Summary
يعمل البروتوكول الحالي على تحسين طرق التروية / إزالة الخلايا في الكبد في الموقع وطرق الفحص المجهري ثنائي الفوتون لإنشاء منصة موثوقة لتصور ديناميكيات إعادة تشكيل المصفوفة خارج الخلية (ECM) أثناء التهاب الكبد الدهني غير الكحولي (NASH).
Abstract
التهاب الكبد الدهني غير الكحولي (NASH) هو أكثر أمراض الكبد المزمنة شيوعا في الولايات المتحدة ، حيث يصيب أكثر من 70 مليون أمريكي. يمكن أن يتطور التهاب الكبد الدهني غير الكحولي إلى التليف وفي النهاية إلى تليف الكبد ، وهو عامل خطر كبير لسرطان الخلايا الكبدية. توفر المصفوفة خارج الخلية (ECM) الدعم الهيكلي وتحافظ على توازن الكبد عبر إشارات الخلايا الأمومية. ينتج تليف الكبد عن خلل في عملية إعادة تشكيل ECM الديناميكية ويتميز بالتراكم المفرط للعناصر الهيكلية والتغيرات المرتبطة بها في الجليكوزامينوجليكان. يطلق على نمط التليف النموذجي ل NASH اسم "سلك الدجاج" ، والذي يتكون عادة من تليف المنطقة 3 حول الجيوب الأنفية / حول الخلايا ، بناء على الميزات التي لاحظتها صبغة ماسون ثلاثية الألوان وبقع بيكروسيروس الحمراء. ومع ذلك ، فإن تقنيات التصوير التقليدية القائمة على شرائح الأنسجة الرقيقة ثنائية الأبعاد (2D) لا يمكنها إظهار التغييرات الهيكلية التفصيلية ثلاثية الأبعاد (3D) ECM ، مما يحد من فهم إعادة تشكيل ECM الديناميكي في تليف الكبد.
قام العمل الحالي بتحسين بروتوكول سريع وفعال لتصوير بنية ECM الأصلية في الكبد عن طريق إزالة الخلايا لمواجهة التحديات المذكورة أعلاه. تم تغذية الفئران إما بحمية تشاو أو الوجبات السريعة لمدة 14 أسبوعا. تم إجراء إزالة الخلايا بعد نضح الوريد البابي في الموقع ، وتم تطبيق تقنيات الفحص المجهري ثنائي الفوتون على الصورة وتحليل التغيرات في ECM الأصلي. تم إعادة تشكيل وتحليل صور 3D للكبد الطبيعي و NASH. قدم إجراء إزالة التروية الخلوية في الموقع وتحليل السقالة بواسطة المجهر ثنائي الفوتون منصة عملية وموثوقة لتصور إعادة تشكيل ECM الديناميكي في الكبد.
Introduction
مرض الكبد الدهني غير الكحولي (NAFLD) هو أكثر أمراض الكبد شيوعا ، حيث يصيب 20٪ -25٪ من السكان البالغين. يتقدم 25٪ من مرضى NAFLD إلى التهاب الكبد الدهني غير الكحولي (NASH) ، حيث يزداد خطر الإصابة بتليف الكبد وفشل الكبدوسرطان الخلايا الكبدية 1. في السنوات العشرين المقبلة ، تشير التقديرات إلى أن NASH ستمثل 2 مليون حالة وفاة مرتبطة بالكبد في الولايات المتحدة2. نظرا لعدم وجود علاجات معتمدة ، هناك حاجة ملحة لفك رموز الآليات التي تسبب تليف الكبد لدى مرضى التهاب الكبد الدهني غير الكحولي وتطوير علاج مستهدف3.
المصفوفة خارج الخلية (ECM) هي بيئة دقيقة ديناميكية ومعقدة تمارس اتصالا ثنائي الاتجاه مع الخلايا لتنظيم توازن الأنسجة4. يتكون ECM للكبد من عناصر هيكلية مثل البروتيوغليكان والكولاجين والفبرونيكتين والإيلاستين والبروتينات غير الهيكلية الأخرى (مثل olfactomedin و thrombospondin) لتوفير الدعم المادي والهيكلي4.
تليف الكبد هو استجابة مزمنة لالتئام الجروح لتلف الكبد من مسببات مختلفة ، بما في ذلك NASH3. ينتج عن خلل في عملية إعادة تشكيل مصفوفة ECM الديناميكية ويتميز بالبروتينات الهيكلية المفرطة في الكبد المصاب4. يعتمد تكوين الألياف على الاتصال الديناميكي بين الخلايا الخلوية بين أنواع الخلايا الكبدية المختلفة. تتمايز الخلايا النجمية الكبدية (HSCs) ، عند تنشيطها ، إلى خلايا تشبه الخلايا الشبيهة بالخلايا الليفية الليفية العضلية التي تعبر عن Smooth Muscle Alpha 2 وتهاجر وتتكاثر وتوليف بروتينات ECM كإجراء لإغلاق الجرح. HSCs المنشطة هي الخلايا المركزية المنتجة للكولاجين في الكبد1.
الآلية الجزيئية لإعادة تشكيل ECM ، وأنماط التليف ، وعلاقتها بالأحداث الخلوية ليست واضحة. لا تزال هناك حاجة إلى فهم أفضل لهيكل ECM ثلاثي الأبعاد (3D) ، على الرغم من أن تقنيات قياس الطيف الكتلي ساعدت في تحليل تكوين بروتين ECM4. تقليديا ، تم إجراء صبغة ماسون ثلاثية الألوان ، وبقع Picro Sirius Red ، وتصوير الجيل التوافقي الثاني (SHG) على أقسام الكبد الرقيقة ثنائية الأبعاد (2D). يسمى نمط التليف النموذجي ل NASH "سلك الدجاج" ، والذي يمتد إلى المنطقة 3 وهو تليف حول الجيوب الأنفية / حول الخلايا 5,6. ومع ذلك ، كان هناك نقص في الدراسات التي تركز على بنية 3D للكبد الأصلي ، وخاصة تلك التي لا تنطوي على تقسيم الأنسجة. من شأن أساليب التصوير القوية لتحديد أنماط وخصائص التليف من خلال إعادة تشكيل ECM الديناميكي في تليف الكبد أن يعزز بشكل كبير فهم آليات NASH وتحديد أهداف علاجية جديدة.
لمواجهة هذه التحديات ، تم تحسين بروتوكول سريع وفعال لتصوير ECM للكبد الأصلي عبر إزالة الخلايا7. إزالة الخلايا من الكبد الكامل هو نهج لإزالة المحتوى الخلوي الكبدي مع الحفاظ على شبكة 3D ECM الأصلية من خلال نضح المنظفات. تم تغذية الفئران إما تشاو أو حمية الوجبات السريعة (FFD) لمدة 14 أسبوعا. تم إجراء إزالة الخلايا بعد نضح الوريد البابي في الموقع بمنظف معتدل ومعدلات تدفق منخفضة للحفاظ على هياكل الكولاجين الليفي الحلزوني الثلاثي والأصلي. تم تطبيق الفحص المجهري ثنائي الفوتون لتحليل التغيرات في هياكل الكولاجين في ECM. تم إعادة تشكيل وتحليل صور 3D لهيكل ECM الأصلي في الكبد الطبيعي و NASH. يوفر إجراء إزالة التروية الخلوية في الموقع وتحليل السقالة بواسطة المجهر ثنائي الفوتون منصة عملية وبأسعار معقولة لتصور إعادة تشكيل ECM الديناميكي في الكبد.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
يتم إجراء التجارب على الحيوانات وفقا للإجراءات التجريبية المعتمدة من قبل لجان رعاية واستخدام الحيوانات المؤسسية (IACUCs) بجامعة ستانفورد ومستشفى شؤون المحاربين القدامى في بالو ألتو. تم تغذية ذكور الفئران C57BL / 6J البالغة من العمر 6-8 أسابيع إما بالطعام أو نظام غذائي للوجبات السريعة مكمل ب 4.2٪ شراب الذرة عالي الفركتوز (انظر جدول المواد) في مياه الشرب لمدة 14 أسبوعا5. تم الاحتفاظ بالفئران في أقفاص قياسية في دورة مظلمة / فاتحة مدتها 12 ساعة.
1. التحضير الجراحي وإجراءات نضح الكبد
- وزن الماوس قبل العملية.
- تخدير الفأر عن طريق إعطاء الكيتامين (90 ملغم / كغم) والزيلازين (10 ملغم / كغم) (انظر جدول المواد) عن طريق الحقن داخل الصفاق. تأكد من تخدير الماوس بالكامل عن طريق قرص إصبع القدم قبل المتابعة إلى الخطوة التالية.
ملاحظة: ليست هناك حاجة إلى إيزوفلوران هنا لأن هذه جراحة عدم البقاء على قيد الحياة. - حلق المنطقة البطنية باستخدام ماكينة قص الشعر وتطهير الجلد بنسبة 70٪ من الإيثانول. ضع الماوس على ظهره ، وشل حركة الساقين على اللوحة الجراحية بشريط.
- بعد إعادة تأكيد عمق التخدير عن طريق قرصة إصبع القدم، استخدم مقص Mayo وملقط Adson (انظر جدول المواد) لعمل شق 3 سم بشكل جانبي في أسفل البطن ثم شق 5 سم عموديا من أسفل البطن إلى عملية الخنجري. احرص على عدم فتح تجويف الصدر.
- بعد فتح الصفاق ، ضع الأمعاء برفق على يسار الحيوان ، وارفع الفص الأيمن من الكبد باستخدام قضيب مائل من الحرير الصناعي (انظر جدول المواد) لكشف الوريد البابي.
- قسطرة الوريد البابي باستخدام قسطرة 24 G IV. أدخل القسطرة في الطرف البعيد من الوريد البابي. ضع طرف القسطرة قبل أن يتفرع الوريد البابي إلى الفص الكبدي.
- اسحب الإبرة فورا عندما تدخل القسطرة الوريد. تأكد من وضع القسطرة بشكل صحيح داخل الوريد عن طريق تعطير الكبد باستخدام PBS باستخدام حقنة 1 مل عبر القسطرة.
ملاحظة: عند تروية PBS ، يجب أن تبيض جميع الفصوص على الفور. إذا تم وضع القسطرة بشكل صحيح ، فسوف يتدفق الدم الوريدي بسرعة عبر القسطرة. - استخدم ملقط Dumont الدقيق ، وحامل إبرة Castroviejo الدقيقة ، وخياطة 4-0 (انظر جدول المواد) لوضع غرزة أسفل تفرع الوريد البابي وغرزة ثانية 1 سم أدناه لتأمين القسطرة.
2. إزالة الخلايا من الأنسجة
- قم بتوصيل القسطرة بأنبوب سيليكون (~ 1 متر طول وقطر داخلي 3 مم وقطر خارجي 4.1 مم) باستخدام موصل Luer. قم بتوصيل أنبوب السيليكون بمضخة تمعجية وخزان يحتوي على ماء منزوع الأيونات (انظر جدول المواد).
- قم بإزالة فقاعات الهواء داخل الأنبوب بعناية وتجنب توليد فقاعات جديدة أثناء التروية. اضبط المضخة التمعجية على خرج تدفق يبلغ 0.2 مل / دقيقة (أي 288 مل / 24 ساعة).
- Perfuse أولا بالماء منزوع الأيونات (~ 50 مل / ماوس) لمدة 2 ساعة. سيتغير لون الكبد من الأحمر إلى الأصفر أثناء التروية.
ملاحظة: ستنتهي صلاحية الحيوان بعد 10 دقائق من التروية. - قم بتبديل محلول التروية إلى 0.5٪ (بالوزن / الحجم) ديوكسي كولات الصوديوم (DOC ، انظر جدول المواد) واستمر طوال الليل (18 ساعة ، ~ 250 مل / ماوس). سيصبح الكبد أبيض في نهاية التروية (الشكل 1).
- قم بتبديل محلول التروية إلى ماء منزوع الأيونات (~ 50 مل / ماوس) و perfuse لمدة 2 ساعة.
- استخدم ملقط Dumont الصغير ومقص الزنبرك الصغير (انظر جدول المواد) لجمع الكبد منزوع الخلايا وغسله بعناية في طبق بتري مع برنامج تلفزيوني.
- قطع الأنسجة منزوعة الخلايا إلى قطع صغيرة للتصوير الفوري أو تجميدها عند -80 درجة مئوية لمزيد من التحليل الكيميائي الحيوي مثل قياس الطيف الكتلي الترادفي أو ELISA أو اللطخة الغربية.
3. إعداد الشرائح للتصوير (باستخدام مجهر مضان متعدد الفوتون / متحد البؤر)
- انقل قطعة صغيرة من الكبد منزوع الخلايا (<3 × 3 × 3 مم) إلى شريحة مجهرية وضع الأنسجة في المنتصف.
- أضف 10 ميكرولتر من وسط تركيب مانع التلاشي (انظر جدول المواد) إلى الأنسجة باستخدام ماصة لتجنب جفاف الأنسجة.
- قم بتغطية المنديل بغطاء زجاجي واستخدم قوة صغيرة لتسطيح العينة. أغلق حواف زجاج الغطاء بطلاء أظافر شفاف عديم اللون (الشكل 2).
ملاحظة: نظرا لوضع الفوتون الثنائي المستقيم من خلال المجهر ، تم استخدام غطاء زجاجي على العينة. ومع ذلك ، يمكن وضع العينات بشكل مختلف إذا تم استخدام مجهر مقلوب.
4. الحصول على الصور
- ضع قطرة من زيت الغمر في الجزء العلوي من زجاج الغطاء وضع الشريحة على حامل شريحة المجهر. اخفض العدسة الشيئية بالزيت 20x حتى تلامس زيت الغمر.
- قم بالتبديل إلى القناة البنفسجية (405 نانومتر) ، وقم بتشغيل الغالق ، وركز على العينة. التنقل وتحديد موضع منطقة الاهتمام للتصوير. قم بإيقاف تشغيل الغالق قبل الانتقال إلى التقاط الصور باستخدام ضوء الليزر.
- قم بالتبديل إلى عنصر تحكم الكمبيوتر وابدأ تشغيل ليزر الفوتون. قم بتشغيل الليزر ثنائي الفوتون أولا (الشكل 3A) ، ثم قم بتشغيل وحدة التحكم بالليزر ثنائية الفوتون (انظر جدول المواد) والمصراع (الشكل 3B ، C). تأكد من أن طاقة الخرج أعلى من 2.5 وات.
تقليل طاقة الليزر لمنع التبريد الفلوري. حدد واضبط أجهزة الكشف (كل من المضاعفات الضوئية والهجينة) لاستيعاب الفلوروفورات المختارة.
ملاحظة: تم إجراء التصوير ثنائي الفوتون بطول موجة إثارة يبلغ 860 نانومتر. تم اختيار قناتين لصور الكولاجين SHG ومضان مثار ثنائي الفوتون (TPEF) ، على التوالي. اكتشفت قناة واحدة تتوافق مع نطاق الطول الموجي 415-445 نانومتر البنية التفصيلية للكولاجين من إشارات SHG. غطت قناة أخرى نطاق 465-669 نانومتر لجمع إشارات TPEF. - اختر عمليات الاستحواذ على الصور المتزامنة أو المتسلسلة. اضبط الثقب على أعلى قيمة. اضبط الأطوال الموجية لليزر والكسب والطاقة والإزاحة. اضبط وقت بقاء البكسل وحجم البكسل والمتوسط والتكبير / التصغير (الشكل 4 أ).
- قم بتمرير وحدة تحكم z للكمبيوتر وقم بتعيين أبعاد z ، وحدد نقطتي البداية والنهاية ، واختر عدد الصور الواردة داخل وحدة التخزين (z-stack). الحصول على الصور.
ملاحظة: هنا ، تم اختيار حجم 20 ميكرومتر Z وحجم خطوة Z 1 ميكرومتر (الشكل 4B).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
تم الكشف عن ألياف الكولاجين مع الجيل التوافقي الثاني والمجهر ثنائي الفوتون. الإشارة هي من هياكل الكولاجين الثلاثي الحلزوني والأصلي القابل للكسر. لم يتم استخدام أجسام مضادة محددة لتحليل الأنواع الفرعية للكولاجين. ومع ذلك ، يمكن إضافة هذا إلى تقنية التصوير.
عندما تتم دراسة أنسجة الكبد دون إزالة الخلايا ، يكون من الصعب الحصول على صور عالية الدقة لشبكة الكولاجين (الشكل 5 أ). في ECM منزوع الخلايا ، تظهر ألياف الكولاجين (الخضراء) متوازية أو متشابكة (الشكل 5 ب). كانت هناك اختلافات واضحة في التشكل والتوزيع المكاني لمكونات ECM بين كبد Chow و FFD. أظهرت ألياف الكولاجين في الفئران على نظام غذائي تشاو شبكة متشابكة ومنظمة تنظيما جيدا. ومع ذلك ، في الفئران التي تتناول FFD ، لوحظت حزم الكولاجين مع اتصال أقل (الشكل 5B).
لمزيد من الدراسة للهيكل ثلاثي الأبعاد ل ECM للكبد ، تم التقاط صور للشرائح بحجم 20 ميكرومتر من حجم Z (سمك) و 1 ميكرومتر من حجم Z-step. أظهرت ألياف الكولاجين في الفئران على حمية تشاو شبكة جيدة التنظيم ولكن ليس في الفئران على FFD (الشكل 6). لتأكيد جودة الكولاجين الليفي في ECM منزوع الخلايا ، تم تثبيت الشرائح ودمجها في البارافين وملطخة بالهيماتوكسيلين والإيوزين (H&E) وأحمر Picrosirius (PSR) (انظر جدول المواد). يوضح H&E أنه تمت إزالة جميع الخلايا. PSR هي تقنية نسيجية شائعة الاستخدام لتسليط الضوء على الكولاجين في أقسام الأنسجة المضمنة في البارافين (الشكل 7).
الشكل 1: كبد الفأر أثناء التروية. يصبح الكبد أبيض وشبه شفاف في نهاية التروية. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: تحضير الشرائح للتصوير. يتم تغطية الأنسجة بغطاء زجاجي ، ويتم تطبيق قوة صغيرة لتسطيح العينة. حواف زجاج الغطاء مختومة بطلاء أظافر شفاف عديم اللون. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: لقطة شاشة لبرنامج الليزر ثنائي الفوتون، الذي يبدأ تشغيل الليزر ثنائي الفوتون. (أ) أولا، الليزر ثنائي الفوتون قيد التشغيل. (ب) ( ج) وحدة التحكم بالليزر ثنائية الفوتون والغالق قيد التشغيل. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: لقطة شاشة لبرنامج الليزر ثنائي الفوتون أثناء التقاط الصورة. (أ) تأكد من ضبط الثقب على أعلى قيمة (الأسهم الحمراء). اضبط الأطوال الموجية لليزر والكسب والطاقة والإزاحة. اضبط وقت مكوث البكسل وحجم البكسل والمتوسط والتكبير/التصغير. (B) اضبط حجم Z على 20 ميكرومتر وحجم الخطوة Z على 1 ميكرومتر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 5: تصوير ECM منزوع الخلايا باستخدام المجهر ثنائي الفوتون . (أ) صور SHG لألياف الكولاجين من شريحة كبد 6 ميكرومتر (مجمدة طازجة) بدون إزالة الخلايا. (ب) تصور صور SHG شبكة كولاجين جيدة التنظيم في أكباد الفئران التي تخضع للتحكم الطبيعي ، حمية تشاو. شبكة الكولاجين المعاد تشكيلها في الفئران على نظام غذائي للوجبات السريعة (FFD). السهم ، منطقة التليف. نجمة ، شبكة الكولاجين المعاد تشكيلها. شريط المقياس = 100 ميكرومتر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 6: هيكل 3D لشبكة الكولاجين الكبد. أظهرت ألياف الكولاجين في الفئران في نظام تشاو الغذائي شبكة جيدة التنظيم ولكن ليس في فئران الوجبات السريعة (FFD). تم التقاط الصور بحجم Z 20 ميكرومتر (سمك) وحجم 1 ميكرومتر Z-step. شريط المقياس = 100 ميكرومتر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 7: تلطيخ الهيماتوكسيلين والإيوزين (H&E) وتلطيخ بيكروسيريوس الأحمر (PSR) ل ECM منزوع الخلايا. يوضح H&E أنه تمت إزالة جميع الخلايا. في صور تلطيخ PSR ، كشفت ECM من الفئران التي تتغذى على تشاو عن شبكة جيدة التنظيم ، وعلى النقيض من ذلك ، أظهرت الفئران التي تتبع نظاما غذائيا للوجبات السريعة (FFD) ألياف كولاجين أكثر كثافة. حجم Z (سمك) = 6 ميكرومتر. شريط المقياس = 100 ميكرومتر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
يوضح البروتوكول الحالي أن إزالة الخلايا من خلال معدل تدفق منخفض DOC في التروية في الموقع تحافظ على هياكل الكولاجين الليفي الثلاثي الحلزوني والأصلي القابلة للكسر ، مما يوفر منصة موثوقة وفعالة من حيث التكلفة لالتقاط إعادة تشكيل ECM الديناميكي في تليف الكبد NASH. على الرغم من إجراء إزالة الخلايا في الكبد الطبيعي والليفي قبل تحديد مكونات ECM أو توليد سقالات بيولوجية لزراعة الخلايا ، إلا أن ديناميكيات إعادة تشكيل ECM في تليف الكبد لم تتم دراستها جيدا8،9،10. تسمح هذه الطريقة للباحثين بإجراء مقارنات عبر نماذج التليف المختلفة.
حاليا ، هناك أنواع مختلفة من بروتوكولات التروية باستخدام DNase أو كبريتات دوديسيل الصوديوم (SDS) أو Triton X-10011. تكلفة DNase مرتفعة لأن كميات كبيرة من الحلول مطلوبة. SDS هو محلول قاسي لتغيير طبيعة الكحول ، وهو منظف أنيوني يعطل الأغشية الخلوية ويفسد البروتينات. لذلك ، فإن الحفاظ على شبكة الكولاجين بأكملها بعد نضح SDS يمثل تحديا. في المقابل ، فإن Triton X-100 ، كمنظف خفيف غير مسخ وغير أيوني ، يعطل تفاعلات الدهون والدهون والبروتين الدهني ويحافظ على تفاعلات البروتين والبروتين. ومع ذلك ، فقد تم الإبلاغ عن أن Triton X-100 يزعج سقالات ECM ، مما يجعل ECM للكبد منزوع الخلايا غير مناسب لمزيد من تحليل قياس الطيف الكتلي11.
تم تعديل بروتوكول التروية مع DOC من العمل السابق7 ، مما يدل على الحفاظ بشكل أفضل على هياكل الكولاجين الليفي الثلاثي الحلزوني والأصلي في معظم الأنسجة. تمت دراسة شبكة الكولاجين باستخدام مجهر الجيل التوافقي الثاني (SHG) بدون أجسام مضادة ، مما يعكس هياكل الكولاجين الثلاثية الحلزونية والليفية الأصلية. كما تم اختبار ECM الكبد منزوع الخلايا من الفئران FFD ، وتم تأكيد التغييرات الهيكلية في NASH.
الخطوات الأكثر أهمية في البروتوكول هي وضع القسطرة وإعداد نظام التروية. تعتبر قسطرة الوريد البابي أمرا حيويا ، ولكن يمكن أيضا استخدام الوريد الأجوف السفلي في حالة تلف الوريد البابي. يجب تجنب الفقاعات في المخزن المؤقت والأنابيب لأنها تؤثر على التروية. نظرا لاستخدام مجهر ثنائي الفوتون مستقيم ، كان حجم العينة محدودا. يمكن تعديل هذا إذا كان سيتم استخدام مجهر مقلوب.
هناك اهتمام متزايد ب ECM المعاد تشكيله في أمراض الكبد المزمنة وسرطان الكبد12،13،14. تم استخدام سقالات ECM منزوعة الخلايا في الإصلاح الجراحي والطب التجديدي كمادة سقالة بيولوجية مناسبة15،16،17. ومع ذلك ، فإن عملية إزالة الخلايا الخفيفة هذه لها أيضا قيود ، حيث قد لا تتم إزالة بعض المكونات الخلوية مثل الحمض النووي أو بقايا الدهون بالكامل. قد يساعد وقت نضح DOC الأطول وزيادة معدل التدفق في الحصول على سقالات منزوعة الخلايا فائقة النقاء. قد تساعد إضافة DNase إلى محلول الغسيل بعد نضح DOC أيضا في إزالة الحمض النووي. يمكن تعديل البروتوكول لخزعات الكبد البشري ، وبالتالي تعزيز فهم تغيرات ECM أثناء تقدم NASH.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
يعلن المؤلفون أنه لا يوجد تضارب في المصالح فيما يتعلق بهذه المقالة.
Acknowledgments
نشكر حديقة Hyesuk على المساعدة الفنية. تم دعم هذا البحث بتمويل من المعهد الوطني للسكري وأمراض الجهاز الهضمي والكلى (NIDDK) ، والمعاهد الوطنية للصحة (R01 2DK083283 ، إلى NJT) ، والمعهد الوطني للشيخوخة (NIA) ، والمعاهد الوطنية للصحة (1R01AG060726 ، إلى NJT). نحن نقدر بامتنان جون مولهولاند وكيتي لي من مرفق تصوير علوم الخلية في مركز بيكمان للمساعدة الفنية في التصوير المجهري ثنائي الفوتون.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4-0 MONOCRYL UNDYED 1 x 18" P-3 | MONOCRYL | Y494G | |
| 4-0 suture | fisher scientific | 10-000-649 | https://www.fishersci.com/shop/products/monomid-nylon-non-absorbable-sutures-7/10000649?keyword=true |
| AnaSed Injection (xylazine) | AnaSed | NDC 59399-110-20 | this drug to use by or on the order of a licensed veterinarian. |
| BD INSYTE AUTOGUARD I.V. CATHETER WITH BC TECHNOLOGY | BD | 382612 | |
| Chow diet | Envigo | # 2918 | Control diet. A fixed formula, non-autoclavable diet manufactured with high quality ingredients and designed to support gestation, lactation, and growth of rodents. |
| Fast-food diet (AIN76A Western Diet) | Test Diet | 1810060 | https://www.testdiet.com/cs/groups/lolweb/@testdiet/documents/web_content/mdrf/mdux/~edisp/ducm04_051601.pdf |
| Hematoxylin and Eosin Stain Kit | vectorlabs | H-3502 | https://vectorlabs.com/hematoxylin-and-eosin-stain-kit.html |
| Kent Scientific Rat Surgical Kit | fisher scientific | 13-005-205 | https://www.fishersci.com/shop/products/rat-surgical-kit/13005205#?keyword=mouse%20surgery%20kit |
| KETAMINE HYDROCHLORIDE INJECTION | Vedco | NDC 50989-996-06 - 10 mL - vial. | KetaVed has been clinically studied in subhuman primates in addition to those species listed under Administration and Dosage. |
| Leica SP5 upright Confocal, multi-photon | Leica | SP5 | |
| Luer connector (Three-way stopcock with SPIN-LOCK®) | bbraun | D300 | https://www.bbraunusa.com/en/products/b0/three-way-stopcockwithspin-lock.html |
| Picrosirius Red Stain Kit | Polysciences, Inc. | 24901 | https://www.polysciences.com/default/picrosirius-red-stain-kit-40771 |
| Rayon tipped applicator | puritan | 25-806 1PR | |
| Sodium deoxycholate | sigmaaldrich | D6750-100G | |
| Syrup | www.target.com | 24 fl oz | https://www.target.com/p/pancake-syrup-24-fl-oz-market-pantry-8482/-/A-13007801 |
| Variable Speed Peristaltic Pump | INTLLAB | BT100 | https://www.amazon.com/gp/product/B082K97W5W/ref=ox_sc_saved_title_2?smid=A12NUUP87ZRRAR&psc=1 |
| VECTASHIELD Antifade Mounting Medium | vectorlabs | H-1000-10 | https://vectorlabs.com/vectashield-mounting-medium.html |
References
- Friedman, S. L., Pinzani, M. Hepatic fibrosis: 2022 unmet needs and a blueprint for the future. Hepatology. 75 (2), 473-488 (2021).
- Ye, Q., et al. Global prevalence, incidence, and outcomes of non-obese or lean non-alcoholic fatty liver disease: A systematic review and meta-analysis. The Lancet Gastroenterology and Hepatology. 5 (8), 739-752 (2020).
- Schwabe, R. F., Tabas, I., Pajvani, U. B. Mechanisms of fibrosis development in non-alcoholic steatohepatitis. Gastroenterology. 158 (7), 1913-1928 (2020).
- Arteel, G. E., Naba, A. The liver matrisome - looking beyond collagens. JHEP Reports. 2 (4), 100115 (2020).
- Jiang, J. X., et al. Nonphagocytic activation of NOX2 is implicated in progressive non-alcoholic steatohepatitis during aging. Hepatology. 72 (4), 1204-1218 (2020).
- Dehnad, A., et al. AGER1 downregulation associates with fibrosis in non-alcoholic steatohepatitis and type 2 diabetes. Journal of Clinical Investigation. 130 (8), 4320-4330 (2020).
- Mayorca-Guiliani, A. E., et al. Decellularization and antibody staining of mouse tissues to map native extracellular matrix structures in 3D. Nature Protocols. 14 (12), 3395-3425 (2019).
- Mazza, G., et al. Cirrhotic human liver extracellular matrix 3D scaffolds promote smad-dependent tgf-beta1 epithelial mesenchymal transition. Cells. 9 (1), 83 (2019).
- Klaas, M., et al. The alterations in the extracellular matrix composition guide the repair of damaged liver tissue. Scientific Reports. 6, 27398 (2016).
- Mattei, G., et al. Mechanostructure and composition of highly reproducible decellularized liver matrices. Acta Biomaterialia. 10 (2), 875-882 (2014).
- Ren, H., et al. Evaluation of two decellularization methods in the development of a whole-organ decellularized rat liver scaffold. Liver International. 33 (3), 448-458 (2013).
- Piersma, B., Hayward, M. K., Weaver, V. M. Fibrosis and cancer: A strained relationship. Biochimica et Biophysica Acta - Reviews on Cancer. 1873 (2), 188356 (2020).
- Cox, T. R.
- Mirdamadi, E. S., Kalhori, D., Zakeri, N., Azarpira, N., Solati-Hashjin, M. Liver tissue engineering as an emerging alternative for liver disease treatment. Tissue Engineering Part B: Reviews. 26 (2), 145-163 (2020).
- Mazza, G., et al. Decellularized human liver as a natural 3D-scaffold for liver bioengineering and transplantation. Scientific Reports. 5, 13079 (2015).
- Jia, Z., et al. 3D culture system for liver tissue mimicking hepatic plates for improvement of human hepatocyte (C3A) function and polarity. BioMed Research International. 2020, 6354183 (2020).
- Shimoda, H., et al. Decellularized liver scaffolds promote liver regeneration after partial hepatectomy. Scientific Reports. 9 (1), 12543 (2019).
