Summary
我们描述了用小鼠大脑中表达荧光素酶 - 绿色荧光蛋白（GFP）的双报告载体转导的人神经祖细胞的实质内移植。移植后，使用荧光显微镜在脑切片 中鉴定的体内 生物发光和表达GFP的移植细胞反复测量荧光素酶信号。
Abstract
细胞疗法长期以来一直是实验神经生物学中新兴的治疗范式。然而，细胞移植研究通常依赖于终点测量，因此只能在有限的程度上评估细胞迁移和存活的纵向变化。本文提供了一种可靠的微创方案，用于移植和纵向跟踪成年小鼠大脑中的神经祖细胞（NPC）。在移植之前，用包含生物发光（萤火虫 - 荧光素酶）和荧光（绿色荧光蛋白[GFP]）报告基因的慢病毒载体转导细胞。NPC在感觉运动皮层中使用立体定向注射移植到右皮质半球。移植后，通过完整的颅骨检测移植细胞长达五周（在第0，3，14，21，35天），使用 体内 生物发光成像的分辨率限制为6，000个细胞。随后，在组织学脑切片中鉴定移植的细胞，并用免疫荧光进一步表征。因此，该协议为移植，跟踪，量化和表征小鼠大脑中的细胞提供了有价值的工具。
Introduction
哺乳动物大脑在受伤或疾病后的再生能力有限，需要创新的策略来促进组织和功能修复。临床前策略侧重于脑再生的不同方面，包括神经保护，神经发生，血管生成1，2，血脑屏障修复3，4或细胞治疗5，6。细胞疗法的优点是能够同时促进许多这些促修复过程。在细胞移植实验中，组织修复是通过（1）直接细胞替代和（2）导致血管生成和神经发生的细胞因子的产生7发生的。干细胞技术的最新进展进一步促进了可扩展的，特征明确的神经细胞源的开发，这些神经细胞源现在正在进行临床试验（在 7，8，9中进行了审查）。虽然细胞疗法已经达到一些神经系统疾病（例如，帕金森病10，中风11和脊髓损伤12）的临床阶段，但它们的疗效一直各不相同，需要更多的临床前研究来了解移植物 - 宿主相互作用的机制。
许多临床前研究的一个主要限制是连续跟踪宿主内的移植细胞。通常只执行终点测量，省略了宿主6，13中的动态迁移和生存过程。这些局限性导致嫁接细胞的表征不佳，并且需要高动物数量来理解纵向变化。为了克服这些局限性，在这项研究中，我们用由红萤火虫荧光素酶和增强型绿色荧光蛋白（rFluc-eGFP）组成的市售双报告慢病毒载体转导诱导诱导多能干细胞（iPSC）来源的神经祖细胞。这些细胞通过立体定位实质内注射移植到小鼠大脑中，并在5周内使用 体内 生物发光成像进行纵向跟踪。在收集脑组织后，鉴定表达GFP的移植细胞，并在组织学脑切片中进一步表征。该方法可以顺利地适应替代的可转导细胞源和移植途径，用于啮齿动物大脑的 体内 应用。总体而言，该程序对于获得小鼠大脑中移植物存活和迁移的纵向信息很有价值，并促进随后的组织学表征。
Protocol
注意：所有涉及小鼠的实验均按照政府，机构和ARRIER指南进行，并得到苏黎世州兽医办公室的批准。使用成年男性和女性非肥胖糖尿病SCID γ（NSG）小鼠（10-14周，25-35g）。将小鼠饲养在常规的II / III型笼子中，每个笼子至少两只动物，在湿度和温度受控的房间里具有恒定的12/12小时光/暗循环。.).
1. 细胞培养和病毒转导
- 如前所述，使用小分子抑制剂区分神经祖细胞（NPC）和iPSCs14。
- 从传代2 开始，在神经干细胞维持培养基（NSMM; 表 1）在涂有聚鸟氨酸/层粘连蛋白521（pLO / L521）的6孔板（每孔2mL培养基）中补充小分子（表1）。每天更换培养基。
注意：要传代NPC，每孔加入1mL细胞解离试剂（参见 材料表），并在37°C下孵育1分钟，直到大多数细胞分离。- 对于包衣，将150μLpLO在1mL 0.1M磷酸盐缓冲盐水（PBS）中/孔中在室温（RT）下孵育2小时。用PBS洗涤三次后，在每孔1mL PBS中孵育10μgL 521，在室温下孵育2小时。
- 对于病毒转导，在涂有pLO / L521的24孔板中每孔板50，000个细胞，并向每个孔中加入预包装的病毒载体（pLL-EF1a-rFLuc-T2A-GFP-mPGK-Puro，LL410PA-1）。
注意：提供的总感染单位（IFU）>2×106 IFU，足以感染100，000个细胞，感染多重性（MOI）为20。细胞计数已使用自动细胞计数器执行。转导效率很大程度上取决于所使用的细胞系。使用慢病毒需要遵守当地生物安全2级（BSL-2）产品指南。 - 将细胞在37°C孵育72小时，同时继续每日更换培养基。
- 通过在荧光显微镜中检查细胞的GFP表达来确认转导成功。将显微镜放大倍率设置为10倍或20倍，并使用适当的激发（460-480nm）和发射范围（490-520nm）来检测转导的表达GFP的细胞。
- 量化GFP转导与总细胞的比率，以估计一般转导疗效。
注意：该协议实现了65-95%的转导率。移植前，转导疗效为 >50%， 作为入/不行的标准。如果不能达到50%的转导疗效，进行嘌呤霉素选择或使用流式细胞术对细胞进行分类，以提高转导细胞的产量。 - 可选：细胞冷冻
- 将细胞向下旋转（300× g，5分钟）并丢弃上清液。将沉淀重悬于1mL冷冻培养基中（见 材料表），并将悬浮液转移到小瓶中以获得106 个细胞/小瓶。将细胞转移到-80°C的冷冻箱中24小时，然后转移到-150°C进行长期储存。
2. 移植的细胞制备
- 从-150°C储存中收集一小瓶细胞并将其转移到实验室。使用自动细胞计数器对细胞进行计数。
注意：该小瓶包含1.5-2×10个6 个细胞。 - 将小瓶快速转移到37°C水浴中，直到没有冰晶残留（2-3分钟）。
注意：重要的是要快速解冻，以尽量减少对细胞膜的任何损害。不要将小瓶完全浸入水浴中，因为它会增加污染的风险。 - 将小瓶转移到生物安全柜中，并将全部内容物（约1mL）移液到无菌的15mL锥形管中。
注意：处理慢病毒转导细胞需要BSL-2。然而，洗涤和传代细胞从培养基中去除病毒颗粒。有关何时允许从BSL-2转移到BSL-1的信息应从地方当局获得。 - 加入9 mL无菌1x PBS，并在300× g下离心5分钟，室温。
- 使用移液器（1-10 mL）通过抽吸除去上清液;轻轻地将悬浮液向移液器尖端倾斜并开始吸气。注意不要干扰颗粒。
- 通过重悬于10mL无菌1x PBS中洗涤细胞。
注意：轻轻地按压管子以将细胞重悬于残余体积中。使用1mL移液管缓慢研磨细胞悬浮液，直到它不含团块或聚集体。 - 使用自动细胞计数器在最终旋转之前对细胞进行计数。
- 在300× g下离心5分钟，室温。
- 除去上清液（步骤2.5），并将细胞沉淀重悬于所需体积的无菌PBS至8×104 个细胞/ μL的浓度。
注意：该方案使用1.6×105 个细胞/ 2μL的PBS体积。
3. 移植程序
- 手术准备
- 清洁和消毒手术设备。
- 准备立体定位装置和显微注射泵系统。
注意：在开始之前，测试汉密尔顿注射器和30 G，2英寸针头至关重要。将针头插入含有无菌0.9%NaCl的管中，并缓慢地将溶液吸入和拉出。 - 设置麻醉机。在涉及任何动物之前测试机器。用70%乙醇清洁诱导室。
- 动物的制备
- 在实验前将小鼠在标准条件下保持至少7天以适应它们。
注意：以下动物用于该方案：雌性NOD / SCID / IL2rγnull（30-35g，也称为NSG）和雌性C57BL / 6J（20-25g，也称为B6）。该过程也可以与雄性小鼠一起进行。 - 测量小鼠体重并调整要注射的止痛药的剂量。腹膜内注射卡洛芬（5mg / kg体重）以减轻疼痛和/或预防炎症反应。
- 使用异氟醚（诱导期为3%，手术维持期为1.5-2%）麻醉动物，在氧气中蒸发。
注意：由于外科手术后快速醒来，并且可以轻松调节麻醉气体的水平，因此首选气态麻醉。 - 使用伤害感受反射来确保动物得到深度麻醉（例如，脚趾捏）。当达到深度麻醉时，将动物从诱导室运送到立体定位框架。使用面罩保持麻醉。
注意：在整个过程中需要目视监测呼吸频率（每分钟40-60次呼吸）。使用保暖垫，以避免在手术过程中体温过低。 - 涂抹眼科润滑剂，以防止眼睛干燥。
- 用电动剃须刀剃掉小鼠头皮，并用棉签用5%betadine溶液消毒皮肤。
- 固定鼠标头并将耳杆插入外耳道。
注：注意不要损坏鼓膜。在插入耳杆之前，将利多卡因软膏涂抹在两个耳道上。要检查动物的头部是否处于稳定位置，请小心地向下推头部，看看是否有运动。如果注意到移动，则耳杆、物镜转换器位置或两者都不正确，需要重新调整。
- 在实验前将小鼠在标准条件下保持至少7天以适应它们。
- 颅骨切开术
- 使用手术刀片沿着中线进行足够大的切割，以揭示λ和bregma地标。
注意：可以应用皮肤牵开器来保持颅骨暴露。 - 用手术刀缩回骨膜和筋膜，并用无菌棉签干燥颅骨表面。
- 调整耳朵和嘴巴杆以标准化头部位置。
注意：前后定位的 bregma 和 lambda 的垂直坐标需要相同。 - 将针头放在前茅，并计算所需注射点的坐标（为此方案选择的目标坐标：前后（AP）：+ 0.5 mm，内侧（ML）：+ 1.5 mm）。将指针移动到该点并用墨水标记。
注意：坐标是根据富兰克林和帕克西诺斯小鼠大脑图谱 16选择的。距离布雷格玛是毫米。 - 将无菌的0.9%NaCl涂在颅骨上，并用外科牙钻在颅骨上钻一个直径为2-3毫米的孔。
- 将指针移动到硬脑膜表面并计算深度坐标。
- 使用手术刀片沿着中线进行足够大的切割，以揭示λ和bregma地标。
- 移植程序
- 将细胞重悬于试管中（步骤2.9），并将2μL细胞悬浮液吸入注射器（5μL或10μL）中。
注意：确保细胞悬浮液中没有气泡。注射器需要保持在水平位置，直到安装到立体定向装置中，以避免细胞沉降。 - 将注射器放在目标部位上方（计算坐标：AP：+ 0.5 mm，ML：+ 1.5 mm），然后将针头缓慢移动到硬脑膜表面。
注意：如果不确定正确的坐标，请在移植细胞之前用染料进行注射和注射部位的组织学评估（有关更多详细信息，请参阅 17）。 - 以0.02 mm / s的速率引导针头进入大脑直至适当的深度（为该协议选择的坐标是背腹侧（DV） - 0.8 mm）。将深度过冲0.1毫米，并将针头抽出相同的距离，为注射的细胞形成一个口袋。
- 使用镊子在针周围涂上组织粘合剂，以防止细胞泄漏。
- 以3-5nL / s的恒定速率注入2μL制备的细胞悬浮液。
注意：注射过程将持续7至12分钟。 - 注射后，将针头留在原位至少5分钟，然后慢慢取出。涂上组织粘合剂以密封颅骨上的孔，然后等待2分钟。
- 将细胞重悬于试管中（步骤2.9），并将2μL细胞悬浮液吸入注射器（5μL或10μL）中。
- 缝合线和后期护理
- 将无菌的0.9%NaCl溶液涂抹在暴露的颅骨上，以避免脱水。
- 用5/0丝缝线缝合伤口。
- 用0.5mL滴皮注射在下背部的林格乳酸盐溶液给动物补水。
- 中断麻醉输送，小心地将鼠标从立体定位装置中取出，并将其放回保持在加热垫上的笼子中。
- 在损伤后的急性期监测动物。每天至少检查两次缝合线，动物体重和整体健康状况。
4. 体内 成像
- 荧光素的制备
- 在室温下解冻D-荧光素钾盐，并在PBS中以30mg / mL制备D-荧光素的新鲜储备溶液。
- 通过0.22μm注射器过滤器对储备溶液进行灭菌。
注：建议立即使用工作解决方案。如有必要，溶解的荧光素可以储存在-20°C。 但是，长时间存储可能会导致信号衰减。荧光素是一种光敏试剂;尽可能避免直射光线。也可以考虑替代底物，例如环状物，以提高分辨率极限18。
- 成像
- 初始设置
注：生物发光成像是使用由暗室和冷却电荷耦合器件（CCD）相机组成的 体内 成像系统（参见 材料表）进行的。- 双击 动态映像软件 图标，然后从下拉列表中选择 用户 ID 。
- 在出现的控制面板中单击初始化。初始化过程完成后，控制面板中的温度盒将变为绿色。
- 在 控制面板 中，选中 “发光 ”和“ 照片 ”框，然后选择 “自动曝光 （约 60 秒）”。选择一个 视场 （为此协议选择了D/12.5cm）。输入拍摄对象高度（1.5 厘米），然后选择 使用拍摄对象高度 焦点选项。手动设置以下参数： 大分档、f/2、阻塞励磁滤光片、 开射滤光片。
- 确定D-荧光素的注射量在300mg / kg体重。注意：标准推荐剂量为150mg / kg D-荧光素。根据报告使用300mg / kg18的更高灵敏度的方案调整了该程序。
- 腹膜注射荧光素（ip）。
注意：如果动物在注射前需要镇静剂，请注意它可能会延长荧光素酶峰值表达时间。 - 等待5分钟，然后用连续供应异氟醚麻醉动物（诱导期4.5%，成像过程中维持期1.5-2%）。
- 将眼科润滑剂涂抹在眼睛上，然后使用传统的剃须刀在头部区域剃须镇静的动物。将动物置于成像室中，并在荧光素注射后15分钟通过单击控制面板中的“ 获取 ”开始 成像 。
- 初始设置
5. 灌注
- 通过静脉注射戊巴比妥钠（150mg / kg体重）麻醉动物。等到鼠标不再对疼痛的刺激做出反应，例如脚趾捏。
- 将鼠标放在背部，用镊子和剪刀打开胸腔。
- 使用标准剪刀打开隔膜。
- 暴露心脏并将针头（从带有振铃器/ 4%多聚甲醛溶液（PFA）的管子）插入左心室的顶点。
注意：小心将针尖保持在心室腔内。 - 用剪刀切开右心室。
- 用振铃器溶液（可保持在室温下）浸泡3-4分钟（流速：17毫升/分钟）。继续，直到心脏洁净。
- 切换旋塞阀以允许PFA的流动（储存在4°C;在手术过程中保持在冰上），并再灌注5分钟（〜100毫升）。
- 停止泵，从左心室取出针头。
注意：PFA灌注均匀地保持组织完整性。它还有助于在移植中保存GFP信号，否则这些信号可能会因扩散而丢失。
6. 处理
- 组织收集
- 使用标准剪刀取下头部，并在皮肤上做一个中线切口。
- 将皮肤翻转到眼睛上以暴露头骨。
- 从顶骨尖端的尾部开始，用弹簧剪刀做一个小切口。将剪刀沿着中鼓动缝线向前推进到眼睛之间的一点。从尾部再次开始，在矢状平面上平行地进行两个平行的切口，相距约4毫米。
注意：注意不要将剪刀按在颅骨的内表面上来损坏大脑。 - 使用镊子小心地倾斜顶骨的一侧并将其折断。对另一方做同样的事情。
注意：使用微瓣将骨从脑膜中释放出来;否则，它们可能会在掰开颅骨的同时损害大脑。如果额骨的某些部分仍然存在，请做一个小切口以倾斜并折断骨板。 - 为了释放大脑，小心地将微瓣滑动到大脑下方（嗅球），并将其轻轻向上倾斜。
- 收集后，将大脑在4°C下保持在4%PFA溶液中4-6小时。 然后将其转移到无菌的1x PBS中。
- 免疫组织化学
- 将大脑转移到30%蔗糖溶液中，在4°C下至少48小时，以防止在冷冻过程中形成晶体。
- 使用滑动切片机切割厚度为40μm的冠状切片。收集切片并将其作为自由浮动切片（在24孔板中）储存在-20°C的冷冻保护剂溶液（表1）中，直到进一步处理。
- 用每个孔的450μL1x PBS冲洗切片（3次，每个5分钟，室温）。
- 用450μL封闭溶液为每个孔（表1）在室温下阻断非特异性位点1小时。
- 用450μL一抗在4°C下孵育每个孔过夜。将抗体稀释在3%驴血清中1：200;PBS中0.1%的Triton-X-100。为了鉴定宿主环境中的供体物质，请使用人特异性细胞核抗体（抗人核抗体，克隆235-1）。
- 用450μL1x PBS对每个孔洗涤切片（3次，每个5分钟，室温）。
- 用450μL相应的荧光二抗孵育每个孔2-3小时（RT）。将抗体稀释在3%驴血清中;0.1% Triton-X-100，1x PBS。
- 用450μL1x PBS对每个孔洗涤切片（3次，每个5分钟，室温）。
- 用450μL0.1μg/ mL 4'，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）染色细胞核。
Representative Results
我们的目标是使用体内生物发光成像纵向跟踪小鼠大脑 中 移植的神经祖细胞，并在随后的组织学分析中鉴定移植的细胞（图1A）。因此，神经祖细胞用由EF1α-rFluc-eGFP组成的慢病毒载体转导。在移植之前，通过 体外 表达eGFP测试细胞成功转导（图1B）。将成功转导的细胞立体地移植到小鼠大脑中所需的坐标（例如，在感觉运动皮层中）。移植后，全身注射D-荧光素，rFluc的底物，并测量移植细胞的信号强度以确认移植成功（图1C）。
为了评估 体内 生物发光成像的检测限，将6，000-180，000个细胞的范围移植到小鼠的右感觉运动皮层中（图2A）。我们在移植后直接检测到<6，000个细胞和与移植细胞计数成比例的生物发光信号（图2B）。由于人细胞源对免疫功能小鼠具有免疫原性，因此使用NOD scid γ（NSG）免疫缺陷小鼠来观察细胞移植物的长期存活。细胞移植后确认了长达5周的生物发光信号的长期存活和检测（图2C，D）。移植的 细胞在随后 的组织学分析中通过eGFP报告基因和抗人细胞核和抗人线粒体抗体的免疫染色成功检测到（图2E）。
图1：神经祖细胞的移植。 （A）rFluc-eGFP NPC的产生和移植的示意图概述;（B）用DAPI复染的NPC的代表性免疫荧光图像（GFP报告基因，绿色）;（B）用DAPI复染的NPC的代表性免疫荧光图像（GFP报告基因，绿色）;（C）移植细胞中生物发光信号的 体内 检测;颜色条 = 蓝色 （0， 最小值， 无信号）， 红色 （4 通量， p/s × 105， 最大信号） 缩写： NPCs = 神经祖细胞;GFP = 绿色荧光蛋白;rFluc-eGFP =红萤火虫荧光素酶和增强的绿色荧光蛋白;DAPI = 4'，6-二脒基-2-苯基吲哚;p/s = 光子/s. 请点击这里查看此图的大图。
图2：移植细胞的时间过程。 （A）移植用细胞数示意图。（B）移植后1 h移植细胞的检测限。（C、 D）移植的时间过程（180，000个细胞）在NSG小鼠中长达35天;色条 = 蓝色（0，最小值，无信号），红色（4 通量，p/s × 105，最大信号） 数据均± SEM （n = 3）。（E）移植后5周组织学切片和移植细胞的代表性荧光图像。比例尺 = 10 μm. 缩写： D = 移植后的第二天;NSG = 免疫缺陷 NOD scid γ;DAPI = 4'，6-二脒基-2-苯基吲哚;GFP = 绿色荧光蛋白;HuNu = 抗人核抗体，克隆235-1;p/s = 光子/s. 请点击这里查看此图的大图。
Discussion
再生受伤的大脑以允许功能恢复仍然是一个未解决的挑战。许多创新的临床前方法已经进化出靶向，例如，免疫调节19，20，血管生成1，21，22，23，血脑屏障完整性2，3，24，25和细胞替代5，26.特别是近年来，由于干细胞技术和高效分化方案的重大进步，基于细胞的疗法已成为一种有前途的大脑治疗策略15，28。本文为移植和跟踪小鼠大脑中的神经细胞提供了一种有价值的方案。该方法适用于小鼠大脑体内应用的所有可转导细胞系。
所呈现的设置使用小鼠中人类起源的移植。由于免疫原性，这些移植在免疫功能正常的野生型小鼠中长期无效。因此，使用免疫缺陷NSG小鼠来克服这一限制。或者，使用小鼠移植可以优选地克服免疫原性方面。如果需要移植人类细胞，人源化小鼠模型代表了一种新兴的替代方案，以降低移植物排斥的可能性29。
使用EF1α启动子下由萤火虫荧光素酶和eGFP组成的商业双报告病毒载体来可视化移植。选择该启动子15以达到高信号强度。然而，除了NPC之外，其他细胞类型已被证明可以在受伤后促进脑功能，包括周细胞30和星形胶质细胞31;因此，根据所使用的细胞系，其他启动子可能更适合达到高表达水平。此外，使用转基因启动子，如CMV，可能导致下调，特别是在长期实验中32。慢病毒载体的转导效率很大程度上取决于所使用的细胞系，并且在单个实验之间可能有所不同。因此， 在开始体内 实验之前，必须评估转导效率，并纠正实验之间转导功效的变化。移植的大脑区域也会影响信号强度。虽然皮质移植的检测限达到<6，000个细胞，但可能需要更多的细胞来检测更深层大脑区域的信号，例如纹状体或海马体。
小鼠大脑中的移植体积限制为1-2μL。因此，确定适合实验的细胞号非常重要。先前已经观察到，增加细胞数量导致存活率降低，很可能是由于移植区域中营养物质和氧气的可用性有限33。与其他 体内 成像方法（如MRI或CT）相比， 体内 生物发光成像提供相对较低的空间分辨率。因此，嫁接细胞的短迁移路径只能在随后的 事后 分析中可靠地评估。
生物发光的绝对信号强度通常与移植的细胞数量成正比。然而，如果移植物移植到更深的大脑结构中，或者如果信号强度在 体内 成像系统的线性检测光谱之外，信号强度可能会降低。目前，开发新型底物以确保比D-荧光素更有效地穿透血脑屏障，包括cycluc1。这些底物可以在未来18进一步提高移植细胞的检测限。总体而言，该协议允许直接的微创手术来移植和观察小鼠大脑中的移植物。
Disclosures
作者没有潜在的利益冲突需要声明。
Acknowledgments
作者 RR 和 CT 感谢 Mäxi 基金会和 3R 能力中心的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Viral Transduction | |||
| pLL-EF1a-rFLuc-T2A-GFP-mPGK-Puro (Lenti-Labeler virus) | Systembio | LL410VA-1 | |
| Consumables | |||
| Eppendorf microtubes; 1.5 mL | Sigma Aldrich | Z606340 | |
| Falcon Tubes; 15 mL | TPP | 91015 | |
| Microscope cover slips | Product of choice | ||
| Microscope slides | Product of choice | ||
| Sterlie cotton swabs | Product of choice | ||
| Sutures; 5/0 silk with curved needle | B. Braun | G0762482 | |
| Syringe filter; 0.22 µm | TPP | 99722 | |
| Syringe; 1 mL and 0.5 mL | B. Braun | 9166017V | |
| Tissue culture plate (24-well) | TPP | 92024 | |
| Equipment | |||
| Automated cell counter (Vi-CELL XR) | Beckmann Coulter Life Science | 383721 | |
| Forceps | Fine Science Tools | 11064-07 | |
| Forceps, fine | Fine Science Tools | 11412-11 | |
| Heating pad | Product of choice | ||
| High Speed Brushless Micromotor Kit | Foredom | K.1060-22. | |
| Ideal Micro Drill Burr Set Of 5 | Cell Point Specific | 60-1000 | |
| In-Vivo imaging system (IVIS Lumina III with Living Imaging 4.2 software package) | Perkin Elmer | CLS136334 | |
| Isoflurane vaporizer | Provet AG | 330724 | |
| Microinjection Syringe Pump system | World Precision Instruments | UMP3T-1 | |
| Microliter syringe; 700-Series; Volume: 5-10 µL | Hamilton | 7635-01 | |
| Microtome | Leica | HM430 | |
| NanoFill-33 G-Needle (removable and reusable) | World Precision Instruments | NF33BV-2 | |
| Needle Holder | Fine Science Tools | 12001-13 | |
| Perfusion pump and tubing | Masterflex | HV-77120-42 | |
| Scalpel | Fine Science Tools | 10003-12 | |
| Small bonn scissors, straight | Fine Science Tools | 14184-09 | |
| Small spring scissors, straight | Fine Science Tools | 15000-03 | |
| Spatula | Merck | Z243213-2EA | |
| Stereotaxic frame for rodents; motorized | World Precision Instruments | 99401 | |
| Pharmaceuticals and Reagents | |||
| Accutase | Invitrogen | A11105-01 | Proteolytic and collagenolytic; cell dissociation reagent |
| Anti-Human Nuclei Antibody, clone 235-1, Biotin Conjugate | Merck | MAB1281B | |
| B27 – Supplement (50x) | Gibco | 17504-001 | |
| Betadine (11 mg Iod als Povidon-Iod pro 1 ml Lösung) | Mundipharma Medical Company | All pharmaceuticals were provided by the cantonal pharmacy, Zurich, Switzerland | |
| Blocking solution (3% donkey serum; 0.1% Triton-X-100 in PBS) | Product of choice; can be homemade | ||
| CHIR99021 (10 mM – 2,500x) | StemMACS | 130-103-926 | |
| Cryoprotectant solution | Product of choice; can be homemade | ||
| DAPI solution (1 mg/mL) | Thermo Fisher Scientific | 62248 | |
| D-Luciferin Potassium Salt | Perkin Elmer | 122799 | |
| DMEM/F12 | Gibco | 11320-074 | |
| Donkey anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 555 | Invitrogen | A-31570 | |
| Donkey serum | Product of choice | ||
| Esconarcon (Pentobarbitalum natricum 300 mg) | Streuli Pharma AG | All pharmaceuticals were provided by the cantonal pharmacy, Zurich, Switzerland | |
| Ethanol; 70% | Product of choice | ||
| FGF Basic recombinant human protein, Animal-origin free | Thermo Fisher Scientific | PHG6015 | |
| Glutamax (100x) | Gibco | A12860-01 | |
| hLif (10 µg/mL – 1,000x) | PeproTech | AF-300-05-25UG | |
| Isoflurane (Isofluran (1-Chlor-2,2,2-trifluorethyl-difluoromethylether) 99.9%) | Provet AG | All pharmaceuticals were provided by the cantonal pharmacy, Zurich, Switzerland | |
| Laminin-L521 (L-521) | Biolaminin LN | LN521 | |
| Lidocaine ointment (Lidocain: 25 mg , Prilocain: 25 mg) | Aspen Pharma Schweiz GmbH | All pharmaceuticals were provided by the cantonal pharmacy, Zurich, Switzerland | |
| Mounting Medium | Product of choice; can be homemade | ||
| N2- Supplement (100x) | Gibco | 75202-001 | |
| Neurobasal | Gibco | 21103-049 | |
| Ophtalmic lubricant (Retinol palmitat: 15,000 UI) | Bausch & Lomb Swiss AG | All pharmaceuticals were provided by the cantonal pharmacy, Zurich, Switzerland | |
| Paraformaldehyde solution | Product of choice | ||
| PBS | Thermo Fisher Scientific | 10010023 | Can also be homemade |
| Poly-L-ornithine Solution (pLO) | Sigma-Aldrich | P4957 | |
| Rimadyl (Carprofen 50 mg) | Zoetis Schweiz GmbH | All pharmaceuticals were provided by the cantonal pharmacy, Zurich, Switzerland | |
| Ringer lactate | B. Braun | 3570500 | |
| Ringer solution | B. Braun | 3570030 | |
| Saline (0.9% NaCl) | B. Braun | 3570160 | |
| SB431542 (10 mM – 3,333.3x) | StemMACS | 130-106-543 | |
| Tissue Adhesive (Histoacryl) | B. Braun | 1050060 |
References
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