Summary
वर्तमान प्रोटोकॉल गैर-अल्कोहल स्टीटोहेपेटाइटिस (एनएएसएच) के दौरान बाह्य मैट्रिक्स (ईसीएम) रीमॉडेलिंग की गतिशीलता की कल्पना करने के लिए एक विश्वसनीय मंच स्थापित करने के लिए सीटू छिड़काव / डीसेल्युलराइजेशन और दो-फोटॉन माइक्रोस्कोपी विधियों में यकृत का अनुकूलन करता है।
Abstract
गैर-मादक स्टीटोहेपेटाइटिस (एनएएसएच) संयुक्त राज्य अमेरिका में सबसे आम पुरानी जिगर की बीमारी है, जो 70 मिलियन से अधिक अमेरिकियों को प्रभावित करती है। एनएएसएच फाइब्रोसिस और अंततः सिरोसिस में प्रगति कर सकता है, जो हेपेटोसेलुलर कार्सिनोमा के लिए एक महत्वपूर्ण जोखिम कारक है। बाह्य मैट्रिक्स (ईसीएम) संरचनात्मक सहायता प्रदान करता है और मातृकोशिकीय संकेतों के माध्यम से यकृत होमियोस्टैसिस को बनाए रखता है। लिवर फाइब्रोसिस गतिशील ईसीएम रीमॉडेलिंग प्रक्रिया में असंतुलन के परिणामस्वरूप होता है और संरचनात्मक तत्वों के अत्यधिक संचय और ग्लाइकोसामिनोग्लाइकेन्स में संबंधित परिवर्तनों की विशेषता है। एनएएसएच के विशिष्ट फाइब्रोसिस पैटर्न को "चिकन तार" कहा जाता है, जिसमें आमतौर पर मैसन के ट्राइक्रोम दाग और पिकरोसिरियस रेड दाग द्वारा देखी गई विशेषताओं के आधार पर ज़ोन 3 पेरिसिनसॉइडल / पेरीसेलुलर फाइब्रोसिस होता है। हालांकि, ये पारंपरिक पतली दो-आयामी (2 डी) ऊतक स्लाइड-आधारित इमेजिंग तकनीक विस्तृत त्रि-आयामी (3 डी) ईसीएम संरचनात्मक परिवर्तनों का प्रदर्शन नहीं कर सकती है, जिससे यकृत फाइब्रोसिस में गतिशील ईसीएम रीमॉडेलिंग की समझ सीमित हो जाती है।
वर्तमान कार्य ने उपरोक्त चुनौतियों का समाधान करने के लिए डीसेल्यूलराइजेशन के माध्यम से यकृत में देशी ईसीएम संरचना की छवि बनाने के लिए एक तेज और कुशल प्रोटोकॉल का अनुकूलन किया। चूहों को 14 सप्ताह के लिए चाउ या फास्ट-फूड आहार के साथ खिलाया गया था। सीटू पोर्टल नस छिड़काव के बाद डीसेल्युलराइजेशन किया गया था, और दो-फोटॉन माइक्रोस्कोपी तकनीकों को देशी ईसीएम में परिवर्तनों की छवि और विश्लेषण करने के लिए लागू किया गया था। सामान्य और एनएएसएच लिवर की 3 डी छवियों का पुनर्गठन और विश्लेषण किया गया था। सीटू छिड़काव डीसेलुलराइजेशन में प्रदर्शन करना और दो-फोटॉन माइक्रोस्कोपी द्वारा मचान का विश्लेषण करना यकृत में गतिशील ईसीएम रीमॉडेलिंग की कल्पना करने के लिए एक व्यावहारिक और विश्वसनीय मंच प्रदान करता है।
Introduction
गैर-अल्कोहल फैटी लीवर रोग (एनएएफएलडी) सबसे आम यकृत रोग है, जो वयस्क आबादी के 20% -25% को प्रभावित करता है। एनएएफएलडी रोगियों का 25% गैर-मादक स्टीटोहेपेटाइटिस (एनएएसएच) में प्रगतिकरता है, जहां सिरोसिस, यकृत की विफलता और हेपेटोसेलुलर कार्सिनोमा का खतरा बढ़ जाता है। अगले 20 वर्षों में, यह अनुमानलगाया गया है कि एनएएसएच अमेरिका 2 में 2 मिलियन यकृत से संबंधित मौतों के लिए जिम्मेदार होगा। चूंकि कोई अनुमोदित उपचार नहीं हैं, इसलिए एनएएसएच रोगियों में यकृत फाइब्रोसिस का कारण बनने वाले तंत्र को समझने और लक्षित उपचार विकसित करने की तत्काल आवश्यकताहै।
बाह्य मैट्रिक्स (ईसीएम) एक गतिशील, जटिल माइक्रोएन्वायरमेंट है जो ऊतक होमियोस्टेसिसको विनियमित करने के लिए कोशिकाओं के साथ द्वि-दिशात्मक संचार करता है। यकृत ईसीएम संरचनात्मक तत्वों जैसे प्रोटिओग्लाइकेन्स, कोलेजन, फाइब्रोनेक्टिन, इलास्टिन और अन्य गैर-संरचनात्मक प्रोटीन (जैसे, ओल्फैक्टोमेडिन और थ्रोम्बोस्पोंडिन) से बना है जो शारीरिक औरसंरचनात्मक सहायता प्रदान करता है।
लिवर फाइब्रोसिस एनएएसएच3 सहित विभिन्न ईटियोलॉजी के यकृत क्षति के लिए एक पुरानी घाव-उपचार प्रतिक्रिया है। यह गतिशील ईसीएम मैट्रिक्स रीमॉडेलिंग प्रक्रिया में असंतुलन के परिणामस्वरूप होता है और घायल यकृत4 में अत्यधिक संरचनात्मक प्रोटीन की विशेषता है। फाइब्रोजेनेसिस विभिन्न यकृत कोशिका प्रकारों के बीच गतिशील सेल-सेल संचार पर निर्भर करता है। हेपेटिक स्टेलेट कोशिकाएं (एचएससी), सक्रिय होने पर, चिकनी मांसपेशी अल्फा 2 एक्टिन-अभिव्यक्ति, माइग्रेटिंग और मायोफाइब्रोब्लास्ट जैसी कोशिकाओं के प्रसार में अंतर करती हैं और घाव-बंद करने वाली कार्रवाई के रूप में ईसीएम प्रोटीन को संश्लेषित करती हैं। सक्रिय एचएससी यकृत में केंद्रीय कोलेजन उत्पादक कोशिकाएं हैं।
ईसीएम रीमॉडेलिंग का आणविक तंत्र, फाइब्रोसिस के पैटर्न, और सेलुलर घटनाओं के साथ उनका संबंध स्पष्ट नहीं है। त्रि-आयामी (3 डी) ईसीएम संरचना की बेहतर समझ अभी भी आवश्यक है, भले ही मास स्पेक्ट्रोमेट्री तकनीकों ने ईसीएम प्रोटीन संरचना 4 का विश्लेषण करने में मदद कीहै। परंपरागत रूप से, मैसन के ट्राइक्रोम दाग, पिकरो सिरियस रेड दाग, और दूसरी हार्मोनिक पीढ़ी (एसएचजी) इमेजिंग को दो-आयामी (2 डी) पतले यकृत वर्गों पर किया गया है। एनएएसएच के विशिष्ट फाइब्रोसिस पैटर्न को "चिकन तार" कहा जाता है, जो ज़ोन 3 तक फैला हुआ है और पेरिसिनसॉइडल / पेरीसेलुलर फाइब्रोसिस 5,6 है। हालांकि, देशी यकृत की 3 डी संरचना पर ध्यान केंद्रित करने वाले अध्ययनों की कमी रही है, विशेष रूप से वे जिनमें ऊतक अनुभागन शामिल नहीं है। यकृत फाइब्रोसिस में गतिशील ईसीएम रीमॉडेलिंग के दौरान फाइब्रोसिस के पैटर्न और विशेषताओं की पहचान करने के लिए मजबूत इमेजिंग दृष्टिकोण एनएएसएच तंत्र की समझ को काफी मजबूत करेगा और नए चिकित्सीय लक्ष्यों की पहचान करेगा।
इन चुनौतियों का समाधान करने के लिए, डीसेलुलराइजेशन7 के माध्यम से देशी यकृत ईसीएम की छवि बनाने के लिए एक तेज़ और कुशल प्रोटोकॉल अनुकूलित किया गया था। डिटर्जेंट छिड़काव के माध्यम से देशी 3 डी ईसीएम नेटवर्क को बनाए रखते हुए यकृत सेलुलर सामग्री को हटाने के लिए पूरे-यकृत डीसेल्युलराइजेशन एक दृष्टिकोण है। चूहों को 14 सप्ताह के लिए या तो चाउ या फास्ट-फूड आहार (एफएफडी) खिलाया गया था। ट्रिपल-हेलिकल और देशी फाइब्रिलर कोलेजन संरचनाओं को संरक्षित करने के लिए हल्के डिटर्जेंट और कम प्रवाह दर के साथ सीटू पोर्टल नस छिड़काव के बाद डीसेल्युलराइजेशन किया गया था। ईसीएम में कोलेजन संरचनाओं में परिवर्तन का विश्लेषण करने के लिए दो-फोटॉन माइक्रोस्कोपी लागू किया गया था। सामान्य और एनएएसएच लिवर में देशी ईसीएम संरचना की 3 डी छवियों का पुनर्गठन और विश्लेषण किया गया था। सीटू छिड़काव डीसेल्यूलराइजेशन में प्रदर्शन करना और दो-फोटॉन माइक्रोस्कोपी द्वारा मचान का विश्लेषण करना यकृत में गतिशील ईसीएम रीमॉडेलिंग की कल्पना करने के लिए एक व्यावहारिक और किफायती मंच प्रदान करता है।
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Protocol
स्टैनफोर्ड विश्वविद्यालय की संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समितियों (आईएसीओसी) और पालो अल्टो में वेटरन्स अफेयर्स अस्पताल द्वारा अनुमोदित प्रयोगात्मक प्रक्रियाओं के अनुसार पशु प्रयोग किए जाते हैं। 6-8 सप्ताह के नर C57BL /6J चूहों को 14सप्ताह के लिए पीने के पानी में 4.2% उच्च फ्रुक्टोज कॉर्न सिरप (सामग्री की तालिका देखें) के साथ पूरक चाउ या फास्ट-फूड आहार खिलाया गया था। चूहों को 12 घंटे के अंधेरे / प्रकाश चक्र में मानक पिंजरों में रखा गया था।
1. सर्जिकल तैयारी और यकृत छिड़काव की प्रक्रियाएं
- प्रक्रिया से पहले माउस का वजन करें।
- इंट्रापरिटोनियल इंजेक्शन के माध्यम से केटामाइन (90 मिलीग्राम / किग्रा) और ज़ाइलज़िन (10 मिलीग्राम / किग्रा) ( सामग्री की तालिका देखें) का प्रशासन करके माउस को एनेस्थेटाइज करें। सुनिश्चित करें कि माउस अगले चरण पर जाने से पहले पैर की अंगुली की चुटकी से पूरी तरह से एनेस्थेटाइज्ड है।
नोट: आइसोफ्लुरेन की यहां आवश्यकता नहीं है क्योंकि यह एक गैर-जीवित सर्जरी है। - हेयर क्लिपर का उपयोग करके उदर क्षेत्र को शेव करें और 70% इथेनॉल के साथ त्वचा को कीटाणुरहित करें। माउस को अपनी पीठ पर रखें, और टेप के साथ सर्जिकल बोर्ड पर पैरों को स्थिर करें।
- पैर की अंगुली द्वारा संज्ञाहरण की गहराई की पुन: पुष्टि करने के बाद, निचले पेट में पार्श्व रूप से 3 सेमी चीरा लगाने के लिए मेयो कैंची और एडसन फोर्सप्स ( सामग्री की तालिका देखें) का उपयोग करें और फिर निचले पेट से ज़िफॉइड प्रक्रिया तक लंबवत 5 सेमी चीरा लगाएं। छाती गुहा को न खोलने के लिए सावधान रहें।
- पेरिटोनियम खोलने के बाद, धीरे से आंतों को जानवर के बाईं ओर रखें, और पोर्टल नस को उजागर करने के लिए रेयॉन टिम्प्ड एप्लिकेटर ( सामग्री की तालिका देखें) के साथ यकृत के दाहिने लोब को ऊपर उठाएं।
- 24 जी IV कैथेटर का उपयोग करके पोर्टल नस को कैथेटराइज करें। कैथेटर को पोर्टल नस के बाहर के छोर में पेश करें। पोर्टल नस शाखाओं को यकृत लोब में बाहर निकालने से पहले कैथेटर टिप रखें।
- कैथेटर के नस में प्रवेश करने पर सुई को तुरंत वापस ले लें। जांचें कि कैथेटर के माध्यम से 1 एमएल सिरिंज का उपयोग करके पीबीएस के साथ यकृत को जोड़कर कैथेटर को नस के अंदर सही ढंग से तैनात किया गया है।
नोट: पीबीएस छिड़काव पर, सभी लोब को तुरंत ब्लैंक करना चाहिए। यदि कैथेटर सही ढंग से रखा जाता है, तो शिरापरक रक्त कैथेटर के माध्यम से जल्दी से बह जाएगा। - पोर्टल नस की शाखाओं के नीचे एक सिलाई रखने के लिए ड्यूमोंट माइक्रो फोर्स, एक कैस्ट्रोविजो माइक्रोनीडल धारक, और 4-0 सीवन ( सामग्री की तालिका देखें) का उपयोग करें और कैथेटर को सुरक्षित करने के लिए 1 सेमी नीचे दूसरी सिलाई करें।
2. ऊतक डीसेल्यूलराइजेशन
- कैथेटर को एक सिलिकॉन ट्यूबिंग (~ 1 मीटर लंबाई, 3 मिमी आंतरिक व्यास और 4.1 मिमी बाहरी व्यास) से एक लुएर कनेक्टर के साथ कनेक्ट करें। सिलिकॉन ट्यूबिंग को एक पेरिस्टालिक पंप और एक जलाशय से कनेक्ट करें जिसमें विआयनीकृत पानी होता है (सामग्री की तालिका देखें)।
- ट्यूब के अंदर हवा के बुलबुले को सावधानीपूर्वक हटा दें और छिड़काव के दौरान नए बुलबुले पैदा करने से बचें। 0.2 एमएल /मिनट (यानी, 288 एमएल / 24 घंटे) के प्रवाह उत्पादन पर पेरिस्टालिक पंप सेट करें।
- 2 घंटे के लिए पहले विआयनीकृत पानी (~ 50 एमएल / माउस) के साथ। छिड़काव के दौरान यकृत का रंग लाल से पीले रंग में बदल जाएगा।
नोट: छिड़काव के 10 मिनट बाद जानवर समाप्त हो जाएगा। - छिड़काव समाधान को 0.5% (wt / vol) सोडियम डीऑक्सीकोलेट (डीओसी, सामग्री की तालिका देखें) पर स्विच करें और रात भर जारी रखें (18 घंटे, ~ 250 एमएल / माउस)। छिड़काव के अंत में यकृत सफेद हो जाएगा (चित्रा 1)।
- छिड़काव समाधान को विआयनीकृत पानी (~ 50 एमएल / माउस) में स्विच करें और 2 घंटे के लिए छिड़काव करें।
- डीसेल्यूलराइज्ड लीवर को इकट्ठा करने के लिए ड्यूमोंट माइक्रो फोर्स और माइक्रो-स्प्रिंग कैंची ( सामग्री की तालिका देखें) का उपयोग करें और इसे पीबीएस के साथ पेट्री-डिश में सावधानीपूर्वक धोएं।
- तत्काल इमेजिंग के लिए डीसेल्यूलराइज्ड ऊतक को छोटे टुकड़ों में काटें या आगे जैव रासायनिक विश्लेषण जैसे कि टेंडम मास स्पेक्ट्रोमेट्री, एलिसा, या पश्चिमी धब्बा के लिए -80 डिग्री सेल्सियस पर फ्रीज करें।
3. इमेजिंग के लिए स्लाइड तैयारी (मल्टीफोटॉन / कॉन्फोकल फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोप के साथ)
- डीसेल्यूलराइज्ड लिवर (<3 x 3 x 3 मिमी) के एक छोटे टुकड़े को माइक्रोस्कोप स्लाइड में स्थानांतरित करें और ऊतक को बीच में रखें।
- ऊतक सुखाने से बचने के लिए पिपेट के साथ ऊतक में एंटीफैड माउंटिंग माध्यम (सामग्री की तालिका देखें) का 10 μL जोड़ें।
- ऊतक को कवर ग्लास के साथ कवर करें और नमूने को समतल करने के लिए एक छोटा बल लागू करें। रंगहीन और पारदर्शी नेल पॉलिश के साथ कवर ग्लास के किनारों को सील करें (चित्रा 2)।
नोट: माइक्रोस्कोप के माध्यम से सीधे दो-फोटॉन की स्थापना के कारण, नमूने पर एक कवर ग्लास का उपयोग किया गया था। हालांकि, यदि उल्टे माइक्रोस्कोप का उपयोग किया जाता है तो नमूने अलग-अलग रखे जा सकते हैं।
4. छवि अधिग्रहण
- कवर ग्लास के शीर्ष पर विसर्जन तेल की एक बूंद रखें और माइक्रोस्कोप स्लाइड धारक पर स्लाइड रखें। 20x तेल उद्देश्य लेंस को कम करें जब तक कि यह विसर्जन तेल से संपर्क न करे।
- बैंगनी (405 एनएम) चैनल पर स्विच करें, शटर चालू करें, और नमूने पर ध्यान केंद्रित करें। इमेजिंग के लिए रुचि के क्षेत्र को नेविगेट करें और स्थिति दें। लेजर लाइट का उपयोग करके छवि अधिग्रहण पर जाने से पहले शटर बंद करें।
- कंप्यूटर नियंत्रण पर स्विच करें और दो-फोटॉन लेजर शुरू करें। पहले दो-फोटॉन लेजर चालू करें (चित्रा 3 ए), फिर दो-फोटॉन लेजर नियंत्रक ( सामग्री की तालिका देखें) और शटर (चित्रा 3 बी, सी) चालू करें। सुनिश्चित करें कि आउटपुट पावर 2.5 डब्ल्यू से अधिक है।
प्रतिदीप्ति शमन को रोकने के लिए लेजर शक्ति को कम करें। चुने हुए फ्लोरोफोरे को समायोजित करने के लिए डिटेक्टरों (फोटोमल्टीप्लायर्स और हाइब्रिड दोनों) का चयन करें और समायोजित करें।
नोट: दो-फोटॉन इमेजिंग 860 एनएम की उत्तेजना तरंग दैर्ध्य पर किया गया था। कोलेजन एसएचजी और दो-फोटॉन उत्तेजित प्रतिदीप्ति (टीपीईएफ) छवियों के लिए क्रमशः दो चैनलों का चयन किया गया था। 415-445 एनएम की तरंग दैर्ध्य सीमा के अनुरूप एक चैनल ने एसएचजी संकेतों से कोलेजन की विस्तृत संरचना का पता लगाया। एक अन्य चैनल ने टीपीईएफ संकेतों को इकट्ठा करने के लिए 465-669 एनएम की सीमा को कवर किया। - एक साथ या अनुक्रमिक छवि अधिग्रहण चुनें। पिनहोल को उच्चतम मान पर समायोजित करें। लेजर तरंग दैर्ध्य, लाभ, शक्ति और ऑफसेट समायोजित करें। पिक्सेल निवास समय, पिक्सेल आकार, औसत और ज़ूम (चित्रा 4 ए) समायोजित करें।
- कंप्यूटर z-नियंत्रक को स्क्रॉल करें और z-आयाम सेट करें, प्रारंभ और समापन बिंदुओं को परिभाषित करें, और वॉल्यूम (z-स्टैक) के भीतर दी गई छवियों की संख्या चुनें। छवियाँ प्राप्त करें.
नोट: यहां, एक 20 μm Z वॉल्यूम और 1 μm Z-step आकार चुना गया था (चित्रा 4B)।
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Representative Results
कोलेजन फाइबर को दूसरी हार्मोनिक पीढ़ी और दो-फोटॉन माइक्रोस्कोपी के साथ पता लगाया गया था। संकेत फ्रैंजिबल ट्रिपल-हेलिकल और देशी फाइब्रिलर कोलेजन संरचनाओं से है। कोलेजन उपप्रकारों का विश्लेषण करने के लिए विशिष्ट एंटीबॉडी का उपयोग नहीं किया गया था; हालांकि, इसे इमेजिंग तकनीक में जोड़ा जा सकता है।
जब यकृत ऊतक का अध्ययन डीसेलुलराइजेशन के बिना किया जाता है, तो कोलेजन नेटवर्क (चित्रा 5 ए) की उच्च-रिज़ॉल्यूशन छवियों को प्राप्त करना चुनौतीपूर्ण होता है। डीसेल्यूलराइज्ड ईसीएम में, कोलेजन फाइबर (हरे) समानांतर या इंटरवीविंग दिखाई देते हैं (चित्रा 5 बी)। चाउ और एफएफडी लिवर के बीच ईसीएम घटकों के आकृति विज्ञान और स्थानिक वितरण में स्पष्ट अंतर थे। चाउ आहार पर चूहों में कोलेजन फाइबर ने एक इंटरवीविंग और अच्छी तरह से संगठित नेटवर्क का प्रदर्शन किया। एफएफडी पर चूहों में, हालांकि, कोलेजन बंडलों को कम कनेक्टिविटी के साथ देखा गया था (चित्रा 5 बी)।
यकृत ईसीएम की 3 डी संरचना का आगे अध्ययन करने के लिए, स्लाइस की छवियों को जेड-वॉल्यूम (मोटाई) के 20 μm और Z-step आकार के 1 μm के साथ कैप्चर किया गया था। चाउ आहार पर चूहों में कोलेजन फाइबर ने एक अच्छी तरह से संगठित नेटवर्क दिखाया लेकिन एफएफडी पर चूहों में नहीं (चित्रा 6)। डीसेल्यूलराइज्ड ईसीएम में फाइब्रिलर कोलेजन की गुणवत्ता की पुष्टि करने के लिए, स्लाइड्स को पैराफिन में तय और एम्बेडेड किया गया था और हेमेटॉक्सिलिन और ईओसिन (एच एंड ई) और पिकरोसिरियस रेड (पीएसआर) के साथ दाग दिया गया था ( सामग्री की तालिका देखें)। एच एंड ई से पता चलता है कि सभी कोशिकाओं को हटा दिया गया है। पीएसआर पैराफिन-एम्बेडेड ऊतक वर्गों (चित्रा 7) में कोलेजन को उजागर करने के लिए आमतौर पर इस्तेमाल की जाने वाली हिस्टोलॉजिकल तकनीक है।
चित्रा 1: छिड़काव के दौरान माउस यकृत। छिड़काव के अंत में यकृत सफेद और अर्ध-पारदर्शी हो जाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 2: इमेजिंग के लिए स्लाइड तैयारी। ऊतक को एक कवर ग्लास के साथ कवर किया जाता है, और नमूने को समतल करने के लिए एक छोटा बल लागू किया जाता है। कवर ग्लास के किनारों को रंगहीन और पारदर्शी नेल पॉलिश के साथ सील किया जाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 3: दो-फोटॉन लेजर सॉफ्टवेयर का स्क्रीनशॉट, दो-फोटॉन लेजर शुरू करता है। (ए) सबसे पहले, दो-फोटॉन लेजर चालू किया जाता है। (बी) (सी) दो-फोटॉन लेजर नियंत्रक और शटर चालू हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्र 4: छवि अधिग्रहण के दौरान दो-फोटॉन लेजर सॉफ्टवेयर का स्क्रीनशॉट। (A) पिनहोल को उच्चतम मान (लाल तीर) पर सेट करना सुनिश्चित करें। लेजर तरंग दैर्ध्य, लाभ, शक्ति और ऑफसेट समायोजित करें। पिक्सेल निवास समय, पिक्सेल आकार, औसत और ज़ूम समायोजित करें। (B) Z वॉल्यूम को 20 μm पर सेट करें और Z-step आकार को 1 μm पर सेट करें। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्र 5: डीसेल्यूलराइज्ड ईसीएम को दो-फोटॉन माइक्रोस्कोपी के साथ चित्रित किया गया है। (ए) डीसेल्यूलराइजेशन के बिना 6 μm लिवर स्लाइस (ताजा जमे हुए) से कोलेजन फाइबर की एसएचजी छवियां। (बी) एसएचजी छवियां सामान्य नियंत्रण, चाउ आहार पर चूहों के यकृत में एक सुव्यवस्थित कोलेजन नेटवर्क को दर्शाती हैं। फास्ट-फूड आहार (एफएफडी) पर चूहों में कोलेजन नेटवर्क को फिर से तैयार किया गया। तीर, फाइब्रोसिस क्षेत्र। स्टार, फिर से तैयार कोलेजन नेटवर्क। स्केल पट्टी = 100 μm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.
चित्रा 6: यकृत कोलेजन नेटवर्क की 3 डी संरचना। चाउ आहार पर चूहों में कोलेजन फाइबर ने एक अच्छी तरह से संगठित नेटवर्क दिखाया लेकिन फास्ट-फूड आहार (एफएफडी) चूहों में नहीं। छवियों को 20 μm Z-वॉल्यूम (मोटाई) और 1 μm Z-step आकार के साथ कैप्चर किया गया था। स्केल पट्टी = 100 μm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.
चित्रा 7: हेमेटॉक्सिलिन और ईओसिन धुंधला (एच एंड ई) और पिकरोसिरियस रेड (पीएसआर) डीसेल्यूलराइज्ड ईसीएम का धुंधलापन। एच एंड ई से पता चलता है कि सभी कोशिकाओं को हटा दिया गया है। पीएसआर धुंधला छवियों में, चाउ-फेड चूहों से ईसीएम ने एक अच्छी तरह से संगठित नेटवर्क का खुलासा किया, और इसके विपरीत, फास्ट-फूड आहार (एफएफडी) पर चूहों ने सघन कोलेजन फाइबर दिखाए। Z-आयतन (मोटाई) = 6 μm. स्केल पट्टी = 100 μm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.
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Discussion
वर्तमान प्रोटोकॉल से पता चलता है कि सीटू छिड़काव में कम प्रवाह दर डीओसी के माध्यम से डीसेल्युलराइजेशन फ्रैंबल ट्रिपल-हेलिकल और देशी फाइब्रिलर कोलेजन संरचनाओं को संरक्षित करता है, जो एनएएसएच लिवर फाइब्रोसिस में गतिशील ईसीएम रीमॉडेलिंग को पकड़ने के लिए एक विश्वसनीय और लागत प्रभावी मंच प्रदान करता है। यद्यपि ईसीएम घटकों की पहचान करने या सेल संस्कृति के लिए जैविक मचानों को उत्पन्न करने से पहले सामान्य और फाइब्रोटिक लिवर में डीसेल्युलराइजेशन किया गया था, यकृत फाइब्रोसिस में ईसीएम रीमॉडेलिंग की गतिशीलता का अच्छी तरह से अध्ययन नहीं किया गया है। यह विधि जांचकर्ताओं को विभिन्न फाइब्रोसिस मॉडल में तुलना करने की अनुमति देती है।
वर्तमान में, DNase, सोडियम डोडेसिल सल्फेट (SDS), या ट्राइटन एक्स -100 11 का उपयोग करके छिड़काव प्रोटोकॉल की किस्में हैं। DNase की लागत अधिक है क्योंकि बड़ी मात्रा में समाधान की आवश्यकता होती है। एसडीएस एक कठोर विकृत समाधान है, एक आयनिक डिटर्जेंट जो सेलुलर झिल्ली को बाधित करता है और प्रोटीन को विकृत करता है। इसलिए, एसडीएस छिड़काव के बाद पूरे कोलेजन नेटवर्क को संरक्षित करना चुनौतीपूर्ण है। इसके विपरीत, ट्राइटन एक्स -100, हल्के गैर-विकृत, गैर-आयनिक डिटर्जेंट के रूप में, लिपिड-लिपिड और लिपिड-प्रोटीन इंटरैक्शन को बाधित करता है और प्रोटीन-प्रोटीन इंटरैक्शन को संरक्षित करता है। हालांकि, यह बताया गया है कि ट्राइटन एक्स -100 ईसीएम मचानों को परेशान करता है, जिससे डीसेल्यूलराइज्ड लिवर ईसीएम आगे मास स्पेक्ट्रोमेट्री विश्लेषणके लिए अनुपयुक्त हो जाता है।
डीओसी के साथ छिड़काव प्रोटोकॉल को पिछले काम7 से संशोधित किया गया था, जो अधिकांश ऊतकों में ट्रिपल-हेलिकल और देशी फाइब्रिलर कोलेजन संरचनाओं के बेहतर संरक्षण का प्रदर्शन करता है। कोलेजन नेटवर्क का अध्ययन एंटीबॉडी के बिना दूसरी हार्मोनिक पीढ़ी (एसएचजी) माइक्रोस्कोपी के साथ किया गया था, जो ट्रिपल-हेलिकल और देशी फाइब्रिलर कोलेजन संरचनाओं को दर्शाता है। एफएफडी चूहों से डीसेल्यूलराइज्ड लिवर ईसीएम का भी परीक्षण किया गया था, और एनएएसएच में संरचनात्मक परिवर्तनों की पुष्टि की गई थी।
प्रोटोकॉल में सबसे महत्वपूर्ण कदम कैथेटर प्लेसमेंट और छिड़काव प्रणाली स्थापित करना है। पोर्टल नस कैथीटेराइजेशन महत्वपूर्ण है, लेकिन पोर्टल नस क्षतिग्रस्त होने पर अवर वेना कावा का भी उपयोग किया जा सकता है। बफर और ट्यूबों में बुलबुले से बचा जाना चाहिए क्योंकि वे छिड़काव को प्रभावित करते हैं। क्योंकि एक सीधा दो-फोटॉन माइक्रोस्कोप का उपयोग किया गया था, नमूना आकार सीमित था। यदि उल्टे माइक्रोस्कोप का उपयोग किया जाना है तो इसे संशोधित किया जा सकता है।
पुरानी जिगर की बीमारियों और हेपेटोकार्सिनोजेनेसिस 12,13,14 में पुनर्निर्मित ईसीएम में रुचि बढ़ रही है। डीसेल्यूलराइज्ड ईसीएम स्काफोल्ड्स को सर्जिकल मरम्मत और पुनर्योजी चिकित्सा में एक उपयुक्त जैविक मचान सामग्री 15,16,17 के रूप में नियोजित किया गया है। हालांकि, इस हल्के डीसेलुलराइजेशन प्रक्रिया की सीमाएं भी हैं, क्योंकि कुछ सेलुलर घटक जैसे डीएनए या लिपिड अवशेष पूरी तरह से हटाए नहीं जा सकते हैं। लंबे समय तक डीओसी छिड़काव समय और प्रवाह दर में वृद्धि से अल्ट्रा-शुद्ध डीसेल्यूलराइज्ड स्काफोल्ड्स प्राप्त करने में मदद मिल सकती है। डीओसी छिड़काव के बाद धोने के समाधान में डीनेस जोड़ने से डीएनए को हटाने में भी मदद मिल सकती है। प्रोटोकॉल को मानव यकृत बायोप्सी के लिए समायोजित किया जा सकता है, इस प्रकार एनएएसएच प्रगति के दौरान ईसीएम परिवर्तनों की समझ को बढ़ाया जा सकता है।
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Disclosures
लेखक घोषणा करते हैं कि इस लेख के बारे में हितों का कोई टकराव नहीं है।
Acknowledgments
हम तकनीकी मदद के लिए हेसुक पार्क को धन्यवाद देते हैं। इस शोध को नेशनल इंस्टीट्यूट ऑफ डायबिटीज एंड डाइजेस्टिव एंड किडनी डिजीज (एनआईडीडीके), एनआईएच (आर01 2डीके083283, एनजेटी), नेशनल इंस्टीट्यूट ऑन एजिंग (एनआईए), एनआईएच (1आर01एजी060726, एनजेटी) से वित्त पोषण द्वारा समर्थित किया गया था। हम दो-फोटॉन माइक्रोस्कोपी इमेजिंग के साथ तकनीकी सहायता के लिए बेकमैन सेंटर में सेल साइंसेज इमेजिंग सुविधा के जॉन मुलहोलैंड और किट्टी ली को कृतज्ञतापूर्वक स्वीकार करते हैं।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4-0 MONOCRYL UNDYED 1 x 18" P-3 | MONOCRYL | Y494G | |
| 4-0 suture | fisher scientific | 10-000-649 | https://www.fishersci.com/shop/products/monomid-nylon-non-absorbable-sutures-7/10000649?keyword=true |
| AnaSed Injection (xylazine) | AnaSed | NDC 59399-110-20 | this drug to use by or on the order of a licensed veterinarian. |
| BD INSYTE AUTOGUARD I.V. CATHETER WITH BC TECHNOLOGY | BD | 382612 | |
| Chow diet | Envigo | # 2918 | Control diet. A fixed formula, non-autoclavable diet manufactured with high quality ingredients and designed to support gestation, lactation, and growth of rodents. |
| Fast-food diet (AIN76A Western Diet) | Test Diet | 1810060 | https://www.testdiet.com/cs/groups/lolweb/@testdiet/documents/web_content/mdrf/mdux/~edisp/ducm04_051601.pdf |
| Hematoxylin and Eosin Stain Kit | vectorlabs | H-3502 | https://vectorlabs.com/hematoxylin-and-eosin-stain-kit.html |
| Kent Scientific Rat Surgical Kit | fisher scientific | 13-005-205 | https://www.fishersci.com/shop/products/rat-surgical-kit/13005205#?keyword=mouse%20surgery%20kit |
| KETAMINE HYDROCHLORIDE INJECTION | Vedco | NDC 50989-996-06 - 10 mL - vial. | KetaVed has been clinically studied in subhuman primates in addition to those species listed under Administration and Dosage. |
| Leica SP5 upright Confocal, multi-photon | Leica | SP5 | |
| Luer connector (Three-way stopcock with SPIN-LOCK®) | bbraun | D300 | https://www.bbraunusa.com/en/products/b0/three-way-stopcockwithspin-lock.html |
| Picrosirius Red Stain Kit | Polysciences, Inc. | 24901 | https://www.polysciences.com/default/picrosirius-red-stain-kit-40771 |
| Rayon tipped applicator | puritan | 25-806 1PR | |
| Sodium deoxycholate | sigmaaldrich | D6750-100G | |
| Syrup | www.target.com | 24 fl oz | https://www.target.com/p/pancake-syrup-24-fl-oz-market-pantry-8482/-/A-13007801 |
| Variable Speed Peristaltic Pump | INTLLAB | BT100 | https://www.amazon.com/gp/product/B082K97W5W/ref=ox_sc_saved_title_2?smid=A12NUUP87ZRRAR&psc=1 |
| VECTASHIELD Antifade Mounting Medium | vectorlabs | H-1000-10 | https://vectorlabs.com/vectashield-mounting-medium.html |
References
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