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Neuroscience

इंट्रासेरेब्रल ट्रांसप्लांटेशन और माउस मस्तिष्क में मानव तंत्रिका पूर्वज कोशिकाओं के विवो बायोल्यूमिनेसेंस ट्रैकिंग में

Published: January 27, 2022 doi: 10.3791/63102
Automatic Translation
1,2, 1, 1, 1, 1, 1, 1, *1,2, *1,2
1Institute for Regenerative Medicine, University of Zurich, 2Neuroscience Center Zurich, University of Zurich and ETH Zurich
* These authors contributed equally

Summary

हम माउस मस्तिष्क में लूसिफेरस-ग्रीन फ्लोरोसेंट प्रोटीन (जीएफपी) को व्यक्त करने वाले दोहरे रिपोर्टर वेक्टर के साथ ट्रांसड्यूस किए गए मानव तंत्रिका पूर्वज कोशिकाओं के इंट्रापेरेन्काइमल प्रत्यारोपण का वर्णन करते हैं। प्रत्यारोपण के बाद, लूसिफेरस सिग्नल को बार-बार विवो बायोल्यूमिनेसेंस और जीएफपी-व्यक्त ग्राफ्टेड कोशिकाओं का उपयोग करके मापा जाता है, जो प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके मस्तिष्क वर्गों में पहचाने जाते हैं।

Abstract

सेल थेरेपी लंबे समय से प्रयोगात्मक न्यूरोबायोलॉजी में एक उभरता हुआ उपचार प्रतिमान रहा है। हालांकि, सेल प्रत्यारोपण अध्ययन अक्सर अंत-बिंदु माप पर भरोसा करते हैं और इसलिए केवल सीमित सीमा तक सेल माइग्रेशन और अस्तित्व के अनुदैर्ध्य परिवर्तनों का मूल्यांकन कर सकते हैं। यह पेपर वयस्क माउस मस्तिष्क में तंत्रिका पूर्वज कोशिकाओं (एनपीसी) को प्रत्यारोपण और अनुदैर्ध्य रूप से ट्रैक करने के लिए एक विश्वसनीय, न्यूनतम इनवेसिव प्रोटोकॉल प्रदान करता है। प्रत्यारोपण से पहले, कोशिकाओं को एक लेंटिविरल वेक्टर के साथ ट्रांसड्यूस किया जाता है जिसमें एक बायोल्यूमिनेसेंट (फायरफ्लाई-लूसिफेरस) और फ्लोरोसेंट (ग्रीन फ्लोरोसेंट प्रोटीन [जीएफपी]) रिपोर्टर शामिल होते हैं। एनपीसी को सेंसरीमोटर कॉर्टेक्स में स्टीरियोटैक्सिक इंजेक्शन का उपयोग करके सही कॉर्टिकल गोलार्ध में प्रत्यारोपित किया जाता है। प्रत्यारोपण के बाद, ग्राफ्टेड कोशिकाओं को पांच सप्ताह तक (दिनों 0, 3, 14, 21, 35) तक बरकरार खोपड़ी के माध्यम से विवो बायोल्यूमिनेसेंस इमेजिंग में उपयोग करके 6,000 कोशिकाओं की रिज़ॉल्यूशन सीमा के साथ पाया गया था। इसके बाद, प्रत्यारोपित कोशिकाओं को हिस्टोलॉजिकल मस्तिष्क वर्गों में पहचाना जाता है और आगे इम्यूनोफ्लोरेसेंस की विशेषता होती है। इस प्रकार, यह प्रोटोकॉल माउस मस्तिष्क में कोशिकाओं को प्रत्यारोपण, ट्रैक, मात्रा और विशेषताओं के लिए एक मूल्यवान उपकरण प्रदान करता है।

Introduction

स्तनधारी मस्तिष्क में चोट या बीमारी के बाद सीमित पुनर्योजी क्षमताएं होती हैं, जिसके लिए ऊतक और कार्यात्मक मरम्मत को बढ़ावा देने के लिए अभिनव रणनीतियों की आवश्यकता होती है। प्रीक्लिनिकल रणनीतियां मस्तिष्क के उत्थान के विभिन्न पहलुओं पर ध्यान केंद्रित करती हैं, जिसमें न्यूरोप्रोटेक्शन, न्यूरोजेनेसिस, एंजियोजेनेसिस 1,2, रक्त-मस्तिष्क-बाधा मरम्मत 3,4, या सेल थेरेपी 5,6 शामिल हैं। सेल थेरेपी में इन समर्थक-मरम्मत प्रक्रियाओं में से कई को एक साथ बढ़ावा देने में सक्षम होने का लाभ है। कोशिकाओं के प्रत्यारोपण के साथ प्रयोगों में, ऊतक की मरम्मत (1) प्रत्यक्ष सेल प्रतिस्थापन और (2) साइटोकिन्स के उत्पादन के माध्यम से हुई है जो एंजियोजेनेसिस और न्यूरोजेनेसिस7 के लिए अग्रणी है। स्टेम सेल प्रौद्योगिकी में हाल की प्रगति ने स्केलेबल, अच्छी तरह से विशेषता वाले तंत्रिका कोशिका स्रोतों के विकास की सुविधा प्रदान की है जो अब नैदानिक परीक्षणों के लिए पाइपलाइन में हैं (7,8,9 में समीक्षा की गई)। यद्यपि सेल उपचार कुछ न्यूरोलॉजिकल बीमारियों (उदाहरण के लिए, पार्किंसंस रोग10, स्ट्रोक 11, और रीढ़ की हड्डी की चोट12) के लिए नैदानिक चरण तक पहुंच गए हैं, उनकी प्रभावकारिता परिवर्तनशील रही है, और ग्राफ्ट-होस्ट इंटरैक्शन के तंत्र को समझने के लिए अधिक प्रीक्लिनिकल शोध की आवश्यकता है।

कई प्रीक्लिनिकल अध्ययनों की एक प्रमुख सीमा मेजबान के अंदर प्रत्यारोपित कोशिकाओं की निरंतर ट्रैकिंग है। अक्सर केवल अंत-बिंदु माप किए जाते हैं, मेजबान 6,13 में गतिशील प्रवासी और उत्तरजीविता प्रक्रियाओं को छोड़कर। इन सीमाओं के परिणामस्वरूप ग्राफ्टेड कोशिकाओं के खराब लक्षण वर्णन होते हैं और अनुदैर्ध्य परिवर्तनों को समझने के लिए उच्च पशु संख्या की आवश्यकता होती है। इन सीमाओं को दूर करने के लिए, इस अध्ययन में, हम प्रेरित प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल (आईपीएससी) -व्युत्पन्न तंत्रिका पूर्वज कोशिकाओं को एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध दोहरी-रिपोर्टर लेंटिवायरल वेक्टर के साथ ट्रांसड्यूस करते हैं जिसमें लाल जुगनू लुसिफेरस और बढ़े हुए हरे फ्लोरोसेंट प्रोटीन (आरफ्लुक-ईजीएफपी) शामिल हैं। इन कोशिकाओं को माउस मस्तिष्क में स्टीरियोटैक्सिक इंट्रापेरेन्काइमल इंजेक्शन के माध्यम से प्रत्यारोपित किया जाता है और 5 सप्ताह में विवो बायोल्यूमिनेसेंस इमेजिंग का उपयोग करके अनुदैर्ध्य रूप से ट्रैक किया जाता है। मस्तिष्क के ऊतक संग्रह के बाद, जीएफपी-व्यक्त ग्राफ्टेड कोशिकाओं की पहचान की जाती है और आगे हिस्टोलॉजिकल मस्तिष्क वर्गों में विशेषता होती है। इस विधि को आसानी से वैकल्पिक ट्रांसड्यूकेबल सेल स्रोतों और कृंतक मस्तिष्क में विवो अनुप्रयोगों के लिए प्रत्यारोपण के मार्गों के लिए अनुकूलित किया जा सकता है। कुल मिलाकर, प्रक्रिया माउस मस्तिष्क में ग्राफ्ट अस्तित्व और प्रवास की अनुदैर्ध्य जानकारी प्राप्त करने के लिए मूल्यवान है और बाद के हिस्टोलॉजिकल लक्षण वर्णन की सुविधा प्रदान करती है।

Protocol

नोट: चूहों से जुड़े सभी प्रयोगों को सरकारी, संस्थागत और आगमन दिशानिर्देशों के अनुसार आयोजित किया गया था और ज्यूरिख के कैंटोनल पशु चिकित्सा कार्यालय द्वारा अनुमोदित किया गया था। वयस्क नर और मादा गैर-मोटापे से ग्रस्त मधुमेह एससीआईडी गामा (एनएसजी) चूहों (10-14 सप्ताह, 25-35 ग्राम) का उपयोग किया गया था। चूहों को नियमित रूप से टाइप II / III पिंजरों में एक नमी में प्रति पिंजरे में कम से कम दो जानवरों के समूहों में रखा गया था- और तापमान-नियंत्रित कमरे में एक निरंतर 12/12 घंटे प्रकाश / अंधेरे चक्र के साथ। .).

1. सेल संस्कृति और वायरल ट्रांसडक्शन

  1. छोटे अणु अवरोधकों का उपयोग करके आईपीएससी से तंत्रिका पूर्वज कोशिकाओं (एनपीसी) को अलग करें जैसा कि पहले वर्णित14 था।
  2. तंत्रिका स्टेम सेल रखरखाव माध्यम (NSMM) में मार्ग 2 के बाद से संस्कृति NPCs15 ; तालिका 1) छोटे अणुओं (तालिका 1) के साथ 6-अच्छी तरह से प्लेटों में पूरक (प्रति अच्छी तरह से मध्यम के 2 मिलीलीटर) पॉली-ऑर्निथिन / लैमिनिन 521 (पीएलओ / एल 521) के साथ लेपित। माध्यम को दैनिक रूप से बदलें।
    नोट: NPCs पारित करने के लिए, प्रति अच्छी तरह से सेल पृथक्करण अभिकर्मक के 1 मिलीलीटर जोड़ें ( सामग्री की तालिका देखें) और 1 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें जब तक कि अधिकांश कोशिकाएं अलग न हो जाएं।
    1. कोटिंग के लिए, कमरे के तापमान (आरटी) पर 2h के लिए प्रति अच्छी तरह से 0.1 एम फॉस्फेट-बफ़र्ड खारा (पीबीएस) के 1 मिलीलीटर में पीएलओ के 150 μL को इनक्यूबेट करें। पीबीएस के साथ तीन धोने के बाद, आरटी में 2 घंटे के लिए पीबीएस के 1 एमएल प्रति अच्छी तरह से 1 मिलीलीटर में एल 521 के 10 μg को इनक्यूबेट करें।
  3. वायरल ट्रांसडक्शन के लिए, पीएलओ / एल 521 के साथ लेपित 24-अच्छी तरह से प्लेट में 50,000 कोशिकाओं को अच्छी तरह से प्लेट करें और प्रत्येक अच्छी तरह से प्रीपैकेज्ड वायरल वैक्टर (pLL-EF1a-rFLuc-T2A-GFP-mPGK-Puro, LL410PA-1) जोड़ें।
    नोट: प्रदान की गई कुल संक्रामक इकाइयां (आईएफयू) >2 × 106 आईएफयू हैं और 20 के संक्रमण (एमओआई) की बहुलता पर 100,000 कोशिकाओं को संक्रमित करने के लिए पर्याप्त हैं। सेल गिनती एक स्वचालित सेल काउंटर के साथ किया गया है। ट्रांसडक्शन दक्षता दृढ़ता से उपयोग की गई सेल लाइन पर निर्भर करती है। लेंटिवायरस के साथ काम करने के लिए जैव सुरक्षा स्तर 2 (बीएसएल -2) उत्पादों के लिए स्थानीय दिशानिर्देशों के अनुपालन की आवश्यकता होती है।
  4. कोशिकाओं को 72 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें, जबकि दैनिक मध्यम परिवर्तन जारी रखें।
  5. एक प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप में GFP अभिव्यक्ति के लिए कोशिकाओं की जाँच करके सफल ट्रांसडक्शन की पुष्टि करें। माइक्रोस्कोप आवर्धन को 10x या 20x पर सेट करें और ट्रांसड्यूस्ड GFP-एक्सप्रेसिंग कोशिकाओं का पता लगाने के लिए उपयुक्त उत्तेजना (460-480 एनएम) और उत्सर्जन सीमा (490-520 एनएम) का उपयोग करें।
  6. सामान्य ट्रांसडक्शन प्रभावकारिता का अनुमान लगाने के लिए कुल कोशिकाओं के लिए जीएफपी-ट्रांसड्यूस किए गए अनुपात को मापें।
    नोट: इस प्रोटोकॉल के साथ 65-95% की ट्रांसडक्शन दर प्राप्त की गई थी। >50% की एक ट्रांसडक्शन प्रभावकारिता को प्रत्यारोपण से पहले एक गो / नो-गो मानदंड के रूप में अनुशंसित किया जाता है। यदि 50% ट्रांसडक्शन प्रभावकारिता प्राप्त नहीं की जा सकती है, तो प्यूरोमाइसिन चयन करें या ट्रांसड्यूस्ड कोशिकाओं की उपज बढ़ाने के लिए प्रवाह साइटोमेट्री का उपयोग करके कोशिकाओं को सॉर्ट करें।
  7. वैकल्पिक: कोशिकाओं की ठंड
    1. कोशिकाओं को नीचे स्पिन करें (300 × जी, 5 मिनट) और supernatant को छोड़ दें। ठंड माध्यम के 1 मिलीलीटर में गोली को फिर से निलंबित करें ( सामग्री की तालिका देखें) और 106 कोशिकाओं / शीशी प्राप्त करने के लिए निलंबन को शीशियों में स्थानांतरित करें। कोशिकाओं को -80 डिग्री सेल्सियस पर 24 घंटे के लिए फ्रीजिंग बक्से में स्थानांतरित करें और फिर दीर्घकालिक भंडारण के लिए -150 डिग्री सेल्सियस पर।

2. प्रत्यारोपण के लिए सेल तैयारी

  1. -150 डिग्री सेल्सियस भंडारण से कोशिकाओं की एक शीशी एकत्र करें और इसे प्रयोगशाला में स्थानांतरित करें। स्वचालित कक्ष काउंटर का उपयोग करके कक्षों की गणना करें.
    नोट:: शीशी 1.5-2 × 106 कक्षों में शामिल हैं।
  2. शीशी को जल्दी से 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में स्थानांतरित करें जब तक कि कोई बर्फ क्रिस्टल नहीं रहता (2-3 मिनट)।
    नोट: सेल झिल्ली को किसी भी नुकसान को कम करने के लिए तेजी से पिघलना महत्वपूर्ण है। शीशी को पानी के स्नान में पूरी तरह से विसर्जित न करें क्योंकि यह संदूषण के जोखिम को बढ़ा सकता है।
  3. जैव सुरक्षा कैबिनेट के लिए शीशी हस्तांतरण और एक बाँझ 15 mL शंक्वाकार ट्यूब में पूरी सामग्री (~ 1 mL) pipette.
    नोट:: Lentivirally transduced कोशिकाओं के साथ कार्य BSL-2 की आवश्यकता है। हालांकि, धोने और पासिंग कोशिकाएं माध्यम से वायरल कणों को हटा देती हैं। बीएसएल -2 से बीएसएल -1 में स्थानांतरण की अनुमति कब है, इसके बारे में जानकारी स्थानीय अधिकारियों से प्राप्त की जानी चाहिए।
  4. 300 × जी, आरटी पर 5 मिनट के लिए बाँझ 1x पीबीएस और सेंट्रीफ्यूज के 9 मिलीलीटर जोड़ें।
  5. एक पिपेट (1-10 मिलीलीटर) का उपयोग करके आकांक्षा द्वारा supernatant निकालें; धीरे से पिपेट टिप की ओर निलंबन झुकाव और aspirating शुरू करते हैं. छर्रे को परेशान न करने के लिए सावधान रहें।
  6. बाँझ 1x PBS के 10 मिलीलीटर में resuspending द्वारा कोशिकाओं को धोएं।
    नोट:: धीरे अवशिष्ट मात्रा में कक्षों को पुन: निलंबित करने के लिए ट्यूब टैब। धीरे-धीरे सेल निलंबन को 1 एमएल पिपेट का उपयोग करके ट्राइट्यूरेट करें जब तक कि इसमें क्लंप या समुच्चय न हों।
  7. एक स्वचालित सेल काउंटर का उपयोग करके अंतिम स्पिन से पहले कोशिकाओं की गणना करें।
  8. 300 × जी, आरटी पर 5 मिनट के लिए सेंट्रीफ्यूज।
  9. supernatant (चरण 2.5) को निकालें और बाँझ PBS की आवश्यक मात्रा में सेल गोली को 8 × 104 कोशिकाओं / μL की एकाग्रता के लिए पुन: निलंबित करें। कोशिकाओं को बर्फ पर रखें और अगले 5h के भीतर प्रत्यारोपण के लिए उनका उपयोग करें।
    नोट: इस प्रोटोकॉल में PBS के 1.6 × 105 कोशिकाओं/ 2 μL की मात्रा का उपयोग किया गया था।

3. प्रत्यारोपण प्रक्रिया

  1. सर्जरी की तैयारी
    1. सर्जरी के उपकरणों को साफ और निष्फल करें।
    2. स्टीरियोटैक्सिक डिवाइस और माइक्रोइंजेक्शन पंप सिस्टम तैयार करें।
      नोट: शुरू करने से पहले हैमिल्टन सिरिंज और 30 जी, 2 इंच सुई का परीक्षण करना महत्वपूर्ण है। बाँझ 0.9% NaCl युक्त एक ट्यूब में सुई डालें और धीरे-धीरे समाधान को अंदर और बाहर खींचें।
    3. संज्ञाहरण मशीन स्थापित करें। किसी भी जानवर को शामिल करने से पहले मशीन का परीक्षण करें। 70% इथेनॉल के साथ प्रेरण कक्ष को साफ करें।
  2. जानवरों की तैयारी
    1. चूहों को मानक स्थितियों में प्रयोगों से पहले कम से कम 7 दिनों के लिए रखें ताकि उन्हें अनुकूलित किया जा सके।
      नोट: इस प्रोटोकॉल के लिए निम्नलिखित जानवरों का उपयोग किया गया था: मादा NOD / SCID / IL2rónull (30-35 g, जिसे NSG के रूप में भी जाना जाता है) और मादा C57BL / 6J (20-25 g, जिसे B6 के रूप में भी जाना जाता है)। प्रक्रिया को पुरुष चूहों के साथ भी किया जा सकता है।
    2. माउस शरीर के वजन को मापने और इंजेक्शन के लिए दर्द निवारक की खुराक को समायोजित करें। दर्द को कम करने और / या एक भड़काऊ प्रतिक्रिया को रोकने के लिए कार्प्रोफेन (5 मिलीग्राम / किग्रा शरीर का वजन) इंट्रापेरिटोनियल रूप से प्रशासित करें।
    3. आइसोफ्लुरेन (प्रेरण चरण में 3% और सर्जरी के दौरान रखरखाव चरण में 1.5-2%) का उपयोग करके जानवरों को एनेस्थेटिक करें) ऑक्सीजन में वाष्पित।
      नोट: गैसीय संज्ञाहरण सर्जिकल प्रक्रिया के बाद एक त्वरित वेक-अप के कारण पसंद किया जाता है और क्योंकि संवेदनाहारी गैस के स्तर को आसानी से समायोजित किया जा सकता है।
    4. यह सुनिश्चित करने के लिए nociceptive सजगता का उपयोग करें कि जानवर गहराई से anesthetized है (उदाहरण के लिए, पैर की अंगुली pinches)। जब गहरी संज्ञाहरण तक पहुंच जाता है, तो जानवर को प्रेरण कक्ष से स्टीरियोटैक्सिक फ्रेम तक ले जाया जाता है। फेस मास्क का उपयोग करके संज्ञाहरण बनाए रखें।
      नोट: सांस की दर को पूरी प्रक्रिया (प्रति मिनट 40-60 सांस) के दौरान नेत्रहीन रूप से निगरानी करने की आवश्यकता है। प्रक्रिया के दौरान हाइपोथर्मिया से बचने के लिए एक वार्मिंग पैड का उपयोग करें।
    5. आंखों को सूखने से रोकने के लिए नेत्र स्नेहक लागू करें।
    6. एक इलेक्ट्रिक रेजर के साथ माउस खोपड़ी को शेव करें और कपास झाड़ू का उपयोग करके 5% बीटाडीन समाधान के साथ त्वचा को कीटाणुरहित करें।
    7. माउस सिर को सुरक्षित करें और बाहरी मीटस में कान की सलाखों को डालें।
      नोट: सावधान रहें कि कान के पर्दे को नुकसान न पहुंचाएं। कान सलाखों को डालने से पहले दोनों कान नहरों पर लिडोकेन मरहम लागू करें। यह जांचने के लिए कि क्या जानवर का सिर स्थिर स्थिति में है, यह देखने के लिए कि क्या आंदोलन है, सिर पर सावधानीपूर्वक नीचे धक्का दें। यदि आंदोलन नोट किया जाता है, तो या तो कान की पट्टी, नोजपीस प्लेसमेंट, या दोनों गलत हैं और उन्हें समायोजित करने की आवश्यकता है।
  3. क्रैनियोटॉमी
    1. लैम्ब्डा और ब्रेग्मा लैंडमार्क को प्रकट करने के लिए काफी बड़ी मिडलाइन के साथ एक कट बनाने के लिए एक सर्जिकल ब्लेड का उपयोग करें।
      नोट: खोपड़ी को उजागर रखने के लिए त्वचा retractors लागू किया जा सकता है।
    2. एक scalpel के साथ periosteum और प्रावरणी वापस लें और खोपड़ी की सतह को सुखाने के लिए बाँझ कपास swabs का उपयोग करें।
    3. सिर की स्थिति को मानकीकृत करने के लिए कान और मुंह की सलाखों को समायोजित करें।
      नोट: bregma और lambda के लिए ऊर्ध्वाधर निर्देशांक anteroposterior स्थिति के लिए समान होने की आवश्यकता है।
    4. Bregma पर सुई रखें और वांछित इंजेक्शन बिंदुओं के निर्देशांक की गणना करें (इस प्रोटोकॉल के लिए चुने गए ब्याज के निर्देशांक: पूर्वकाल-पीछे (एपी): + 0.5 मिमी, औसत दर्जे का-पार्श्व (एमएल): + 1.5 मिमी)। सुई को उस बिंदु पर ले जाएं और इसे स्याही से चिह्नित करें।
      नोट: निर्देशांक फ्रैंकलिन और Paxinos माउस मस्तिष्क एटलस 16 के आधार पर चुना गया था। दूरी bregma से मिमी कर रहे हैं.
    5. खोपड़ी के लिए बाँझ 0.9% NaCl लागू करें और एक सर्जिकल, दंत ड्रिल के साथ खोपड़ी के माध्यम से 2-3 मिमी के व्यास के साथ एक छेद ड्रिल करें।
    6. सुई को ड्यूरा की सतह पर ले जाएं और गहराई निर्देशांक की गणना करें।
  4. प्रत्यारोपण प्रक्रिया
    1. ट्यूब में कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें (चरण 2.9) और एक सिरिंज (5 μL या 10 μL) में सेल निलंबन के 2 μL आकर्षित करें।
      नोट:: सुनिश्चित करें कि कोई एयर बुलबुले सेल निलंबन में मौजूद हैं। सिरिंज को क्षैतिज स्थिति में रखने की आवश्यकता होती है जब तक कि सेल अवसादन से बचने के लिए स्टीरियोटैक्टिक डिवाइस में माउंट नहीं किया जाता है।
    2. सिरिंज को लक्ष्य साइट के ऊपर रखें (गणना निर्देशांक: एपी: + 0.5 मिमी, एमएल: + 1.5 मिमी) और धीरे-धीरे सुई को ड्यूरा की सतह पर ले जाएं।
      नोट: यदि सही निर्देशांक के बारे में अनिश्चित है, तो कोशिकाओं को प्रत्यारोपित करने से पहले इंजेक्शन साइट के डाई और हिस्टोलॉजिकल मूल्यांकन के साथ इंजेक्शन करें (अधिक जानकारी के लिए, 17 देखें)।
    3. उचित गहराई तक मस्तिष्क में 0.02 मिमी / सेकंड की दर से सुई का मार्गदर्शन करें (इस प्रोटोकॉल के लिए चुना गया निर्देशांक पृष्ठीय-वेंट्रल (डीवी) - 0.8 मिमी है)। 0.1 मिमी द्वारा गहराई को ओवरशूट करें और इंजेक्ट की गई कोशिकाओं के लिए एक जेब बनाने के लिए एक ही दूरी पर सुई को वापस ले लें।
    4. कोशिकाओं के रिसाव को रोकने के लिए संदंश का उपयोग करके सुई के चारों ओर ऊतक चिपकने वाला लागू करें।
    5. 3-5 nL/s की स्थिर दर पर तैयार सेल निलंबन के 2 μL इंजेक्ट करें।
      नोट: इंजेक्शन प्रक्रिया 7 और 12 मिनट के बीच चलेगी।
    6. इंजेक्शन के बाद, धीरे-धीरे इसे वापस लेने से पहले सुई को कम से कम 5 मिनट के लिए छोड़ दें। खोपड़ी में छेद को सील करने के लिए ऊतक चिपकने वाला लागू करें और एक और 2 मिनट तक प्रतीक्षा करें।
  5. टांके और बाद की देखभाल
    1. निर्जलीकरण से बचने के लिए उजागर खोपड़ी के लिए बाँझ 0.9% NaCl समाधान लागू करें।
    2. एक 5/0 रेशम टांके धागे के साथ घाव को बंद करें।
    3. रिंगर लैक्टेट समाधान के 0.5 मिलीलीटर के साथ जानवर को हाइड्रेट करें चमड़े के नीचे पीठ के निचले हिस्से में इंजेक्ट किया गया।
    4. संज्ञाहरण वितरण को बाधित करें और स्टीरियोटैक्सिक उपकरण से माउस को सावधानीपूर्वक हटा दें और इसे हीटिंग पैड पर रखे गए पिंजरे में वापस रखें।
    5. तीव्र चरण postinjury के दौरान जानवरों की निगरानी. दिन में कम से कम दो बार टांका, जानवरों के वजन और समग्र स्वास्थ्य की जांच करें।

4. विवो इमेजिंग में

  1. लूसिफेरिन की तैयारी
    1. आरटी पर डी-लूसिफेरिन पोटेशियम नमक को पिघलाएं और पीबीएस में 30 मिलीग्राम / एमएल पर डी-लूसिफेरिन का एक ताजा स्टॉक समाधान तैयार करें।
    2. एक 0.22 μm सिरिंज फिल्टर के माध्यम से स्टॉक समाधान निष्फल.
      नोट:: कार्यसमाधान का तत्काल उपयोग अनुशंसित है। यदि आवश्यक हो, तो भंग लूसिफेरिन को -20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है। हालांकि, लंबे समय तक भंडारण के परिणामस्वरूप सिग्नल का क्षरण हो सकता है। लूसिफेरिन एक प्रकाश-संवेदनशील अभिकर्मक है; जब भी संभव हो, इसे सीधे प्रकाश से बाहर रखें। वैकल्पिक सब्सट्रेट्स पर भी विचार किया जा सकता है, उदाहरण के लिए, साइक्लुक, रिज़ॉल्यूशन सीमा18 में सुधार करने के लिए।
  2. इमेजिंग
    1. प्रारंभिक सेटअप
      नोट: Bioluminescence इमेजिंग एक में विवो इमेजिंग प्रणाली का उपयोग कर प्रदर्शन किया गया था ( सामग्री की तालिका देखें) एक अंधेरे कक्ष और एक ठंडा चार्ज युग्मित डिवाइस (सीसीडी) कैमरा से मिलकर.
      1. लिविंग इमेज सॉफ़्टवेयर आइकन को डबल-क्लिक करें और ड्रॉप-डाउन सूची से उपयोगकर्ता ID का चयन करें.
      2. प्रकट होने वाले नियंत्रण कक्ष में प्रारंभ करें क्लिक करें. एक बार प्रारंभिक प्रक्रिया पूरी होने के बाद, नियंत्रण कक्ष में तापमान बॉक्स हरा हो जाएगा।
      3. नियंत्रण कक्ष में, Luminescent और फ़ोटोग्राफ़ बक्से की जाँच करें और ऑटो एक्सपोज़र (~ 60 s) का चयन करें। दृश्य के किसी फ़ील्ड का चयन करें (D/12.5cm इस प्रोटोकॉल के लिए चुना गया था). विषय ऊंचाई (1.5 सेमी) दर्ज करें और उपयोग विषय ऊंचाई फ़ोकस विकल्प का चयन करें। मैन्युअल रूप से निम्न पैरामीटर सेट करें: बड़े binning, f/2, अवरुद्ध उत्तेजना फ़िल्टर, और खुला उत्सर्जन फ़िल्टर।
    2. 300 मिलीग्राम / किलोग्राम शरीर के वजन पर डी-लूसिफेरिन की इंजेक्शन मात्रा निर्धारित करें। नोट: मानक अनुशंसित खुराक डी-लूसिफेरिन के 150 मिलीग्राम / किलोग्राम है। इस प्रक्रिया को 300 मिलीग्राम / किग्रा18 का उपयोग करके उच्च संवेदनशीलता की रिपोर्ट करने वाले प्रोटोकॉल के अनुसार समायोजित किया गया था।
    3. लूसिफेरिन इंट्रापेरिटोनियल रूप से इंजेक्ट करें (आई.पी.)।
      नोट: यदि जानवर को इंजेक्शन से पहले बेहोश करने की आवश्यकता है, तो ध्यान रखें कि यह पीक लूसिफेरस अभिव्यक्ति समय का विस्तार कर सकता है।
    4. 5 मिनट के लिए प्रतीक्षा करें, फिर आइसोफ्लुरेन की निरंतर आपूर्ति के साथ जानवरों को बेहोश करें (प्रेरण चरण में 4.5% और इमेजिंग प्रक्रिया के दौरान रखरखाव चरण में 1.5-2%)।
    5. आंखों पर नेत्र स्नेहक लागू करें, फिर पारंपरिक बाल शेवर का उपयोग करके सिर के क्षेत्र पर बेहोश जानवरों को शेव करें। इमेजिंग चैंबर में जानवरों को रखें और नियंत्रण कक्ष में प्राप्त करें पर क्लिक करके लूसिफेरिन इंजेक्शन के 15 मिनट बाद इमेजिंग शुरू करें।

5. परफ्यूजन

  1. सोडियम पेंटोबार्बिटल (150 मिलीग्राम / किग्रा शरीर के वजन) के आईपी इंजेक्शन द्वारा जानवरों को एनेस्थेटिक करें। तब तक प्रतीक्षा करें जब तक कि माउस अब दर्दनाक उत्तेजनाओं का जवाब नहीं देता है, जैसे कि पैर की अंगुली की अंगुली चुटकी।
  2. माउस को अपनी पीठ पर रखें और छाती गुहा को खोलने के लिए चिमटी और कैंची का उपयोग करें।
  3. डायाफ्राम को खोलने के लिए मानक कैंची का उपयोग करें।
  4. दिल को बेनकाब करें और बाएं वेंट्रिकल के शीर्ष में एक सुई डालें (रिंगर / 4% पैराफॉर्मेल्डिहाइड समाधान (पीएफए) के साथ टयूबिंग से)।
    नोट: निलय के लुमेन में सुई की नोक रखने के लिए सावधान रहें।
  5. कैंची का उपयोग करके दाएं वेंट्रिकल को काटें।
  6. 3-4 मिनट (प्रवाह दर: 17 मिलीलीटर / मिनट) के लिए रिंगर समाधान (आरटी पर रखा जा सकता है) के साथ perfuse। तब तक जारी रखें जब तक कि दिल साफ न हो जाए।
  7. पीएफए के प्रवाह के लिए अनुमति देने के लिए स्टॉपकॉक को स्विच करें (4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें; प्रक्रिया के दौरान बर्फ पर रखें) और एक और 5 मिनट (~ 100 एमएल) के लिए perfuse करें।
  8. पंप बंद करो और बाएं वेंट्रिकल से सुई को हटा दें।
    नोट: पीएफए के साथ परफ्यूजन समान रूप से ऊतक अखंडता को संरक्षित करता है। यह प्रत्यारोपण में जीएफपी सिग्नल के संरक्षण की सुविधा भी प्रदान करता है जो अन्यथा प्रसार के कारण खो सकता है।

6. प्रसंस्करण

  1. ऊतक संग्रह
    1. मानक कैंची का उपयोग करके सिर को हटा दें और त्वचा में एक मध्यरेखा चीरा बनाएं।
    2. खोपड़ी को उजागर करने के लिए त्वचा को आंखों पर घुमाएं।
    3. पार्श्विका हड्डी के बिंदु पर पुच्छल भाग से शुरू करें और वसंत कैंची का उपयोग करके एक छोटा चीरा बनाएं। कैंची rostrally midsagittal टांके के साथ आंखों के बीच एक बिंदु तक अग्रिम. पुच्छल भाग से फिर से शुरू करें और sagittal विमान में समानांतर और ~ 4 मिमी के अलावा दो कटौती करते हैं।
      नोट: खोपड़ी की आंतरिक सतह के खिलाफ कैंची दबाकर मस्तिष्क को नुकसान न पहुंचाने के लिए सावधान रहें।
    4. पार्श्विका हड्डी के एक तरफ ध्यान से झुकाव करने और इसे तोड़ने के लिए संदंश का उपयोग करें। दूसरे पक्ष के साथ भी ऐसा ही करें।
      नोट: meninges से हड्डी को मुक्त करने के लिए एक microspatula का उपयोग करें; अन्यथा, वे खोपड़ी को तोड़ते समय मस्तिष्क को नुकसान पहुंचा सकते हैं। यदि ललाट की हड्डी के कुछ हिस्से बने रहते हैं, तो झुकाव और हड्डी की प्लेट को तोड़ने के लिए एक छोटा सा कट करें।
    5. मस्तिष्क को छोड़ने के लिए, मस्तिष्क (घ्राण बल्ब) के नीचे माइक्रोस्पैटुला को ध्यान से स्लाइड करें और इसे धीरे से ऊपर की ओर झुकाएं।
    6. एकत्र करने के बाद, मस्तिष्क को 4 डिग्री सेल्सियस पर 4-6 घंटे के लिए 4% पीएफए समाधान में रखें। बाद में इसे बाँझ 1x PBS में स्थानांतरित करें।
  2. इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री
    1. ठंड के दौरान क्रिस्टल के गठन को रोकने के लिए मस्तिष्क को 4 डिग्री सेल्सियस पर कम से कम 48 घंटे के लिए 30% सुक्रोज समाधान में स्थानांतरित करें।
    2. 40 μm की मोटाई के साथ कोरोनल वर्गों को काटने के लिए एक स्लाइडिंग माइक्रोटोम का उपयोग करें। आगे की प्रक्रिया तक -20 डिग्री सेल्सियस पर क्रायोप्रोटेक्टेंट समाधान (तालिका 1) में मुक्त-फ्लोटिंग वर्गों (24-अच्छी तरह से प्लेट में) के रूप में वर्गों को इकट्ठा और संग्रहीत करें।
    3. प्रत्येक अच्छी तरह से (3 बार, 5 मिनट प्रत्येक, आरटी) के लिए 1x PBS के 450 μL के साथ वर्गों कुल्ला।
    4. RT पर 1 h के लिए प्रत्येक अच्छी तरह से (तालिका 1) के लिए ब्लॉकिंग समाधान के 450 μL के साथ गैर-विशिष्ट साइटों को ब्लॉक करें।
    5. रात भर में 4 डिग्री सेल्सियस पर प्राथमिक एंटीबॉडी के 450 μL के साथ प्रत्येक अच्छी तरह से इनक्यूबेट करें। 3% गधा सीरम में एंटीबॉडी 1: 200 पतला; पीबीएस में 0.1% ट्राइटन-एक्स-100। मेजबान वातावरण में दाता सामग्री की पहचान करने के लिए, मानव-विशिष्ट नाभिक (एंटी-ह्यूमन न्यूक्लियस एंटीबॉडी, क्लोन 235-1) के लिए एंटीबॉडी का उपयोग करें।
    6. प्रत्येक अच्छी तरह से (3 बार, 5 मिनट प्रत्येक, आरटी) के लिए 1x PBS के 450 μL के साथ वर्गों को धोएं।
    7. 2-3 ज (आरटी) के लिए इसी फ्लोरोसेंट माध्यमिक एंटीबॉडी के 450 μL के साथ प्रत्येक अच्छी तरह से इनक्यूबेट करें। 3% गधा सीरम में एंटीबॉडी को पतला करें; 0.1% Triton-X-100 1x PBS में.
    8. प्रत्येक अच्छी तरह से (3 बार, 5 मिनट प्रत्येक, आरटी) के लिए 1x PBS के 450 μL के साथ वर्गों को धोएं।
    9. 0.1 μg / mL 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) के 450 μL के साथ नाभिक दाग।

Representative Results

हम विवो बायोल्यूमिनेसेंस इमेजिंग का उपयोग करके माउस मस्तिष्क में प्रत्यारोपित तंत्रिका पूर्वज कोशिकाओं को अनुदैर्ध्य रूप से ट्रैक करने और बाद के हिस्टोलॉजिकल विश्लेषण (चित्रा 1 ए) में प्रत्यारोपित कोशिकाओं की पहचान करने का लक्ष्य रखते हैं। इसलिए, तंत्रिका पूर्वज कोशिकाओं को एक लेंटिवायरल वेक्टर के साथ ट्रांसड्यूस किया जाता है जिसमें EF1α-rFluc-eGFP होता है। प्रत्यारोपण से पहले, कोशिकाओं को विट्रो में ईजीएफपी (चित्रा 1 बी) की अभिव्यक्ति द्वारा सफल ट्रांसडक्शन के लिए परीक्षण किया गया था। सफलतापूर्वक ट्रांसड्यूस की गई कोशिकाओं को माउस मस्तिष्क में वांछित निर्देशांक (उदाहरण के लिए, सेंसरीमोटर कॉर्टेक्स में) पर स्टीरियोटैक्टिकल रूप से प्रत्यारोपित किया गया था। प्रत्यारोपण के बाद, चूहों को व्यवस्थित रूप से डी-लूसिफेरिन के साथ इंजेक्ट किया गया था, आरफ्लुक के लिए सब्सट्रेट, और प्रत्यारोपित कोशिकाओं की सिग्नल तीव्रता को सफल प्रत्यारोपण (चित्रा 1 सी) की पुष्टि करने के लिए मापा गया था।

इन विवो बायोल्यूमिनेसेंस इमेजिंग की पहचान सीमा का मूल्यांकन करने के लिए, माउस के सही सेंसरीमोटर कॉर्टेक्स में 6,000-180,000 कोशिकाओं की एक सीमा को प्रत्यारोपित किया गया था (चित्रा 2 ए)। हमने <6,000 कोशिकाओं का पता लगाया और प्रत्यारोपण के बाद सीधे प्रत्यारोपित सेल गिनती के लिए एक बायोल्यूमिनेसेंस सिग्नल आनुपातिक (चित्रा 2 बी)। जैसा कि मानव सेल स्रोत इम्युनोकॉम्पेटेंट चूहों के लिए इम्युनोजेनिक हैं, एनओडी स्किड गामा (एनएसजी) इम्यूनोडेफिशिएंट चूहों का उपयोग सेल ग्राफ्ट के दीर्घकालिक अस्तित्व का निरीक्षण करने के लिए किया गया था। सेल प्रत्यारोपण (चित्रा 2 सी, डी) के बाद 5 सप्ताह तक लंबे समय तक जीवित रहने और बायोल्यूमिनेसेंस सिग्नल का पता लगाने की पुष्टि की गई थी। प्रत्यारोपित कोशिकाओं को सफलतापूर्वक ईजीएफपी रिपोर्टर के माध्यम से बाद के हिस्टोलॉजिकल विश्लेषण में पूर्व विवो का पता लगाया गया था और एंटी-ह्यूमन नाभिक और एंटी-ह्यूमन माइटोकॉन्ड्रियल एंटीबॉडी (चित्रा 2 ई) के साथ इम्यूनोस्टेनिंग किया गया था।

Figure 1
चित्रा 1: तंत्रिका पूर्वज कोशिकाओं का प्रत्यारोपण। (A) rFluc-eGFP NPCs की पीढ़ी और प्रत्यारोपण का योजनाबद्ध अवलोकन( B) ट्रांसड्यूस्ड NPCs (GFP रिपोर्टर, हरे) की प्रतिनिधि immunofluorescence छवि DAPI (नीले) के साथ counterstained; स्केल बार = 5 μm. (C) प्रतिरोपित कोशिकाओं में बायोल्यूमिनेसेंस सिग्नल के विवो डिटेक्शन में; रंग पट्टी = नीला (0, मिनट, कोई संकेत नहीं), लाल (4 फ्लक्स, पी / एस × 105, अधिकतम संकेत) संक्षेप: एनपीसी = तंत्रिका पूर्वज कोशिकाएं; GFP = हरा फ्लोरोसेंट प्रोटीन; rFluc-eGFP = लाल जुगनू लुसिफेरस और बढ़ाया हरा फ्लोरोसेंट प्रोटीन; DAPI = 4', 6-diamidino-2-phenylindole; p/s = photons/s. कृपया इस आकृति का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें।

Figure 2
चित्रा 2: प्रत्यारोपित कोशिकाओं का समय पाठ्यक्रम। (ए) प्रत्यारोपण के लिए सेल नंबरों का योजनाबद्ध दृश्य। (बी) प्रतिरोपण के बाद प्रतिरोपित कोशिकाओं की पहचान सीमा 1 घंटे। (C, D) एनएसजी चूहों में 35 दिनों तक के लिए प्रत्यारोपण (180,000 कोशिकाओं) का समय पाठ्यक्रम; रंग पट्टी = नीला (0, मिनट, कोई संकेत नहीं), लाल (4 फ्लक्स, पी / एस × 105, अधिकतम संकेत) डेटा का मतलब SEM (n = 3) ± है। (ई) हिस्टोलॉजिकल वर्गों और प्रत्यारोपित कोशिकाओं की प्रतिनिधि प्रतिदीप्ति छवियां प्रत्यारोपण के 5 सप्ताह बाद। स्केल बार = 10 μm संक्षेप: D = प्रत्यारोपण के बाद दिन; एनएसजी = immunodeficient NOD scid गामा; DAPI = 4', 6-diamidino-2-phenylindole; GFP = हरा फ्लोरोसेंट प्रोटीन; HuNu = विरोधी मानव नाभिक एंटीबॉडी, क्लोन 235-1; p/s = photons/s. कृपया इस आकृति का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें।

Discussion

कार्यात्मक वसूली के लिए अनुमति देने के लिए घायल मस्तिष्क को पुनर्जीवित करना एक अपूर्ण चुनौती बनी हुई है। कई अभिनव प्रीक्लिनिकल दृष्टिकोण ों ने लक्ष्यीकरण विकसित किया है, उदाहरण के लिए, प्रतिरक्षा मॉडुलन19,20, एंजियोजेनेसिस 1,21,22,23, रक्त-मस्तिष्क-बाधा अखंडता 2,3,24,25, और सेल प्रतिस्थापन 5,26 . विशेष रूप से हाल के वर्षों में, स्टेम सेल प्रौद्योगिकी और कुशल भेदभाव प्रोटोकॉल15,28 में प्रमुख प्रगति के कारण सेल-आधारित उपचार मस्तिष्क के लिए एक आशाजनक उपचार रणनीति के रूप में उभरे हैं। यह पेपर माउस मस्तिष्क में तंत्रिका कोशिकाओं को प्रत्यारोपित करने और ट्रैक करने के लिए एक मूल्यवान प्रोटोकॉल प्रदान करता है। विधि माउस मस्तिष्क में विवो अनुप्रयोगों के लिए सभी transducable सेल लाइनों के लिए लागू होता है।

प्रस्तुत सेटअप माउस में मानव मूल के प्रत्यारोपण का उपयोग करता है। ये प्रत्यारोपण इम्युनोजेनिसिटी के कारण इम्यूनोक्षम जंगली प्रकार के चूहों में दीर्घकालिक रूप से व्यवहार्य नहीं हैं। इसलिए, immunodeficient NSG चूहों का उपयोग इस सीमा को दूर करने के लिए किया गया था। वैकल्पिक रूप से, माउस प्रत्यारोपण के उपयोग को इम्युनोजेनिक पहलुओं को दूर करने के लिए पसंद किया जा सकता है। यदि मानव कोशिकाओं के प्रत्यारोपण की आवश्यकता होती है, तो मानवीकृत माउस मॉडल ग्राफ्ट अस्वीकृति की संभावना को कम करने के लिए एक उभरते हुए विकल्प का प्रतिनिधित्व करतेहैं।

EF1α प्रोमोटर के तहत फायरफ्लाई लूसिफेरस और ईजीएफपी से मिलकर एक वाणिज्यिक डुअल-रिपोर्टर वायरल वेक्टर का उपयोग प्रत्यारोपण की कल्पना करने के लिए किया गया था। इस प्रोमोटर को एक उच्च सिग्नल तीव्रता15 प्राप्त करने के लिए चुना गया था। हालांकि, एनपीसी के अलावा, अन्य सेल प्रकारों को चोट के बाद मस्तिष्क समारोह को बढ़ावा देने के लिए दिखाया गया है, जिसमें पेरिसाइट30 और एस्ट्रोसाइट्स31 शामिल हैं; इसलिए, उपयोग की जाने वाली सेल लाइन के आधार पर, अन्य promotors उच्च अभिव्यक्ति स्तर ों को प्राप्त करने के लिए अधिक उपयुक्त हो सकते हैं। इसके अतिरिक्त, ट्रांसजीन प्रमोटरों का उपयोग, जैसे कि सीएमवी, डाउनरेगुलेशन का कारण बन सकता है, खासकर दीर्घकालिक प्रयोगोंमें 32। लेंटिवायरल वेक्टर की ट्रांसडक्शन दक्षता दृढ़ता से उपयोग की गई सेल लाइन पर निर्भर करती है और एकल प्रयोगों के बीच भिन्न हो सकती है। इसलिए, ट्रांसडक्शन दक्षता का मूल्यांकन इन विवो प्रयोगों को शुरू करने से पहले और प्रयोगों के बीच ट्रांसडक्शन प्रभावकारिता में भिन्नताओं को सही करने के लिए किया जाना चाहिए। प्रत्यारोपण का मस्तिष्क क्षेत्र भी संकेत शक्ति को प्रभावित करता है। हालांकि कॉर्टिकल प्रत्यारोपण के लिए <6,000 कोशिकाओं की एक पहचान सीमा प्राप्त की गई थी, लेकिन इसे गहरे मस्तिष्क क्षेत्रों में सिग्नल का पता लगाने के लिए अधिक कोशिकाओं की आवश्यकता हो सकती है, उदाहरण के लिए, स्ट्रिएटम या हिप्पोकैम्पस।

माउस मस्तिष्क में प्रत्यारोपण की मात्रा 1-2 μL तक सीमित है। इसलिए, प्रयोगों के लिए एक उपयुक्त सेल नंबर की पहचान करना महत्वपूर्ण है। यह पहले देखा गया है कि सेल संख्या में वृद्धि से जीवित रहने की दर में कमी आती है, सबसे अधिक संभावना प्रत्यारोपण के क्षेत्र में पोषक तत्वों और ऑक्सीजन की सीमित उपलब्धता के कारणहोती है। विवो बायोल्यूमिनेसेंस इमेजिंग में एमआरआई या सीटी जैसे विवो इमेजिंग विधियों में अन्य की तुलना में अपेक्षाकृत कम स्थानिक रिज़ॉल्यूशन प्रदान करता है। इसलिए, ग्राफ्टेड कोशिकाओं के छोटे प्रवासी पथों का मूल्यांकन केवल बाद के पोस्ट-हॉक विश्लेषण में मज़बूती से किया जा सकता है।

बायोल्यूमिनेसेंस की पूर्ण संकेत शक्ति आमतौर पर प्रत्यारोपित सेल संख्या के लिए आनुपातिक होती है। हालांकि, सिग्नल की ताकत कम हो सकती है यदि ग्राफ्ट को गहरी मस्तिष्क संरचनाओं में प्रत्यारोपित किया जाता है या यदि सिग्नल की ताकत इन विवो इमेजिंग सिस्टम के रैखिक डिटेक्शन स्पेक्ट्रम के बाहर है। वर्तमान में, उपन्यास substrates D-luciferin की तुलना में रक्त-मस्तिष्क बाधा भर में अधिक कुशल प्रवेश सुनिश्चित करने के लिए विकसित कर रहे हैं, जिसमें cycluc1 भी शामिल है। ये सब्सट्रेट भविष्य में ग्राफ्टेड कोशिकाओं की पहचान सीमा में और सुधार कर सकतेहैं 18। कुल मिलाकर, यह प्रोटोकॉल माउस मस्तिष्क में ग्राफ्ट को ट्रांसप्लांट करने और निरीक्षण करने के लिए एक सीधी, न्यूनतम इनवेसिव प्रक्रिया की अनुमति देता है।

Disclosures

लेखकों के पास घोषित करने के लिए हितों का कोई संभावित संघर्ष नहीं है।

Acknowledgments

लेखक आरआर और सीटी Mäxi फाउंडेशन और 3R क्षमता केंद्र से समर्थन स्वीकार करते हैं।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Viral Transduction
pLL-EF1a-rFLuc-T2A-GFP-mPGK-Puro (Lenti-Labeler virus) Systembio LL410VA-1
Consumables
Eppendorf microtubes; 1.5 mL Sigma Aldrich Z606340
Falcon Tubes; 15 mL TPP 91015
Microscope cover slips Product of choice
Microscope slides Product of choice
Sterlie cotton swabs Product of choice
Sutures; 5/0 silk with curved needle B. Braun G0762482
Syringe filter; 0.22 µm TPP 99722
Syringe; 1 mL and 0.5 mL B. Braun 9166017V
Tissue culture plate (24-well) TPP 92024
Equipment
Automated cell counter (Vi-CELL XR) Beckmann Coulter Life Science 383721
Forceps Fine Science Tools 11064-07
Forceps, fine Fine Science Tools 11412-11
Heating pad Product of choice
High Speed Brushless Micromotor Kit Foredom K.1060-22.
Ideal Micro Drill Burr Set Of 5 Cell Point Specific 60-1000
In-Vivo imaging system (IVIS Lumina III with Living Imaging 4.2 software package) Perkin Elmer CLS136334
Isoflurane vaporizer Provet AG 330724
Microinjection Syringe Pump system World Precision Instruments UMP3T-1
Microliter syringe; 700-Series; Volume: 5-10 µL Hamilton 7635-01
Microtome Leica HM430
NanoFill-33 G-Needle (removable and reusable) World Precision Instruments NF33BV-2
Needle Holder Fine Science Tools 12001-13
Perfusion pump and tubing Masterflex HV-77120-42
Scalpel Fine Science Tools 10003-12
Small bonn scissors, straight Fine Science Tools 14184-09
Small spring scissors, straight Fine Science Tools 15000-03
Spatula Merck Z243213-2EA
Stereotaxic frame for rodents; motorized World Precision Instruments 99401
Pharmaceuticals and Reagents
Accutase Invitrogen A11105-01 Proteolytic and collagenolytic; cell dissociation reagent
Anti-Human Nuclei Antibody, clone 235-1, Biotin Conjugate Merck MAB1281B
B27 – Supplement (50x) Gibco 17504-001
Betadine (11 mg Iod als Povidon-Iod pro 1 ml Lösung) Mundipharma Medical Company All pharmaceuticals were provided by the cantonal pharmacy, Zurich, Switzerland
Blocking solution (3% donkey serum; 0.1% Triton-X-100 in PBS) Product of choice; can be homemade
CHIR99021 (10 mM – 2,500x) StemMACS 130-103-926
Cryoprotectant solution Product of choice; can be homemade
DAPI solution (1 mg/mL) Thermo Fisher Scientific 62248
D-Luciferin Potassium Salt Perkin Elmer 122799
DMEM/F12 Gibco 11320-074
Donkey anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 555 Invitrogen A-31570
Donkey serum Product of choice
Esconarcon (Pentobarbitalum natricum 300 mg) Streuli Pharma AG All pharmaceuticals were provided by the cantonal pharmacy, Zurich, Switzerland
Ethanol; 70% Product of choice
FGF Basic recombinant human protein, Animal-origin free Thermo Fisher Scientific  PHG6015
Glutamax (100x) Gibco A12860-01
hLif (10 µg/mL – 1,000x) PeproTech AF-300-05-25UG
Isoflurane (Isofluran (1-Chlor-2,2,2-trifluorethyl-difluoromethyl­ether) 99.9%) Provet AG All pharmaceuticals were provided by the cantonal pharmacy, Zurich, Switzerland
Laminin-L521 (L-521) Biolaminin LN LN521
Lidocaine ointment (Lidocain: 25 mg , Prilocain: 25 mg) Aspen Pharma Schweiz GmbH All pharmaceuticals were provided by the cantonal pharmacy, Zurich, Switzerland
Mounting Medium Product of choice; can be homemade
N2- Supplement (100x) Gibco  75202-001
Neurobasal Gibco  21103-049
Ophtalmic lubricant (Retinol palmitat: 15,000 UI) Bausch & Lomb Swiss AG All pharmaceuticals were provided by the cantonal pharmacy, Zurich, Switzerland
Paraformaldehyde solution Product of choice
PBS Thermo Fisher Scientific 10010023 Can also be homemade
Poly-L-ornithine Solution (pLO) Sigma-Aldrich P4957
Rimadyl (Carprofen 50 mg) Zoetis Schweiz GmbH All pharmaceuticals were provided by the cantonal pharmacy, Zurich, Switzerland
Ringer lactate B. Braun 3570500
Ringer solution B. Braun 3570030
Saline (0.9% NaCl) B. Braun 3570160
SB431542 (10 mM – 3,333.3x) StemMACS 130-106-543
Tissue Adhesive (Histoacryl) B. Braun 1050060

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References

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तंत्रिका विज्ञान अंक 179 सेल प्रत्यारोपण लूसिफेरस विवो इमेजिंग जीएफपी मस्तिष्क अनुभाग इंट्रापैरेन्काइमल प्रत्यारोपण में
इंट्रासेरेब्रल ट्रांसप्लांटेशन और <em>माउस मस्तिष्क में</em> मानव तंत्रिका पूर्वज कोशिकाओं के विवो बायोल्यूमिनेसेंस ट्रैकिंग में
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Weber, R. Z., Bodenmann, C., Uhr, D., Zürcher, K. J., Wanner, D., Generali, M., Nitsch, R. M., Rust, R., Tackenberg, C. Intracerebral Transplantation and In Vivo Bioluminescence Tracking of Human Neural Progenitor Cells in the Mouse Brain. J. Vis. Exp. (179), e63102, doi:10.3791/63102 (2022).

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