Summary
הפרוטוקול הנוכחי מייעל את שיטות זילוח / דה-צלולריזציה באתרו של הכבד ושיטות מיקרוסקופיה של שני פוטונים כדי ליצור פלטפורמה אמינה להמחשת הדינמיקה של עיצוב מחדש של מטריצה חוץ-תאית (ECM) במהלך סטאטוהפטיטיס לא אלכוהולית (NASH).
Abstract
סטיאטוהפטיטיס לא אלכוהולית (NASH) היא מחלת הכבד הכרונית הנפוצה ביותר בארצות הברית, המשפיעה על יותר מ -70 מיליון אמריקאים. NASH יכול להתקדם לפיברוזיס ובסופו של דבר לשחמת הכבד, גורם סיכון משמעותי לקרצינומה הפטוצלולרית. המטריצה החוץ תאית (ECM) מספקת תמיכה מבנית ושומרת על הומאוסטזיס בכבד באמצעות אותות מטריתיים. פיברוזיס בכבד נובע מחוסר איזון בתהליך העיצוב מחדש הדינמי של ECM ומאופיין בהצטברות יתר של אלמנטים מבניים ושינויים נלווים בגליקוזאמינוגליקנים. דפוס הפיברוזיס הטיפוסי של NASH נקרא "חוט עוף", אשר בדרך כלל מורכב מפיברוזיס perisinusoidal/pericellular zone 3, בהתבסס על תכונות שנצפו על ידי כתם טריכרום של Masson וכתמים אדומים Picrosirius. עם זאת, טכניקות הדמיה מסורתיות דו-ממדיות (2D) מבוססות שקופיות רקמה אינן יכולות להדגים את השינויים המבניים המפורטים של ECM תלת-ממדי (3D), ומגבילים את ההבנה של עיצוב מחדש דינמי של ECM בפיברוזיס בכבד.
העבודה הנוכחית אופטימיזציה פרוטוקול מהיר ויעיל כדי לדמות את מבנה ECM המקורי בכבד באמצעות decellularization כדי להתמודד עם האתגרים לעיל. עכברים הוזנו בצ'או או במזון מהיר במשך 14 שבועות. דה-צלולריזציה בוצעה לאחר זילוח ורידים פורטלי באתרו , וטכניקות המיקרוסקופ הדו-פוטוני יושמו כדי לצלם ולנתח שינויים ב-ECM המקורי. התמונות התלת-ממדיות של הכבד הנורמלי והכבד NASH שוחזרו ונותחו. ביצוע דה-צלולריזציה של זילוח באתרו וניתוח הפיגום על ידי מיקרוסקופ של שני פוטונים סיפקו פלטפורמה מעשית ואמינה לדמיין את העיצוב מחדש הדינמי של ECM בכבד.
Introduction
מחלת כבד שומני לא אלכוהולי (NAFLD) היא מחלת הכבד הנפוצה ביותר, המשפיעה על 20%-25% מהאוכלוסייה הבוגרת. 25% מחולי NAFLD מתקדמים לסטיאטוהפטיטיס לא אלכוהולית (NASH), שם הסיכון לשחמת, אי ספיקת כבד וקרצינומה הפטוצלולרית עולה1. ב-20 השנים הבאות, ההערכה היא כי NASH יהיה אחראי ל-2 מיליון מקרי מוות הקשורים לכבד בארה"ב2. מכיוון שאין טיפולים מאושרים, יש צורך דחוף לפענח את המנגנונים הגורמים לפיברוזיס בכבד בחולי NASH ולפתח טיפול ממוקד3.
המטריצה החוץ תאית (ECM) היא מיקרו-סביבה דינמית ומורכבת המפעילה תקשורת דו-כיוונית עם תאים כדי לווסת את הומאוסטזיס רקמות4. ECM הכבד מורכב מאלמנטים מבניים כגון פרוטאוגליקנים, קולגן, פיברונקטין (fibronectin), אלסטין וחלבונים לא מבניים אחרים (למשל, אולפקטומדין וטרומבוספונדין) כדי לספק תמיכה פיזית ומבנית4.
פיברוזיס בכבד היא תגובה כרונית לריפוי פצעים לנזק לכבד של אטיולוגיות שונות, כולל NASH3. היא נובעת מחוסר איזון בתהליך העיצוב מחדש הדינמי של מטריצת ECM ומאופיינת בעודף חלבונים מבניים בכבד הפגוע4. פיברוגנזה תלויה בתקשורת התא-תא הדינמית בין סוגים שונים של תאי כבד. תאי סטלט בכבד (HSCs), כאשר הם מופעלים, מתמיינים לתאים דמויי מיופיברובלסטים המבטאים, נודדים ומתרבים של אקטין שריר חלק ומסנתזים חלבוני ECM כפעולה לסגירת פצעים. HSCs פעילים הם התאים המרכזיים מייצרי הקולגן בכבד1.
המנגנון המולקולרי של עיצוב מחדש של ECM, דפוסי פיברוזיס והקשר שלהם לאירועים תאיים אינם ברורים. עדיין נדרשת הבנה טובה יותר של מבנה ה-ECM התלת-ממדי (3D), למרות שטכניקות ספקטרומטריית מסות סייעו לנתח את הרכב החלבונים ECM4. באופן מסורתי, כתם הטריכרום של מאסון, הכתמים האדומים של פיקרו סיריוס והדמיית הדור ההרמוני השני (SHG) בוצעו על קטעי כבד דקים דו-ממדיים (דו-ממדיים). דפוס הפיברוזיס הטיפוסי של NASH נקרא "חוט תרנגולת", אשר משתרע לאזור 3 והוא פיברוזיס perisinusoidal/pericellular 5,6. עם זאת, חסרים מחקרים המתמקדים במבנה התלת-ממדי של הכבד הטבעי, במיוחד אלה שאינם כרוכים בחתך רקמות. גישות הדמיה חזקות לזיהוי דפוסים ומאפיינים של פיברוזיס במהלך עיצוב מחדש דינמי של ECM בפיברוזיס בכבד יחזקו באופן משמעותי את ההבנה של מנגנוני NASH ויזהו מטרות טיפוליות חדשות.
כדי להתמודד עם אתגרים אלה, פרוטוקול מהיר ויעיל הותאם להדמיה של ECM הכבד המקורי באמצעות דה-צלולריזציה7. דה-צלולריזציה של כל הכבד היא גישה להסרת התוכן התאי בכבד תוך שמירה על רשת ECM תלת-ממדית מקורית באמצעות זילוח חומרי ניקוי. עכברים הוזנו בצ'או או בדיאטת מזון מהיר (FFD) במשך 14 שבועות. דה-צלולריזציה בוצעה לאחר זילוח ורידים פורטלי באתרו עם חומר ניקוי עדין וספיקות נמוכות כדי לשמר מבני קולגן תלת-סליליים ופיברילריים מקומיים. מיקרוסקופ שני פוטונים יושם כדי לנתח שינויים במבני קולגן ב- ECM. התמונות התלת-ממדיות של מבנה ה-ECM המקורי בכבדים רגילים ובכבדי NASH שוחזרו ונותחו. ביצוע דה-צלולריזציה של זילוח באתרו וניתוח הפיגום במיקרוסקופ של שני פוטונים מספק פלטפורמה מעשית ובמחיר סביר לדמיין את העיצוב מחדש הדינמי של ECM בכבד.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
ניסויים בבעלי חיים מבוצעים על פי נהלי הניסוי שאושרו על ידי הוועדות המוסדיות לטיפול ושימוש בבעלי חיים (IACUCs) של אוניברסיטת סטנפורד ובית החולים לענייני חיילים משוחררים בפאלו אלטו. עכברים זכרים בני 6-8 שבועות C57BL/6J הוזנו בצ'או או בתזונה של מזון מהיר בתוספת סירופ תירס עתיר פרוקטוז 4.2% (ראו טבלת חומרים) במי שתייה במשך 14 שבועות5. העכברים הוחזקו בכלובים סטנדרטיים במחזור חושך/אור של 12 שעות.
1. הכנה כירורגית ונהלים של זילוח הכבד
- שקול את העכבר לפני ההליך.
- מרדימים את העכבר על ידי מתן קטמין (90 מ"ג/ק"ג) וקסילזין (10 מ"ג/ק"ג) (ראו טבלת חומרים) באמצעות הזרקה תוך צפקית. ודא שהעכבר מורדם לחלוטין על ידי צביטת בוהן לפני שתמשיך לשלב הבא.
הערה: אין צורך באיזופלורן כאן מכיוון שמדובר בניתוח שאינו הישרדותי. - יש לגלח את אזור הגחון באמצעות קוצץ שיער ולחטא את העור באתנול 70%. הנח את העכבר על גבו, ולשתק את הרגליים על לוח הניתוחים עם קלטת.
- לאחר אישור מחדש של עומק ההרדמה על ידי צביטת בוהן, השתמש במספריים של מאיו ומלקחיים אדסון (ראה טבלת חומרים) כדי לבצע חתך של 3 ס"מ לרוחב בבטן התחתונה ולאחר מכן חתך של 5 ס"מ אנכית מהבטן התחתונה לתהליך הקסיפואיד. היזהר לא לפתוח את חלל החזה.
- לאחר פתיחת הצפק, מניחים בעדינות את המעיים משמאל לבעל החיים, ומרימים את האונה הימנית של הכבד עם מוליך עם קרני ריון (ראו טבלת חומרים) כדי לחשוף את הווריד הפורטלי.
- צנתור את הווריד הפורטלי באמצעות צנתר 24 G IV. הכנס את הצנתר לקצה הדיסטלי של וריד הפורטל. הניחו את קצה הצנתר לפני שווריד הפורטל מסתעף לאונות הכבד.
- למשוך את המחט מיד כאשר הצנתר נכנס לווריד. בדוק כי הצנתר ממוקם כראוי בתוך הווריד על ידי ניקוב הכבד עם PBS באמצעות מזרק 1mL דרך הצנתר.
הערה: עם זילוח PBS, כל האונות צריכות להתכווץ מיד. אם הצנתר ממוקם כראוי, דם ורידי יזרום במהירות דרך הצנתר. - השתמש במלקחיים מיקרו של Dumont, מחזיק מיקרו-מחט Castroviejo, ותפר 4-0 (ראה טבלת חומרים) כדי להניח תפר מתחת להסתעפות של וריד הפורטל ותפר שני 1 ס"מ מתחת כדי לאבטח את הצנתר.
2. דה-צלולריזציה של רקמות
- חבר את הצנתר לצינור סיליקון (~ 1 מ 'אורך, 3 מ"מ קוטר פנימי וקוטר חיצוני 4.1 מ"מ) עם מחבר Luer. חברו את צינורות הסיליקון למשאבה פריסטלטית ולמאגר המכיל מים שעברו דה-יוניזציה (ראו טבלת חומרים).
- הסר בזהירות את בועות האוויר בתוך הצינור והימנע מיצירת בועות חדשות במהלך הזילוח. הגדר את המשאבה הפריסטלטית בתפוקת זרימה של 0.2 מ"ל/דקה (כלומר, 288 מ"ל/24 שעות).
- יש לערבב תחילה עם מים שעברו דה-יוניזציה (~ 50 מ"ל / עכבר) למשך שעתיים. צבע הכבד ישתנה מאדום לצהוב במהלך הזילוח.
הערה: תוקף בעל החיים יפוג לאחר 10 דקות של זילוח. - החליפו את תמיסת הזילוח לנתרן דאוקסיכולאט 0.5% (wt/vol) (DOC, ראו טבלת חומרים) והמשיכו למשך הלילה (18 שעות, ~250 מ"ל/עכבר). הכבד יהפוך לבן בסוף הזילוח (איור 1).
- החליפו את תמיסת הזילוח למים שעברו דה-יוניזציה (~ 50 מ"ל/עכבר) ונתזה למשך שעתיים.
- השתמשו במלקחיים זעירים של Dumont ובמספריים מיקרו-קפיציים (ראו טבלת חומרים) כדי לאסוף את הכבד שעבר דה-צלולריזציה ולשטוף אותו בזהירות בצלוחית פטרי עם PBS.
- חתכו את הרקמה הדה-צלולרית לחתיכות קטנות לצורך הדמיה מיידית או הקפיאו בטמפרטורה של -80°C לאנליזה ביוכימית נוספת כגון ספקטרומטריית מסות טנדם, ELISA או כתם מערבי.
3. הכנת שקופיות להדמיה (במיקרוסקופ פלואורסצנטי מולטיפוטון/קונפוקל)
- מעבירים חתיכה קטנה של כבד נטול תאים (<3 x 3 x 3 מ"מ) לשקופית מיקרוסקופ ומניחים את הרקמה באמצע.
- הוסף 10 μL של אמצעי הרכבה נגד דהייה (ראה טבלת חומרים) לרקמה עם פיפטה כדי למנוע התייבשות רקמות.
- מכסים את הרקמה בזכוכית כיסוי ומפעילים כוח קטן כדי לשטח את הדגימה. אטמו את שולי זכוכית הכיסוי בלק חסר צבע ושקוף (איור 2).
הערה: בשל קיבוע שני הפוטון הזקוף דרך המיקרוסקופ, נעשה שימוש בזכוכית כיסוי על הדגימה. עם זאת, ניתן למקם דגימות באופן שונה אם משתמשים במיקרוסקופ הפוך.
4. רכישת תמונות
- הניחו טיפת שמן טבילה על החלק העליון של זכוכית הכיסוי והניחו את המגלשה על מחזיק המגלשה במיקרוסקופ. מנמיכים את עדשת האובייקט עם שמן 20x עד שהיא באה במגע עם שמן הטבילה.
- עבור לערוץ הסגול (405 ננומטר), הפעל את התריס והתמקד בדגימה. נווט ומקם את תחום העניין להדמיה. כבה את התריס לפני המעבר לרכישת תמונה באמצעות אור לייזר.
- עבור לפקד המחשב והפעל את הלייזר של שני פוטונים. הפעילו תחילה את הלייזר הדו-פוטוני (איור 3A), ואז הפעילו את בקר הלייזר הדו-פוטוני (ראו טבלת חומרים) ואת התריס (איור 3B,C). ודא שהספק המוצא גבוה מ- 2.5 ואט.
הפחת את עוצמת הלייזר כדי למנוע מרווה פלואורסצנטית. בחר והתאם גלאים (הן מכפילי אור והן היברידיים) כדי להתאים לפלואורופורים שנבחרו.
הערה: הדמיה של שני פוטונים בוצעה באורך גל עירור של 860 ננומטר. שתי תעלות נבחרו עבור תמונות קולגן SHG ושני פוטונים מעוררים פלואורסצנטיים (TPEF), בהתאמה. ערוץ אחד המתאים לטווח אורכי גל של 415-445 ננומטר זיהה את המבנה המפורט של קולגן מאותות SHG. ערוץ נוסף כיסה את הטווח של 465-669 ננומטר לאיסוף אותות TPEF. - בחר רכישות תמונה בו-זמניות או רציפות. התאם את חור הסיכה לערך הגבוה ביותר. התאם את אורכי הגל של הלייזר, הרווח, ההספק וההסטה. התאימו את זמן השהייה של הפיקסלים, את גודל הפיקסלים, הממוצע ואת הזום (איור 4A).
- גלול בבקר z של המחשב והגדר את ממדי z, הגדר את נקודות ההתחלה והסיום, ובחר את מספר התמונות הנתון באמצעי אחסון (z-stack). רכוש תמונות.
הערה: כאן נבחר נפח Z של 20 מיקרומטר וגודל של 1 מיקרומטר Z-step (איור 4B).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
סיבי הקולגן זוהו באמצעות יצירה הרמונית שנייה ומיקרוסקופ של שני פוטונים. האות מגיע ממבני הקולגן התלת-סלילי והפיברילרי הטבעי. נוגדנים ספציפיים לא שימשו לניתוח תת-סוגים של קולגן; עם זאת, ניתן להוסיף זאת לטכניקת ההדמיה.
כאשר רקמת הכבד נחקרת ללא דה-צלולריזציה, מאתגר לקבל תמונות ברזולוציה גבוהה של רשת הקולגן (איור 5A). באק"מ דה-צלולרי, סיבי קולגן (ירוק) נראים מקבילים או שזורים זה בזה (איור 5B). היו הבדלים ברורים במורפולוגיה ובהתפלגות המרחבית של רכיבי ECM בין כבדי צ'או וכבדי FFD. סיבי קולגן בעכברים שקיבלו דיאטת צ'או הציגו רשת שזורה ומאורגנת היטב. בעכברים עם FFD, לעומת זאת, נצפו צרורות קולגן עם פחות קישוריות (איור 5B).
כדי להמשיך ולחקור את המבנה התלת-ממדי של ECM בכבד, תמונות של הפרוסות צולמו עם 20 מיקרומטר של נפח Z (עובי) ו-1 מיקרומטר של גודל Z-step. סיבי קולגן בעכברים שקיבלו דיאטת צ'או הראו רשת מאורגנת היטב, אבל לא בעכברים שקיבלו FFD (איור 6). כדי לאשר את איכות הקולגן הפיברילרי ב-ECM נטול תאים, השקופיות תוקנו והוטמעו בפרפין ונצבעו בהמטוקסילין ובאוזין (H&E) ובאדום פיקרוסיריוס (PSR) (ראו טבלת חומרים). H&E מראה שכל התאים הוסרו. PSR היא טכניקה היסטולוגית נפוצה להדגשת קולגן במקטעי רקמה משובצים פרפין (איור 7).
איור 1: כבד עכבר במהלך זילוח. הכבד הופך לבן ושקוף למחצה בסוף הזילוח. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: הכנת שקופיות להדמיה. הרקמה מכוסה בזכוכית כיסוי, וכוח קטן מופעל כדי לשטח את הדגימה. שולי זכוכית הכיסוי אטומים בלק חסר צבע ושקוף. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: צילום מסך של תוכנת הלייזר של שני פוטונים, המפעילה את הלייזר הדו-פוטוני. (A) ראשית, הלייזר בעל שני הפוטונים מופעל. (ב) (C) בקר הלייזר בעל שני הפוטונים והתריס מופעלים. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4: צילום מסך של תוכנת הלייזר בעלת שני הפוטונים במהלך רכישת תמונה. (A) הקפד להגדיר את חור הסיכה לערך הגבוה ביותר (חיצים אדומים). התאם את אורכי הגל של הלייזר, הרווח, ההספק וההסטה. התאם את זמן השהייה של הפיקסלים, את גודל הפיקסלים, את הממוצע ואת הזום. (B) הגדר את עוצמת הקול Z ל- 20 מיקרומטר ואת גודל שלב Z ל- 1 מיקרומטר. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 5: ECM דה-צלולרי שצולם במיקרוסקופ של שני פוטונים . (A) תמונות SHG של סיבי קולגן מפרוסה של 6 מיקרומטר בכבד (טרי קפוא) ללא דה-צלולריזציה. (B) תמונות SHG מתארות רשת קולגן מאורגנת היטב בכבדים של עכברים בקבוצת ביקורת רגילה, דיאטת צ'או. רשת קולגן מחודשת בעכברים בדיאטת מזון מהיר (FFD). חץ, אזור פיברוזיס. כוכב, רשת קולגן משופצת. סרגל קנה מידה = 100 מיקרומטר. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 6: מבנה תלת-ממדי של רשת קולגן בכבד. סיבי הקולגן בעכברים שקיבלו דיאטת צ'או הראו רשת מאורגנת היטב, אך לא בעכברי דיאטת מזון מהיר (FFD). התמונות צולמו בנפח Z (עובי) של 20 מיקרומטר ובגודל Z-step של 1 מיקרומטר. סרגל קנה מידה = 100 מיקרומטר. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 7: צביעת המטוקסילין ואאוזין (H&E) וצביעה באדום פיקרוסיריוס (PSR) של ECM נטול תאים. H&E מראה שכל התאים הוסרו. בתמונות הצביעה של PSR, ה-ECM של העכברים שניזונו מצ'או חשף רשת מאורגנת היטב, ולעומת זאת, עכברים שקיבלו דיאטת מזון מהיר (FFD) הראו סיבי קולגן צפופים יותר. Z-נפח (עובי) = 6 מיקרומטר. סרגל קנה מידה = 100 מיקרומטר. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
הפרוטוקול הנוכחי מראה כי דה-צלולריזציה באמצעות זילוח DOC באתרו בקצב זרימה נמוך משמרת את מבני הקולגן התלת-סלילי והפיברילרי הטבעי, ומספקת פלטפורמה אמינה וחסכונית ללכידת עיצוב מחדש דינמי של ECM בפיברוזיס כבד NASH. למרות שדה-צלולריזציה בוצעה בכבדים רגילים ופיברוטיים לפני זיהוי רכיבי ECM או יצירת פיגומים ביולוגיים לתרבית תאים, הדינמיקה של עיצוב מחדש של ECM בפיברוזיס בכבד לא נחקרה היטב 8,9,10. שיטה זו מאפשרת לחוקרים לערוך השוואות בין מודלים שונים של פיברוזיס.
נכון לעכשיו, ישנם סוגים שונים של פרוטוקולי זילוח באמצעות DNase, נתרן דודציל סולפט (SDS), או Triton X-10011. העלות של DNase גבוהה מכיוון שנדרשים כמויות גדולות של פתרונות. SDS הוא תמיסת דנטורינג קשה, חומר ניקוי אניוני המשבש את קרומי התאים ומנטרל חלבונים. לכן, שימור כל רשת הקולגן לאחר זילוח SDS הוא מאתגר. לעומת זאת, Triton X-100, כחומר ניקוי עדין שאינו דנטורינג ולא יוני, משבש אינטראקציות שומנים-שומנים ושומנים-חלבונים ומשמר אינטראקציות חלבון-חלבון. עם זאת, דווח כי Triton X-100 מפריע לפיגומי ECM, מה שהופך את ECM הכבד decellularized לא מתאים לניתוח ספקטרומטריית מסה נוספת11.
פרוטוקול הזלוף עם DOC שונה מהעבודה הקודמת7, והדגים שימור טוב יותר של מבני הקולגן התלת-סלילי והפיברילרי המקומי ברוב הרקמות. רשת הקולגן נחקרה במיקרוסקופ הדור ההרמוני השני (SHG) ללא נוגדנים, המשקפים את מבני הקולגן התלת-סלילי והפיברילרי הטבעי. ECM הכבד נטול התאים מעכברי FFD נבדק גם הוא, ושינויים מבניים ב- NASH אושרו.
השלבים הקריטיים ביותר בפרוטוקול הם מיקום הצנתר והגדרת מערכת הזלוף. צנתור הווריד הפורטלי הוא חיוני, אך ניתן להשתמש גם בווריד הנבוב התחתון אם וריד הפורטל ניזוק. יש להימנע מבועות בחיץ ובצינורות מכיוון שהן משפיעות על הזלוף. מכיוון שנעשה שימוש במיקרוסקופ זקוף של שני פוטונים, גודל הדגימה היה מוגבל. ניתן לשנות זאת אם יש להשתמש במיקרוסקופ הפוך.
יש עניין גובר ECM משופץ במחלות כבד כרוניות hepatocarcinogenesis12,13,14. פיגומי ECM דה-צלולריים שימשו בתיקון כירורגי וברפואה רגנרטיבית כחומר פיגום ביולוגי מתאים15,16,17. עם זאת, לתהליך דה-צלולריזציה קל זה יש גם מגבלות, מכיוון שרכיבים תאיים מסוימים כגון DNA או שאריות שומנים עשויים שלא להיות מוסרים לחלוטין. זמן זילוח DOC ארוך יותר ועלייה בקצב הזרימה עשויים לסייע בקבלת פיגומים דה-סלולריים מטוהרים במיוחד. הוספת DNase לתמיסת הכביסה לאחר זילוח DOC עשויה גם לעזור להסיר DNA. ניתן להתאים את הפרוטוקול לביופסיות כבד אנושיות, ובכך לשפר את ההבנה של שינויים ב- ECM במהלך התקדמות NASH.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים מצהירים כי אין ניגודי עניינים בנוגע למאמר זה.
Acknowledgments
אנו מודים להיסוק פארק על העזרה הטכנית. מחקר זה נתמך על ידי מימון מהמכון הלאומי לסוכרת ומחלות עיכול וכליות (NIDDK), NIH (R01 2DK083283, ל- NJT), המכון הלאומי להזדקנות (NIA), NIH (1R01AG060726, ל- NJT). אנו מודים לג'ון מלהולנד וקיטי לי ממתקן הדימות למדעי התא במרכז בקמן על הסיוע הטכני בהדמיה במיקרוסקופ של שני פוטונים.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4-0 MONOCRYL UNDYED 1 x 18" P-3 | MONOCRYL | Y494G | |
| 4-0 suture | fisher scientific | 10-000-649 | https://www.fishersci.com/shop/products/monomid-nylon-non-absorbable-sutures-7/10000649?keyword=true |
| AnaSed Injection (xylazine) | AnaSed | NDC 59399-110-20 | this drug to use by or on the order of a licensed veterinarian. |
| BD INSYTE AUTOGUARD I.V. CATHETER WITH BC TECHNOLOGY | BD | 382612 | |
| Chow diet | Envigo | # 2918 | Control diet. A fixed formula, non-autoclavable diet manufactured with high quality ingredients and designed to support gestation, lactation, and growth of rodents. |
| Fast-food diet (AIN76A Western Diet) | Test Diet | 1810060 | https://www.testdiet.com/cs/groups/lolweb/@testdiet/documents/web_content/mdrf/mdux/~edisp/ducm04_051601.pdf |
| Hematoxylin and Eosin Stain Kit | vectorlabs | H-3502 | https://vectorlabs.com/hematoxylin-and-eosin-stain-kit.html |
| Kent Scientific Rat Surgical Kit | fisher scientific | 13-005-205 | https://www.fishersci.com/shop/products/rat-surgical-kit/13005205#?keyword=mouse%20surgery%20kit |
| KETAMINE HYDROCHLORIDE INJECTION | Vedco | NDC 50989-996-06 - 10 mL - vial. | KetaVed has been clinically studied in subhuman primates in addition to those species listed under Administration and Dosage. |
| Leica SP5 upright Confocal, multi-photon | Leica | SP5 | |
| Luer connector (Three-way stopcock with SPIN-LOCK®) | bbraun | D300 | https://www.bbraunusa.com/en/products/b0/three-way-stopcockwithspin-lock.html |
| Picrosirius Red Stain Kit | Polysciences, Inc. | 24901 | https://www.polysciences.com/default/picrosirius-red-stain-kit-40771 |
| Rayon tipped applicator | puritan | 25-806 1PR | |
| Sodium deoxycholate | sigmaaldrich | D6750-100G | |
| Syrup | www.target.com | 24 fl oz | https://www.target.com/p/pancake-syrup-24-fl-oz-market-pantry-8482/-/A-13007801 |
| Variable Speed Peristaltic Pump | INTLLAB | BT100 | https://www.amazon.com/gp/product/B082K97W5W/ref=ox_sc_saved_title_2?smid=A12NUUP87ZRRAR&psc=1 |
| VECTASHIELD Antifade Mounting Medium | vectorlabs | H-1000-10 | https://vectorlabs.com/vectashield-mounting-medium.html |
References
- Friedman, S. L., Pinzani, M. Hepatic fibrosis: 2022 unmet needs and a blueprint for the future. Hepatology. 75 (2), 473-488 (2021).
- Ye, Q., et al. Global prevalence, incidence, and outcomes of non-obese or lean non-alcoholic fatty liver disease: A systematic review and meta-analysis. The Lancet Gastroenterology and Hepatology. 5 (8), 739-752 (2020).
- Schwabe, R. F., Tabas, I., Pajvani, U. B. Mechanisms of fibrosis development in non-alcoholic steatohepatitis. Gastroenterology. 158 (7), 1913-1928 (2020).
- Arteel, G. E., Naba, A. The liver matrisome - looking beyond collagens. JHEP Reports. 2 (4), 100115 (2020).
- Jiang, J. X., et al. Nonphagocytic activation of NOX2 is implicated in progressive non-alcoholic steatohepatitis during aging. Hepatology. 72 (4), 1204-1218 (2020).
- Dehnad, A., et al. AGER1 downregulation associates with fibrosis in non-alcoholic steatohepatitis and type 2 diabetes. Journal of Clinical Investigation. 130 (8), 4320-4330 (2020).
- Mayorca-Guiliani, A. E., et al. Decellularization and antibody staining of mouse tissues to map native extracellular matrix structures in 3D. Nature Protocols. 14 (12), 3395-3425 (2019).
- Mazza, G., et al. Cirrhotic human liver extracellular matrix 3D scaffolds promote smad-dependent tgf-beta1 epithelial mesenchymal transition. Cells. 9 (1), 83 (2019).
- Klaas, M., et al. The alterations in the extracellular matrix composition guide the repair of damaged liver tissue. Scientific Reports. 6, 27398 (2016).
- Mattei, G., et al. Mechanostructure and composition of highly reproducible decellularized liver matrices. Acta Biomaterialia. 10 (2), 875-882 (2014).
- Ren, H., et al. Evaluation of two decellularization methods in the development of a whole-organ decellularized rat liver scaffold. Liver International. 33 (3), 448-458 (2013).
- Piersma, B., Hayward, M. K., Weaver, V. M. Fibrosis and cancer: A strained relationship. Biochimica et Biophysica Acta - Reviews on Cancer. 1873 (2), 188356 (2020).
- Cox, T. R.
- Mirdamadi, E. S., Kalhori, D., Zakeri, N., Azarpira, N., Solati-Hashjin, M. Liver tissue engineering as an emerging alternative for liver disease treatment. Tissue Engineering Part B: Reviews. 26 (2), 145-163 (2020).
- Mazza, G., et al. Decellularized human liver as a natural 3D-scaffold for liver bioengineering and transplantation. Scientific Reports. 5, 13079 (2015).
- Jia, Z., et al. 3D culture system for liver tissue mimicking hepatic plates for improvement of human hepatocyte (C3A) function and polarity. BioMed Research International. 2020, 6354183 (2020).
- Shimoda, H., et al. Decellularized liver scaffolds promote liver regeneration after partial hepatectomy. Scientific Reports. 9 (1), 12543 (2019).
