Summary
Vi presenterar processen att isolera, sprida och karakterisera kolvätenedbrytande bakterier från akvatiska livsmiljöer. Protokollet beskriver bakteriell isolering, identifiering med 16S rRNA-metoden och testning av deras kolvätenedbrytande potential. Denna artikel skulle hjälpa forskare att karakterisera mikrobiell biologisk mångfald i miljöprover, och specifikt screena för mikrober med bioremedieringspotential.
Abstract
Kolväteföroreningar är motsträviga mot nedbrytning och deras ackumulering i miljön är giftig för alla livsformer. Bakterier kodar för många katalytiska enzymer och är naturligt kapabla att metabolisera kolväten. Forskare utnyttjar biologisk mångfald i akvatiska ekosystem för att isolera bakterier med biologisk nedbrytning och bioremedieringspotential. Sådana isolat från miljön ger en rik uppsättning metaboliska vägar och enzymer, som kan utnyttjas ytterligare för att skala upp nedbrytningsprocessen i industriell skala. I den här artikeln beskriver vi den allmänna processen för isolering, förökning och identifiering av bakteriearter från vattenlevande livsmiljöer och skärmar deras förmåga att använda kolväten som den enda kolkällan in vitro med enkla tekniker. Detta protokoll beskriver isoleringen av olika bakteriearter och deras efterföljande identifiering med hjälp av 16S rRNA-analysen. Protokollet presenterar också steg för att karakterisera kolvätenedbrytande potential hos bakterieisolat. Detta protokoll kommer att vara användbart för forskare som försöker isolera bakteriearter från miljömiljöer för deras biotekniska tillämpningar.
Introduction
Kolväten (HC) används i stor utsträckning både som bränslen och i kemiska tillämpningar. Aromatiska kolväten som bensen, toluen och xylen används i stor utsträckning som lösningsmedel1. Alkener såsom etylen och propen tjänar som prekursorer vid syntesen av polyeten- respektive polypropenpolymerer. Polymerisation av ett annat kolväte, styren bildar polystyren. Antropogena aktiviteter introducerar kolväten i miljön under produktion och transport. Kolväteförorening av mark och vatten innebär allvarliga problem för miljön och människors hälsa. Mikrober spelar en viktig roll för att upprätthålla ekosystemet genom att reglera de biogeokemiska cyklerna och utnyttja ett brett spektrum av substrat, som också inkluderar föroreningar och xenobiotika, omvandla dem till kol och energikälla. Denna process för avgiftning av miljöföroreningar av mikroorganismer är känd som bioremediering 3,4,5,6,7.
Mikroorganismer med förmåga att bryta ned kolväten finns i vatten- och markmiljöer 8,9,10. Många bakterier med potential att bryta ner alkaner och aromatiska HC har identifierats, såsom Pseudomonas, Acinetobacter, Rhodococcus, Marinobacter och Oleibacter11. Utvecklingen av tekniskt avancerade kulturoberoende metoder har hjälpt till att upptäcka nya HC-nedbrytande mikrobiella samhällen12. Genomiskt material som isoleras direkt från källprover förstärks och sekvenseras med metoder med hög genomströmning som Next Generation Sequencing (NGS) följt av analys, vilket eliminerar behovet av att odla mikroorganismer. NGS-metoder, såsom metagenomanalys, är dyra och lider av nackdelar relaterade till förstärkningsprocessen13. Odlingstekniker som selektiv anrikningskultur14 som riktar sig mot isolering av kolvätenedbrytande mikrober är fortfarande användbara eftersom de tillåter forskare att undersöka och manipulera metaboliska vägar i bakterieisolat.
Genomisk DNA-isolering och efterföljande sekvensering av det genomiska materialet avslöjar värdefull information om vilken organism som helst. Helgenomsekvensering hjälper till att identifiera gener som kodar för antibiotikaresistens, potentiella läkemedelsmål, virulensfaktorer, transportörer, xenobiotiska-metaboliserande enzymer etc15,16,17. Sekvensering av 16SrRNA-kodande gen har visat sig vara en robust teknik för att identifiera bakteriell fylogeni. Bevarande av gensekvensen och funktionen genom åren gör det till ett pålitligt verktyg för att identifiera okända bakterier och jämföra ett isolat med de närmaste arterna. Dessutom är längden på denna gen optimal för bioinformatisk analys18. Alla dessa funktioner tillsammans med enkel genförstärkning med universella primers och förbättring av gensekvenseringsteknik gör det till en guldstandard för identifiering av mikrober.
Här beskriver vi ett förfarande för att återvinna odlingsbara mikroorganismer med HC-nedbrytande potential från miljöprover. Metoden som beskrivs nedan beskriver insamling och identifiering av HC-nedbrytande bakterier och är uppdelad i fem sektioner: (1) insamling av bakterier från vattenprover, (2) isolering av rena kulturer, (3) undersökning av HC-nedbrytande förmåga hos bakterieisolat (4) genomisk DNA-isolering och (5) identifiering baserad på 16S rRNA-gensekvensering och BLAST-analys. Denna procedur kan anpassas för att isolera bakterier för många olika biotekniska tillämpningar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Provtagning, bearbetning och analys
OBS: Här presenterar vi ett protokoll för att isolera bakterier från akvatiska livsmiljöer. Några av isolaten kan vara patogena, använd därför handskar och desinficera arbetsområdet före och efter användning.
- Samla 500 ml vattenprov i fem sterila glasflaskor från olika platser i vattenkroppen. Mät pH och temperatur för varje prov med hjälp av en pH-mätare respektive termometer.
OBS: Protokollet är inte platsspecifikt och kan enkelt anpassas för att isolera organismer från kolväteförorenade vattenförekomster också. - Filtrera provet i en sats av filterark med storleken 100 ml till och med 0,22 μm porstorlek under aseptiska förhållanden.
OBS: Filterpapperets diameter bör inte överstiga petriskålens diameter. Till exempel är filterpapper som inte överstiger 85 mm diameter optimalt för en 100-120 mm petriskål. - Håll filterpapperen över olika näringsmedieplattor (PYE 19, R2A 20,M9, LB, NB, TSB, M63 21 och M2G22). De olika typerna av tillväxtmedier möjliggör urval och anrikning av olika mikroorganismer. Kompositioner av olika tillväxtmedier anges i tabell 1. Använd ett papper för varje mediaplatta och dra av efter 2 timmar med sterila pincett.
- Späd de ofiltrerade vattenproverna (10,6 spädning) i sterilt dubbeldestillerat vatten genom tillsats av 100 μL av det uppsamlade vattenprovet i 900 μL sterilt vatten. Detta resulterar i en utspädning på 1:10. Ta 100 μl från detta prov och tillsätt i 900 μl sterilt vatten för att erhålla spädning 1:100. Upprepa utspädningen tills utspädningsvecket är 1:1 000 000. Blanda genom pipettering. Den slutliga volymen av varje utspädning kommer att vara 1 ml.
- Sprid 100 μl av det utspädda vattenprovet individuellt på alla plattor av tillväxtmedier som nämns i steg 3 i tre exemplar.
- Inkubera plattorna vid 30 °C i 24–48 timmar beroende på koloniernas tillväxt.
OBS: De flesta miljöisolat växer vid en optimal temperatur på 30 °C. Om proverna isoleras från en miljö med extrema temperaturer, inkubera plattorna vid samma temperatur som uppsamlingsstället. - Välj sedan kolonierna med en steril tandpetare eller pipettspets och utför kvadrantsträckning för att få isolerade kolonier.
- Inkubera plattorna över natten. Nästa dag, screena kolonierna baserat på deras morfologiska egenskaper som färg, struktur, form, storlek, marginal, höjd etc. Restreak kolonierna för att få rena kulturer.
- Utför gramfärgning av varje ren kultur23 och fortsätt med glycerolstamberedning.
- För beredning av glycerolstammen, inokulera en enda koloni i 3 ml lämpligt odlingssubstrat och inkubera vid 30 °C. Från nattkulturen, ta 700 μL och tillsätt 300 μL 100% glycerol (steriliserad genom autoklavering) i kryovialer24. Frys injektionsflaskorna vid -80 °C för långtidsförvaring.
2. Nedbrytning av kolväten
OBS: Exemplet nedan är att screena isolaten som kan bryta ner styren. Det är en smärre ändring av den metod som anpassades i en tidigare rapport25. Följ stegen under aseptiska förhållanden.
- Från en nystrimmig tallrik, välj en koloni och inokulera i 5 ml tryptisk sojabuljong (TSB) / näringsbuljong (NB). Odla kulturen över natten vid 30 ° C med skakning vid 200 rpm tills absorbansen når ~ 2.
OBS: Annat än TSB / NB kan vilket tillväxtmedium som helst väljas där bakterierna når hög celldensitet. - Nästa dag pelleterar cellerna vid 2862 x g i 5 min vid 4 °C och kasserar supernatanten.
- Tvätta pelleten två gånger med 2 ml autoklaverad saltlösning (0,9% NaCl) och snurra vid 2862 x g i 5 min vid 4 °C.
OBS: Saltlösning är isoton och upprätthåller därmed det osmotiska trycket inuti bakterieceller. - Återsuspendera pelleten i 2 ml flytande kolfritt basmedium (LCFBM). Mät absorbansen (OD600).
- Ta två sterila Erlenmeyerkolvar med 150 ml kontrollkapacitet och experimentgruppen. Märk dem som A och B.
- Tillsätt 40 ml LCFBM och styren (5 mM) i den oinokulerade /kontrollgruppen (kolv A).
- Tillsätt 35 ml LCFBM och styren i kolv B (justera den slutliga koncentrationen av styren till 5 mM). Tillsätt cellsuspensionen med en slutlig OD600 celler ≈ 0,1 och fyll den återstående volymen med LCFBM upp till 40 ml. Inkubera kolvarna vid 30 °C med skakning vid 200 varv/min i 30 dagar.
OBS: Kolväten i överskott kan vara giftiga för mikroberna, börja därför med låg koncentration och öka den gradvis. - Upprepa ovanstående för varje ytterligare stam som måste utvärderas med avseende på nedbrytning av kolväten.
- Mät OD600 för varje kolv var 5:e dag och rita upp en tillväxtkurva. Öka inkubationen upp till 45 dagar om bakterierna kan använda styren. En ökning av OD600 indikerar att bakterien kan metabolisera styren.
3. Screening av katekolnedbrytning med bakterieisolat
OBS: Nedbrytningen av aromatiska kolväten såsom styren, bensen, xylen, naftalen, fenoler etc. ger katekoler som reaktionsintermediärer. Katekolerna metaboliseras vidare av bakterier med hjälp av katekol-1,2-dioxygenas och katekol-2,3-dioxygenasenzymer genom orto- respektive metaklyvningsvägarna26. Dessa enzymer är också involverade i nedbrytningen av andra kolväten, såsom klorbensen27. Protokollet som nämns nedan använder helcellslysat för katekol 2, 3-dioxygenasenzymanalys28. Samma lysmetod kan användas för att screena aktiviteten av katekol 1, 2-dioxygenas. Reaktionsblandningens sammansättning varierar emellertid. Båda enzymerna är inducerbara i naturen och kan induceras genom tillsats av fenol till tillväxtmediet.
- Med hjälp av en steril slinga inokulerar bakteriekolonin från en nystrimmig platta i mineralsaltmedium (MSM) kompletterat med 1-4 mM fenol. Inkubera kulturen vid 30 °C och 200 rpm. Skörda kulturen vid 4 °C när OD 600 når mellan 1,4–1,6 (dvs. i sen exponentiell fas) genom att spinna vid4500 x g i 20 minuter.
- Tvätta cellpelleten med fosfatbuffert (0,5 M, pH 7,5).
- Återsuspendera cellerna i ovannämnda fosfatbuffert och justera den slutliga OD600 ≈ 1,0.
- Lyse cellerna genom pulserande ultraljudsbehandling för 1,5 min, varaktigheten av varje puls är 15 s. Efter detta steg måste suspensionen vara klar eller mindre grumlig. Om inte, öka antalet pulser och kontrollera om suspensionen är klar. Efter varje puls, håll provet på is för att undvika proteinnedbrytning.
- Ta bort cellskräp och obrutna celler genom centrifugering vid 9 000 x g i 30 minuter och behåll den kalla temperaturen (4 °C).
- Pipettera försiktigt den genomskinliga supernatanten. Denna fraktion har råextraktet för enzymanalys.
- Bestäm proteinkoncentrationen av råextrakt med antingen Bradford eller Lowrys metod29,30.
- För att bestämma aktiviteten av katekol-2,3-dioxygenas, mät bildningen av reaktionens slutprodukt (2-hydroximukonisk semialdehyd) med en spektrofotometer.
- Bered reaktionsblandningen genom att tillsätta 20 μl katekol (50 mM), 960 μL fosfatbuffert (50 mM, pH 7,5) och 20 μl råextrakt.
- För den negativa kontrollen, ersätt råextraktet med fosfatbuffert och justera den slutliga volymen till 1 ml.
- Inkubera reaktionsblandningen i 30 minuter. Vid inställda tidsintervall, mät absorbansen vid 375 nm. En ökning av absorbansen indikerar bildandet av reaktionens slutprodukt, 2-hydroximukonsyrasemialdehyd (2-HMS). Utför experimentet i tre exemplar.
OBS: Katekol är ljuskänsligt och syrekänsligt. Förvara reaktionsblandningen i mörker och stäng rören tätt för att förhindra naturlig nedbrytning av katekol.
4. Genomisk DNA-isolering av den rena kulturen
OBS: Detta är det allmänna protokollet för isolering av genomiskt DNA. Gramfärgning utfördes under provinsamlingen, bearbetningen och analyssteget. På grund av variationen i cellväggtjocklek hos grampositiva och gramnegativa bakterier modifieras celllysmetoden i enlighet därmed. Använd handskar medan du isolerar och desinficera arbetsbänken med 70% etanol för att undvika att nukleaserna bryter ned DNA. Några av de kemikalier som nämns nedan kan orsaka allvarliga brännskador på huden och korrekt försiktighet måste iakttas vid hantering av dem.
- Isolering av genomiskt DNA från gramnegativa bakterier31.
- Välj en enda koloni och inokulera i ett nytt tillväxtmedium i sterila provrör.
- Placera rören i en inkubatorshaker vid 200 rpm och låt bakterierna växa över natten vid 30 °C.
- Nästa dag, pellets 1,5 ml över natten odlad kultur vid 12 400 x g i 3 min.
- Ta bort supernatanten och suspendera pelleten igen i 200 μl lysbuffert (40 mM Tris-acetat, pH 7,8, 20 mM natriumacetat, 1 mM EDTA, 1% SDS).
- Tillsätt 66 μL NaCl-lösning (5 M) och blanda väl.
- Pelletera den resulterande blandningen vid 12 400 x g i 10 min (4 °C).
- Pipettera den klara supernatanten i ett nytt mikrocentrifugrör och tillsätt en lika stor volym kloroform.
- Invertera blanda lösningen flera gånger tills en mjölkaktig lösning observeras.
- Snurra vid 12 400 x g i 3 minuter och överför supernatanten till en ren injektionsflaska.
- Tillsätt 1 ml iskall 100% etanol; blanda genom inversion tills vita DNA-strängar fälls ut.
- Centrifugera det utfällda DNA:t vid 2 200 x g i 10 minuter vid 4 °C och kassera supernatanten.
- Tvätta DNA-pelleten med 1 ml 70% etanol och låt DNA-pelleten torka i 5 minuter vid rumstemperatur.
- När pelleten har torkat, suspenderas den på nytt i 100 μl 1x Tris-EDTA(TE)-buffert och DNA förvaras vid -20 °C.
- Mät koncentrationen (A260/280) med spektrofotometer och kör DNA på agarosgel (1%) för att bedöma kvaliteten på DNA24.
- Isolering av genomiskt DNA från grampositiv stam32
- Välj en enda koloni och inokulera i färskt tillväxtmedium i sterila provrör.
- Placera rören i en inkubatorshaker vid 200 rpm och låt bakterierna växa över natten vid en lämplig tillväxttemperatur.
- Nästa dag, ta 1,5 ml av den odlade kulturen och centrifugera vid 8,600 x g i 5 min.
- Ta bort supernatanten och suspendera cellerna i TE-bufferten.
- Justera OD600 = 1,0 med TE-buffert och överför 740 μL av cellsuspensionen till ett rent mikrofugerör.
- Tillsätt 20 μl lysozym (100 mg/ml buljong) och blanda väl genom pipettering. Inkubera vid 37 °C i 30 minuter (i torrt bad).
- Tillsätt 40 μL 10% SDS och blanda väl.
- Tillsätt 8 μl proteinas K (10 mg/ml). Blanda väl och inkubera vid 56 °C i 1-3 timmar (i torrt bad). Suspensionen bör bli klar nu med ökad viskositet, vilket markerar effektiv celllys.
OBS: Suspensionen kan lämnas över natten om cellerna inte lyseras ordentligt. - Förvärm blandningen CTAB/NaCl till 65 °C (i torrt bad) och tillsätt 100 μl av blandningen till cellsuspensionen. Blanda väl.
- Inkubera vid 65 °C i 10 minuter (i torrt bad).
- Tillsätt 500 μL kloroform:isoamylalkohol (24:1) och blanda väl. Snurra vid 16 900 x g i 10 min vid 25 °C.
- Överför vattenfasen till ett nytt mikrocentrifugrör och undvik den organiska fasen (viskös fas längst ner).
- Tillsätt försiktigt 500 μL fenol:kloroform:isoamylalkohol (25:24:1) och blanda väl. Snurra vid 16 900 x g i 10 min vid 25 °C.
- Ta vattenfasen i ett nytt mikrocentrifugrör. Tillsätt 500 μL kloroform:isoamylalkohol (24:1) och blanda väl.
- Överför vattenfasen och tillsätt 0,6 volymdelar isopropanol (förkyld vid -20 °C).
- De utfällda DNA-strängarna måste vara synliga i trådliknande form. Inkubera vid -20 °C i 2 timmar till övernattning.
- Centrifugera vid 16 900 x g i 15 min vid 4 °C för att pellet DNA.
- Häll av isopropanolen försiktigt och tvätta pelleten med 1 ml kall 70 % etanol (förkyld vid -20 °C) för att avlägsna eventuella föroreningar.
- Centrifugera vid 16 900 x g i 5 min vid 4 °C. Kassera supernatanten.
- Låt pelleten torka i rumstemperatur i 20 minuter eller håll röret vid 37 °C. Se till att pelleten inte är övertorkad.
- Resuspendera i 100 μl 1x TE-buffert och förvara DNA vid -20 °C.
OBS: Om pelleten blir övertorkad och är svår att återsuspendera, inkubera mikrocentrifugröret med DNA-pellet och nukleasfritt vatten vid 37 °C i 15-20 minuter och återsuspendera igen genom pipettering. - Mät koncentrationen (A260/280) med hjälp av en spektrofotometer efter att ha gjort 1:100 utspädning i 1x TE-buffert och kör DNA på agarosgel (1%) för att bedöma kvaliteten på DNA24.
5. 16S rRNA-sekvensering
OBS: Protokollet som beskrivs nedan är för amplifiering och sekvensering av 16S rRNA för bakteriell identifiering. Information härledd från 16S rRNA-sekvensen används för identifiering av en okänd organism och för att hitta släktskapet mellan olika organismer.
- För att identifiera stammarna, amplifiera DNA isolerat från de rena bakteriekulturerna med PCR med universella primrar riktade mot 16S rRNA-sekvens för bakterier: 27F (5'-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3') och 1492R (5'- TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3')33.
- Bered PCR-blandningen (25 μL-reaktioner) på is med 18 μL autoklaverat/nukleasfritt vatten, 2,5 μL 10x buffert, 0,5 μL både framåt- och bakåtprimrar (100 μM lager), 2 μL dNTP-blandning (100 μM lager), 1 μL DNA-mall (2-15 ng/μL) och 1 U Taq-polymeras.
- Använd följande cykelförhållanden för 16S rRNA-genamplifiering: Inledande denaturering vid 94 °C i 10 minuter (slutlig denaturering vid 94 °C i 40 s, primerglödgning vid 56 °C i 1 min, förlängning vid 74 °C i 2 minuter) x 30 cykler, slutlig förlängning vid 74 °C i 10 minuter.
- När cykeln är slut, blanda 5 μL prov och 1 μL 5x DNA-laddningsfärgämne. Kör på 1% agarosgel för att verifiera förstärkningen. Förvara PCR-produkterna vid 4 °C under kort tid eller frys dem vid -20 °C tills vidare användning.
- För 16S rRNA-gensekvensering, ställ in samma reaktion som nämnts ovan för högre volym (100 μL).
- Rena amplicons för Sanger-sekvensering24,34 med PCR-produktreningssats eller blanda hela provet med DNA-laddningsfärgämne och ladda på en agarosgel för att utföra gelextraktionsmetod.
- När sekvenseringen är klar konverterar du resultatfilen i FASTA-format och kontrollerar sekvenslikheten med det grundläggande sökverktyget för lokal justering (BLAST) på NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)35.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Schemat som beskriver hela proceduren för isolering och screening av bakterier från akvatiska livsmiljöer och deras efterföljande identifiering genom 16S rRNA-analys representeras i figur 1. Vattenprover från en våtmark i Dadri, Indien samlades in i sterila glasflaskor och togs omedelbart till laboratoriet för bearbetning. Proverna leddes genom filterplåtar med en porstorlek på 0,22 μm och filterpapperen hölls i kontakt med olika mediaplattor. Efter 2 timmar avlägsnades filterpapper och plattorna inkuberades över natten vid 30 °C för kolonibildning (figur 2). Nästa dag valdes enskilda bakteriekolonier ut och strimlades på färska medieplattor (figur 2). Den rena kulturen som genererades lagrades och användes därefter för vidare analys. Med hjälp av denna metod kunde vi skapa ett bibliotek med mer än 100 unika bakterieisolat. Vi syftade till att identifiera bakterieisolat som kan utnyttja kolväten, särskilt styren, som är den primära komponenten i engångsplast. De isolerade bakterierna odlades individuellt i respektive media med tillsats av flytande styren som enda kolkälla (figur 3). Vi kunde identifiera fyra isolat som använder styren som en enda kolkälla. Två av isolaten karakteriserades utförligt ytterligare för styrennedbrytning25.
Bakterieisolaten testades sedan för förekomst av enzymatiska vägar för nedbrytning av kolvätemetabolism. Kolvätemetabolism i vissa bakterier resulterar i produktion av katekoler som mellanprodukter, som ytterligare bryts ned genom ortoklyvning och metaklyvningsvägar. Katekol-1,2-dioxygenas och katekol-2,3-dioxygenasenzymer är ansvariga för ringklyvningsreaktion36. Miljöbakterier som har dessa enzymer har visat sig metabolisera flera aromatiska föreningar. Således utfördes en katekolnedbrytningsanalys för att bedöma bakterieisolatens HC-nedbrytande potential (figur 4). En representativ bestämning för ett av isolaten visas i figur 4.
För att identifiera bakterieisolaten utfördes 16S rRNA-sekvensering. En preliminär gramfärgning utfördes för att karakterisera bakterierna, vilket hjälper till att identifiera och felsöka efterföljande steg. Grampositiva bakterier är vanligtvis motsträviga mot celllysbuffertar som leder till lågt genomiskt DNA-utbyte37. Således skulle resultaten erhållna från gramfärgning38 före genomisk DNA-isolering hjälpa till att välja protokollet för genomisk DNA-isolering. Efter DNA-isolering bekräftades integriteten hos genomiskt DNA genom att visualisera ett litet DNA-prov på agarosgel (figur 5A) och kvantifieras med UV-absorbansmetod med användning av en spektrofotometer. 16S rRNA-genen amplifierades med hjälp av universell primersekvens (figur 5B). Medan 500 bp är avgörande för sekvensering, uppnås ideala resultat med 1 300-1 500 bp39. För att erhålla graden av släktskap mellan isolerade stammar konstruerades ett fylogenetiskt träd med hjälp av programvaran phylogeny.fr40 (figur 6).
Figur 1: Schematiskt arbetsflöde för studien Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Bilder av bakteriekolonier från vattenprover. Det uppsamlade vattenprovet leddes genom 0,22 μm filterpapper. Filterpapperen förvarades över olika mediaplattor. Plattorna inkuberades i 24-48 timmar tills isolerade kolonier observerades. De enskilda kolonierna strök sedan på färska tallrikar för ren kulturisolering. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: Representativa resultat av mikrobiell nedbrytning av styren och screening av kolvätenedbrytningspotential hos bakterier. Cellerna odlades i LCFBM kompletterat med 5 mM styren som enda kolkälla under 40 dagar vid 30 °C och 200 rpm. OD600 mättes var 5:e dag. Kontrollkolven hade endast LCFBM. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 4: Representation av katekol-2,3-dioxygenasenzymanalys för att övervaka nedbrytningen av katekol. A) Det färglösa substratet katekol omvandlas till en gulfärgad produkt genom katekol-2,3-dioxygenas. Reaktionsblandningen innehåller katekol, fosfatbuffert och råcellslysat. Bildningen av produkten detekteras genom mätning av absorbans vid 375 nm. b) Representativ graf för katekol-2,3-dioxygenasenzymtest med helcellslysat. Reaktionsblandningen i negativ kontroll har buffert och katekolsubstrat utan celllysat. Absorbansen mättes vid 375 nm med ett intervall på 10 min. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 5: Genomisk DNA-isolering och 16S rRNA PCR. (A) Gelelektrofores av isolerat genomiskt DNA. Lane M: DNA-storleksmarkör, Lane 1-2: Genomiskt DNA. (B) Verifiering av 16S rRNA-genamplifiering med 1% gelelektrofores. Geler visualiserades genom färgning med etidiumbromid; Lane M: DNA-storleksmarkör (1 kb), Lane 1-4: Förstärkta PCR-produkter från olika stammar. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 6: Analys av 16S rRNA-gensekvenseringsresultat. Representativ dendrogramkonstruktion med hjälp av phylogeny.fr-programmet för att skildra släktskapet mellan Exiguobacterium-stammar isolerade från en våtmark (markerad i röd ruta) med den kända Exiguobacterium sp. 16S rRNA-sekvenserna av kända Exiguobacterium sp. erhölls från NCBI. Denna siffra har hämtats från en tidigare artikel (Chauhan et.al.) utan någon ändring25. Klicka här för att se en större version av denna figur.
| Pepton jäst extrakt (PYE) | |
| Pepton | 2g |
| Jästextrakt | 1g |
| 1 M MgSO4 | 1 ml |
| 1M CaCl2 | 1 ml |
| Destillerat vatten | Upp till 1000 ml |
| Sterilisera i autoklav vid 121 °C och 15 PSI i 15 minuter. | |
| Reasoners 2A (R2A) | |
| Hydrolysat av kaseinsyra | 0,5 gr |
| Jästextrakt | 0,5 gr |
| Proteas pepton | 0,5 gr |
| Druvsocker | 0,5 g |
| Stärkelse, löslig | 0,5 gr |
| K2HPO4 | 0,5 gr |
| Destillerat vatten | Upp till 1000 ml |
| Sterilisera i autoklav vid 121 °C och 15 PSI i 15 minuter. | |
| M2G | |
| 10X M2 salter (1L) - | |
| Na2HPO4 | 17.4 gr |
| KH2PO4 | 10.6 gr |
| NH4Cl | 5.0 gr |
| Autoklav 10X M2 salter vid 121 °C och 15 PSI i 15 min. | |
| 10X M2 salter | 100 ml |
| 50mM MgCl2 | 10 ml |
| 30% glukos (w/v) | 10 ml |
| 1 mMFeSO4 i 0,8 mM EDTA, pH 6,8 | 10 ml |
| 50 mM CaCl2 | 10 ml |
| Destillerat vatten | Upp till 1000 ml |
| Filtrera sterilisera. | |
| Lysogeni buljong (LB) | |
| Kaseinenzymhydrolysat | 10 g |
| Jästextrakt | 5 g |
| NaCl | 10 g |
| Destillerat vatten | Upp till 1000 ml |
| Sterilisera i autoklav vid 121 °C och 15 PSI i 15 minuter. | |
| Näringsbuljong (NB) | |
| Pepton | 15 g |
| Jästextrakt | 3 g |
| NaCl | 6 g |
| Glukos | 1 g |
| Destillerat vatten | Upp till 1000 ml |
| Sterilisera i autoklav vid 121 °C och 15 PSI i 15 minuter. | |
| Tryptisk sojabuljong (TSB) | |
| Pankreas digest av kasein | 17.0 gr |
| Papaic digest av sojaböna måltid | 3 g |
| NaCl | 5 g |
| K2HPO4 | 2,5 gr |
| Druvsocker | 2,5 gr |
| Destillerat vatten | Upp till 1000 ml |
| Sterilisera i autoklav vid 121 °C och 15 PSI i 15 minuter. | |
| M63 | |
| NH4Cl | 2g |
| KH2PO4 | 13.6 gr |
| FeSO4.7H 2O | 0,5 mg |
| 20% glycerol | 10 ml |
| 1 M MgSO4 | 1 ml |
| Destillerat vatten | Upp till 1000 ml |
| M9 minimal media | |
| 5X M9-salter | |
| Na 2HPO4.7H 20 | 12.8 gr |
| KH2PO4 | 3 g |
| NH4Cl | 1 g |
| NaCl | 0,5 gr |
| Destillerat vatten | Upp till 200 ml |
| Autoklav 5X M9-salter vid 121 ° C och 15 PSI i 15 min. | |
| 1X M9-media | |
| 5X M9-salter | 20 ml |
| 20% glukos | 2 ml |
| 1 M MgSO4 | 200 μl |
| 1M CaCl2 | 10 μl |
| Autoklaverat vatten | Upp till 100 ml |
| OBS – För beredning av fasta medier, använd 1,5 % Bacto Agar (15 g/L) |
Tabell 1.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Det är väl etablerat att endast cirka 1% av bakterierna på jorden lätt kan odlas i laboratoriet6. Även bland de odlingsbara bakterierna förblir många okaraktäriserade. Förbättringar i molekylära metoder har gett en ny dimension till analys och utvärdering av bakteriesamhällen. Sådana tekniker har dock begränsningar, men de gör inte kulturanalyserna överflödiga. Rena odlingstekniker för att isolera enskilda bakteriearter förblir den primära mekanismen för karakterisering av fysiologiska egenskaper. Jord och vattenlevande livsmiljöer hyser många bakterier med nya enzymer och vägar, som kan utnyttjas för biotekniska användningsområden. Denna studie beskriver en enkel och billig metod för isolering och karakterisering av bakterier från ekologiska prover.
Olika bakterier har olika näringsbehov, varför olika tillväxtmedier användes för att öka sannolikheten för att isolera olika bakteriearter. En stor begränsning med denna metod är att mikrober med krävande tillväxtkrav kan uteslutas. Huvudmålet med detta steg är också att maximera antalet bakteriearter som erhålls från provet. Antalet bakteriearter i provbiblioteket skulle förbättra chanserna att isolera mikrober med bioremedieringspotential. Även om vi bara varierade tillväxtmedier kan varierande tillväxttemperatur och syrekoncentration också öka chanserna att ytterligare utöka provbiblioteket med unika arter41,42.
Ett kritiskt steg i protokollet är att kontrollera användningen av substratet som testas (styren i vårt fall). Det är viktigt att utforma experimentet för sådan undersökning med försiktighet för att undvika falskt negativa resultat. Beroende på tillväxtegenskaper kan mikroben inte omedelbart anpassa sig till att använda substratet som testas och kan kräva en anrikningsprocess. I vårt fall är bakterietillväxten långsam i LCFBM-mediet som används för att testa användningen av kolväte som enda kolkälla25. För att kringgå detta problem kan initiala kulturer startas genom att tillsätta (1% v / v) TSB eller NB till LCFBM-mediet för att stödja bakterietillväxt. Identifiering av den odlade mikroben uppnås genom 16S rRNA-sekvensering43. Denna metod erbjuder en robust och kostnadseffektiv metod för mikrobiell identifiering. 16S-sekvensering kan dock endast ge taxonomisk identifiering på högre nivå. För specifik identifiering på artnivå måste andra familjespecifika primrar användas i kombination med olika biokemiska tester44,45.
Enzymanalys med helcellslysat kräver användning av en effektiv celllysmetod. Bakteriell celllys uppnås vanligtvis genom att utföra ultraljudsbehandling. En frys-tina metod är dock en alternativ metod för mild celllys, vilket tros förhindra denaturering av protein. Förfarandet består i att snabbt frysa cellerna vid -80 °C och tina vid 4 °C i följd46. Tillsatsen av milda tvättmedel som NP-40 eller Triton-X-100 hjälper också till vid celllys och denaturerar inte proteinerna på grund av deras icke-joniska natur47. Bakterier med tjocka cellväggar som cyanobakterier48 kan dock inte dra nytta av den skonsamma celllysmetoden med användning av tvättmedel49 och därför måste lysmetoden för enzymanalys väljas därefter.
Genom att fokusera på den odlingsbara bakteriepopulationen från miljöprover kan forskare snabbt utföra många olika experiment. De metoder som beskrivs här kräver inte användning av mycket sofistikerade instrument och kan enkelt utföras i en standardlaboratorieuppsättning. Eftersom kolväten och farliga kemikalier används bör laboratoriet utrustas med korrekt hantering och bortskaffande enligt standardrutiner. Tillvägagångssättet som beskrivs här kan enkelt anpassas för att studera en mängd olika bakteriearter för många biotekniska tillämpningar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna deklarerar inga intressekonflikter.
Acknowledgments
Vi tackar Dr. Karthik Krishnan och medlemmar i RP-labbet för deras hjälpsamma kommentarer och förslag. DS stöds av SNU-Doctoral fellowship och Earthwatch Institute India Fellowship. RP-labbet stöds av ett CSIR-EMR-bidrag och startfonder från Shiv Nadar University.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agarose | Sigma-Aldrich | A4718 | Gel electrophoresis |
| Ammonium chloride (NH4Cl) | Sigma-Aldrich | A9434 | Growth medium component |
| Ammonium sulphate | Sigma-Aldrich | A4418 | Growth medium component |
| Bacto-Agar | Millipore | 1016141000 | Solid media preparation |
| Calcium chloride (CaCl2) | MERCK | C4901-500G | Growth medium component |
| Catechol | Sigma-Aldrich | 135011 | Hydrocarbon degradation assay |
| Cetyltrimethylammonium bromide, CTAB | Sigma-Aldrich | H6269 | Genomic DNA Isolation |
| Chloroform | HIMEDIA | MB109 | Genomic DNA isolation |
| Disodium phosphate (Na2HPO4) | Sigma-Aldrich | S5136 | Growth medium component |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E9884 | gDNA buffer component |
| Ferrous sulphate, heptahydrate (FeSO4.7H20) | Sigma-Aldrich | 215422 | Growth medium component |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G7021 | Growth medium component |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | Growth medium component; Glycerol stocks |
| Isopropanol | HIMEDIA | MB063 | Genomic DNA isolation |
| LB Agar | Difco | 244520 | Growth medium |
| Luria-Bertani (LB) | Difco | 244620 | Growth medium |
| Magnesium sulphate (MgSO4) | MERCK | M2643 | Growth medium component |
| Manganese (II) sulfate monohydrate (MnSO4.H20) | Sigma-Aldrich | 221287 | Growth medium component |
| Nutrient Broth (NB) | Merck (Millipore) | 03856-500G | Growth medium |
| Peptone | Merck | 91249-500G | Growth medium component |
| Phenol | Sigma-Aldrich | P1037 | Genomic DNA isolation |
| Potassium phosphate, dibasic (K2HPO4) | Sigma-Aldrich | P3786 | Growth medium component |
| Potassium phosphate, monobasic (KH2PO4) | Sigma-Aldrich | P9791 | Growth medium component |
| Proteinase K | ThermoFisher Scientific | AM2546 | Genomic DNA isolation |
| QIAquick Gel Extraction kit | QIAGEN | 160016235 | DNA purification |
| QIAquick PCR Purification kit | QIAGEN | 163038783 | DNA purification |
| R2A Agar | Millipore | 1004160500 | Growth medium |
| SmartSpec Plus Spectrophotometer | BIO-RAD | 4006221 | Absorbance measurement |
| Sodium acetate | Sigma-Aldrich | S2889 | Genomic DNA isolation |
| Sodium chloride (NaCl) | Sigma-Aldrich | S9888 | Growth medium component |
| Sodium dodecyl sulphate (SDS) | Sigma-Aldrich | L3771 | Genomic DNA isolation |
| Styrene | Sigma-Aldrich | S4972 | Styrene biodegradation |
| Taq DNA Polymerase | NEB | M0273X | 16s rRNA PCR |
| Tris-EDTA (TE) | Sigma-Aldrich | 93283 | Resuspension of genomic DNA |
| Tryptic Soy Broth (TSB) | Merck | 22092-500G | Growth medium |
| Yeast extract | Sigma-Aldrich | Y1625-1KG | Growth medium component |
| Zinc sulfate heptahydrate (ZnSO4.7H20) | Sigma-Aldrich | 221376 | Growth medium component |
References
- Sirotkin, A. V. Reproductive effects of oil-related environmental pollutants. Encyclopedia of Environmental Health. , 493-498 (2019).
- Li, C., Busquets, R., Campos, L. C. Assessment of microplastics in freshwater systems: A review. Science of The Total Environment. 707, 135578 (2020).
- Siddiqa, A., Faisal, M. Microbial degradation of organic pollutants using indigenous bacterial strains. Handbook of Bioremediation. , 625-637 (2021).
- Hossain, F., et al. Bioremediation potential of hydrocarbon degrading bacteria: isolation, characterization, and assessment. Saudi Journal of Biological Sciences. , (2021).
- Wongbunmak, A., Khiawjan, S., Suphantharika, M., Pongtharangkul, T. BTEX biodegradation by Bacillus amyloliquefaciens subsp. plantarum W1 and its proposed BTEX biodegradation pathways. Scientific Reports. 10 (1), 17408 (2020).
- Bodor, A., et al. Challenges of unculturable bacteria: environmental perspectives. Reviews in Environmental Science and Bio/Technology. 19 (1), 1-22 (2020).
- Phale, P. S., Sharma, A., Gautam, K. Microbial degradation of xenobiotics like aromatic pollutants from the terrestrial environments. Pharmaceuticals and Personal Care Products: Waste Management and Treatment Technology. , 259-278 (2019).
- Brooijmans, R. J. W., Pastink, M. I., Siezen, R. J. Hydrocarbon-degrading bacteria: the oil-spill clean-up crew. Microbial Biotechnology. 2 (6), 587-594 (2009).
- Sorkhoh, N. A., Ghannoum, M. A., Ibrahim, A. S., Stretton, R. J., Radwan, S. S. Crude oil and hydrocarbon-degrading strains of Rhodococcus rhodochrous isolated from soil and marine environments in Kuwait. Environmental Pollution. 65 (1), 1-17 (1990).
- Chaillan, F., et al. Identification and biodegradation potential of tropical aerobic hydrocarbon-degrading microorganisms. Research in Microbiology. 155 (7), 587-595 (2004).
- Bôto, M. L., et al. Harnessing the potential of native microbial communities for bioremediation of oil spills in the Iberian Peninsula NW coast. Frontiers in Microbiology. 12, 879 (2021).
- Wang, Y., et al. A culture-independent approach to unravel uncultured bacteria and functional genes in a complex microbial community. PloS One. 7 (10), 47530 (2012).
- Jovel, J., et al. Characterization of the gut microbiome using 16S or shotgun metagenomics. Frontiers in Microbiology. 7, 459 (2016).
- Spini, G., et al. Molecular and microbiological insights on the enrichment procedures for the isolation of petroleum degrading bacteria and fungi. Frontiers in Microbiology. 0, 2543 (2018).
- Pightling, A. W., et al. Interpreting whole-genome sequence analyses of foodborne bacteria for regulatory applications and outbreak investigations. Frontiers in Microbiology. , 1482 (2018).
- Salipante, S. J., et al. Application of whole-genome sequencing for bacterial strain typing in molecular epidemiology. Journal of Clinical Microbiology. 53 (4), 1072-1079 (2015).
- Lovley, D. R. Cleaning up with genomics: applying molecular biology to bioremediation. Nature Reviews Microbiology. 1 (1), 35-44 (2003).
- Janda, J. M., Abbott, S. L. 16S rRNA gene sequencing for bacterial identification in the diagnostic laboratory: pluses, perils, and pitfalls. Journal of Clinical Microbiology. 45 (9), 2761-2764 (2007).
- Poindexter, J. S. Biological properties and classification of the Caulobacter group. Bacteriological Reviews. 28 (3), 231-295 (1964).
- Reasoner, D. J., Geldreich, E. A new medium for the enumeration and subculture of bacteria from potable water. Applied and Environmental Microbiology. 49 (1), 1-7 (1985).
- Pardee, A. B. The genetic control and cytoplasmic expression of “Inducibility” in the synthesis of β-galactosidase by E. coli. Journal of Molecular Biology. 1 (2), 165-178 (1959).
- Ely, B.
- R, C.
- Green, M. R., Hughes, H., Sambrook, J., MacCallum, P. Molecular cloning: a laboratory manual. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. , 1890 (2012).
- Chauhan, D., Agrawal, G., Deshmukh, S., Roy, S. S., Priyadarshini, R. Biofilm formation by Exiguobacterium sp. DR11 and DR14 alter polystyrene surface properties and initiate biodegradation. RSC Advances. 8 (66), 37590-37599 (2018).
- Takeo, M., Nishimura, M., Shirai, M., Takahashi, H., Negoro, S. Purification and characterization of catechol 2,3-Dioxygenase from the aniline degradation pathway of Acinetobacter sp. YAA and its mutant enzyme, which resists substrate inhibition. Bioscience, Biotechnology, Biochemistry. 71, 70079-70080 (2007).
- Nguyen, O. T., Ha, D. D. Degradation of chlorotoluenes and chlorobenzenes by the dual-species biofilm of Comamonas testosteroni strain KT5 and Bacillus subtilis strain DKT. Annals of Microbiology. 69 (3), 267-277 (2019).
- Hupert-Kocurek, K., Guzik, U., Wojcieszyńska, D. Characterization of catechol 2, 3-dioxygenase from Planococcus sp. strain S5 induced by high phenol concentration. Acta Biochimica Polonica. 59 (3), (2012).
- Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry. 72 (1-2), 248-254 (1976).
- Peterson, G. L., et al. A simplification of the protein assay method of Lowry et al. which is more generally applicable. Analytical Biochemistry. 83 (2), 346-356 (1977).
- Chen, W. P., Kuo, T. T. A simple and rapid method for the preparation of gram-negative bacterial genomic DNA. Nucleic Acids Research. 21 (9), 2260 (1993).
- William, S., Feil, H., Copeland, A. Bacterial genomic DNA isolation using CTAB. Sigma. 50 (6876), (2012).
- Frank, J. A., et al. Critical evaluation of two primers commonly used for amplification of bacterial 16S rRNA genes. Applied and Environmental Microbiology. 74 (8), 2461-2470 (2008).
- Sanger, F., Nicklen, S., Coulson, A. R. DNA sequencing with chain-terminating inhibitors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 74 (12), 5463-5467 (1977).
- Johnson, M., et al. NCBI BLAST: a better web interface. Nucleic Acids Research. 36, suppl 2 5-9 (2008).
- Harayama, S., Rekik, M. Bacterial aromatic ring-cleavage enzymes are classified into two different gene families. Journal of Biological Chemistry. 264 (26), 15328-15333 (1989).
- Li, X., et al. Efficiency of chemical versus mechanical disruption methods of DNA extraction for the identification of oral Gram-positive and Gram-negative bacteria. The Journal of International Medical Research. 48 (5), 300060520925594 (2020).
- Coico, R.
- Clarridge, J. E. III Impact of 16S rRNA gene sequence analysis for identification of bacteria on clinical microbiology and infectious diseases. Clinical Microbiology Reviews. 17 (4), 840 (2004).
- Dereeper, A., et al. Phylogeny. fr: robust phylogenetic analysis for the non-specialist. Nucleic Acids Research. 36, suppl 2 465-469 (2008).
- Wadowsky, R. M., Wolford, R., McNamara, A. M., Yee, R. B. Effect of temperature, pH, and oxygen level on the multiplication of naturally occurring Legionella pneumophila in potable water. Applied and Environmental Microbiology. 49 (5), 1197-1205 (1985).
- du Toit, W. J., Pretorius, I. S., Lonvaud-Funel, A. The effect of sulphur dioxide and oxygen on the viability and culturability of a strain of Acetobacter pasteurianus and a strain of Brettanomyces bruxellensis isolated from wine. Journal of Applied Microbiology. 98 (4), 862-871 (2005).
- Johnson, J. S., et al. Evaluation of 16S rRNA gene sequencing for species and strain-level microbiome analysis. Nature Communications. 10 (1), 1-11 (2019).
- Kim, E., et al. Design of PCR assays to specifically detect and identify 37 Lactobacillus species in a single 96 well plate. BMC Microbiology. 20 (1), 1-14 (2020).
- Poretsky, R., Rodriguez-R, L. M., Luo, C., Tsementzi, D., Konstantinidis, K. T. Strengths and limitations of 16S rRNA gene amplicon sequencing in revealing temporal microbial community dynamics. PLoS ONE. 9 (4), (2014).
- Johnson, B. H., Hecht, M. H. Recombinant proteins can be isolated from E. coli cells by repeated cycles of freezing and thawing. Bio/Technology. 12 (12), 1357-1360 (1994).
- Rodríguez-Carmona, E., Cano-Garrido, O., Seras-Franzoso, J., Villaverde, A., García-Fruitós, E. Isolation of cell-free bacterial inclusion bodies. Microbial Cell Factories. 9 (1), 71 (2010).
- Hoiczyk, E., Hansel, A. Cyanobacterial cell walls: News from an unusual prokaryotic envelope. Journal of Bacteriology. 182 (5), 1191 (2000).
- Erstad, S. M., Sakuragi, Y. Easy and efficient permeabilization of cyanobacteria for in vivo enzyme assays using B-PER. Bio-Protocol. 8 (1), (2018).
