Summary
我们介绍了从水生栖息地分离，繁殖和表征碳氢化合物降解细菌的过程。该协议概述了细菌分离，通过16S rRNA方法鉴定以及测试其碳氢化合物降解潜力。本文将帮助研究人员表征环境样本中的微生物生物多样性，特别是筛选具有生物修复潜力的微生物。
Abstract
碳氢化合物污染物不易降解，它们在环境中的积累对所有生命形式都是有毒的。细菌编码许多催化酶，并且自然能够代谢碳氢化合物。科学家利用水生生态系统中的生物多样性来分离具有生物降解和生物修复潜力的细菌。这种来自环境的分离物提供了一套丰富的代谢途径和酶，可以进一步用于在工业规模上扩大降解过程。在本文中，我们概述了从水生栖息地分离，繁殖和鉴定细菌物种的一般过程，并使用简单的技术筛选它们利用碳氢化合物作为 体外 唯一碳源的能力。本协议描述了各种细菌物种的分离以及随后使用16S rRNA分析进行鉴定。该协议还提供了表征细菌分离物的碳氢化合物降解潜力的步骤。该协议对于试图从环境栖息地中分离细菌物种以进行生物技术应用的研究人员很有用。
Introduction
碳氢化合物（HC）被广泛用作燃料和化学应用。苯、甲苯、二甲苯等芳烃被广泛用作溶剂1。乙烯和丙烯等烯烃分别作为聚乙烯和聚丙烯聚合物合成的前体。另一种烃类苯乙烯聚合形成聚苯乙烯。人为活动在生产和运输过程中将碳氢化合物引入环境。土壤和水的碳氢化合物污染对环境和人类健康造成严重关切。微生物通过调节生物地球化学循环和利用包括污染物和异生素在内的各种基质，将其转化为碳和能源，在维持生态系统方面发挥着重要作用。微生物对环境污染物进行解毒的过程称为生物修复3,4,5,6,7。
在水生和土壤栖息地中发现了具有降解碳氢化合物能力的微生物8,9,10。已经鉴定出许多具有降解烷烃和芳香族HC潜力的细菌，例如假单胞菌，不动杆菌，红球菌，马里诺杆菌和Oleibacter11。技术先进的培养独立方法的开发有助于发现新的HC降解微生物群落12。直接从源样品中分离的基因组材料通过下一代测序（NGS）等高通量方法进行扩增和测序，然后进行分析，无需培养微生物。NGS方法，如宏基因组分析，价格昂贵，并且存在与扩增过程相关的缺点13。靶向分离碳氢化合物降解微生物的选择性富集培养物14等培养技术仍然有用，因为它们允许研究人员探测和操纵细菌分离物中的代谢途径。
基因组DNA分离和随后的基因组材料测序揭示了有关任何生物体的宝贵信息。全基因组测序有助于鉴定编码抗生素耐药性的基因、潜在药物靶点、毒力因子、转运蛋白、异生代谢酶等15,16,17。16SrRNA编码基因的测序已被证明是鉴定细菌系统发育的可靠技术。多年来基因序列和功能的保存使其成为识别未知细菌并将分离株与最接近的物种进行比较的可靠工具。此外，该基因的长度最适合生物信息学分析18。所有这些特点，以及使用通用引物进行基因扩增的便利性和基因测序技术的改进，使其成为微生物鉴定的黄金标准。
在这里，我们描述了一种从环境样品中回收具有HC降解潜力的可培养微生物的程序。下面描述的方法概述了HC降解细菌的收集和鉴定，分为五个部分：（1）从水样中收集细菌，（2）分离纯培养物，（3）探索细菌分离株的HC降解能力（4）基因组DNA分离，以及（5）基于16S rRNA基因测序和BLAST分析的鉴定。该程序可以适用于分离细菌以进行许多不同的生物技术应用。
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Protocol
1. 样品采集、处理和分析
注意：在这里，我们提出了一种从水生栖息地分离细菌的方案。一些分离物可能具有致病性，因此，在使用前后戴上手套并对工作区域进行消毒。
- 从水体的不同位置收集 500 mL 水样在五个无菌玻璃瓶中。分别使用pH计和温度计测量每个样品的pH和温度。
注意：该方案不是针对特定地点的，也可以很容易地适应从碳氢化合物污染的水体中分离生物。 - 在无菌条件下，在一批 100 mL 至 0.22 μm 孔径的滤片中过滤样品。
注意：滤纸的直径不应超过培养皿直径。例如，直径不超过85毫米的滤纸最适合100-120毫米的培养皿。 - 将滤纸放在不同的营养培养基板上（PYE19，R2A 20，M9，LB，NB，TSB，M6321和M2G22）。不同类型的生长培养基允许选择和富集不同的微生物。表1列出了各种生长培养基的组成。每个培养基板使用一张纸，并在2小时后使用无菌镊子剥离。
- 通过在 900 μL 无菌水中加入 100 μL 收集的水样品，在无菌双蒸水中连续稀释未过滤的水样品（106 稀释）。这导致 1：10 的稀释度。从该样品中，取 100 μL 并加入 900 μL 无菌水以获得 1：100 稀释度。重复稀释，直到稀释倍数为1：1,000,000。通过移液混合。每次稀释的最终体积为 1 mL。
- 将 100 μL 稀释的水样品分别铺在步骤 3 中提到的所有生长培养基板上，一式三份。
- 根据菌落的生长，将板在30°C孵育24至48小时。
注意：大多数环境分离物在30°C的最佳温度下生长。 如果将样品从极端温度的环境中分离出来，请将板以与收集地点相同的温度孵育。 - 接下来，使用无菌牙签或移液器吸头挑选菌落并进行象限条纹以获得分离的菌落。
- 将培养皿孵育过夜。第二天，根据其形态特征（如颜色、质地、形状、大小、边缘、海拔等）筛选菌落。重新建立殖民地以获得纯正的培养物。
- 对每个纯培养物23 进行革兰氏染色，并进行甘油原液制备。
- 为了制备甘油储备液，将单个菌落接种在3mL适当的生长培养基中，并在30°C下孵育。 从过夜培养物中，取 700 μL 并在冷冻管24 中加入 300 μL 100% 甘油（通过高压灭菌）。将小瓶冷冻在-80°C以长期储存。
2. 碳氢化合物的降解
注意：下面的示例用于筛选可以降解苯乙烯的分离物。这是对上一份报告中采用的方法略有修改25.在无菌条件下遵循步骤。
- 从新鲜条纹的平板中，选择一个菌落并接种在 5 mL 胰蛋白酶大豆肉汤 （TSB）/营养肉汤 （NB） 中。将培养物在30°C下生长过夜，以200rpm振荡直至吸光度达到~2。
注意：除TSB / NB外，可以选择细菌达到高细胞密度的任何生长培养基。 - 第二天，在4°C下以2862× g 沉淀细胞5分钟，弃去上清液。
- 用2mL高压灭菌的盐水（0.9%NaCl）洗涤沉淀两次，并在4°C下以2862× g 旋转5分钟。
注意：盐水是等渗的，因此，它维持细菌细胞内的渗透压。 - 将沉淀重悬于 2 mL 液态无碳基础培养基 （LCFBM） 中。测量吸光度（OD600）。
- 取两个容量为150mL的无菌锥形瓶进行对照和实验组。将它们标记为 A 和 B。
- 在未接种/对照组（烧瓶A）中，加入40mLLCFBM和苯乙烯（5mM）。
- 在烧瓶B中，加入35mLLCFBM和苯乙烯（将苯乙烯的终浓度调节至5mM）。加入细胞悬液，最终OD600 细胞≈0.1，并用LCFBM补足剩余体积，最大可达40 mL。将烧瓶在30°C下以200rpm振荡孵育30天。
注意：过量的碳氢化合物可能对微生物有毒，因此，从低浓度开始，逐渐增加。 - 对必须评估碳氢化合物降解的每个额外菌株重复上述操作。
- 每5天测量每个烧瓶的OD600 并绘制生长曲线。如果细菌可以利用苯乙烯，则将孵育时间延长至45天。OD600 的增加表明细菌可以代谢苯乙烯。
3. 细菌分离株对儿茶酚降解的筛选
注意：芳烃如苯乙烯，苯，二甲苯，萘，酚类等的降解产生邻苯二酚作为反应中间体。儿茶酚在邻苯二酚1,2-双加氧酶和儿茶酚2,3-双加氧酶的帮助下分别通过邻位和间裂解途径被细菌进一步代谢26。这些酶还参与其他碳氢化合物的降解，例如氯苯27。下面提到的方案使用全细胞裂解物进行儿茶酚2,3-双加氧酶测定28。相同的裂解方法可用于筛选邻苯二酚1,2-双加氧酶的活性。然而，反应混合物的组成会有所不同。这两种酶本质上都是可诱导的，可以通过向生长培养基中添加苯酚来诱导。
- 在无菌环的帮助下，将新鲜条纹板中的细菌菌落接种到补充有1-4mM苯酚的矿物盐培养基（MSM）中。在30°C和200rpm下孵育培养物。当OD 600达到1.4-1.6之间（即，在指数后期）时，通过在4500 × g 旋转20分钟，在4°C收获培养物。
- 用磷酸盐缓冲液（0.5M，pH 7.5）洗涤细胞沉淀。
- 将细胞重悬于上述磷酸盐缓冲液中，并将最终OD600≈1.0调节。
- 通过脉冲超声处理裂解细胞1.5分钟，每个脉冲的持续时间为15秒。在此步骤之后，悬浮液必须透明或不太浑浊。如果没有，请增加脉冲数并检查悬架是否清除。每次脉冲后，将样品放在冰上以避免蛋白质降解。
- 通过以9,000× g 离心30分钟来除去细胞碎片和未破碎的细胞，保持低温（4°C）。
- 小心地移取澄清的上清液。该馏分具有用于酶测定的粗提取物。
- 通过布拉德福德或洛瑞方法29,30确定粗提取物的蛋白质浓度。
- 为了确定儿茶酚2,3-双加氧酶的活性，通过分光光度计测量反应终产物（2-羟基粘康酸半醛）的形成。
- 通过加入 20 μL 邻苯二酚 （50 mM）、960 μL 磷酸盐缓冲液（50 mM，pH 7.5）和 20 μL 粗提取物来制备反应混合物。
- 对于阴性对照，用磷酸盐缓冲液替换粗提取物，并将最终体积调节至1 mL。
- 将反应混合物孵育30分钟。在设定的时间间隔内，测量375nm处的吸光度。吸光度的增加表明反应最终产物2-羟基粘康酸半醛（2-HMS）的形成。一式三份进行实验。
注意：邻苯二酚对光敏感和对氧敏感。将反应混合物储存在黑暗中并紧紧关闭管，以防止儿茶酚的自然降解。
4. 纯培养物的基因组DNA分离
注意：这是分离基因组DNA的一般方案。在样品收集、处理和分析步骤中进行革兰氏染色。由于革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌的细胞壁厚度变化，因此对细胞裂解方法进行了相应的修改。隔离时戴上手套，用70%乙醇消毒工作台，以避免核酸酶降解DNA。下面提到的一些化学物质会导致皮肤严重灼伤，在处理它们时必须格外小心。
- 从革兰氏阴性细菌中分离基因组DNA31.
- 挑选单个菌落并在无菌试管中的新鲜生长培养基中接种。
- 将试管置于200rpm的培养箱振荡器中，并使细菌在30°C下生长过夜。
- 第二天，以12,400 x g 沉淀1.5 mL过夜生长的培养物3分钟。
- 除去上清液并将沉淀重悬于200μL裂解缓冲液（40mM乙酸三酯，pH 7.8,20mM乙酸钠，1mM EDTA，1%SDS）中。
- 加入 66 μL NaCl 溶液 （5 M） 并充分混合。
- 将所得混合物以12,400× g 沉淀10分钟（4°C）。
- 将透明上清液移液到新鲜的微量离心管中，并加入等体积的氯仿。
- 多次倒置混合溶液，直到观察到乳白色溶液。
- 以12,400× g 旋转3分钟，并将上清液转移到干净的小瓶中。
- 加入 1 mL 冰冷的 100% 乙醇;通过倒置混合，直到白色的DNA链沉淀出来。
- 在4°C下以2,200× g 离心沉淀的DNA10分钟，并弃去上清液。
- 用 1 mL 70% 乙醇洗涤 DNA 沉淀，让 DNA 沉淀在室温下干燥 5 分钟。
- 干燥后，将沉淀重悬于100μL 1x Tris-EDTA（TE）缓冲液中，并将DNA储存在-20°C。
- 使用分光光度计测量浓度（A260/280），并在琼脂糖凝胶（1%）上运行DNA，以评估DNA24的质量。
- 从革兰氏阳性菌株中分离基因组DNA32
- 挑选单个菌落并在无菌试管中的新鲜生长培养基中接种。
- 将试管以200rpm的速度放入培养箱振荡器中，让细菌在合适的生长温度下生长过夜。
- 第二天，取 1.5 mL 生长的培养物并以 8,600 x g 离心 5 分钟。
- 取出上清液并将细胞重悬于TE缓冲液中。
- 用TE缓冲液调节OD600 = 1.0，并将740μL细胞悬液转移到干净的微量离心管中。
- 加入 20 μL 溶菌酶（100 mg/mL 原液），并通过移液充分混合。在37°C孵育30分钟（在干浴中）。
- 加入 40 μL 10% SDS 并充分混合。
- 加入 8 μL 蛋白酶 K （10 毫克/毫升）。充分混合并在56°C下孵育1-3小时（在干浴中）。随着粘度的增加，悬浮液现在应该变得清晰，标志着有效的细胞裂解。
注意：如果细胞未正确裂解，悬浮液可以放置过夜。 - 在65°C（在干浴中）预热CTAB / NaCl混合物，并将100μL该混合物加入细胞悬液中。混合均匀。
- 在65°C孵育10分钟（在干浴中）。
- 加入 500 μL 氯仿：异戊醇 （24：1） 并充分混合。在25°C下以16,900× g 旋转10分钟。
- 将水相转移到新鲜的微量离心管中，避免有机相（底部的粘性相）。
- 小心地加入 500 μL 苯酚：氯仿：异戊醇 （25：24：1） 并充分混合。在25°C下以16,900× g 旋转10分钟。
- 将水相放入新鲜的微量离心管中。加入 500 μL 氯仿：异戊醇 （24：1） 并充分混合。
- 转移水相并加入0.6体积的异丙醇（在-20°C下预冷）。
- 沉淀的DNA链必须以线状形式可见。在-20°C孵育2小时至过夜。
- 在4°C下以16,900× g 离心15分钟以沉淀DNA。
- 小心地倒出异丙醇，并用1mL冷的70%乙醇（在-20°C下预冷）洗涤沉淀以除去任何杂质。
- 在4°C下以16,900× g 离心5分钟。 弃去上清液。
- 让沉淀在室温下干燥20分钟或将管保持在37°C。 确保颗粒没有过度干燥。
- 重悬于100μL的1x TE缓冲液中，并将DNA储存在-20°C。
注意：如果沉淀变得过度干燥并且难以重悬，请将微量离心管与DNA沉淀和无核酸酶的水在37°C孵育15-20分钟，然后通过移液再次重悬。 - 在1x TE缓冲液中进行1：100稀释后，使用分光光度计测量浓度（A260/280），并在琼脂糖凝胶（1%）上运行DNA，以评估DNA24的质量。
5. 16S rRNA测序
注意：下面概述的方案用于扩增和测序16S rRNA以进行细菌鉴定。从16S rRNA序列获得的信息用于鉴定未知生物并找到不同生物之间的相关性。
- 为了鉴定菌株，使用针对细菌的16S rRNA序列的通用引物通过PCR扩增从纯细菌培养物中分离的DNA： 27F （5'-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3'）和 1492R （5'-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3'）33。
- 在冰上用 18 μL 高压灭菌/无核酸酶水、2.5 μL 10x 缓冲液、0.5 μL 正向和反向引物（100 μM 储备液）、2 μL dNTP 混合物（100 μM 储备液）、1 μL DNA 模板 （2-15 ng/μL） 和 1 U U Taq 聚合酶制备 PCR 混合物（25 μL 反应）。
- 使用以下循环条件进行16S rRNA基因扩增：在94°C下初始变性10分钟，（在94°C下最终变性40秒，引物在56°C下退火1分钟，在74°C下延伸2分钟）x 30个循环，最终在74°C下延伸10分钟。
- 循环结束后，混合 5 μL 样品和 1 μL 5x DNA 上样染料。在 1% 琼脂糖凝胶上运行以验证扩增。将PCR产物短期储存在4°C或将其冷冻在-20°C直至进一步使用。
- 对于 16S rRNA 基因测序，对于更高体积 （100 μL），设置与上述相同的反应。
- 使用PCR产物纯化试剂盒纯化用于Sanger测序24,34的扩增子，或将整个样品与DNA上样染料混合并上样琼脂糖凝胶上以执行凝胶提取方法。
- 测序完成后，将结果文件转换为 FASTA 格式，并使用 NCBI （http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）35 上的基本局部比对搜索工具 （BLAST） 检查序列相似性。
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Representative Results
图1概述了从水生栖息地分离和筛选细菌以及随后通过16S rRNA分析鉴定细菌的整个过程的示意图。来自印度达德里湿地的水样被收集在无菌玻璃瓶中，并立即带到实验室进行处理。样品通过孔径为0.22 μm的滤片，滤纸与不同的培养基板保持接触。2小时后，除去滤纸，并将板在30°C下孵育过夜以形成菌落（图2）。第二天，选择单个细菌菌落并在新鲜培养基板上划线（图2）。将生成的纯培养物储存起来，随后用于进一步分析。使用这种方法，我们能够创建一个包含100多种独特细菌分离株的文库。我们旨在确定可以利用碳氢化合物的细菌分离物，特别是苯乙烯，它是一次性塑料的主要成分。分离的细菌在各自的培养基中单独生长，并添加液态苯乙烯作为碳的唯一来源（图3）。我们可以确定四种利用苯乙烯作为碳唯一来源的分离物。对其中两种分离物进行了广泛的表征，以进一步降解苯乙烯25。
然后测试细菌分离物是否存在降解碳氢化合物代谢的酶途径。一些细菌中的碳氢化合物代谢导致儿茶酚作为中间体的产生，这些邻苯二酚通过邻位切割和异切割途径进一步降解。儿茶酚1,2-双加氧酶和儿茶酚2,3-双加氧酶负责环裂解反应36。具有这些酶的环境细菌已被证明可以代谢几种芳香族化合物。因此，进行了儿茶酚降解测定以评估细菌分离株的HC降解潜力（图4）。其中一种分离株的代表性测定如图 4所示。
为了鉴定细菌分离株，进行了16S rRNA测序。进行了初步革兰氏染色以表征细菌，这有助于识别和排除后续步骤。革兰氏阳性细菌通常对细胞裂解缓冲液不耐药，导致基因组DNA产量低37。因此，在基因组DNA分离之前从革兰氏染色38 获得的结果将有助于选择基因组DNA分离的方案。DNA分离后，通过在琼脂糖凝胶上可视化少量DNA样品（图5A）来确认基因组DNA的完整性，并使用分光光度计通过紫外吸光度法进行定量。使用通用引物序列扩增16S rRNA基因（图5B）。虽然 500 bp 对于测序至关重要，但使用 1,300-1,500 bp39 可获得理想的结果。为了获得分离菌株之间的亲缘关系程度，使用 phylogeny.fr 软件40 构建了系统发育树（图6）。
图1：研究的工作流程示意图 请点击此处查看此图的大图。
图2：来自水样的细菌菌落图像。 收集的水样通过0.22μm滤纸。滤纸保存在不同的介质板上。将板孵育24-48小时，直到观察到分离的菌落。然后将单个菌落划在新鲜平板上以进行纯培养分离。 请点击此处查看此图的大图。
图3：微生物降解苯乙烯和筛选细菌烃降解电位的代表性结果。 将细胞在补充有5mM苯乙烯作为唯一碳源的LCFBM中生长，在30°C和200rpm下生长40天。每5天测量一次OD600 。对照烧瓶只有LCFBM。 请点击此处查看此图的大图。
图 4：儿茶酚 2,3-双加氧酶测定以监测儿茶酚降解的表示。 （A）无色底物邻苯二酚在邻苯二酚2,3-双加氧酶的作用下转化为黄色产物。反应混合物含有儿茶酚、磷酸盐缓冲液和粗细胞裂解物。通过测量375nm处的吸光度来检测产物的形成。（B）儿茶酚2,3-双加氧酶测定与全细胞裂解物的代表性图。阴性对照中的反应混合物具有不含细胞裂解物的缓冲液和儿茶酚底物。在375nm处以10分钟的间隔测量吸光度。 请点击此处查看此图的大图。
图 5：基因组 DNA 分离和 16S rRNA PCR。 （A）分离基因组DNA的凝胶电泳。泳道 M：DNA 大小标记，泳道 1-2：基因组 DNA。（B）通过1%凝胶电泳验证16S rRNA基因扩增。通过用溴化乙锭染色来观察凝胶;泳道 M：DNA 大小标记 （1 kb），泳道 1-4：来自不同菌株的扩增 PCR 产物。 请点击此处查看此图的大图。
图 6：16S rRNA 基因测序结果分析。 使用 phylogeny.fr 程序构建代表性树状图，以描述从湿地（红色框中突出显示）分离的 Exiguobacterium 菌株与已知 Exiguobacterium sp的相关性。已知 Exiguobacterium sp.的16S rRNA序列是从NCBI获得的。这个数字取自之前的一篇论文（Chauhan et.al.），没有任何修改25。 请点击此处查看此图的大图。
| 蛋白胨酵母提取物 | |
| 蛋白胨 | 2克 |
| 酵母提取物 | 1克 |
| 1M 镁硫4 | 1毫升 |
| 1M 氯化钙2 | 1毫升 |
| 蒸馏水 | 高达 1000 毫升 |
| 通过在 121°C 和 15 PSI 下高压灭菌 15 分钟。 | |
| 推理者 2A （R2A） | |
| 酪蛋白酸水解物 | 0.5 克 |
| 酵母提取物 | 0.5 克 |
| 蛋白酶蛋白胨 | 0.5 克 |
| 右旋糖 | 0.5克 |
| 淀粉，可溶性 | 0.5 克 |
| K2HPO4 | 0.5 克 |
| 蒸馏水 | 高达 1000 毫升 |
| 通过在 121°C 和 15 PSI 下高压灭菌 15 分钟。 | |
| M2G | |
| 10X M2 盐 （1L） - | |
| Na2HPO4 | 17.4 克 |
| KH2PO4 | 10.6 克 |
| NH4厘升 | 5.0 克 |
| 在121°C和15PSI下高压灭菌10X M 2盐15分钟。 | |
| 10X M2盐 | 100毫升 |
| 50毫米氯化镁2 | 10毫升 |
| 30% 葡萄糖 （w/v） | 10毫升 |
| 1 mM FeSO4 在 0.8 mM EDTA 中，pH 6.8 | 10毫升 |
| 50 毫米氯化钙2 | 10毫升 |
| 蒸馏水 | 高达 1000 毫升 |
| 过滤器消毒。 | |
| 溶原肉汤 （LB） | |
| 酪蛋白酶水解物 | 10 克 |
| 酵母提取物 | 5 克 |
| 氯化钠 | 10 克 |
| 蒸馏水 | 高达 1000 毫升 |
| 通过在 121°C 和 15 PSI 下高压灭菌 15 分钟。 | |
| 营养肉汤（NB） | |
| 蛋白胨 | 15 克 |
| 酵母提取物 | 3 克 |
| 氯化钠 | 6 克 |
| 葡萄糖 | 1 克 |
| 蒸馏水 | 高达 1000 毫升 |
| 通过在 121°C 和 15 PSI 下高压灭菌 15 分钟。 | |
| 胰蛋白酶大豆汤 | |
| 酪蛋白的胰腺消化物 | 17.0 克 |
| 豆粕的教皇文摘 | 3 克 |
| 氯化钠 | 5 克 |
| K2HPO4 | 2.5 克 |
| 右旋糖 | 2.5 克 |
| 蒸馏水 | 高达 1000 毫升 |
| 通过在 121°C 和 15 PSI 下高压灭菌 15 分钟。 | |
| M63 | |
| NH4厘升 | 2克 |
| KH2PO4 | 13.6 克 |
| 二氧化铁4.7H 2O | 0.5毫克 |
| 20%甘油 | 10毫升 |
| 1M 镁硫4 | 1毫升 |
| 蒸馏水 | 高达 1000 毫升 |
| M9 最小介质 | |
| 5X M9盐 | |
| Na2HPO4.7H 20 | 12.8 克 |
| KH2PO4 | 3 克 |
| NH4厘升 | 1 克 |
| 氯化钠 | 0.5 克 |
| 蒸馏水 | 高达 200 毫升 |
| 在 121°C 和 15 PSI 下高压灭菌 5X M9 盐 15 分钟。 | |
| 1X M9 介质 | |
| 5X M9盐 | 20毫升 |
| 20%葡萄糖 | 2毫升 |
| 1M 镁硫4 | 200微升 |
| 1M 氯化钙2 | 10 微升 |
| 高压灭菌水 | 高达 100 毫升 |
| 注意 – 对于固体培养基制备，请使用 1.5% 杆菌琼脂 （15 克/升） |
表 1.
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Discussion
众所周知，地球上只有大约1%的细菌可以在实验室中轻松培养6。即使在可培养的细菌中，许多细菌仍未被描述。分子方法的改进为细菌群落的分析和评估提供了新的维度。然而，这些技术确实有局限性，但它们不会使培养分析变得多余。分离单个细菌种类的纯培养技术仍然是表征生理特性的主要机制。土壤和水生栖息地蕴藏着许多具有新型酶和途径的细菌，这些细菌可用于生物技术用途。本研究描述了一种从生态样品中分离和表征细菌的简单且廉价的方法。
不同的细菌具有不同的营养需求，因此使用各种生长培养基来增加分离不同细菌物种的概率。这种方法的一个主要限制是，具有苛刻生长要求的微生物可能会被排除在外。此外，此步骤的主要目标是最大化从样品中获得的细菌种类的数量。样品库中细菌种类的数量将提高分离具有生物修复潜力的微生物的机会。虽然我们只改变生长培养基，但不同的生长温度和氧气浓度也可以增加进一步扩展具有独特物种41,42的样品库的机会。
该方案的一个关键步骤是检查被测基材（在我们的例子中是苯乙烯）的利用率。重要的是要小心设计此类调查的实验，以避免假阴性结果。根据生长特性，微生物可能无法立即适应利用被测试的底物，并且可能需要富集过程。在我们的案例中，细菌在用于测试碳氢化合物作为唯一碳源的利用的LCFBM培养基中生长缓慢25。为了避免这个问题，可以通过向LCFBM培养基中添加（1% v/v）TSB或NB来支持细菌生长来开始初始培养。培养微生物的鉴定通过16S rRNA测序43完成。该方法为微生物鉴定提供了一种稳健且经济高效的方法。然而，16S测序只能提供更高层次的分类鉴定。对于特定物种水平的鉴定，必须将其他家族特异性引物与各种生化测试结合使用44,45。
使用全细胞裂解物进行酶测定需要使用有效的细胞裂解方法。细菌细胞裂解通常通过超声处理来实现。然而，冻融法是温和细胞裂解的替代方法，据信可以防止蛋白质变性。该过程包括在-80°C下快速冷冻细胞并在4°C下依次解冻46。添加温和的洗涤剂，如NP-40或Triton-X-100也有助于细胞裂解，并且由于其非离子性质，不会使蛋白质变性47。然而，具有厚细胞壁的细菌（例如蓝藻48 ）可能无法从使用去垢剂49 的温和细胞裂解方法中受益，因此，必须相应地选择酶测定的裂解方法。
通过关注环境样本中可培养的细菌种群，研究人员可以快速进行许多不同的实验。这里描述的方法不需要使用非常复杂的仪器，可以在标准实验室设置中轻松执行。由于使用碳氢化合物和危险化学品，实验室应根据标准操作程序配备适当的处理和处置。这里描述的方法可以很容易地适应于研究多种细菌物种，用于许多生物技术应用。
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Disclosures
作者声明不存在利益冲突。
Acknowledgments
我们感谢Karthik Krishnan博士和RP实验室成员的有益意见和建议。DS得到了SNU-Doctor奖学金和地球观察研究所印度奖学金的支持。RP实验室得到了Shiv Nadar大学的CSIR-EMR拨款和启动资金的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agarose | Sigma-Aldrich | A4718 | Gel electrophoresis |
| Ammonium chloride (NH4Cl) | Sigma-Aldrich | A9434 | Growth medium component |
| Ammonium sulphate | Sigma-Aldrich | A4418 | Growth medium component |
| Bacto-Agar | Millipore | 1016141000 | Solid media preparation |
| Calcium chloride (CaCl2) | MERCK | C4901-500G | Growth medium component |
| Catechol | Sigma-Aldrich | 135011 | Hydrocarbon degradation assay |
| Cetyltrimethylammonium bromide, CTAB | Sigma-Aldrich | H6269 | Genomic DNA Isolation |
| Chloroform | HIMEDIA | MB109 | Genomic DNA isolation |
| Disodium phosphate (Na2HPO4) | Sigma-Aldrich | S5136 | Growth medium component |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E9884 | gDNA buffer component |
| Ferrous sulphate, heptahydrate (FeSO4.7H20) | Sigma-Aldrich | 215422 | Growth medium component |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G7021 | Growth medium component |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | Growth medium component; Glycerol stocks |
| Isopropanol | HIMEDIA | MB063 | Genomic DNA isolation |
| LB Agar | Difco | 244520 | Growth medium |
| Luria-Bertani (LB) | Difco | 244620 | Growth medium |
| Magnesium sulphate (MgSO4) | MERCK | M2643 | Growth medium component |
| Manganese (II) sulfate monohydrate (MnSO4.H20) | Sigma-Aldrich | 221287 | Growth medium component |
| Nutrient Broth (NB) | Merck (Millipore) | 03856-500G | Growth medium |
| Peptone | Merck | 91249-500G | Growth medium component |
| Phenol | Sigma-Aldrich | P1037 | Genomic DNA isolation |
| Potassium phosphate, dibasic (K2HPO4) | Sigma-Aldrich | P3786 | Growth medium component |
| Potassium phosphate, monobasic (KH2PO4) | Sigma-Aldrich | P9791 | Growth medium component |
| Proteinase K | ThermoFisher Scientific | AM2546 | Genomic DNA isolation |
| QIAquick Gel Extraction kit | QIAGEN | 160016235 | DNA purification |
| QIAquick PCR Purification kit | QIAGEN | 163038783 | DNA purification |
| R2A Agar | Millipore | 1004160500 | Growth medium |
| SmartSpec Plus Spectrophotometer | BIO-RAD | 4006221 | Absorbance measurement |
| Sodium acetate | Sigma-Aldrich | S2889 | Genomic DNA isolation |
| Sodium chloride (NaCl) | Sigma-Aldrich | S9888 | Growth medium component |
| Sodium dodecyl sulphate (SDS) | Sigma-Aldrich | L3771 | Genomic DNA isolation |
| Styrene | Sigma-Aldrich | S4972 | Styrene biodegradation |
| Taq DNA Polymerase | NEB | M0273X | 16s rRNA PCR |
| Tris-EDTA (TE) | Sigma-Aldrich | 93283 | Resuspension of genomic DNA |
| Tryptic Soy Broth (TSB) | Merck | 22092-500G | Growth medium |
| Yeast extract | Sigma-Aldrich | Y1625-1KG | Growth medium component |
| Zinc sulfate heptahydrate (ZnSO4.7H20) | Sigma-Aldrich | 221376 | Growth medium component |
References
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