के औसत मूल्य और मानक विचलन को मैप करता है। चरण 2 और 3 का एक विस्तृत दृश्य अनुपूरक चित्र S12 और अनुपूरक चित्र S13 में प्रस्तुत किया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 13
चित्रा 13: परिणामों का विज़ुअलाइज़ेशन - भाग 1. AnViM का उपयोग करके प्रयोग की पूरी अवधि में अलग-अलग कोशिकाओं के गुणों को ट्रैक करने के लिए चरण। चरण 2 और 3 का एक विस्तृत दृश्य अनुपूरक चित्र S14 और अनुपूरक चित्र S15 में प्रस्तुत किया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 14
चित्रा 14: परिणामों का विज़ुअलाइज़ेशन - भाग 2. AnViM का उपयोग करके मूल्यांकन किए गए गुणों के समय ट्रेस उत्पन्न करने के लिए चरण. उपयोगकर्ता के पास एक ग्राफ में तीन गुणों तक की साजिश रचने का विकल्प होता है। समय के निशान या तो सभी कोशिकाओं या केवल उन कोशिकाओं के लिए उत्पन्न होते हैं जिनके लिए ट्रैकिंग पूरे प्रयोग में सफल रही थी। चरण 5 का एक विस्तृत दृश्य अनुपूरक चित्र S16 और अनुपूरक चित्र S17 में प्रस्तुत किया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 15
चित्रा 15: परिणामों का विज़ुअलाइज़ेशन - भाग 3. AnViM का उपयोग करके मूल्यांकन किए गए गुणों के गर्मी मानचित्र उत्पन्न करने के लिए कदम। हीट मैप्स शुरुआती फ्रेम और सभी चयनित गुणों के बाद सभी फ्रेम के लिए उत्पन्न होते हैं। चरण 3 का एक विस्तृत दृश्य पूरक चित्र S18 में प्रस्तुत किया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 16
चित्र 16: कक्ष ID 1 के लिए समय ट्रेस. प्रदर्शित दो गुण सेलुलर साइटोस्केलेटल तनाव ("औसतन मेडियन") और सेलुलर गति ("स्पीडमेडियन") हैं। सेलुलर साइटोस्केलेटल तनाव और सेलुलर गति दोनों को कोशिकाओं के भीतर ग्रिड बिंदुओं में औसत मूल्य के रूप में परिमाणित किया जाता है। मूल्यांकन किए गए गुणों के बीच संबंधों की कल्पना करने के लिए दो गुणों को मनमाने ढंग से इकाइयों के साथ एक ही अक्ष पर प्लॉट किया जाता है। अतिरिक्त चर नाम अनुपूरक तालिका S1 में सूचीबद्ध हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 17
चित्रा 17: विश्लेषण मोनोलेयर में अलग-अलग कोशिकाओं के गुणों के हीट मैप्स। प्रत्येक सेल पैनल में इंगित संपत्ति के औसत मूल्य के साथ रंगीन है। इस प्रकार, गहरा लाल रंग स्पेक्ट्रम में अधिकतम सेलुलर मूल्य को इंगित करता है, और गहरा नीला विश्लेषण किए गए मोनोलेयर में न्यूनतम सेलुलर मूल्य को इंगित करता है। जैसा कि टैम्बे एट अल. में वर्णित है, पीएलओएस वन (2013)2, सीमा के करीब स्थित कोशिकाओं में छवि के बाहर कोशिकाओं के अज्ञात गुणों से प्रभावित यांत्रिक बल होते हैं। इसलिए ऊष्मा मानचित्र सीमा से दूर कोशिकाओं के लिए उत्पन्न होता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

चित्रा S1: ऊपर और नीचे फ्लोरोसेंट मनका के नमूना छवियों. कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें।

चित्रा S2: चित्र 3 से चरण 2 का एक विस्तृत दृश्य। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें।

चित्रा S3: चित्र 3 से चरण 4 का एक विस्तृत दृश्य। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें।

चित्रा S4 A: चित्र 3 से चरण 6 का विस्तृत दृश्य. कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें।

चित्रा S5: चित्र 5 से चरण 3 का एक विस्तृत दृश्य। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें।

चित्रा S6: चित्रा 5 से चरण 5 का एक विस्तृत दृश्य। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें।

चित्रा S7: चित्र 6 से चरण 3 का एक विस्तृत दृश्य. कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें।

चित्रा S8: चित्र 8 से चरण 6 के सेल-ECM बल आउटपुट का एक विस्तृत दृश्य. कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें।

चित्रा S9: चित्र 8 से चरण 6 के सेल-सेल बल आउटपुट का एक विस्तृत दृश्य. कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें।

चित्रा S10: चित्र 10 से चरण 2 का एक विस्तृत दृश्य। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें।

चित्रा S11: चित्र 11 से चरण 2 का एक विस्तृत दृश्य. कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें।

चित्रा S12: चित्र 12 से चरण 2 का एक विस्तृत दृश्य। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें।

चित्रा S13: चित्र 12 से चरण 3 के आउटपुट का एक विस्तृत दृश्य। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें।

चित्रा S14: चित्र 13 में चरण 2 का एक विस्तृत दृश्य। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें।

चित्रा S15: चित्र 13 से चरण 3 का एक विस्तृत दृश्य। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें।

चित्रा S16: चित्र 14 से चरण 5 में जनरेट किए गए डेटा फ़ाइलों का एक विस्तृत दृश्य. कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें।

चित्रा S17: चित्र 14 से चरण 5 में उत्पन्न एक भूखंड का एक विस्तृत दृश्य। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें।

चित्रा S18: एक गर्मी मानचित्र का एक विस्तृत दृश्य और चित्र 15 से चरण 4 में उत्पन्न रंग स्पेक्ट्रम की सीमा वाली फ़ाइल। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें।

तालिका S1: iTACS द्वारा परिमाणित चयनित गुणों की एक सूची. इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए कृपया यहाँ क्लिक करें.

Discussion

अनुयायी कोशिकाएं जीवित रहने, बढ़ने और कार्य करने के लिए यांत्रिक और रासायनिक संकेतों दोनों का उपयोग करती हैं। माइक्रोस्कोपी सॉफ़्टवेयर की एक विस्तृत विविधता प्रतिदीप्ति-आधारित इमेजिंग के माध्यम से रासायनिक संकेतों का आकलन करने में उपयोगकर्ता के अनुभव को अनुकूलित करती है। हालांकि, यांत्रिक संकेतों के मूल्यांकन में ऐसी क्षमताएं शामिल हैं जो मानक माइक्रोस्कोपी सॉफ़्टवेयर में उपलब्ध नहीं हैं। इसके अलावा, यांत्रिक संकेतों का मूल्यांकन सबसे कुशल होता है जब डेटा अधिग्रहण डेटा विश्लेषण के साथ एकीकृत होता है। एक एकीकृत मंच की कमी जो यांत्रिक संकेत मूल्यांकन की अद्वितीय जरूरतों को पूरा करती है, प्रयोगात्मक सेल जीव विज्ञान में एक प्रमुख तकनीकी अंतर रही है। सेलुलर सिग्नल (iTACS) का विश्लेषण करने के लिए एकीकृत टूलकिट इस अंतर को पूरा करने के लिए डिज़ाइन किया गया है। iTACS, AnViM और AcTrM के दो घटक, उपयोगकर्ताओं को चार व्यापक श्रेणियों के सेलुलर गुणों को मापने के लिए आवश्यक क्षमताओं से लैस करते हैं: बल, गति, आकृति विज्ञान, और प्रतिदीप्ति / चमक। इन श्रेणियों में, iTACS वर्तमान में व्यक्तिगत अनुयायी कोशिकाओं के 50 से अधिक अद्वितीय पहलुओं का खुलासा करने में सक्षम है। इन पहलुओं में प्रत्येक व्यापक श्रेणी के विशिष्ट गुण शामिल हैं, जिसमें उनके प्रतिनिधि मूल्य और सेल में परिवर्तनशीलता शामिल है (पूरक तालिका S1)। उदाहरण के लिए, बलों के भीतर, साइटोस्केलेटन में तन्यता बल हैं, इस तनाव की अनिसोट्रॉपी, अधिकतम तनाव का अभिविन्यास, और सेल-ईसीएम इंटरफ़ेस में कतरनी तनाव जो अनुयायी कोशिकाओं के व्यवहार पर गहरा प्रभाव डालता है1,3,6।

एक मोनोलेयर की व्यक्तिगत कोशिकाओं के यांत्रिक व्यवहार की जांच करने के लिए एक उपन्यास दृष्टिकोण
एक मोनोलेयर की अलग-अलग कोशिकाएं रासायनिक और यांत्रिक प्रकृति के संकेतों के आदान-प्रदान में लगी हुई हैं3। इन दो प्रकार के संकेतों को सेलुलर मोनोलेयर में एक अलग तरीके से प्रेषित किया जाता है23। हालांकि, यांत्रिक संकेत संचरण ज्ञान रासायनिक संकेत संचरण के पीछे है। यह ज्ञान अंतर सेलुलर यांत्रिक संकेतों का आकलन करने के लिए सरल और सहज ज्ञान युक्त दृष्टिकोण की निरंतर कमी के साथ मेल खाता है। यहां वर्णित उपन्यास डेटा मैपिंग दृष्टिकोण इस अंतर को भरने के लिए सुसज्जित है। इस तरह के मानचित्रण से पता चलता है कि एक सेल के पड़ोसी क्षेत्र में आंतरिक साइटोस्केलेटल तनाव का उतार-चढ़ाव विश्राम, द्रवीकरण और एंकरिंग संकेतों के रूप में कार्य करता है जो सेलुलर आकार, आकार और सेल 18 की गति में परिवर्तन को विनियमित करते हैं। पड़ोसी क्षेत्रों के गुणों के नक्शे "बहुकोशिकीय उपखंड" पैटर्न प्रदर्शित करते हैं जहां उपखंड के भीतर कोशिकाओं को अपेक्षाकृत समान माइक्रोएन्वायरमेंट के संपर्क में लाया जाता है और उपखंड की सीमा पर कोशिकाओं को उल्लेखनीय रूप से गैर-समान माइक्रोएन्वायरमेंट 18 के संपर्क में लाया जाता है।

बल मापन प्रौद्योगिकी की पहुंच
पीएए हाइड्रोजेल बनाने, हाइड्रोजेल विरूपण और सेलुलर गति का विश्लेषण करने और सेल-ईसीएम और सेल-सेल बलों को मापने के लिए विभिन्न प्रकार के प्रोटोकॉल मौजूद हैं1,2,7,8,9,13,14,15,18,20,21,24,25,26,27 ,28,29,30,31,32. हालांकि, ये विकास सामान्य सेल जीव विज्ञान प्रयोगशालाओं की पहुंच से बाहर हैं और इंजीनियरिंग विशेषज्ञता वाली प्रयोगशालाओं तक ही सीमित हैं। इन दृष्टिकोणों के तकनीकी पहलुओं को स्वचालित करके और उन्हें एक एकीकृत और उपयोगकर्ता के अनुकूल मंच के तहत एकीकृत करके, iTACS का लक्ष्य यांत्रिक संकेतों के मूल्यांकन को प्रयोगात्मक सेल जीव विज्ञान अनुसंधान और शिक्षा में एक नियमित गतिविधि बनाना है।

ImageJ उपयोगकर्ताओं को उन दृष्टिकोणों का उपयोग करके एप्लिकेशन विकसित करने की अनुमति देता है जिनके लिए बहुत कम या कोई प्रशिक्षण की आवश्यकता नहीं होगी11। iTACS काफी हद तक समुदाय संचालित निरंतर विकास की सुविधा के लिए सरल स्क्रिप्टिंग दृष्टिकोण का उपयोग करके बनाया गया है। AcTrM का एक बड़ा हिस्सा BeanShell स्क्रिप्ट का उपयोग करके प्रोग्राम किया गया है, और AnViM का थोक ImageJ मैक्रोज़ का उपयोग करके प्रोग्राम किया गया है। उपयोगकर्ता के माइक्रोस्कोप पर इन क्षमताओं को लागू करने के लिए ये स्क्रिप्ट और मार्गदर्शन गिटहब (https://github.com/IntegrativeMechanobiologyLaboratory/iTACS) के माध्यम से उपलब्ध हैं।

अधिग्रहीत छवियों का गुणवत्ता मानकीकरण
यद्यपि अनुयायी कोशिकाओं में भौतिक बलों को मापने के लिए लोचदार-सब्सट्रेट-आधारित तकनीकों को विकसित और विभिन्न प्रयोगशालाओं में लागू किया गया है, प्रोटोकॉल में अभी भी मानकीकरण का अभाव है। एक क्षेत्र जिसे मानकीकरण की सबसे अधिक आवश्यकता होती है, वह अधिग्रहित शीर्ष मोतियों की छवियों की गुणवत्ता है (पूरक चित्रा S1)। महत्वपूर्ण मुद्दे पूरे प्रयोग के दौरान ध्यान में बहाव से उत्पन्न होते हैं। हमारे उपन्यास संदर्भ-छवि-आधारित refocusing दृष्टिकोण इस तरह के एक उद्देश्य प्रक्रिया पर ध्यान केंद्रित करता है। AcTrM के बहुत पहले चरण में परिभाषित पैरामीटर आवश्यक उद्देश्य गुणवत्ता सीमाएं लागू करते हैं। अन्य मानकीकरण उपायों को AcTrM के भविष्य के संस्करणों में प्रोग्राम किया जा सकता है।

iTACS की व्यापक प्रयोज्यता
अनुयायी कोशिकाओं के कई पहलुओं को मापने के अलावा, iTACS संरचना विभिन्न प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल और आवश्यकताओं के लिए इसके उपयोग की सुविधा प्रदान करती है। AcTrM सॉफ़्टवेयर निर्देशित उपयोगकर्ता स्व-प्रशिक्षण की अनुमति देता है। उदाहरण के लिए, साइटोप्लाज्मिक कैल्शियम के उतार-चढ़ाव का एक साथ मूल्यांकन वर्तमान में हार्डवेयर को पुनर्स्थापित करने और पुन: केंद्रित करने की गति से सीमित है और एक समय में एक ही स्थान पर सबसे अच्छा किया जाता है। हालांकि, वर्तमान कार्यान्वयन लंबी अवधि की इमेजिंग, बाधित इमेजिंग के लिए अच्छी तरह से सुसज्जित है, जहां नमूना को प्रयोग की पूरी अवधि के लिए माइक्रोस्कोप चरण पर बनाए नहीं रखा जा सकता है। चूंकि प्रयोग की शुरुआत में संदर्भ छवियों का अधिग्रहण किया जाता है, इसलिए आईटीएसीएस यांत्रिक संकेतों के वास्तविक समय की इमेजिंग को सक्षम बनाता है, जिससे दवा-स्क्रीनिंग अनुप्रयोगों में नए रास्ते खुलते हैं। AnViM उपयोगकर्ताओं को आम आदमी की शर्तों में अत्यधिक तकनीकी जानकारी प्रदान करने की अनुमति देता है। सेलुलर गुणों के एक व्यापक स्पेक्ट्रम को मापने और पूरे प्रयोग में उन्हें ट्रैक करने की क्षमता नए अंतरकोशिकीय संचार तंत्र की खोज के लिए आवश्यक महत्वपूर्ण क्षमताओं का गठन करती है।

आईटीएसीएस के भविष्य के विकास के लिए, हमने चार फोकस क्षेत्रों की पहचान की है: (1) डेटा अधिग्रहण और डेटा विश्लेषण की गति में वृद्धि, (2) नए सेलुलर संकेतों का आकलन करने के लिए दृष्टिकोण का कार्यान्वयन 13, (3) आईटीएसीएस-आधारित सेलुलर सिग्नल मूल्यांकन पर कार्यशालाओं और शिक्षा मॉड्यूल का विकास, (4) कम लागत वाले स्वचालन समाधानों का विकास।

Disclosures

लेखकों ने हितों के टकराव की घोषणा नहीं की है।

Acknowledgments

D.T.T. प्रयोगात्मक सेल जीव विज्ञान अनुसंधान की जरूरतों पर चर्चा उत्तेजक के लिए दक्षिण अलबामा विश्वविद्यालय में फेफड़ों के जीव विज्ञान के लिए केंद्र के साथ संबद्ध कर्मचारियों को धन्यवाद. ये चर्चाएं आईटीएसीएस के विकास की शुरुआत करने में महत्वपूर्ण थीं।

इस काम को राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान / नेशनल हार्ट लंग ब्लड इंस्टीट्यूट, P01 HL66299 और R37 HL60024 (स्टीवंस), R01-HL118334 (अल्वारेज़), F32-HL144040-01 (Xu), और दक्षिण अलबामा विश्वविद्यालय से अब्राहम मिशेल कैंसर रिसर्च फंड (सिंह, पलंकी, ताम्बे), अनुसंधान और विद्वानों के विकास अनुदान (ताम्बे), अनुसंधान और विद्वानों के विकास के लिए स्नातक के माध्यम से अनुदान द्वारा भाग में समर्थित किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagents and components used in prepare glass surface for hydrogel coating
(3-Aminopropyl)trimethoxysilane, 97% Aldrich chemistry 13822565
2% Bis Solution Bio-rad 1610142
3-(Trimethoxysilyl)propyl methacrylate,98% Acros organics 2530850
40% Acrylamide Solution Bio-rad 1610140
Glass bottom 35 mm dish/ 6 or 12 or 24 well plates MatTek or CellVis
Glutaraldehyde, EM Grade, 25% Polysciences 1909100
Sodium Hydroxide Sigma-aldrich 1002074706
Reagents and components used in preparing suitable hydrogel
2% Bis Solution Bio-rad 1610142
40% Acrylamide Solution Bio-rad 1610140
Ammonium Persulfate Bio-rad 1610700
Cover Slips Electron Microscopy Sciences 7222301
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (1M) Gibco 14190136
FluoSpheres carboxylate 0.2 um, yellow-green(505/515) Invitrogen F8811
FluoSpheres carboxylate 0.5 um, red(580/605) Invitrogen F8812
FluoSpheres carboxylate 2.0 um, red(580/605) Invitrogen F8826
Rain-X
TEMED Bio-rad 1610801
Reagents used in coating extracellular matrix on the hydrogel
Collagen Type I Rat Tail Corning 354236
HEPES(1M) Gibco 15630080
Phosphate Buffered Saline (1M) Gibco 10010023
Sulfo-SANPAH CovaChem 102568434
Microscope hardware used in the current study
Camera Hamamatsu Flash 4.0 LT sCMOS Camera C11440-42U
H117 ProScanTM Stages Prior Scientific
Light source- Lambda DG4 and Lambda DG5 Sutter instrument company
Microscope Nikon eclipse TE2000-S 550372
ProScan III Universal Microscope Automation Controller Prior Scientific
Stagetop incubator ibidi 11922
Stepper Motor Focus Drive Prior Scientific

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References

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जीव विज्ञान अंक 181
सेलुलर संकेतों का विश्लेषण करने के लिए एकीकृत टूलकिट: बल, गति, आकृति विज्ञान, और प्रतिदीप्ति
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Nguyen, A., Battle, K., Paudel, S.… More

Nguyen, A., Battle, K., Paudel, S. S., Xu, N., Bell, J., Ayers, L., Chapman, C., Singh, A. P., Palanki, S., Rich, T., Alvarez, D. F., Stevens, T., Tambe, D. T. Integrative Toolkit to Analyze Cellular Signals: Forces, Motion, Morphology, and Fluorescence. J. Vis. Exp. (181), e63095, doi:10.3791/63095 (2022).

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