Summary
Настоящий протокол оптимизирует методы перфузии/децеллюляризации печени in situ и двухфотонной микроскопии для создания надежной платформы для визуализации динамики ремоделирования внеклеточного матрикса (ECM) при неалкогольном стеатогепатите (НАСГ).
Abstract
Неалкогольный стеатогепатит (НАСГ) является наиболее распространенным хроническим заболеванием печени в Соединенных Штатах, поражающим более 70 миллионов американцев. НАСГ может прогрессировать до фиброза и, в конечном итоге, до цирроза, значительного фактора риска гепатоцеллюлярной карциномы. Внеклеточный матрикс (ECM) обеспечивает структурную поддержку и поддерживает гомеостаз печени с помощью матрицеллюлярных сигналов. Фиброз печени возникает в результате дисбаланса в динамическом процессе ремоделирования ECM и характеризуется чрезмерным накоплением структурных элементов и связанными с этим изменениями гликозаминогликанов. Типичная картина фиброза НАСГ называется «куриной проволокой», которая обычно состоит из перисинусоидального / перицеллюлярного фиброза зоны 3, основанного на особенностях, наблюдаемых трихромным пятном Массона и красными пятнами Picrosirius. Тем не менее, эти традиционные методы визуализации на основе тонких двумерных (2D) тканевых слайдов не могут продемонстрировать подробные трехмерные (3D) структурные изменения ECM, что ограничивает понимание динамического ремоделирования ECM при фиброзе печени.
Текущая работа оптимизировала быстрый и эффективный протокол для визуализации нативной структуры ECM в печени посредством децеллюляризации для решения вышеуказанных проблем. Мышей кормили либо чау-чау, либо фаст-фудом в течение 14 недель. Децеллюляризацию проводили после перфузии воротной вены in situ , а методы двухфотонной микроскопии применяли для визуализации и анализа изменений в нативной ECM. Были восстановлены и проанализированы 3D-изображения нормальной печени и печени с НАСГ. Выполнение перфузионной децеллюляризации in situ и анализ каркаса с помощью двухфотонной микроскопии обеспечили практичную и надежную платформу для визуализации динамического ремоделирования ECM в печени.
Introduction
Неалкогольная жировая болезнь печени (НАЖБП) является наиболее распространенным заболеванием печени, поражающим 20-25% взрослого населения. У 25% пациентов с НАЖБП прогрессирует до неалкогольного стеатогепатита (НАСГ), при котором повышается риск цирроза печени, печеночной недостаточности и гепатоцеллюлярной карциномы1. По оценкам, в ближайшие 20 лет на долю НАСГ будет приходиться 2 миллиона смертей, связанных с печенью, в США2. Поскольку не существует утвержденных методов лечения, существует острая необходимость в расшифровке механизмов, вызывающих фиброз печени у пациентов с НАСГ, и разработке целенаправленного лечения3.
Внеклеточный матрикс (ECM) представляет собой динамическое сложное микроокружение, которое осуществляет двунаправленную связь с клетками для регулирования гомеостазатканей 4. ECM печени состоит из структурных элементов, таких как протеогликаны, коллагены, фибронектин, эластин и другие неструктурные белки (например, ольфактомедин и тромбоспондин) для обеспечения физической и структурной поддержки4.
Фиброз печени является хронической ранозаживляющей реакцией на поражение печени различной этиологии, включая НАСГ3. Он возникает в результате дисбаланса в процессе динамического ремоделирования матрицы ECM и характеризуется чрезмерным количеством структурных белков в поврежденной печени4. Фиброгенез зависит от динамической межклеточной коммуникации между различными типами клеток печени. Звездчатые клетки печени (ГСК) при активации дифференцируются в гладкомышечные альфа-2-актин-экспрессирующие, мигрирующие и пролиферирующие миофибробластоподобные клетки и синтезируют белки ECM в качестве закрывающего рану действия. Активированные ГСК являются центральными клетками, продуцирующими коллаген в печени1.
Молекулярный механизм ремоделирования ECM, паттерны фиброза и их связь с клеточными событиями не ясны. По-прежнему необходимо лучше понять трехмерную (3D) структуру ECM, даже несмотря на то, что методы масс-спектрометрии помогли проанализировать состав белкаECM 4. Традиционно трихромное окрашивание Массона, красители Picro Sirius Red и визуализация генерации второй гармоники (SHG) выполнялись на двумерных (2D) тонких срезах печени. Типичная картина фиброза НАСГ называется «куриной проволокой», которая распространяется на зону 3 и представляет собой перисинусоидальный/перицеллюлярный фиброз 5,6. Тем не менее, не хватало исследований, посвященных 3D-структуре нативной печени, особенно тех, которые не связаны с разделением тканей. Надежные подходы к визуализации для выявления закономерностей и характеристик фиброза во время динамического ремоделирования ECM при фиброзе печени значительно укрепит понимание механизмов НАСГ и выявят новые терапевтические мишени.
Чтобы решить эти проблемы, был оптимизирован быстрый и эффективный протокол для визуализации ECM нативной печени с помощью децеллюляризации7. Децеллюляризация всей печени — это подход к удалению клеточного содержимого печени при сохранении нативной сети 3D ECM за счет перфузии детергента. Мышей кормили либо чау-чау, либо диетой быстрого питания (FFD) в течение 14 недель. Децеллюляризацию проводили после перфузии воротной вены in situ мягким детергентом и низкой скоростью потока для сохранения тройных спиральных и нативных фибриллярных коллагеновых структур. Двухфотонная микроскопия применялась для анализа изменений коллагеновых структур в ECM. Были восстановлены и проанализированы 3D-изображения нативной структуры ECM в нормальной печени и печени с НАСГ. Выполнение перфузионной децеллюляризации in situ и анализ каркаса с помощью двухфотонной микроскопии обеспечивает практичную и доступную платформу для визуализации динамического ремоделирования ECM в печени.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Эксперименты на животных проводятся в соответствии с экспериментальными процедурами, утвержденными институциональными комитетами по уходу за животными и их использованию (IACUC) Стэнфордского университета и Госпиталя по делам ветеранов в Пало-Альто. 6-8-недельных мышей-самцов C57BL / 6J кормили либо чау-чау, либо диетой быстрого питания с добавлением 4,2% кукурузного сиропа с высоким содержанием фруктозы (см. Таблицу материалов) в питьевой воде в течение 14 недель5. Мышей содержали в стандартных клетках в течение 12 часов в темно-светлом цикле.
1. Хирургическая подготовка и процедуры перфузии печени
- Взвесьте мышь перед процедурой.
- Обезболивают мышей, вводя кетамин (90 мг / кг) и ксилазин (10 мг / кг) (см. Таблицу материалов) посредством внутрибрюшинной инъекции. Убедитесь, что мышь полностью обезболивается, ущипнув пальцы ног, прежде чем переходить к следующему шагу.
ПРИМЕЧАНИЕ: Изофлуран здесь не нужен, так как это операция, не приводящая к выживанию. - Побрейте вентральную область с помощью машинки для стрижки волос и продезинфицируйте кожу 70% этанолом. Положите мышь на спину, а ноги на хирургической доске обездвижите скотчем.
- После подтверждения глубины анестезии защемлением пальца ноги используйте ножницы Майонеза и щипцы Адсона (см. Таблицу материалов), чтобы сделать разрез 3 см сбоку в нижней части живота, а затем разрез 5 см по вертикали от нижней части живота до мечевидного отростка. Будьте осторожны, чтобы не открыть грудную полость.
- После вскрытия брюшины аккуратно поместите кишечник слева от животного и поднимите правую долю печени с помощью аппликатора с вискозным наконечником (см. Таблицу материалов), чтобы обнажить воротную вену.
- Катетеризируют воротную вену с помощью катетера 24 G IV. Ввести катетер в дистальный конец воротной вены. Поместите наконечник катетера до того, как воротная вена разветвится в печеночные доли.
- Извлеките иглу сразу после того, как катетер войдет в вену. Убедитесь, что катетер правильно расположен внутри вены, перфузируя печень PBS с помощью шприца объемом 1 мл через катетер.
ПРИМЕЧАНИЕ: После перфузии PBS все доли должны немедленно побледнеть. Если катетер установлен правильно, венозная кровь будет быстро течь через катетер. - Используйте микрощипцы Dumont, держатель микроиглы Castroviejo и шов 4-0 (см. Таблицу материалов), чтобы наложить шов ниже разветвления воротной вены, и второй стежок на 1 см ниже, чтобы закрепить катетер.
2. Тканевая децеллюляризация
- Подсоедините катетер к силиконовой трубке (длина ~1 м, внутренний диаметр 3 мм и наружный диаметр 4,1 мм) с помощью соединителя Luer. Подсоедините силиконовую трубку к перистальтическому насосу и резервуару с деионизированной водой (см. Таблицу материалов).
- Осторожно удалите пузырьки воздуха внутри трубки и избегайте образования новых пузырьков во время перфузии. Установите перистальтический насос на производительность 0,2 мл/мин (т.е. 288 мл/24 ч).
- Сначала перфузируйте деионизированной водой (~ 50 мл / мышь) в течение 2 часов. Цвет печени изменится с красного на желтый во время перфузии.
ПРИМЕЧАНИЕ: Животное умрет через 10 минут перфузии. - Переключите перфузионный раствор на 0,5% (мас./об.) дезоксихолата натрия (DOC, см. Таблицу материалов) и продолжайте в течение ночи (18 ч, ~ 250 мл / мышь). Печень станет белой в конце перфузии (рис. 1).
- Замените перфузионный раствор на деионизированную воду (~ 50 мл / мышь) и перфузируйте в течение 2 часов.
- Используйте микрощипцы Дюмона и ножницы с микропружиной (см. Таблицу материалов), чтобы собрать децеллюляризированную печень и тщательно вымыть ее в чашке Петри с PBS.
- Разрежьте децеллюляризированную ткань на мелкие кусочки для немедленной визуализации или заморозьте при -80 ° C для дальнейшего биохимического анализа, такого как тандемная масс-спектрометрия, ИФА или вестерн-блоттинг.
3. Подготовка предметного стекла к визуализации (с помощью многофотонного/конфокального флуоресцентного микроскопа)
- Перенесите небольшой кусочек децеллюляризированной печени (<3 x 3 x 3 мм) на предметное стекло микроскопа и поместите ткань в середину.
- Добавьте 10 мкл антибактериальной монтажной среды (см. Таблицу материалов) в ткань с помощью пипетки, чтобы избежать высыхания ткани.
- Накройте ткань покровным стеклом и приложите небольшое усилие, чтобы сплющить образец. Заклейте края покровного стекла бесцветным и прозрачным лаком для ногтей (рисунок 2).
ПРИМЕЧАНИЕ: Из-за установки вертикального двухфотона через микроскоп на образце использовалось покровное стекло. Однако образцы могут быть размещены по-другому, если используется инвертированный микроскоп.
4. Получение изображения
- Нанесите каплю иммерсионного масла на верхнюю часть покровного стекла и поместите предметное стекло на держатель предметного стекла микроскопа. Опустите 20-кратную масляную линзу объектива до тех пор, пока она не соприкоснется с иммерсионным маслом.
- Переключитесь на фиолетовый (405 нм) канал, включите затвор и сфокусируйтесь на образце. Перемещайтесь и позиционируйте интересующую область для визуализации. Выключите затвор, прежде чем переходить к получению изображения с помощью лазерного излучения.
- Переключитесь на компьютерное управление и запустите двухфотонный лазер. Сначала включите двухфотонный лазер (рис. 3A), затем включите контроллер двухфотонного лазера (см. Таблицу материалов) и затвор (рис. 3B, C). Убедитесь, что выходная мощность превышает 2.5 Вт.
Уменьшите мощность лазера, чтобы предотвратить гашение флуоресценции. Выберите и отрегулируйте детекторы (как фотоумножители, так и гибридные) в соответствии с выбранными флуорофорами.
ПРИМЕЧАНИЕ: Двухфотонная визуализация была выполнена на длине волны возбуждения 860 нм. Два канала были выбраны для коллагеновых ГСП и двухфотонных возбужденных флуоресцентных изображений (TPEF) соответственно. Один канал, соответствующий диапазону длин волн 415-445 нм, обнаружил детальную структуру коллагена по сигналам SHG. Другой канал охватывал диапазон 465-669 нм для сбора сигналов TPEF. - Выберите одновременное или последовательное получение изображений. Отрегулируйте точечное отверстие до максимального значения. Отрегулируйте длины волн лазера, усиление, мощность и смещение. Отрегулируйте время выдержки пикселя, размер пикселя, усреднение и масштаб (рис. 4A).
- Прокрутите z-контроллер компьютера и установите z-размеры, определите начальную и конечную точки, а также выберите количество изображений, передаваемых в томе (z-стек). Получение изображений.
ПРИМЕЧАНИЕ: Здесь был выбран объем Z 20 мкм и размер шага Z 1 мкм (рис. 4B).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Коллагеновые волокна были обнаружены с помощью генерации второй гармоники и двухфотонной микроскопии. Сигнал исходит от хрупких тройных спиральных и нативных фибриллярных коллагеновых структур. Специфические антитела не использовались для анализа подтипов коллагена; Тем не менее, это может быть добавлено к технике визуализации.
Когда ткань печени изучается без децеллюляризации, сложно получить изображения коллагеновой сети с высоким разрешением (рис. 5А). В децеллюляризированном ECM коллагеновые волокна (зеленые) кажутся параллельными или переплетающимися (рис. 5B). Были очевидные различия в морфологии и пространственном распределении компонентов ECM между печенью Чоу и FFD. Коллагеновые волокна у мышей на диете чау-чау демонстрировали переплетение и хорошо организованную сеть. Однако у мышей с FFD наблюдались коллагеновые пучки с меньшей связностью (рис. 5B).
Для дальнейшего изучения 3D-структуры ECM печени были получены изображения срезов с 20 мкм Z-объема (толщины) и 1 мкм Z-шага. Коллагеновые волокна у мышей на диете чау-чау показали хорошо организованную сеть, но не у мышей на FFD (рис. 6). Для подтверждения качества фибриллярного коллагена в децеллюляризованном ECM предметные стекла фиксировали и встраивали в парафин и окрашивали гематоксилином и эозином (H&E) и пикросириусом красным (PSR) (см. Таблицу материалов). H&E показывает, что все клетки были удалены. PSR является широко используемым гистологическим методом для выделения коллагена в срезах тканей, залитых парафином (рис. 7).
Рисунок 1: Печень мыши во время перфузии. Печень становится белой и полупрозрачной в конце перфузии. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Подготовка слайдов к визуализации. Ткань накрывается покровным стеклом, и прикладывается небольшое усилие, чтобы сплющить образец. Края покровного стекла заклеиваются бесцветным и прозрачным лаком для ногтей. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Скриншот программного обеспечения двухфотонного лазера, запускающего двухфотонный лазер. (A) Сначала включается двухфотонный лазер. (В) (C) Контроллер двухфотонного лазера и затвор включены. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4: Скриншот программного обеспечения двухфотонного лазера во время получения изображения. (A) Убедитесь, что отверстие установлено на максимальное значение (красные стрелки). Отрегулируйте длины волн лазера, усиление, мощность и смещение. Отрегулируйте время выдержки пикселя, размер пикселя, усреднение и масштабирование. (B) Установите объем Z на 20 мкм и размер шага Z на 1 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 5: Децеллюляризированная ECM, полученная с помощью двухфотонной микроскопии . (A) ГСП-изображения коллагеновых волокон из среза печени размером 6 мкм (свежезамороженного) без децеллюляризации. (B) Изображения SHG показывают хорошо организованную коллагеновую сеть в печени мышей на нормальной контрольной диете. Реконструированная коллагеновая сеть у мышей на диете быстрого питания (FFD). Стрелка, область фиброза. Звезда, реконструированная коллагеновая сеть. Масштабная линейка = 100 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 6: 3D-структура коллагеновой сети печени. Коллагеновые волокна у мышей на диете чау-чау показали хорошо организованную сеть, но не у мышей с диетой быстрого питания (FFD). Изображения были получены с Z-объемом (толщиной) 20 мкм и Z-шагом 1 мкм. Масштабная линейка = 100 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 7: Окрашивание гематоксилином и эозином (H & E) и окрашивание Picrosirius red (PSR) децеллюляризованного ECM. H&E показывает, что все клетки были удалены. На изображениях окрашивания PSR ECM от мышей, которых кормили чау-чау, выявил хорошо организованную сеть, и, напротив, у мышей на диете быстрого питания (FFD) были обнаружены более плотные коллагеновые волокна. Z-объем (толщина) = 6 мкм. Масштабная линейка = 100 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Настоящий протокол показывает, что децеллюляризация с помощью перфузии DOC in situ с низкой скоростью потока сохраняет хрупкие структуры тройной спирали и нативного фибриллярного коллагена, обеспечивая надежную и экономичную платформу для динамического ремоделирования ECM при фиброзе печени НАСГ. Несмотря на то, что децеллюляризация проводилась в нормальной и фиброзной печени до идентификации компонентов ECM или создания биологических каркасов для клеточной культуры, динамика ремоделирования ECM при фиброзе печени недостаточно изучена 8,9,10. Этот метод позволяет исследователям проводить сравнения между различными моделями фиброза.
В настоящее время существуют разновидности протоколов перфузии с использованием ДНКазы, додецилсульфата натрия (SDS) или Triton X-10011. Стоимость ДНКазы высока, потому что требуются большие объемы растворов. SDS представляет собой жесткий денатурирующий раствор, анионное детергентное средство, которое разрушает клеточные мембраны и денатурирует белки. Поэтому сохранение всей коллагеновой сети после перфузии SDS является сложной задачей. Напротив, Triton X-100, как мягкое неденатурирующее, неионогенное детергент, нарушает липидно-липидные и липидно-белковые взаимодействия и сохраняет белок-белковые взаимодействия. Тем не менее, сообщалось, что Triton X-100 возмущает каркасы ECM, делая децеллюляризованный ECM печени непригодным для дальнейшего масс-спектрометрического анализа11.
Протокол перфузии с DOC был модифицирован по сравнению с предыдущей работой7, демонстрируя лучшую сохранность тройных спиральных и нативных фибриллярных коллагеновых структур в большинстве тканей. Коллагеновая сеть была изучена с помощью микроскопии генерации второй гармоники (SHG) без антител, отражающих структуры тройной спирали и нативного фибриллярного коллагена. Также был протестирован децеллюляризированный ECM печени у мышей с FFD, и были подтверждены структурные изменения в НАСГ.
Наиболее важными этапами в протоколе являются установка катетера и настройка перфузионной системы. Катетеризация воротной вены жизненно важна, но нижняя полая вена также может быть использована при повреждении воротной вены. Следует избегать пузырьков в буфере и трубках, поскольку они влияют на перфузию. Поскольку использовался вертикальный двухфотонный микроскоп, размер выборки был ограничен. Это может быть изменено, если будет использоваться инвертированный микроскоп.
Растет интерес к ремоделированному ECM при хронических заболеваниях печени и гепатокарциногенезе12,13,14. Децеллюляризированные каркасы ECM использовались в хирургическом восстановлении и регенеративной медицине в качестве подходящего материала биологических каркасов15,16,17. Однако этот мягкий процесс децеллюляризации также имеет ограничения, поскольку некоторые клеточные компоненты, такие как ДНК или остатки липидов, не могут быть полностью удалены. Более длительное время перфузии DOC и увеличение скорости потока могут помочь получить ультраочищенные децеллюляризированные каркасы. Добавление ДНКазы в промывочный раствор после перфузии DOC также может помочь удалить ДНК. Протокол может быть скорректирован для биопсии печени человека, что улучшает понимание изменений ECM во время прогрессирования НАСГ.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов в отношении данной статьи.
Acknowledgments
Благодарим Hyesuk Park за техническую помощь. Это исследование было поддержано финансированием Национального института диабета, болезней органов пищеварения и почек (NIDDK), NIH (R01 2DK083283, в NJT), Национального института старения (NIA), NIH (1R01AG060726, в NJT). Мы выражаем благодарность Джону Малхолланду (Jon Mulholland) и Китти Ли (Kitty Lee) из Центра клеточных наук (Cell Sciences Imaging Facility) Центра Бекмана (Beckman Center) за техническую помощь в проведении двухфотонной микроскопии.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4-0 MONOCRYL UNDYED 1 x 18" P-3 | MONOCRYL | Y494G | |
| 4-0 suture | fisher scientific | 10-000-649 | https://www.fishersci.com/shop/products/monomid-nylon-non-absorbable-sutures-7/10000649?keyword=true |
| AnaSed Injection (xylazine) | AnaSed | NDC 59399-110-20 | this drug to use by or on the order of a licensed veterinarian. |
| BD INSYTE AUTOGUARD I.V. CATHETER WITH BC TECHNOLOGY | BD | 382612 | |
| Chow diet | Envigo | # 2918 | Control diet. A fixed formula, non-autoclavable diet manufactured with high quality ingredients and designed to support gestation, lactation, and growth of rodents. |
| Fast-food diet (AIN76A Western Diet) | Test Diet | 1810060 | https://www.testdiet.com/cs/groups/lolweb/@testdiet/documents/web_content/mdrf/mdux/~edisp/ducm04_051601.pdf |
| Hematoxylin and Eosin Stain Kit | vectorlabs | H-3502 | https://vectorlabs.com/hematoxylin-and-eosin-stain-kit.html |
| Kent Scientific Rat Surgical Kit | fisher scientific | 13-005-205 | https://www.fishersci.com/shop/products/rat-surgical-kit/13005205#?keyword=mouse%20surgery%20kit |
| KETAMINE HYDROCHLORIDE INJECTION | Vedco | NDC 50989-996-06 - 10 mL - vial. | KetaVed has been clinically studied in subhuman primates in addition to those species listed under Administration and Dosage. |
| Leica SP5 upright Confocal, multi-photon | Leica | SP5 | |
| Luer connector (Three-way stopcock with SPIN-LOCK®) | bbraun | D300 | https://www.bbraunusa.com/en/products/b0/three-way-stopcockwithspin-lock.html |
| Picrosirius Red Stain Kit | Polysciences, Inc. | 24901 | https://www.polysciences.com/default/picrosirius-red-stain-kit-40771 |
| Rayon tipped applicator | puritan | 25-806 1PR | |
| Sodium deoxycholate | sigmaaldrich | D6750-100G | |
| Syrup | www.target.com | 24 fl oz | https://www.target.com/p/pancake-syrup-24-fl-oz-market-pantry-8482/-/A-13007801 |
| Variable Speed Peristaltic Pump | INTLLAB | BT100 | https://www.amazon.com/gp/product/B082K97W5W/ref=ox_sc_saved_title_2?smid=A12NUUP87ZRRAR&psc=1 |
| VECTASHIELD Antifade Mounting Medium | vectorlabs | H-1000-10 | https://vectorlabs.com/vectashield-mounting-medium.html |
References
- Friedman, S. L., Pinzani, M. Hepatic fibrosis: 2022 unmet needs and a blueprint for the future. Hepatology. 75 (2), 473-488 (2021).
- Ye, Q., et al. Global prevalence, incidence, and outcomes of non-obese or lean non-alcoholic fatty liver disease: A systematic review and meta-analysis. The Lancet Gastroenterology and Hepatology. 5 (8), 739-752 (2020).
- Schwabe, R. F., Tabas, I., Pajvani, U. B. Mechanisms of fibrosis development in non-alcoholic steatohepatitis. Gastroenterology. 158 (7), 1913-1928 (2020).
- Arteel, G. E., Naba, A. The liver matrisome - looking beyond collagens. JHEP Reports. 2 (4), 100115 (2020).
- Jiang, J. X., et al. Nonphagocytic activation of NOX2 is implicated in progressive non-alcoholic steatohepatitis during aging. Hepatology. 72 (4), 1204-1218 (2020).
- Dehnad, A., et al. AGER1 downregulation associates with fibrosis in non-alcoholic steatohepatitis and type 2 diabetes. Journal of Clinical Investigation. 130 (8), 4320-4330 (2020).
- Mayorca-Guiliani, A. E., et al. Decellularization and antibody staining of mouse tissues to map native extracellular matrix structures in 3D. Nature Protocols. 14 (12), 3395-3425 (2019).
- Mazza, G., et al. Cirrhotic human liver extracellular matrix 3D scaffolds promote smad-dependent tgf-beta1 epithelial mesenchymal transition. Cells. 9 (1), 83 (2019).
- Klaas, M., et al. The alterations in the extracellular matrix composition guide the repair of damaged liver tissue. Scientific Reports. 6, 27398 (2016).
- Mattei, G., et al. Mechanostructure and composition of highly reproducible decellularized liver matrices. Acta Biomaterialia. 10 (2), 875-882 (2014).
- Ren, H., et al. Evaluation of two decellularization methods in the development of a whole-organ decellularized rat liver scaffold. Liver International. 33 (3), 448-458 (2013).
- Piersma, B., Hayward, M. K., Weaver, V. M. Fibrosis and cancer: A strained relationship. Biochimica et Biophysica Acta - Reviews on Cancer. 1873 (2), 188356 (2020).
- Cox, T. R.
- Mirdamadi, E. S., Kalhori, D., Zakeri, N., Azarpira, N., Solati-Hashjin, M. Liver tissue engineering as an emerging alternative for liver disease treatment. Tissue Engineering Part B: Reviews. 26 (2), 145-163 (2020).
- Mazza, G., et al. Decellularized human liver as a natural 3D-scaffold for liver bioengineering and transplantation. Scientific Reports. 5, 13079 (2015).
- Jia, Z., et al. 3D culture system for liver tissue mimicking hepatic plates for improvement of human hepatocyte (C3A) function and polarity. BioMed Research International. 2020, 6354183 (2020).
- Shimoda, H., et al. Decellularized liver scaffolds promote liver regeneration after partial hepatectomy. Scientific Reports. 9 (1), 12543 (2019).
