Summary
iTACS(셀룰러 신호)를 분석하는 통합 툴킷은 부착 셀에서 다양한 화학 및 기계적 신호를 동시에 측정하는 과정을 자동화합니다. iTACS는 지역 사회 기반의 개발을 용이하게하고 연구원이 교육 배경에 관계없이 모든 플랫폼 기능을 사용할 수 있도록 설계되었습니다.
Abstract
세포력과 운동의 정량적 평가는 지난 4년간 상당히 발전했습니다. 이러한 발전은 세포 배양 시스템에서 통찰력있는 기계적 신호 공정을 검사하는 프레임 워크를 제공했습니다. 그러나, 필드는 현재 세 가지 문제에 직면: 획득 된 데이터의 품질 표준화의 부족, 데이터 분석 및 시각화에 기술적 오류, 그리고 아마도 가장 중요한 것은, 기술은 일반적인 세포 생물학 실험실에 대한 손이 닿지 않는 남아있다. 이러한 한계를 극복하기 위해 셀룰러 신호(iTACS)를 분석하기 위한 통합 툴킷이라는 새로운 실험 플랫폼을 개발했습니다. iTACS는 인수 및 교육 모듈(AcTrM) 및 분석 및 시각화 모듈(AnViM)의 두 가지 구성 요소로 구성됩니다. AcTrM은 NIH-ImageJ 기반 현미경 제어 소프트웨어인 μManager를 기반으로 하며 일반적인 이미지 수집 프로토콜의 사용자 자체 교육 및 자동화를 용이하게 합니다. AnViM은 NIH-ImageJ를 기반으로 하며 데이터 분석의 사용자 친화적인 자동화와 결과의 통찰력 있는 시각화를 용이하게 합니다. 이 실험은 하이드로겔에 부착된 세포, 하이드로겔에 내장된 선적 선량마커를 배양하고, 마지막으로 이러한 이미지에서 세포의 포괄적인 기계적 특성화를 추출하는 것을 포함한다. 현재 iTACS를 통해 사용자는 형태학, 운동, 사이토셀레탈 력 및 개별 세포 및 이웃 영역의 형광을 포함한 다양한 특성을 분석하고 추적할 수 있습니다. 품질 표준화 문제는 AcTrM에서 참조 이미지 유도 재초점 기술인 참조 이미지 유도 로 해결되었습니다. 데이터 분석의 기술적 문제는 다각적인 이미지 세분화 절차, 경계 조건을 식별하는 사용자 친화적 인 접근 방식 및 새로운 셀룰러 속성 기반 데이터 시각화를 통해 AnViM에서 해결되었습니다. AcTrM은 기본 형광 현미경을 실험 세포 역학 장비로 간단하게 변환할 수 있도록 설계되었으며, AnViM은 사용자가 엔지니어링 배경없이 셀룰러 기계 신호를 측정할 수 있도록 장착되어 있습니다. iTACS는 지역 사회 기반 의 개발 기능을 갖춘 오픈 소스 스위트 룸으로 연구 커뮤니티에 사용할 수 있습니다.
Introduction
일반적으로 사용되는 광학 이미징 및 데이터 분석 도구는 거의 구식인 하드웨어 및 소프트웨어 기술을 사용합니다. 전자 기기의 발전, 전산 접근법 및 일반적인 실험 세포 생물학 도구로의 수학적 분석의 번역 및 구현지연은 세포 생리학에 대한 지식의 성장 속도에 대한 주요 제약조건입니다. 현재, 세포 생물학 연구원은 손이 닿지 않는 곳에 있는 분자 생물학 공구를 찾아내지만, 기술 원리에 근거를 둔 공구는 손이 닿지 않는 곳에 있습니다. 이러한 엔지니어링 원리 기반 도구 중 하나는 단층 응력 현미경 검사법(MSM)1,2입니다. MSM은 전 세계 다양한 실험실에서 적응하고 연구되었지만, 그 사용은 주로 엔지니어링 전문 지식이있는 실험실에 국한되어 있습니다3,4,5,6,7,8,9.
NIH-ImageJ는 세포 생물학 연구자들 사이에서 가장 인기있는 오픈 소스 도구 중 하나입니다10. 사용자 커뮤니티 기여 중심의 발전은 인기의 중심이었습니다11,12. ImageJ에는 사용자가 고급 프로그래밍 언어와 간소화된 스크립팅 접근 방식을 혼합하여 응용 프로그램을 개발할 수 있는 기능이 있습니다. 이러한 기능을 통해 기본적인 프로그래밍 지식을 가진 사용자가 소프트웨어에 대한 새로운 기여를 구현, 조정 및 발전시킬 수 있습니다. NIH-ImageJ의 이러한 품질을 기반으로 당사는 셀룰러 신호(iTACS)를 분석하기 위한 통합 툴킷을 개발하여 원하는 하드웨어 및 소프트웨어 도구를 저비용 통합하여 부착 셀 11,12에서 다양한 화학 및 기계적 신호의 측정을 자동화할 수 있도록 합니다.
iTACS는 인수 및 교육 모듈(AcTrM) 및 분석 및 시각화 모듈(AnViM)의 두 가지 구성 요소로 구성됩니다. AcTrM은 NIH-ImageJ 기반 이미지 수집 응용 프로그램인 μManager를 기반으로 제작되어 사용자가 기존 광학 특성의 시간 경과 측정과 여러 샘플12에서 부착 셀의 다양한 물리적 특성을 설정할 수 있도록 합니다. AcTrM은 그래픽 인터페이스에 포함된 간결한 방향을 통해 사용자 교육을 용이하게 합니다. 또한, 물리적 힘의 실시간 측정을 용이하게 하고 획득된 데이터의 품질 표준화를 가능하게 하도록 설계된 레퍼런스 이미지 기반 자동 초점 의 새로운 기능을 가지고 있습니다.
AnViM은 ImageJ 플러그인, 신속한 소프트웨어 및 파일 처리 스크립트를 기반으로 하여 셀룰러 모양, 크기, 방향, 속도 및 모션 방향, 세포 외 매트릭스(ECM)에 가해지는 트랙션, 그리고 이웃 세포, 수축 및 주변 셀 과 이웃 영역의 전단 모멘트 등 50개 이상의 특성을 정량적으로 평가할 수 있습니다. AnViM은 사용자가 기본 기술 배경을 마스터하지 않고 셀룰러 물리적 특성을 정량화할 수 있도록 합니다11. 또한 대화형 또는 배치 처리 모드에서 데이터 분석을 수행할 수 있습니다. 개별 셀의 특성의 시간적 변화를 보여주는 공간 변화와 그래프를 보여주는 열 맵을 생성합니다.
일반적인 실험에서, 사용자는 상단 표면에 적절한 세포외 매트릭스 단백질과 두 가지 유형의 임베디드 형광 마커를 가진 탄성 하이드로겔에 세포를 배양한다. 본질적으로, 세포를 배양하기 전과 후에 이 형광 마커의 심상은 개별 세포 2,13의 내과 주위에 힘을 정량화하기에 충분합니다. AnViM은 이러한 결과를 부착 클러스터의 개별 셀에 매핑하고 통찰력 있는 이미지와 그래프를 생성합니다.
Protocol
참고: iTACS 플랫폼을 사용하여 검사된 샘플은 연약한 기판에 부착된 세포입니다. 기계 및 화학 신호를 평가하기 위한 프로토콜은 인수 및 교육 모듈(AcTrM) 및 분석 및 시각화 모듈(AnViM)의 두 가지 순차적인 부분으로 나뉩니다.
1. 인수 및 교육 모듈 (AcTrM)
참고: AcTrM은 데이터 수집 및 사용자 셀프 교육 프로세스를 자동화합니다. 데이터 수집 전에 세포가 가하는 힘을 정량화하는 데 필요한 정보를 제공할 수 있는 소프트 기판을 준비합니다.
- 하이드로겔 제제
참고: 여기서 목표는 1,250개의 파 전단 변조기, 약 100μm 두께 및 22mm 직경 폴리아크릴아미드(PAA) 하이드로겔을 준비하는 것입니다.- Yeung et al.의 방법을 따라 폴리아크릴아미드 용액을 준비하고 Trepat et al.14,15에 의해 설명된 단계에 따라 하이드로겔을 캐스팅한다. 절차의 한 가지 예외는 세포 바로 아래에 내장 된 구슬직경이 0.5 μm이고 노란색 형광을 방출한다는 것입니다.
- 관측 영역이 큰 세포 없는 영역이 예상되는 경우 2 μm 구슬을 커버글래스에 부착하는 단계를 건너뜁니다.
참고: 하이드로겔 준비 프로토콜은 이제 필드에 공정하게 확립되었습니다16. 후속 설명 전반에 걸쳐 0.5 μm 구슬을 '상단 구슬'이라고 하며 2μm 구슬을 '바닥 구슬'이라고 합니다. 그러나 아래쪽 구슬에는 이미지 된 영역에 셀 프리 영역이 큰 선택 사항입니다. 이러한 세포없는 영역에서 상단 비드 패턴은 바닥 비드 패턴의 목적을 제공합니다. - 현미경 단계에 임베디드 형광 구슬이 있는 하이드로겔을 장착합니다.
- 플레이트의 온도가 정상 상태를 달성하는 데 15-20분 허용합니다.
참고: 플레이트의 상단 표면은 세포외 매트릭스 단백질로 기능화되지만 세포는 하이드로겔에 아직 시드되지 않습니다.
- 참조 이미지 수집
- Part 1: 위치 목록 만들기
참고: 이 단계에서 수동 입력에는 AcTrM 프롬프트가 가장 적합한 비드 분포가 있는 위치를 선택하는 것이 포함됩니다. 이 단계에서는 이전에 만든 파일이 사용되지 않습니다. 이 단계에서 생성된 주요 새 폴더에는 't0imgs', 'tnimgs' 및 '텍스트 파일' 폴더가 있으며 생성된 파일에는 위치 목록 파일이 포함됩니다. AcTrM을 사용하여 위치 목록 생성을 안내하는 다음 단계에 대한 시각적 설명은 그림 2 를 참조하십시오. 시연된 예제에서는 20배 배율로 데이터를 수집합니다.- 시작 μManager 2.0 - 베타.
- IMBL 리소스 창에서 AcTrM.bsh 버튼을 클릭하여 AcTrM을 실행합니다.
- 획득 속성 정의라는 창에서 측면 위치(즉, XY) 복구의 정확도, 거칠고 세련된 재초점(즉, z) 작업의 단계 크기 및 초점 복구를 위한 허용 가능한 이미지 상관 관계 계수의 값에 대한 적절한 목표, 허용 오차를 선택합니다.
참고: 측면 위치 복구에 대한 미세한 허용 오차는 위치 복구속도가 느려지지만, 실질적인 허용 오차는 데이터 분석 중에 위치 보정이 필요하며 초점 복구에 어려움을 초래할 수 있습니다. 스텝 크기가 작으면 재초점 작업이 느려지지만 매우 높은 스텝 크기로 인해 포커스를 놓칠 수 있는 빠른 움직임이 발생할 수 있습니다. - AcTrM - 0 단계 창에서 새로 수집을 선택하여 위치 목록을 만듭니다.
참고: AcTrM이라는 제목의 창 - 1단계 에는 다음 단계의 모든 키가 나열됩니다. 이러한 단계에는 스테이지 이동, 포커스 조정, μManager의 단추 클릭 등이 포함됩니다. 이러한 단계는 데이터 수집에 적합한 위치 목록을 구성하는 데 있습니다. - 마이크로매니저 라이브를 클릭하여 AcTrM - 1단계 창에 나열된 수동 조정시 샘플을 시각화합니다.
- 이 창에 나열된 단계를 따릅니다.
- 이제 구슬의 이미지를 획득합니다. 상단 구슬에 적합한 채널을 선택합니다.
- 바닥 구슬도 보세요. 이렇게 하려면 아래쪽 구슬의 채널을 선택합니다. 아래 구슬의 흐릿한 이미지가 보입니다.
참고: 채널은 주 μManager 창의 사전 설정된 드롭다운 메뉴에서 전환할 수 있습니다. 실험에서 아래쪽 구슬을 사용하는 경우 선택한 위치에 있는지 확인합니다. 이러한 구슬은 흐릿하게 나타납니다. - 적절한 위치를 선택하면 스테이지 위치 목록 창에서 표시를 클릭하여 위치를 저장합니다.
참고: 최상의 위치는 상단 표면(즉, 위쪽 구슬) 바로 아래에 내장된 상단 구슬의 조밀하고 균일한 분포와 커버 글래스(즉, 하단 구슬)에 부착된 적어도 두 개의 구슬(예: 하단 구슬)에 부착된 두 개의 구슬에 의해 정의됩니다(보조 도면 S1). 아래 쪽 구슬이 크고 초점이 없는 링으로 나타나면 포커스 복구속도가 빠릅니다. 그러나 포커스 또는 측면 위치 복구가 필요 없는 한 위치에서 실험이 수행되는 경우 아래쪽 구슬 이미지와 관련된 지침을 무시합니다. - 그림 2에 설명된 6-9 단계를 수행하여 목록에 추가 위치를 포함합니다.
참고: 제거 라운드가 플레이트에서 선택한 최상의 포지션을 허용할 수 있도록 몇 가지 추가 위치를 선택합니다.
- 2부: 참조 이미지 수집
참고: 이 단계에서는 수동 입력이 포함되지 않습니다. 이 단계에서 이전에 만든 키 파일은 '텍스트 파일/*.pos'를 포함합니다. 이 단계에서 생성된 주요 새 파일 및 폴더에는 't0imgs' 및 'tnimgs' 폴더 내의 파일이 포함됩니다. AcTrM을 사용하여 참조 이미지의 수집을 안내하는 다음 단계에 대한 시각적 설명은 그림 3 및 보충 도 S2 를 참조하십시오. AcTrM - 2단계 창에는 모든 주요 단계도 나열되어 있습니다.- AcTrM - 2단계 창에 나열된 단계에 따라 다차원 획득 창에서 선택합니다. 예를 들어, 장시간 경과를 수행하려면 촬영할 여러 이미지를 나타내고, 첫 번째 채널을 위상 채널로 선택한 다음, 위쪽 구슬에 대한 다음 을 선택한 다음 아래쪽 구슬에 대해 다음 을 선택합니다. 다차원 획득 창에서 닫을 클릭한 다음 ActrM - 2단계 창에서 확인을 클릭합니다.
- AcTrM에서 - 3단계 창에서 참조 이미지 기반 XYZ 위치 복구를 참여하도록 선택합니다. 선택은 일반적으로 예입니다. 그러나 포커스 나 스테이지 드리프트의 공간이없는 한 위치에서 이미지를 획득하는 경우 AcTrM - 3 단계 창의 선택은 아니오가 됩니다.
- AcTrM - XYZ 복구 옵션 창에서, 정제 된 XYZ 복구, 지역 및 정교한 XYZ 복구및 재초점을 시작하는 방향 (보충 그림 S4)에 대한 세련된 XYZ 복구, 지역 및 채널을 수행 할지 여부를, 거친 XYZ 복구를위한 채널을 설정합니다. 완료되면 AcTrM은 참조 이미지를 수집합니다.
참고: 채널의 일반적인 선택은 하단 비즈 채널입니다. XYZ 복구는 현재 구현에서 전체 이미지로 수행될 때 가장 효과적입니다. 참조 이미지는 전형적으로 하이드로겔의 전송된 빛 이미지, 상단 구슬의 형광 화상 및 아래쪽 구슬의 형광 영상을 포함한다. 각 이미지 집합의 콘텐츠는 다차원 수집 창에서 선택한 내용에 따라 다를 수 있습니다. 그러나 소프트웨어는 그림 2에서 결정된 각 위치에서 설정된 참조 이미지를 획득합니다. 이 단계의 끝에서는 선택한 디렉터리에서 't0imgs', 'tnimgs', '텍스트 파일'의 세 폴더가 만들어집니다. 't0imgs' 폴더에는 μManager에서 인식하고 후속 단계에서 사용되는 형식의 참조 이미지가 포함되어 있습니다. 'tnimgs' 폴더에는 파일 이름 'c0_p0_t0.tif', 'c1_p0_t0.tif' 등이 있는 별도의 TIFF 이미지가 포함되어 있습니다. 여기서 'c'는 채널을 의미하며, 'p'는 포지션을 의미하며, 't'는 당분간 을 의미합니다. 다음 문자는 채널 번호, 위치 번호 및 프레임 번호입니다. 폴더 'textfiles'에는 XML 형식의 위치 목록과 이미지 수집 및 위치 복구를 위한 사용자 선택 사항이 포함되어 있습니다.
- Part 1: 위치 목록 만들기
- 세포 종자 및 성장
참고: iTACS 플랫폼은 스파스 셀, 완전히 컨런트 모노레이어, 네트워크 형성 분석 및 구멍 또는 상당한 간격이 있는 단층층을 포함하여 부착 된 세포의 기계적 거동에 대한 일반적인 시험관 내 평가에 사용되는 샘플 준비 프로토콜을 수용 할 수있는 유연성을 가지고 있습니다.- 배양 쥐 폐 미세 혈관 내피 세포플라스크17,18에 합류한다.
- 트립신을 사용하여 세포를 분리합니다. 10% 태아소 혈청을 함유하는 배양 배지에서 세포를 농도 1 x 106 세포/mL로 재연한다.
- 부분적으로 건조한 하이드로겔 표면에 리액트 된 세포의 5 μL 액적을 놓고 세포 배양 인큐베이터에 놓습니다.
참고: 10% 태아소 혈청을 함유하는 배양 배지에서 2일 후, 그 방울의 세포는 혼잡한 세포 섬을 형성한다1.
- 남은 실험을 위한 자동화된 이미지 수집
참고: 이 단계에 대한 수동 입력에는 AcTrM 프롬프트가 이미지 수집을 재개하도록 요청하는 다음이 포함됩니다. 이 단계에서 이전에 만든 키 파일에는 'textfiles/*.pos'와 폴더 't0imgs'의 하단 비드 이미지 파일이 포함됩니다. 이 단계에서 생성된 주요 새 파일은 업데이트된 위치 목록 파일과 이미지 'tnimgs/*_t*.tif'입니다.- 현미경 환경 제어 시스템이 안정적인 조직 배양 조건에 도달하도록 하십시오.
- 배양된 세포를 함유한 플레이트를 현미경 단계에 부드럽게 장착합니다.
- 온도와 습도가 안정될 수 있도록 15-20분 허용합니다.
참고: AcTrM을 사용하여 나머지 실험에 대한 이미지 수집을 안내하는 다음 단계에 대한 시각적 설명은 그림 4 를 참조하십시오. - 시작 μManager 2.0 - 베타.
- IMBL 리소스 창에서 AcTrM.bsh 버튼을 클릭하여 AcTrM을 실행합니다.
참고: 획득 속성 정의 창에서 선택한 항목은 무시하지만 이전 단계에서 선택한 사항을 사용합니다. - AcTrM - 단계 0 창에서 일시 중지 된 수집을 계속 선택합니다.
- 데이터 폴더('t0imags', 'tnimgs', 'textfiles')가 저장된 이전 단계에서 다차원 수집 창에서 식별된 배율 및 디렉토리를 선택합니다.
참고: 창제목은 사용자가 적절한 디렉터리를 선택하도록 안내합니다. - 플레이트 창 재배치 에서 플레이트(3개의 비콜리니선형 위치)를 재배치하는 데 사용되는 채널과 함께 선택합니다.
참고: 저장된 이미지가 카메라에 표시됩니다. 겹치는 이미지가 빨간색, 녹색 및 검은색 이미지로 표시되면 수동 조정을 수행합니다. - 수락을 클릭하여 인수를 진행합니다.
참고: 이 단계는 플레이트가 현미경 단계에서 다시 장착될 때 플레이트 정렬의 돌이킬 수 없는 에서 약간의 변화를 극복합니다. AcTrM프롬을 따라 빨간색으로 표시된 참조 이미지의 합성 이미지와 현재 녹색으로 표시된 목표를 통해 관찰되는 이미지의 합성 이미지를 보여 줌으로써 세 위치 각각의 정렬을 신속히 수행합니다. 녹색을 빨간색에 충분히 가깝게 두면 소프트웨어에 대한 작업이 줄어듭니다. 겹침이 완벽하면 합성 이미지가 노란색과 검은색으로 나타납니다. 충분히 닫히는 것은 일반적으로 동일한 하단 구슬이 빨간색과 녹색 이미지 모두에서 볼 수 있고 해당 빨간색및 녹색 초점이 닿는 링이 서로 닿는 경우입니다. 플레이트 재배치가 완료되면 AcTrM은 스테이지를 선택한 각 위치로 이동하여 참조 이미지를 카메라를 통해 현재 보이는 이미지와 일치하여 XYZ 위치를 복구합니다. 첫 번째 측면(XY) 위치가 일치한 다음 포커스(Z)가 일치합니다. 거친 회복은 위치와 초점의 정제 된 회복에 선행됩니다. 실험의 현재 상태 업데이트는 보충 도서 S3에 표시된 4부 창을 통해 화면에 표시됩니다. 획득한 이미지는 '*_t1.tif', '*_t2.tif'에 이어 'tnimgs' 폴더에 저장되어 이미지 세트의 시간 수를 나타냅니다. XYZ 복구가 업데이트된 위치를 식별하는 경우 새 위치 목록이 생성되어 '텍스트 파일' 폴더에 저장됩니다.
2. 분석 및 시각화 모듈(AnViM)
- 자동화된 데이터 분석 설정
참고: 이 단계에서 수동 입력에는 'tnimgs' 폴더의 위치를 식별하는 것이 포함됩니다. 이 단계에서 이전에 만든 키 파일은 'tnimgs/*.tif'입니다. 이 단계에서 생성된 주요 새 파일 및 폴더에는 'tnimgs'와 동일한 부모 폴더의 '분석' 폴더와 각 위치 '분석/p*'에 대한 폴더가 포함됩니다. 각 '분석/p*'에서 이 단계는 'phs' 및 'tny' 폴더 내에 새로운 '*.tif' 이미지 파일을 만듭니다. 이러한 이미지는 셀과 상단 구슬의 자른 및 표류 이미지를 해제합니다. 생성된 다른 파일에는 분석 선택 항목이 나열된 '분석/분석.txt', '분석/p*/skipAnalysis.txt', 분석이 현저한 기존 드리프트로 인해 건너뛰는 인스턴스를 나열하는 '분석/p*/part_shift_values_pixel_degree.dat', 예상 드리프트 값을 나열하는 '분석/p*/part_shift_values_pixel_degree.dat'이 있습니다. AnViM은 'tnimgs' 폴더의 원시 데이터를 변경하지 않습니다. AnViM을 사용하여 자동화된 데이터 분석 설정을 안내하는 다음 단계에 대한 시각적 설명은 그림 5 를 참조하십시오.- 사전 처리 - 피지 소프트웨어를 시작하고 MSM으로 레이블이 MSM 드롭 다운 메뉴에서 첫 번째 옵션을 선택합니다.
- 파일 브라우저 대화 상자를 사용하여 분석된 데이터가 포함된 'tnimgs' 폴더가 포함된 폴더를 선택합니다.
- 이미지의 채널을 정의합니다. 보충 도 S5의 지침에 따라 셀의 전송된 광 이미지(세포의 위상 대비 이미지), 하단 구슬 이미지 및 위쪽 구슬 이미지를 식별합니다. 다음 세 개의 확인란('위치 폴더로 파일 이동', '강체 모션에 대한 추가 수정', '데이터 자르기 및 위치 폴더 저장')는 일반적으로 검사됩니다. 마지막으로 셀이 교차하는 이미지의 심하게 표류된 데이터, 픽셀 크기 및 측면을 거부하는 허용 오차를 정의합니다.
- 비드가 눈에 띄게 표시되도록 하단 비드 이미지의 밝기와 대비를 향상시키기위한 프롬프트에 응답합니다. 메뉴의 슬라이더 막대를 사용하여 조정하고 확인을 클릭 합니다.
- 이제 시프트를 제거하기 위해 위치 수정을 수행합니다. 완료되면 분석 폴더가 만들어집니다.
참고: 콘트라스트 향상은 일반적으로 필요하지 않지만 레이저에 노출을 최소화해야 하는 실험에서는 이 조항을 사용할 수 있습니다. 그 선택 후, AnViM은 'tnimgs' 폴더에서 파일을 '분석' 폴더에 복사합니다. 각 위치에 해당하는 파일은 폴더 '분석/p0, 분석/p1' 등에 저장됩니다. 이러한 각 위치 폴더 내에서 AnViM은 원래 전송된 라이트 이미지, 상단 구슬 이미지 및 하단 구슬 이미지를 포함하는 'cels', 'defs' 및 'refs' 폴더를 각각 만듭니다(보충 그림 S6). 그런 다음 AnViM은 아래쪽 구슬의 이미지에서 경질 된 움직임을 분석하고 세포의 수정 된 전송 된 빛 이미지와 업데이트 된 상단 구슬 이미지를 포함하는 'tny'폴더를 포함하는 'phs'폴더를 만듭니다. 마지막으로 채널, 작업, 허용 오차, 픽셀 크기 및 경계 교차의 사용자 선택은 'analysisChoices.txt' 파일(보충 그림 S6)에 저장됩니다.
- 하이드로겔 및 단층의 변형 을 정량화
참고: 이미지 시퀀스에서 이동을 정량화하는 것은 빠르게 진화하는 필드19입니다. 이 기술은 속도, 정확도, 원시 이미지 내의 특정 기능 및 특정 변형 패턴을 포함한 기능에 지속적으로 최적화되어 있습니다. 따라서 일부 사용자는 여기에 제시 된 것과 다른 변형 정량화 접근 방식을 사용할 수 있습니다.-
1부: 하이드로겔 변형의 정량화
참고: 이 단계에서 수동 입력에는 데이터 디렉터리 식별 및 그리드 해상도 선택이 포함됩니다. 이 단계에서 이전에 만든 키에는 'p*/tny/*.tif'이 있습니다. 이 파일에서 생성된 주요 새 파일은 하이드로겔의 위쪽 표면의 변위 벡터를 나열하는 'p*/변위/*_disp.dat'입니다. 상단 비즈 이미지20의 파티클 이미지 속도 분석AnViM을 통해 참여해야 할 다음 단계에 대한 시각적 설명은 그림 6을 참조하십시오.- 피지 소프트웨어를 시작하고 MSM 드롭 다운 메뉴에서 MSM을 선택 - 젤 변형.
- 여기에서 실험에 적합한 옵션을 선택합니다.
- 파일 브라우저 대화 상자를 사용하여 분석된 데이터가 포함된 '분석' 폴더의 상위 디렉터디를 선택합니다.
- 젤 변형 제거 창 계산을 위한 매개 변수에서 적절한 상관 관계 윈도우 크기, 노이즈 수준 및 임계값(보충 도서 S7)20을 선택합니다.
참고: 결과는 각 위치 폴더 '분석/p0, 분석/p1' 등에서 새로 생성된 '변위' 디렉토리에 저장됩니다. 여기서 모든 출력 파일이 저장됩니다.
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2부: 단층 변형 의 정량화
참고: 이 단계에서 수동 입력에는 데이터 디렉터리 식별 및 그리드 해상도 선택이 포함됩니다. 이 단계에서 이전에 만든 키에는 'p*/tny/*.tif'이 있습니다. 이 파일에서 생성된 주요 새 파일은 셀의 모션 벡터를 나열하는 'p*/속도/*_vel.dat'입니다. 상단 비즈 이미지20의 파티클 이미지 속도 분석AnViM을 통해 참여 단계에 대한 시각적 설명은 그림 7을 참조하십시오. 절차는 하이드로겔 변형을 정량화하기 위해 다음 것과 유사하며 MSM - MSM 드롭다운 메뉴에서 셀룰러 모션을 선택합니다. 결과는 각 위치 폴더 '분석/p0', '분석/p1' 등에서 새로 생성된 '속도' 디렉터리에 저장됩니다.
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1부: 하이드로겔 변형의 정량화
- 세포-ECM 및 세포 력의 정량화
참고: 이 단계에서 수동 입력에는 데이터 디렉터리 식별, 하이드로겔 강성을 나타내는 것, 셀룰러 클러스터 세분화 프롬프트에 응답하여 셀 이외 영역에서 세포를 감지하는 것이 포함됩니다. 이 단계에서 이전에 만든 키에는 'p*/변위/**_disp.dat'이 포함됩니다. 이 단계에서 생성된 주요 새 파일은 하이드로겔의 세포에 의해 가해지는 힘을 나열하는 'p*/traction/*_trac.dat'입니다. 셀을 포함하는 그리드 점의 위치를 나열하는 'p*/견인/*_domain.dat'; 그리고 입력 파일 'p */traction.in, p*/clusterInput.txt' 및 'p*/prestress.in'이 단계에 대한 사용자 선택을 기록합니다. 세포-ECM 및 세포 세포 력의 첫 번째 정량적 평가에 따라, 기술에 대한 몇 가지 변이가 개발되었다1,15. 변이는 기판, 세포, 실험 조건 또는 수치 도구7,8,21,22의 특정 케이스에 초점을 맞춥니다. 하이드로 겔 변형 데이터1,2,15에 대한 AnViM, Fourier 변환 트랙션 현미경 검사법 및 단층 응력 현미경 분석을 통해 참여하는 시각적 설명은 그림 8을 참조하십시오.- 피지 소프트웨어를 시작하고 MSM 드롭다운 메뉴에서 MSM - 셀-ECM 및 셀 셀 힘 (드롭다운 메뉴의 세 번째 옵션)을 선택합니다.
- 파일 브라우저 대화 상자를 사용하여 분석된 데이터를 포함하는 폴더 'tnimgs' 및 '분석'이 포함된 '분석' 폴더의 상위 디렉터디를 선택합니다. 선택하려면 클릭합니다.
- 셀룰러 힘 창 계산을 위한 매개 변수에서 전단 계열, 하이드로겔의 두께 및 예상 된 노이즈 레벨을 입력합니다. 확인을 선택합니다. 이를 통해 MATLAB 기능을 통해 견인력을 실행할 수 있습니다.
참고: 이러한 입력에 따라 AnViM은 셀-ECM 힘을 계산합니다. - 그 후 단층이 컨실릭되어 있는지 여부를 나타냅니다. 전체 셀 이미지가 셀로 덮여 있는 경우 대답은 예입니다. 이 경우 셀 셀 힘은 전체 프레임에 걸쳐 계산됩니다. 반면에 이미지의 일부에 셀이 없는 경우 대답은 아니요입니다. 이 경우 AnViM 프롬프트를 따라 셀이 포함된 이미지 영역의 세분화를 용이하게 합니다.
- 대답이 '아니오'인 경우 소프트웨어가 프롬프트할 때 비셀 개체 주위에 다각형을 수동으로 그린 다음 세분화에 적합한 메서드(들)를 선택합니다. 소프트웨어는 세포의 색상 (검은 색 또는 흰색)을 요청합니다.
- 소프트웨어에서 자동으로 채우기 스팟 옵션을 확인하고 확인을 클릭 합니다.
참고: 컨할 수 없는 단층의 분할 단계는 '섹션 2.4'의 첫 번째 부분에서 다룹니다. Cell-ECM 힘은 각 위치 폴더 내에서 새로 생성된 디렉터리 '견인'에 '*_trac.dat' 파일에 저장되며 셀-ECM 힘 계산 소프트웨어에 대한 입력은 파일 'traction.in'(보충 도면 S8)에 저장됩니다. 셀 셀 힘은 각 위치 폴더 내에서 새로 생성된 디렉터리 'prestress'에 '*_prestress.dat' 파일에 저장되며 셀 셀-셀 힘 계산 소프트웨어에 대한 입력은 파일 'prestress.in'(보충 도면 S9)에 저장됩니다.
- 개별 셀에 대한 그리드 포인트 값 매핑
참고: iTACS의 현재 초점 중 하나는 현장에서 측정된 기계적 신호를 해석하는 간단한 접근 방식을 도입하는 것입니다. 이 접근 방식은 클러스터의 인접 한 셀 간의 기계적 상호 작용을 검사하는 데 유용합니다.18. 전반적으로 지금까지 정량화된 속성은 셀룰러 클러스터 전체에서 정기적으로 간격이 있는 그리드 지점에 있습니다. 이 데이터는 개별 셀의 형태적 경계 내에서 선택한 속성의 중앙값, 평균 및 표준 편차를 식별하고 셀룰러 물리적 특성/신호로 할당합니다. 이러한 것에서, 표준 편차는 가변성을 나타내기 위해 사용되며, 평균과 중앙값의 차이는 분포의 특성을 나타내기 위해 사용되며, 중앙값은 선택한 속성에 대한 셀의 전체 상태를 나타내는 데 사용된다.- Part 1: 셀을 포함하는 이미지 영역의 세분화
참고: 이 단계에 대한 수동 입력에는 데이터 디렉터리 식별 및 분할 프롬프트에 응답하여 셀 없음 영역에서 셀을 감지하는 것이 포함됩니다. 이 단계에서 이전에 만든 키에는 'p*/phs/*.tif'이 있습니다. 이 단계에서 생성된 주요 새 파일은 'p*/phs/bwImages/*.tif', 셀 영역이 없는 영역으로부터 셀 영역을 분리하는 바이너리 이미지인 'p*/phs/textResults/frameNum_percentHealed.txt', 각 인스턴스의 셀이 다루는 퍼센트 이미지 영역을 나열하는 'p*/phs/textResults/frameNum_percentHealed.txt', AcTrM 인터페이스에 입력된 사용자 선택을 기록하는 'p*/clusterInput.txt'입니다. 셀이 포함된 이미지 영역을 분할하는 다음 단계에 대한 시각적 설명은 그림 9 을 참조하십시오. 이 부분은 셀 셀 힘을 계산하기 전에 완료해야 합니다. 이 경우 이러한 단계를 반복할 필요가 없습니다. 또한 이러한 단계가 셀 셀 힘 계산 전에 수행되는 경우 힘 계산의 시작 부분에 요청되지 않습니다.- 피지 소프트웨어를 시작하고 MSM 드롭다운 메뉴에서 세분화 - 셀룰러 클러스터를 선택합니다.
- 파일 브라우저 대화 상자를 사용하여 정기적으로 간격이 있는 그리드 포인트에 정량화된 속성을 포함하는 위치 디렉터리 '분석/p0', '분석/p1' 등을 선택합니다.
- 단층이 컨실릭되어 있는지 여부를 나타냅니다.
참고: 아래 단계는 단층이 혼잡하지 않은 경우에만 호출됩니다. AnViM 프롬프트를 따라 새로운 다갈래 접근 방식을 적용하여 셀이 포함된 이미지 영역을 식별합니다. 이 프로세스에는 각각 다른 방식으로 세분화에 접근하는 네 가지 방법이 포함됩니다. 조합에 사용되는 이들 방법 중 하나 또는 다중은 세포의 다양한 이미지를 커버한다. 따라서 데이터에 가장 적합한 조합을 찾기 위해 다른 방법을 시도해 보십시오. - 최적의 세분화를 얻기 위해 '도메인 연결 계수'와 '얼룩 계수'를 조정합니다.
참고: '얼룩 요인'은 세포를 포함하는 영역을 더 크게 만듭니다. - 이진 이미지에서 셀이 검은색 또는 흰색으로 나타나는지 여부를 나타냅니다.
- 경계 이미지 창을 정리하는 길에서 이미지를 자동으로 또는 수동으로 청소할지 여부를 선택합니다.
참고: 이미지의 원치 않는 특징은 분석할 셀 클러스터에서 분리된 픽셀의 셀 및 백색 반점이 차지하는 픽셀의 검은색 반점입니다. 분석은 연결된 영역에서만 수행할 수 있습니다. 따라서 연결이 끊어진 여러 영역을 별도로 분석해야 합니다.
- 파트 2: 이미지의 개별 셀 세분화
참고: 이 단계에 대한 수동 입력에는 데이터 디렉터리 식별 및 이미지 내의 개별 셀을 감지하기 위한 세분화 프롬프트에 응답하는 것이 포함됩니다. 이 단계에서 이전에 만든 키 파일에는 'p*/phs/*.tif'과 'p*/phs/bwImages/*.tif'이 있습니다. 생성된 주요 새 파일은 셀룰러 형태학적 특성을 포함하는 'p*/phs/textResults/*.csv'입니다. 단층의 개별 셀을 분할하는 다음 단계에 대한 시각적 설명은 그림 10 을 참조하십시오.- 피지 소프트웨어를 시작하고 MSM 드롭 다운 메뉴에서 세분화를 선택 - 개별 셀.
- 파일 브라우저 대화 상자를 사용하여 정기적으로 간격이 있는 그리드 포인트에 정량화된 속성을 포함하는 위치 디렉터리 '분석/p0', '분석/p1' 등을 선택합니다.
- 입력 매개변수 선택 창에서 셀 경계에 비해 셀 센터가 눈에 띄는 양과 셀의 검출을 유도하는 두 개의 흐림 매개변수(보충 도 S10)를 나타냅니다.
- 각 위치에 대한 이미지 스택에서 가장 작은 일반 셀에 다각형을 그립니다. 이 영역을 계산하는 데 사용됩니다. 이보다 작은 것은 소프트웨어에 의해 셀로 간주되지 않습니다.
- 다음으로 가장 큰 정상 셀 주위에 다각형을 그리고 세포 센터 또는 세포 세포 인터페이스가 더 밝는지 여부를 나타냅니다.
참고: AnViM은 해당 프레임 내의 셀에 대한 정보가 포함된 각 프레임에 대해 'phs/textResults/0001.csv', 'phs/textResults/0002.csv' 등을 만듭니다. 이 단계에서 이 파일에는 영역, 중심, 둘레, 방향, 원형, 종횡비, 둥글림, 견고성, 노셀 영역으로부터의 거리를 포함하는 세포에 대한 형태학적 정보가 포함되어 있습니다. 이러한 속성의 길이 단위는 픽셀이고 각도는 정도입니다. 마지막으로 이 파일은 후속 단계에서 셀룰러 픽셀 강도, 모션 및 힘을 포함하도록 업데이트됩니다.
- 3부: 셀의 픽셀 강도 매핑
참고: 이 단계에서 수동 입력에는 데이터 디렉터리 식별 및 매핑 속성 및 매개 변수 선택이 포함됩니다. 이 단계에서 이전에 만든 키 파일에는 'p*/phs/*.tif'(또는 'p*/fluo/*.tif') 및 'p*/phs/bwImages/*.tif'이 있습니다. 이 단계에서 생성된 주요 새 파일은 셀룰러 형태학적 특성을 나열하는 'p*/phs/textResults/*.csv'입니다. 다음 단계에 대한 시각적 설명은 개별 셀 및 해당 주변 영역으로 둘러싸인 영역의 픽셀 강도를 평가하고 셀의 속성으로 정의하려면 도 11 을 참조하십시오.- 피지 소프트웨어를 시작하고 , MSM 드롭 다운 메뉴에서, 셀에지도를 선택 - 강도.
- 파일 브라우저 대화 상자를 사용하여 정기적으로 간격이 있는 그리드 포인트에 정량화된 속성을 포함하는 위치 디렉터리 '분석/p0', '분석/p1' 등을 선택합니다.
- 소프트웨어에 의해 메시지가 표시될 때 세포 구분 감지 또는 셀룰러 형광 정량화선택 인접 영역의 크기를 정의합니다. 둘 다 주변 지역의 속성을 수집하고 셀 상자의 속성을 수집합니다. 확인을 클릭 합니다.
- 셀룰러 강도 창을 기록하는 목적에서 강도 매핑에 사용할 이미지 유형, 주변 영역의 크기 및 개별 셀 또는 셀 및 해당 영역 모두에 대해 데이터가 수집되는지 여부를 나타냅니다(보충 도 S11).
참고: 위상 대비 이미지의 픽셀 강도를 매핑하면 셀 분할 이벤트를 감지할 수 있습니다. 형광화상 강도를 매핑하면 형광성 태그된 세포질 분자의 변동을 감지할 수 있습니다. 위의 단계의 출력은 개별 셀에 대한 평균, 중앙값, 표준 편차, 최소 및 최대 픽셀 강도 값입니다. 이 번호는 파일 'phs/textResults/0001.csv', 'phs/textResults/0002.csv 등의 새 열로 입력됩니다.
- 4부: 셀의 힘과 모션 매핑
참고: 이 단계에 대한 수동 입력에는 데이터 디렉터리 식별 및 매핑 속성 및 매개 변수 선택이 포함됩니다. 이 단계에서 이전에 만든 주요 파일은 'p*/phs/textResults/*.csv', 'p*/속도/*_vel.dat', 'p*/변위/*_disp.dat', 'p*/견인/*_trac.dat', 'p*/prestress/*_prestress.dat', 'p*/phs/bwImages/*.tif'입니다. 이 단계에서새 파일이 만들어지지 않습니다. 대신 새 정보(셀룰러 힘 및 모션 속성)가 파일 'p*/phs/textResults/*.csv'에 추가됩니다. 개별 셀 및 해당 주변 영역이 포괄하는 영역의 힘과 움직임을 평가하고 세포의 속성으로 정의하는 단계의 시각적 설명은 그림 12 를 참조하십시오.- 셀의 MSM 드롭다운 메뉴 맵 - 모션/포스 데이터 (추가 그림 S12)에서 선택합니다.
- 그런 다음 2.4.3 단계에 나열된 단계를 따릅니다.
참고: 새로운 열은 파일 'phs/textResults/0001.csv', 'phs/textResults/0002.csv'등에 추가되며, 속도의 평균, 중앙값 및 표준 편차, 속도의 방향, 평균 사이토셀레탈 장력, 장력 이섭성, 스트레인 에너지, 하이드로겔의 방향 성, 신장 성수량(최고 장력, eCM3) 등이다.
- Part 1: 셀을 포함하는 이미지 영역의 세분화
- 결과 시각화
- 1부: 실험 전반에 걸친 셀룰러 ID 추적
참고: 이 단계에 대한 수동 입력에는 데이터 디렉터리 식별 및 시각화할 매핑된 속성을 선택하는 것이 포함됩니다. 이 단계에서 이전에 만든 키에는 'p*/phs/textResults/*.csv'이 포함됩니다. 이 단계에서 생성된 주요 새 파일은 셀룰러 데이터의 시간 추적을 포함하는 'p*/phs/textResults/cellTimeTrace_*.csv'입니다. 실험 의 전체 기간 동안 개별 셀의 속성을 추적하려면 다음 단계에 대한 시각적 설명은 그림 13 을 참조하십시오.- 피지 소프트웨어를 시작하고 MSM 드롭 다운 메뉴에서 결과를 선택 - 추적 데이터.
- 파일 브라우저 대화 상자를 사용하여 추적할 셀룰러 속성을 포함하는 위치 디렉터리 '분석/p0', '분석/p1' 등을 선택합니다. 완료되면 선택합니다.
- 추적 창 에 대한 시작점 선택 에서 모니터링을 위한 시작 프레임과 동시에 추적되는 프레임 수(추가 그림 S14)를 선택합니다. 프레임 번호 1에 대해 속도를 결정할 수 없으므로 항상 프레임 번호 2에서 시작합니다. 완료되면 확인을 클릭 합니다.
- 변수 확인에서 트랙 만들기 창에서 변수 이름을 입력하거나 확인란에서 용어를 선택하여 변수를 선택합니다(추가 그림 S15). 그런 다음 확인을 클릭합니다.
참고: 추적은 고유한 셀 번호가 포함된 각 열과 연속 시간 인스턴스를 나타내는 각 행이 포함된 'phs/textResults/cellTimeTrace_*.csv' 파일을 생성합니다.
- 2부: 평가된 셀룰러 특성의 시간 추적 생성
참고: 이 단계에 대한 수동 입력에는 데이터 디렉터리 식별 및 시각화할 매핑된 속성을 선택하는 것이 포함됩니다. 이 단계에서 이전에 만든 키에는 'p*/phs/textResults/cellTimeTrace_*.csv'이 있습니다. 이 단계에서 생성된 주요 새 파일은 타임 트랙 플롯과 플롯 데이터가 포함된 'p*/phs/추적데이터플롯/*.csv'을 포함하는 'p*/phs/추적데이터플롯/*.tif'입니다. 평가된 셀룰러 속성의 시간 트랙을 생성하는 다음 단계에 대한 시각적 설명은 그림 14 를 참조하십시오.- 플롯 - 피지 소프트웨어를 시작하고, MSM 드롭 다운 메뉴에서 결과를 선택합니다.
- 파일 브라우저 대화 상자를 사용하여 플롯할 추적된 셀룰러 속성을 포함하는 위치 디렉터리 '분석/p0', '분석/p1' 등을 선택합니다.
- 예 또는 아니오 버튼을 클릭하여 끊어지지 않은 트랙이 있는 셀로 플롯을 제한할지 여부를 선택합니다.
참고: 이 옵션은 하나 이상의 시간 인스턴스에서 검색할 수 없는 셀을 무시합니다. - 플롯할 변수 수를 동시에 선택하고 확인을 클릭 합니다.
참고: 현재 AnViM은 최대 3개의 변수를 동일한 플롯에 표시할 수 있도록 합니다. - 드롭다운 메뉴를 사용하여 플롯을 위해 개별 변수를 선택합니다.
참고: 이러한 단계는 태그가 지정된 이미지 파일 형식(TIFF) 파일과 'phs/추적DataPlots/' 폴더 내에서 쉼표 구분된 데이터 파일을 만듭니다. 파일 이름은 밑줄로 구분된 변수 이름으로 구성되며 셀 번호로 끝납니다.
- 3부: 평가된 셀룰러 특성의 열지도 생성
참고: 이 단계에서 수동 입력에는 데이터 디렉터리 식별 및 시각화할 매핑된 속성을 선택하는 것이 포함됩니다. 이 단계에서 이전에 만든 키에는 'p*/phs/textResults/cellTimeTrace_*.csv'이 있습니다. 이 단계에서 생성된 주요 새 파일은 셀룰러 속성의 히트맵인 'p*/phs/segmentedImages/cellPropMaps/*.tif'입니다. 평가된 셀룰러 속성의 열 맵을 생성하는 단계에 대한 시각적 설명은 그림 15 를 참조하십시오.- MSM 드롭다운 메뉴 결과 중에서 선택 - 사진.
- 2.5.2 단계에 설명된 단계를 따릅니다.
참고: 출력은 'phs/세그먼트이미지/셀프로맵/' 폴더에 TIFF 파일 파일로 저장됩니다. 파일 이름은 밑줄로 구분된 시간 인스턴스 번호 및 가변 이름입니다.
- 1부: 실험 전반에 걸친 셀룰러 ID 추적
Representative Results
시연된 예제의 두 가지 주요 출력을 소개합니다. 첫 번째 출력은 세포 번호 1에 대한 세포 속도 및 세포 골격 장력의 시간 추적입니다 (도 16). 속성은 속성 간의 시각적 연결을 용이하게 하기 위해 공유 수직 축에 표시되고 가로 축은 시간 인스턴스 번호를 나타냅니다. 이 실험에서는 연속 프레임을 15분 간격으로 획득했습니다. 두 번째 출력은 실험에 1h의 열 맵 배열입니다(그림 17). 여기에 표시된 특성에는 스프레드 영역, 방향, 원형, 속도, 움직임 방향, 최대 장력 방향, 세포골격 긴장, 기판 견인 및 개별 세포의 장력 성 역도가 포함됩니다.
그림 1: 셀룰러 신호(iTACS)를 분석하기 위한 통합 툴킷 구조입니다. iTACS의 두 가지 주요 구성 요소는 인수 및 교육 모듈(AcTrM) 및 분석 및 시각화 모듈(AnViM)입니다. AcTrM은 현미경 단계에서 단단히 고정될 수 있는 하이드로겔, 모든 세포 파종 및 한 초점 평면에 세포를 유지하는 성장 프로토콜을 준비하기 위해 현재 존재하는 다양한 하이드로겔 제제 기술을 사용할 수 있다. AnViM은 다양한 기술을 사용하여 하이드로겔 및 단층 변형, 세포-ECM 힘 및 세포 세포 력을 정량화할 수 있다. 힘 측정 프로토콜의 이러한 모든 사용자 선호 구성 요소는 iTACS에 수용 할 수 있으며 대시 상자로 식별되었습니다. 솔리드 박스로 식별된 구성 요소는 셀룰러 힘 측정 기술에 대한 새로운 기여입니다. AnViM의 시각화는 개별 셀 에 걸쳐 속성의 중앙값 과 가변성에 중점을 둡니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 참조 이미지 수집 - 1부. AcTrM을 사용하여 위치 목록을 만들기 위한 단계입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 참조 이미지 수집 - 2부. AcTrM을 사용하여 참조 이미지를 획득하기 위한 단계입니다. 2단계, 4단계, 6단계에 대한 자세한 뷰는 각각 보충 피규어 S2, S3 및 S4에 표시됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: 나머지 실험에 대한 자동 이미지 수집. 이미지 수집을 재개하여 AcTrM을 사용하여 셀룰러 동작을 평가하는 단계입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5: 자동화된 데이터 분석 설정. AnViM을 사용하여 자동화된 이미지 분석을 시작하는 단계입니다. 이 소프트웨어는 AcTrM에서 사용하는 이미지 형식을 인식합니다. 3단계와 5단계에서 패널에 대한 자세한 뷰는 각각 보충 도서 S5 및 보충 도 S6에 나와 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 6: 하이드로겔 및 단층층의 변형 을 정량화 - 1부. 참여 단계는 AnViM을 통해, Tseng, Q. 외, PNAS (2012)20의 입자 이미지 벨로시메트리 구현을 통해 하이드로겔의 상단 표면의 변형을 정량화한다. 사용자는 또한 하이드로겔 변형을 정량화하기 위해 AnViM 의 다른 접근 방식 내에서 구현할 수 있습니다. 3단계의 자세한 뷰는 보충 도면 S7에 제시됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 7: 하이드로겔 및 단층층의 변형 을 정량화 - 2 부. 참여 단계는, AnViM을 통해, Tseng, Q. 외, PNAS (2012)20의 입자 이미지 벨로시메트리 구현을 통해 개별 세포의 로컬 모션을 정량화한다. 사용자는 또한 AnViM 내의 다른 접근 법 내에서 셀룰러 모션을 정량화할 수 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 8: 세포-ECM 및 세포 세포 력의 정량화. AnViM을 통해, 트러스 등의 포리에 변환 트랙션 현미경 구현을 통해, 자연 물리학(2009)15를 통해 하이드로겔의 세포에 의해 가해지는 힘을 정량화하고, 탐베 외의 단층 스트레스 현미경 구현(2011)을 통해 개별 세포와 이웃 세포 사이의 힘을 정량화하는 단계. 사용자는 또한 세포-ECM 및 세포 세포 힘을 정량화하기 위하여 AnViM 그밖 접근 법 안에 구현할 수 있습니다. 단계 6의 자세한 보기는 보충 도서 S8 및 보충 도S9에 제시됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 9: 개별 셀에 그리드 점 값을 매핑 - 부품 1. 새로운 다갈래 접근법을 사용하여 셀을 포함하는 이미지 영역을 분할하는 단계입니다. 이 접근법은 세포의 위상 대비, 밝은 필드 또는 형광 심상을 세그먼트하는 데 사용할 수 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 10: 개별 셀에 대한 그리드 점 값 매핑 - 2부. AnViM에서 개발된 새로운 다갈래 방식을 사용하여 단층의 개별 세포를 분할하는 단계. 이 접근법은 세포의 위상 대비, 밝은 필드 또는 형광 심상을 세그먼트하는 데 사용할 수 있습니다. 2단계의 자세한 뷰는 보충 도면 S10에 제시됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 11: 개별 셀에 대한 그리드 점 값 매핑 - 3부. 개별 셀 내 및 AnViM을 사용하여 개별 셀의 인접 영역 내에서 픽셀 강도를 평가하는 단계. 평가된 강도에는 전염된 광 강도 및 형광 강도를 포함한다. 이 부분은 개별 셀 내및 개별 셀의 인접 영역 내에서 픽셀 강도의 중앙값 및 표준 편차를 매핑합니다. 2단계의 자세한 뷰는 보충 도서 S11에 제시됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 12: 개별 셀에 대한 그리드 점 값 매핑 - 4부. 개별 셀 내 및 AnViM을 사용하여 개별 셀의 인접 영역 내에서 그리드 포인트의 힘 및 모션 특성을 평가하는 단계. 이 부분은 개별 셀 내및 개별 셀의 인접 영역 내에서 속성의 중앙값 및 표준 편차를 매핑합니다. 단계 2 및 3의 자세한 보기는 보충 도 S12 및 보충 도 S13에 제시됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 13: 결과의 시각화 - 1부. AnViM을 사용하여 실험 의 전체 기간 동안 개별 셀의 속성을 추적하는 단계. 단계 2 및 3의 자세한 보기는 보충 도 S14 및 보충 도 S15에 표시됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 14: 결과의 시각화 - 2부. AnViM을 사용하여 평가된 속성의 시간 추적을 생성하는 단계입니다. 사용자는 하나의 그래프에서 최대 3개의 속성을 플로팅할 수 있습니다. 시간 추적은 전체 실험에서 추적이 성공한 모든 셀 또는 해당 셀에 대해서만 생성됩니다. 단계 5의 자세한 보기는 보충 도 S16 및 보충 도 S17에 제시됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 15: 결과의 시각화 - 3부. AnViM을 사용하여 평가된 속성의 열 맵을 생성하는 단계입니다. 히트 맵은 시작 프레임 및 선택한 모든 속성에 따라 모든 프레임에 대해 생성됩니다. 3단계의 자세한 뷰는 추가 도면 S18에 제시된다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 16: 셀 ID 1의 시간 추적입니다. 표시되는 두 가지 특성은 세포 세포 골격 장력 ("avgtenMedian") 및 셀룰러 속도 ("speedMedian")입니다. 세포 세포 세포 골격 장력과 세포 속도 모두 세포 내의 그리드 포인트에 걸쳐 중앙값으로 정량화됩니다. 두 속성은 평가된 속성 간의 관계를 시각화하기 위해 임의의 단위가 있는 동일한 축에 플롯됩니다. 추가 변수 이름은 보충 표 S1에 나열됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 17: 분석된 단층에서 개별 셀의 특성을 열지도합니다. 각 셀은 패널에 표시된 속성의 중앙값으로 채색됩니다. 따라서, 딥 레드는 색상 스펙트럼에서 최대 세포 값을 나타내고, 딥 블루는 분석된 단층 전반에 걸쳐 최소 셀룰러 값을 나타낸다. Tambe et al., PLoS One (2013)2에 설명된 바와 같이, 경계에 가까운 세포는 이미지 외부 세포의 알 수 없는 특성에 의해 영향을 받는 기계적 힘을 갖는다. 따라서 경계에서 멀리 떨어진 셀에 대해 열 맵이 생성됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 S1: 위쪽 및 아래쪽 형광 비드의 샘플 이미지입니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
그림 S2: 그림 3에서 2단계의 자세한 보기입니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
그림 S3: 그림 3에서 4단계의 자세한 보기입니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
그림 S4 A: 그림 3에서 6단계의 자세한 보기. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
그림 S5: 그림 5에서 3단계의 자세한 보기입니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
그림 S6: 그림 5에서 5단계의 자세한 보기입니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
그림 S7: 그림 6에서 3단계의 자세한 보기입니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
도 S8: 도 8에서 6단계의 셀-ECM 힘 출력에 대한 상세보기. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
도 S9: 도 8에서 6단계의 세포 세포력 출력에 대한 자세한 보기. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
그림 S10: 그림 10에서 2단계의 자세한 보기입니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
그림 S11: 도 11에서 2단계의 자세한 보기입니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
그림 S12: 그림 12에서 2단계의 자세한 보기입니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
그림 S13: 도 12에서 3단계의 출력에 대한 자세한 보기입니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
그림 S14: 도 13에서 2단계의 자세한 보기입니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
그림 S15: 그림 13에서 3단계의 자세한 보기입니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
그림 S16: 그림 14에서 5단계에서 생성된 데이터 파일에 대한 자세한 보기입니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
그림 S17: 도 14에서 5단계에서 생성된 플롯의 자세한 보기입니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
그림 S18: 도 15에서 4단계에서 생성된 색상 스펙트럼의 범위를 포함하는 열 맵 및 파일의 상세보기입니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
표 S1: iTACS에 의해 정량화된 선택한 속성 목록입니다. 이 테이블을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
Discussion
부착 셀은 생존, 성장 및 기능을 위해 기계적 및 화학 신호를 모두 사용합니다. 다양한 현미경 소프트웨어는 형광 기반 이미징을 통해 화학 신호를 평가하는 데 사용자 경험을 최적화합니다. 그러나 기계 신호의 평가에는 표준 현미경 소프트웨어에서 사용할 수 없는 기능이 포함됩니다. 또한 데이터 수집이 데이터 분석과 통합될 때 기계적 신호 평가가 가장 효율적입니다. 기계 신호 평가의 고유한 요구를 충족하는 통합 플랫폼의 부족은 실험 세포 생물학의 주요 기술적 격차였습니다. 셀룰러 신호(iTACS)를 분석하는 통합 툴킷은 이러한 격차를 충족하도록 설계되었습니다. iTACS, AnViM 및 AcTrM의 두 구성 요소는 사용자에게 힘, 모션, 형태, 형광/밝기의 네 가지 광범위한 범주의 셀룰러 특성을 정량화하는 데 필요한 기능을 제공합니다. 이러한 범주에 걸쳐 iTACS는 현재 개별 부착 세포의 50 개 이상의 독특한 측면을 드러낼 수 있습니다. 이러한 양상은 셀 전체의 대표값 및 가변성을 포함하여 각 광범위한 범주의 특정 특성을 포함합니다(보충 표 S1). 예를 들어, 힘 내에서, 세포골격을 가로지르는 인장력이 있고, 이 장력의 이온성, 최대 장력의 방향, 및 셀-ECM 인터페이스 전반에 걸쳐 전단 응력이 있어 신봉세포의 동작에 지대한 영향을 미친다1,3,6.
단층의 개별 세포의 기계적 행동을 검사하는 새로운 접근 법
단층의 개별 세포는 화학및 기계적 성격의 신호교환에 종사한다3. 이러한 두 가지 유형의 신호는 셀룰러 모노레이어를 상이한 방식으로 전달한다23. 그러나, 기계적 신호 전송 지식은 화학 신호 전송의 뒤에 지연. 이 지식 격차는 세포 기계 신호를 평가하기 위한 간단하고 직관적인 접근 방식의 지속적인 부족과 일치합니다. 여기에 설명된 새로운 데이터 매핑 접근 방식은 이 격차를 메울 수 있도록 준비되어 있습니다. 이러한 매핑은 세포의 이웃 영역에서 본질적인 사이토켈레탈 장력의 변동이 셀레칼18의 세포 모양, 크기 및 속도의 변화를 조절하는 휴식, 유동화 및 앵커링 신호역할을 한다는 것을 보여준다. 이웃 영역의 특성의 지도는 세분화 내의 세포가 상대적으로 균일한 미세 환경에 노출되고 세분화의 경계에 있는 세포가 현저하게 부균일한 마이크로환경에 노출되는 "다세포 세분" 패턴을 나타낸다.
힘 측정 기술의 접근성
PAA 하이드로겔을 만들고, 하이드로겔 변형 및 세포 운동을 분석하고, 세포-ECM 및 세포-세포 군력을 정량화하기 위해 다양한 프로토콜이 존재합니다 1,2,7,9,9,14,15,15,21,21,25,25,26,27 ,28,29,30,31,32. 그러나 이러한 발전은 일반적인 세포 생물학 실험실의 손이 닿지 않고 엔지니어링 전문 지식을 갖춘 실험실에 국한되어 있습니다. 이러한 접근법의 기술적 측면을 자동화하고 통합되고 사용자 친화적인 플랫폼으로 통합함으로써 iTACS의 목표는 기계 신호의 평가를 실험세포 생물학 연구 및 교육에서 일상적인 활동으로 만드는 것입니다.
ImageJ를 사용하면 교육이 거의 또는 전혀 필요하지 않은 접근 방식을 사용하여 응용 프로그램을 개발할 수 있습니다11. iTACS는 커뮤니티 중심의 지속적인 개발을 용이하게 하기 위해 간단한 스크립팅 접근 방식을 사용하여 주로 구축되었습니다. 대부분의 AcTrM은 BeanShell 스크립트를 사용하여 프로그래밍되며, 대부분의 AnViM은 ImageJ 매크로를 사용하여 프로그래밍됩니다. 사용자의 현미경에서 이러한 기능을 구현하기 위한 이러한 스크립트 및 지침은 GitHub(https://github.com/IntegrativeMechanobiologyLaboratory/iTACS)를 통해 확인할 수 있습니다.
획득한 이미지의 품질 표준화
부착 된 세포에서 물리적 힘을 정량화하는 탄성 기판 기반 기술이 다양한 실험실에서 개발되고 구현되었지만 프로토콜은 여전히 표준화가 부족합니다. 표준화가 가장 필요한 영역 중 하나는 획득한 상단 구슬 이미지의 품질입니다(보충 그림 S1). 실험 전반에 걸쳐 초점드에서 중요한 문제가 발생합니다. 우리의 새로운 참조 이미지 기반 재초점 접근 방식은 객관적인 프로세스를 집중합니다. AcTrM의 첫 번째 단계에서 정의된 매개 변수는 필요한 객관적인 품질 제한을 부과합니다. 다른 표준화 조치는 향후 버전의 AcTrM에서 프로그래밍할 수 있습니다.
iTACS의 광범위한 적용 가능성
iTACS 구조는 부착 된 세포의 다양한 측면을 정량화하는 것 외에도 다양한 실험 프로토콜 및 요구에 대한 사용을 용이하게합니다. AcTrM은 소프트웨어 유도 사용자 셀프 교육을 허용합니다. 예를 들어, 세포질 칼슘 변동의 동시 평가에 의해 요구되는 고속 이미징은 현재 하드웨어의 재배치 및 재집중 속도에 의해 제한되며 한 번에 한 위치에서 수행하는 것이 가장 좋습니다. 그러나, 현재 구현은 실험의 전체 기간 동안 현미경 단계에서 샘플을 유지할 수 없는 장기 이미징, 중단된 이미징을 위해 잘 갖추어져 있다. iTACS는 실험 초기에 참조 영상을 수집하므로 기계적 신호의 실시간 이미징을 가능하게 하여 약물 선별 응용 분야에서 새로운 길을 열어줍니다. AnViM을 사용하면 레이맨의 용어로 고도의 기술 정보를 제공할 수 있습니다. 광범위한 세포 특성을 정량화하고 실험 전반에 걸쳐 추적할 수 있는 능력은 새로운 세포 간 통신 메커니즘을 발견하는 데 필요한 중요한 기능을 구성합니다.
iTACS의 향후 개발을 위해 데이터 수집 및 데이터 분석 속도의 (1) 향상, (2) 새로운 셀룰러 신호 평가 접근 방식의 구현, (3) iTACS 기반 셀룰러 신호 평가에 대한 워크샵 및 교육 모듈 개발, (4) 저비용 자동화 솔루션 개발 의 네 가지 초점 영역을 확인했습니다.
Disclosures
저자는 이해 상충을 선언하지 않습니다.
Acknowledgments
D.T.T. 실험적인 세포 생물학 연구 필요에 토론을 자극하기 위한 사우스 앨라배마 대학에 폐 생물학 센터와 제휴한 직원에게 감사드립니다. 이러한 논의는 iTACS의 개발을 시화하는 데 결정적인 역할을 했습니다.
이 작품은 국립 보건 원 / 국립 심장 폐 혈액 연구소의 보조금에 의해 부분적으로 지원되었다, P01 HL66299 및 R37 HL60024 (스티븐스), R01-HL118334 (알바레즈), F32-HL144040-01 (Xu), 아브라함 미첼 암 연구 기금 (싱, 팔란키, 탐베), 연구 및 학술 개발 그랜트 (탐베)
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents and components used in prepare glass surface for hydrogel coating | |||
| (3-Aminopropyl)trimethoxysilane, 97% | Aldrich chemistry | 13822565 | |
| 2% Bis Solution | Bio-rad | 1610142 | |
| 3-(Trimethoxysilyl)propyl methacrylate,98% | Acros organics | 2530850 | |
| 40% Acrylamide Solution | Bio-rad | 1610140 | |
| Glass bottom 35 mm dish/ 6 or 12 or 24 well plates | MatTek or CellVis | ||
| Glutaraldehyde, EM Grade, 25% | Polysciences | 1909100 | |
| Sodium Hydroxide | Sigma-aldrich | 1002074706 | |
| Reagents and components used in preparing suitable hydrogel | |||
| 2% Bis Solution | Bio-rad | 1610142 | |
| 40% Acrylamide Solution | Bio-rad | 1610140 | |
| Ammonium Persulfate | Bio-rad | 1610700 | |
| Cover Slips | Electron Microscopy Sciences | 7222301 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (1M) | Gibco | 14190136 | |
| FluoSpheres carboxylate 0.2 um, yellow-green(505/515) | Invitrogen | F8811 | |
| FluoSpheres carboxylate 0.5 um, red(580/605) | Invitrogen | F8812 | |
| FluoSpheres carboxylate 2.0 um, red(580/605) | Invitrogen | F8826 | |
| Rain-X | |||
| TEMED | Bio-rad | 1610801 | |
| Reagents used in coating extracellular matrix on the hydrogel | |||
| Collagen Type I Rat Tail | Corning | 354236 | |
| HEPES(1M) | Gibco | 15630080 | |
| Phosphate Buffered Saline (1M) | Gibco | 10010023 | |
| Sulfo-SANPAH | CovaChem | 102568434 | |
| Microscope hardware used in the current study | |||
| Camera | Hamamatsu Flash 4.0 LT sCMOS Camera | C11440-42U | |
| H117 ProScanTM Stages | Prior Scientific | ||
| Light source- Lambda DG4 and Lambda DG5 | Sutter instrument company | ||
| Microscope | Nikon eclipse TE2000-S | 550372 | |
| ProScan III Universal Microscope Automation Controller | Prior Scientific | ||
| Stagetop incubator | ibidi | 11922 | |
| Stepper Motor Focus Drive | Prior Scientific |
References
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