Summary
Het huidige protocol optimaliseert de lever in situ perfusie / decellularisatie en twee-foton microscopie methoden om een betrouwbaar platform te creëren om de dynamiek van extracellulaire matrix (ECM) remodellering tijdens niet-alcoholische steatohepatitis (NASH) te visualiseren.
Abstract
Niet-alcoholische steatohepatitis (NASH) is de meest voorkomende chronische leverziekte in de Verenigde Staten, die meer dan 70 miljoen Amerikanen treft. NASH kan zich ontwikkelen tot fibrose en uiteindelijk tot cirrose, een belangrijke risicofactor voor hepatocellulair carcinoom. De extracellulaire matrix (ECM) biedt structurele ondersteuning en handhaaft de leverhomeostase via matricellulaire signalen. Leverfibrose is het gevolg van een onbalans in het dynamische ECM-remodelleringsproces en wordt gekenmerkt door overmatige accumulatie van structurele elementen en bijbehorende veranderingen in glycosaminoglycanen. Het typische fibrosepatroon van NASH wordt "kippengaas" genoemd, dat meestal bestaat uit zone 3 perisinusoïdale / pericellulaire fibrose, gebaseerd op kenmerken waargenomen door Masson's trichrome vlek en Picrosirius Red-vlekken. Deze traditionele dunne tweedimensionale (2D) op weefseldia's gebaseerde beeldvormingstechnieken kunnen echter niet de gedetailleerde driedimensionale (3D) ECM-structurele veranderingen aantonen, waardoor het begrip van de dynamische ECM-remodellering bij leverfibrose wordt beperkt.
Het huidige werk optimaliseerde een snel en efficiënt protocol om de oorspronkelijke ECM-structuur in de lever via decellularisatie in beeld te brengen om de bovenstaande uitdagingen aan te pakken. Muizen werden gedurende 14 weken gevoed met chow of fastfooddieet. Decellularisatie werd uitgevoerd na in situ portale aderperfusie en de twee-foton microscopietechnieken werden toegepast om veranderingen in de inheemse ECM in beeld te brengen en te analyseren. De 3D-beelden van de normale en NASH-levers werden gereconstitueerd en geanalyseerd. Het uitvoeren van in situ perfusiedecellularisatie en het analyseren van de steiger door twee-fotonenmicroscopie bood een praktisch en betrouwbaar platform om de dynamische ECM-remodellering in de lever te visualiseren.
Introduction
Niet-alcoholische leververvetting (NAFLD) is de meest voorkomende leverziekte, die 20% -25% van de volwassen bevolking treft. 25% van de NAFLD-patiënten evolueert naar niet-alcoholische steatohepatitis (NASH), waarbij het risico op cirrose, leverfalen en hepatocellulair carcinoom toeneemt1. In de komende 20 jaar wordt geschat dat NASH verantwoordelijk zal zijn voor 2 miljoen levergerelateerde sterfgevallen in de VS2. Omdat er geen goedgekeurde behandelingen zijn, is er een dringende noodzaak om de mechanismen te ontcijferen die leverfibrose veroorzaken bij NASH-patiënten en een gerichte behandeling te ontwikkelen3.
De extracellulaire matrix (ECM) is een dynamische, complexe micro-omgeving die bidirectionele communicatie met cellen uitoefent om weefselhomeostase te reguleren4. De lever-ECM is samengesteld uit structurele elementen zoals proteoglycanen, collageen, fibronectine, elastine en andere niet-structurele eiwitten (bijv. Olfactomedine en trombospondine) om fysieke en structurele ondersteuning te bieden4.
Leverfibrose is een chronische wondgenezingsreactie op leverschade van verschillende etiologieën, waaronder NASH3. Het is het gevolg van een onbalans in het dynamische ECM-matrixremodelleringsproces en wordt gekenmerkt door overmatige structurele eiwitten in de gewonde lever4. Fibrogenese is afhankelijk van de dynamische cel-cel communicatie tussen verschillende leverceltypen. Hepatische stellaatcellen (HSC's), wanneer geactiveerd, differentiëren in Smooth Muscle Alpha 2 Actine-expresserende, migrerende en prolifererende myofibroblastachtige cellen en synthetiseren ECM-eiwitten als een wondsluitende actie. Geactiveerde HSC's zijn de centrale collageenproducerende cellen in de lever1.
Het moleculaire mechanisme van ECM-remodellering, patronen van fibrose en hun relatie met cellulaire gebeurtenissen zijn niet duidelijk. Een beter begrip van de driedimensionale (3D) ECM-structuur is nog steeds nodig, hoewel massaspectrometrietechnieken hebben geholpen bij het analyseren van de ECM-eiwitsamenstelling4. Traditioneel zijn Masson's trichrome vlek, Picro Sirius Red vlekken en tweede harmonische generatie (SHG) beeldvorming uitgevoerd op tweedimensionale (2D) dunne leversecties. Het typische fibrosepatroon van NASH wordt "kippengaas" genoemd, dat zich uitstrekt tot zone 3 en perisinusoïdale / pericellulaire fibrose 5,6 is. Er is echter een gebrek aan studies die zich richten op de 3D-structuur van de inheemse lever, met name die waarbij geen weefselsectie plaatsvindt. Robuuste beeldvormingsbenaderingen om patronen en kenmerken van fibrose te identificeren tijdens dynamische ECM-remodellering bij leverfibrose zouden het begrip van NASH-mechanismen aanzienlijk versterken en nieuwe therapeutische doelen identificeren.
Om deze uitdagingen aan te gaan, werd een snel en efficiënt protocol geoptimaliseerd om de inheemse lever-ECM in beeld te brengen via decellularisatie7. Decellularisatie van de hele lever is een benadering om de hepatische cellulaire inhoud te verwijderen met behoud van het oorspronkelijke 3D ECM-netwerk door middel van wasmiddelperfusie. Muizen kregen gedurende 14 weken chow of fastfooddieet (FFD). Decellularisatie werd uitgevoerd na in situ poortaderperfusie met mild reinigingsmiddel en lage stroomsnelheden om triple-spiraalvormige en inheemse fibrillaire collageenstructuren te behouden. Twee-fotonenmicroscopie werd toegepast om veranderingen in collageenstructuren in ECM te analyseren. De 3D-beelden van de oorspronkelijke ECM-structuur in normale en NASH-levers werden gereconstitueerd en geanalyseerd. Het uitvoeren van in situ perfusie decellularisatie en het analyseren van de steiger door twee-foton microscopie biedt een praktisch en betaalbaar platform om de dynamische ECM-remodellering in de lever te visualiseren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Dierproeven worden uitgevoerd volgens de experimentele procedures die zijn goedgekeurd door de institutionele dierverzorgings- en gebruikscommissies (IACUCs) van Stanford University en het Veterans Affairs Hospital in Palo Alto. 6-8 weken oude mannelijke C57BL / 6J-muizen kregen chow of een fastfooddieet aangevuld met 4,2% fructose-glucosestroop (zie tabel met materialen) in drinkwater gedurende 14 weken5. De muizen werden in standaard kooien gehouden bij een 12 uur donker/licht cyclus.
1. Chirurgische voorbereiding en procedures van leverperfusie
- Weeg de muis vóór de procedure.
- Verdoof de muis door ketamine (90 mg/kg) en Xylazine (10 mg/kg) (zie tabel met materialen) toe te dienen via een intraperitoneale injectie. Zorg ervoor dat de muis volledig wordt verdoofd door teen te knijpen voordat u doorgaat naar de volgende stap.
OPMERKING: Isofluraan is hier niet nodig, omdat dit een niet-overlevingsoperatie is. - Scheer het ventrale gebied met een tondeuse en desinfecteer de huid met 70% ethanol. Plaats de muis op zijn rug en immobiliseer de benen op de operatieplaat met tape.
- Na het opnieuw bevestigen van de diepte van de anesthesie door een teenknijper, gebruikt u een Mayo-schaar en een Adson-tang (zie tabel met materialen) om een incisie van 3 cm lateraal in de onderbuik te maken en vervolgens een incisie van 5 cm verticaal van de lage buik naar het xiphoid-proces. Pas op dat u de borstholte niet opent.
- Na het openen van het peritoneum, plaatst u de darmen voorzichtig naar links van het dier en verhoogt u de rechterkwab van de lever met een rayon-applicator (zie materiaaltabel) om de poortader bloot te leggen.
- Catheteriseer de poortader met behulp van een 24 G IV-katheter. Breng de katheter in het distale uiteinde van de poortader. Plaats de katheterpunt voordat de poortader zich vertakt in de leverkwabben.
- Trek de naald onmiddellijk terug wanneer de katheter in de ader komt. Controleer of de katheter correct in de ader is geplaatst door de lever te perfuseren met PBS met behulp van een spuit van 1 ml via de katheter.
OPMERKING: Bij PBS-perfusie moeten alle lobben onmiddellijk blancheren. Als de katheter correct is geplaatst, zal veneus bloed snel door de katheter stromen. - Gebruik Dumont microtang, een Castroviejo micronaaldhouder en 4-0 hechtdraad (zie Materiaaltabel) om een steek onder de vertakking van de poortader te plaatsen en een tweede steek 1 cm onder om de katheter vast te zetten.
2. Weefseldecellularisatie
- Sluit de katheter aan op een siliconen slang (~ 1 m lengte, 3 mm binnendiameter en 4,1 mm buitendiameter) met een Luer-connector. Sluit de siliconenslang aan op een peristaltische pomp en een reservoir met gedeïoniseerd water (zie materiaaltabel).
- Verwijder voorzichtig de luchtbellen in de buis en vermijd het genereren van nieuwe bellen tijdens de perfusie. Stel de peristaltische pomp in op een debiet van 0,2 ml/min (d.w.z. 288 ml/24 uur).
- Breng eerst onder met gedeïoniseerd water (~50 ml/muis) gedurende 2 uur. De kleur van de lever zal veranderen van rood naar geel tijdens perfusie.
OPMERKING: Het dier vervalt na 10 minuten perfusie. - Schakel de perfusieoplossing over naar 0,5% (wt/vol) natriumdeoxycholaat (DOC, zie materiaaltabel) en ga 's nachts verder (18 uur, ~250 ml/muis). De lever wordt wit aan het einde van de perfusie (figuur 1).
- Schakel de perfusieoplossing over op gedeïoniseerd water (~ 50 ml / muis) en laat gedurende 2 uur doordrenken.
- Gebruik Dumont microtang en microveerschaar (zie Materiaaltabel) om de gedecellulariseerde lever op te vangen en voorzichtig te wassen in een petrischaaltje met PBS.
- Snijd het gedecellulariseerde weefsel in kleine stukjes voor onmiddellijke beeldvorming of bevries bij -80 °C voor verdere biochemische analyse zoals tandem massaspectrometrie, ELISA of western blot.
3. Diavoorbereiding voor beeldvorming (met een multifoton/confocale fluorescentiemicroscoop)
- Breng een klein stukje gedecellulariseerde lever (<3 x 3 x 3 mm) over op een microscoopglaasje en plaats het weefsel in het midden.
- Voeg 10 μL antifade montagemedium (zie tabel met materialen) toe aan het weefsel met een pipet om uitdroging van het weefsel te voorkomen.
- Bedek de tissue met een dekglas en oefen een kleine kracht uit om het monster plat te maken. Sluit de randen van het afdekglas af met kleurloze en transparante nagellak (figuur 2).
OPMERKING: Vanwege de instelling van het rechtopstaande twee-foton door de microscoop, werd een dekglas op het monster gebruikt. Monsters kunnen echter anders worden geplaatst als een omgekeerde microscoop wordt gebruikt.
4. Beeldacquisitie
- Plaats een druppel dompelolie op de bovenkant van het afdekglas en plaats de dia op de microscoopglaashouder. Laat de 20x olieobjectieflens zakken totdat deze in contact komt met de dompelolie.
- Schakel over naar het violette kanaal (405 nm), schakel de sluiter in en stel scherp op het monster. Navigeer en positioneer het interessegebied voor beeldvorming. Schakel de sluiter uit voordat u naar beeldacquisitie gaat met behulp van laserlicht.
- Schakel over naar de computerbesturing en start de twee-fotonenlaser. Schakel eerst de laser met twee fotonen in (figuur 3A) en schakel vervolgens de lasercontroller met twee fotonen (zie materiaaltabel) en de sluiter (figuur 3B, C) in. Zorg ervoor dat het uitgangsvermogen hoger is dan 2,5 W.
Verminder het laservermogen om fluorescentie-blussen te voorkomen. Selecteer en pas detectoren (zowel fotomultipliers als de hybride) aan de gekozen fluoroforen aan.
OPMERKING: Beeldvorming van twee fotonen werd uitgevoerd bij een excitatiegolflengte van 860 nm. Twee kanalen werden geselecteerd voor respectievelijk collageen SHG en twee-foton geëxciteerde fluorescentie (TPEF) beelden. Eén kanaal dat overeenkomt met het golflengtebereik van 415-445 nm detecteerde de gedetailleerde structuur van collageen uit SHG-signalen. Een ander kanaal bestreek het bereik van 465-669 nm om TPEF-signalen te verzamelen. - Kies gelijktijdige of opeenvolgende beeldacquisities. Stel het gaatje in op de hoogste waarde. Pas lasergolflengten, versterking, vermogen en offset aan. Pas de verblijftijd van de pixel, de pixelgrootte, de gemiddelde en de zoom aan (figuur 4A).
- Blader door de z-controller van de computer en stel de z-dimensies in, definieer het begin- en eindpunt en kies het aantal afbeeldingen binnen een volume (z-stack). Verkrijg afbeeldingen.
OPMERKING: Hier is gekozen voor een volume van 20 μm Z en een Z-stapgrootte van 1 μm (figuur 4B).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De collageenvezels werden gedetecteerd met tweede harmonische generatie en twee-fotonenmicroscopie. Het signaal is afkomstig van de frangible triple-helical en native fibrillaire collageenstructuren. Specifieke antilichamen werden niet gebruikt om collageensubtypen te analyseren; Dit zou echter kunnen worden toegevoegd aan de beeldvormingstechniek.
Wanneer het leverweefsel wordt bestudeerd zonder decellularisatie, is het een uitdaging om beelden met hoge resolutie van het collageennetwerk te krijgen (figuur 5A). In gedecellulariseerde ECM lijken collageenvezels (groen) parallel of verweven (figuur 5B). Er waren duidelijke verschillen in de morfologie en ruimtelijke verdeling van de ECM-componenten tussen Chow- en FFD-levers. Collageenvezels bij muizen op een chow-dieet vertoonden een verweven en goed georganiseerd netwerk. Bij muizen op FFD werden echter collageenbundels waargenomen met minder connectiviteit (figuur 5B).
Om de 3D-structuur van lever-ECM verder te bestuderen, werden beelden van de plakjes vastgelegd met een Z-volume van 20 μm (dikte) en 1 μm Z-stapgrootte. Collageenvezels bij muizen op chow-dieet vertoonden een goed georganiseerd netwerk, maar niet bij de muizen op FFD (figuur 6). Om de kwaliteit van het fibrillaire collageen in de gedecellulariseerde ECU te bevestigen, werden de dia's gefixeerd en ingebed in paraffine en gekleurd met Hematoxyline en eosine (H &E) en Picrosirius rood (PSR) (zie tabel met materialen). H&E laat zien dat alle cellen zijn verwijderd. De PSR is een veelgebruikte histologische techniek om collageen in paraffine-ingebedde weefselsecties te markeren (figuur 7).
Figuur 1: Muizenlever tijdens perfusie. De lever wordt wit en semi-transparant aan het einde van de perfusie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Diavoorbereiding voor beeldvorming. Het weefsel is bedekt met een dekglas en er wordt een kleine kracht uitgeoefend om het monster plat te maken. De randen van het afdekglas zijn afgedicht met kleurloze en transparante nagellak. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Screenshot van de twee-foton lasersoftware, het starten van de twee-foton laser. (A) Eerst wordt de twee-fotonenlaser ingeschakeld. b) (C) De lasercontroller met twee fotonen en de sluiter zijn ingeschakeld. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Screenshot van de twee-foton lasersoftware tijdens beeldacquisitie. (A) Zorg ervoor dat u het gaatje instelt op de hoogste waarde (rode pijlen). Pas lasergolflengten, versterking, vermogen en offset aan. Pas de verblijftijd van de pixel, de pixelgrootte, de gemiddelde en de zoom aan. (B) Stel het Z-volume in op 20 μm en de Z-stapgrootte op 1 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5: Gedecellulariseerde ECM afgebeeld met twee-fotonenmicroscopie . (A) SHG-beelden van collageenvezels uit een leverschijf van 6 μm (vers bevroren) zonder decellularisatie. (B) SHG-afbeeldingen tonen een goed georganiseerd collageennetwerk in levers van muizen op normaal controle, chow-dieet. Geremodelleerd collageennetwerk bij muizen op een fastfooddieet (FFD). Pijl, fibrose gebied. Ster, geremodelleerd collageennetwerk. Schaalbalk = 100 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 6: 3D-structuur van het levercollageennetwerk. De collageenvezels in muizen op het chow-dieet vertoonden een goed georganiseerd netwerk, maar niet in fastfooddieetmuizen (FFD). De beelden zijn gemaakt met een Z-volume van 20 μm (dikte) en een Z-stapgrootte van 1 μm. Schaalbalk = 100 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 7: Hematoxyline en eosine kleuring (H&E) en Picrosirius rood (PSR) kleuring van de gedecellulariseerde ECM. H&E laat zien dat alle cellen zijn verwijderd. In de PSR-kleuringsafbeeldingen onthulde de ECU van de chow-gevoede muizen een goed georganiseerd netwerk, en daarentegen vertoonden muizen op een fastfooddieet (FFD) dichtere collageenvezels. Z-volume (dikte) = 6 μm. Schaalbalk = 100 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Het huidige protocol toont aan dat decellularisatie door middel van een lage stroomsnelheid DOC in situ perfusie de frangible triple-helical en native fibrillaire collageenstructuren behoudt, waardoor een betrouwbaar en kosteneffectief platform wordt geboden om dynamische ECM-remodellering in NASH-leverfibrose vast te leggen. Hoewel decellularisatie werd uitgevoerd in normale en fibrotische levers voordat ECM-componenten werden geïdentificeerd of biologische scaffolds voor celkweek werden gegenereerd, is de dynamiek van ECM-remodellering bij leverfibrose niet goed bestudeerd 8,9,10. Met deze methode kunnen onderzoekers vergelijkingen maken tussen verschillende fibrosemodellen.
Momenteel zijn er verschillende perfusieprotocollen met behulp van DNase, natriumdodecylsulfaat (SDS) of Triton X-10011. De kosten van DNase zijn hoog omdat er grote hoeveelheden oplossingen nodig zijn. SDS is een agressieve denatureringsoplossing, een anionisch reinigingsmiddel dat de celmembranen verstoort en eiwitten denatureert. Daarom is het behoud van het hele collageennetwerk na SDS-perfusie een uitdaging. Triton X-100 daarentegen, als een mild niet-denaturerend, niet-ionisch wasmiddel, verstoort lipide-lipide- en lipide-eiwitinteracties en behoudt eiwit-eiwitinteracties. Er is echter gemeld dat Triton X-100 de ECM-steigers verstoort, waardoor de gedecellulariseerde lever-ECM ongeschikt is voor verdere massaspectrometrie-analyse11.
Het perfusieprotocol met DOC werd gewijzigd ten opzichte van het vorige werk7, wat een beter behoud van de triple-spiraalvormige en inheemse fibrillaire collageenstructuren in de meeste weefsels aantoont. Het collageennetwerk werd bestudeerd met tweede harmonische generatie (SHG) microscopie zonder antilichamen, die de triple-spiraalvormige en inheemse fibrillaire collageenstructuren weerspiegelen. De gedecellulariseerde lever-ECM van FFD-muizen werd ook getest en structurele veranderingen in NASH werden bevestigd.
De meest kritische stappen in het protocol zijn het plaatsen van de katheter en het instellen van het perfusiesysteem. De poortaderkatheterisatie is van vitaal belang, maar de inferieure vena cava kan ook worden gebruikt als de poortader beschadigd is. Bubbels in de buffer en buizen moeten worden vermeden omdat ze de perfusie beïnvloeden. Omdat een rechtopstaande twee-fotonenmicroscoop werd gebruikt, was de steekproefgrootte beperkt. Dit kan worden gewijzigd als een omgekeerde microscoop moet worden gebruikt.
Er is een toenemende belangstelling voor de geremodelleerde ECM bij chronische leverziekten en hepatocarcinogenese12,13,14. Gedecellulariseerde ECM-steigers zijn gebruikt in chirurgische reparatie en regeneratieve geneeskunde als een geschikt biologisch steigermateriaal15,16,17. Dit milde decellularisatieproces heeft echter ook beperkingen, omdat sommige cellulaire componenten zoals DNA of lipideresten mogelijk niet volledig worden verwijderd. Langere DOC-perfusietijd en een toename van de stroomsnelheid kunnen helpen om ultragezuiverde gedecellulariseerde steigers te krijgen. Het toevoegen van DNase aan de wasoplossing na de DOC-perfusie kan ook helpen bij het verwijderen van DNA. Het protocol kan worden aangepast voor menselijke leverbiopten, waardoor het begrip van ECM-veranderingen tijdens NASH-progressie wordt verbeterd.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren dat er geen belangenconflicten zijn met betrekking tot dit artikel.
Acknowledgments
We bedanken Hyesuk Park voor de technische hulp. Dit onderzoek werd ondersteund door financiering van het National Institute of Diabetes and Digestive and Kidney Diseases (NIDDK), NIH (R01 2DK083283, naar NJT), het National Institute on Aging (NIA), NIH (1R01AG060726, naar NJT). We zijn dankbaar voor Jon Mulholland en Kitty Lee van de Cell Sciences Imaging Facility in het Beckman Center voor technische assistentie bij de beeldvorming met twee fotonenmicroscopie.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4-0 MONOCRYL UNDYED 1 x 18" P-3 | MONOCRYL | Y494G | |
| 4-0 suture | fisher scientific | 10-000-649 | https://www.fishersci.com/shop/products/monomid-nylon-non-absorbable-sutures-7/10000649?keyword=true |
| AnaSed Injection (xylazine) | AnaSed | NDC 59399-110-20 | this drug to use by or on the order of a licensed veterinarian. |
| BD INSYTE AUTOGUARD I.V. CATHETER WITH BC TECHNOLOGY | BD | 382612 | |
| Chow diet | Envigo | # 2918 | Control diet. A fixed formula, non-autoclavable diet manufactured with high quality ingredients and designed to support gestation, lactation, and growth of rodents. |
| Fast-food diet (AIN76A Western Diet) | Test Diet | 1810060 | https://www.testdiet.com/cs/groups/lolweb/@testdiet/documents/web_content/mdrf/mdux/~edisp/ducm04_051601.pdf |
| Hematoxylin and Eosin Stain Kit | vectorlabs | H-3502 | https://vectorlabs.com/hematoxylin-and-eosin-stain-kit.html |
| Kent Scientific Rat Surgical Kit | fisher scientific | 13-005-205 | https://www.fishersci.com/shop/products/rat-surgical-kit/13005205#?keyword=mouse%20surgery%20kit |
| KETAMINE HYDROCHLORIDE INJECTION | Vedco | NDC 50989-996-06 - 10 mL - vial. | KetaVed has been clinically studied in subhuman primates in addition to those species listed under Administration and Dosage. |
| Leica SP5 upright Confocal, multi-photon | Leica | SP5 | |
| Luer connector (Three-way stopcock with SPIN-LOCK®) | bbraun | D300 | https://www.bbraunusa.com/en/products/b0/three-way-stopcockwithspin-lock.html |
| Picrosirius Red Stain Kit | Polysciences, Inc. | 24901 | https://www.polysciences.com/default/picrosirius-red-stain-kit-40771 |
| Rayon tipped applicator | puritan | 25-806 1PR | |
| Sodium deoxycholate | sigmaaldrich | D6750-100G | |
| Syrup | www.target.com | 24 fl oz | https://www.target.com/p/pancake-syrup-24-fl-oz-market-pantry-8482/-/A-13007801 |
| Variable Speed Peristaltic Pump | INTLLAB | BT100 | https://www.amazon.com/gp/product/B082K97W5W/ref=ox_sc_saved_title_2?smid=A12NUUP87ZRRAR&psc=1 |
| VECTASHIELD Antifade Mounting Medium | vectorlabs | H-1000-10 | https://vectorlabs.com/vectashield-mounting-medium.html |
References
- Friedman, S. L., Pinzani, M. Hepatic fibrosis: 2022 unmet needs and a blueprint for the future. Hepatology. 75 (2), 473-488 (2021).
- Ye, Q., et al. Global prevalence, incidence, and outcomes of non-obese or lean non-alcoholic fatty liver disease: A systematic review and meta-analysis. The Lancet Gastroenterology and Hepatology. 5 (8), 739-752 (2020).
- Schwabe, R. F., Tabas, I., Pajvani, U. B. Mechanisms of fibrosis development in non-alcoholic steatohepatitis. Gastroenterology. 158 (7), 1913-1928 (2020).
- Arteel, G. E., Naba, A. The liver matrisome - looking beyond collagens. JHEP Reports. 2 (4), 100115 (2020).
- Jiang, J. X., et al. Nonphagocytic activation of NOX2 is implicated in progressive non-alcoholic steatohepatitis during aging. Hepatology. 72 (4), 1204-1218 (2020).
- Dehnad, A., et al. AGER1 downregulation associates with fibrosis in non-alcoholic steatohepatitis and type 2 diabetes. Journal of Clinical Investigation. 130 (8), 4320-4330 (2020).
- Mayorca-Guiliani, A. E., et al. Decellularization and antibody staining of mouse tissues to map native extracellular matrix structures in 3D. Nature Protocols. 14 (12), 3395-3425 (2019).
- Mazza, G., et al. Cirrhotic human liver extracellular matrix 3D scaffolds promote smad-dependent tgf-beta1 epithelial mesenchymal transition. Cells. 9 (1), 83 (2019).
- Klaas, M., et al. The alterations in the extracellular matrix composition guide the repair of damaged liver tissue. Scientific Reports. 6, 27398 (2016).
- Mattei, G., et al. Mechanostructure and composition of highly reproducible decellularized liver matrices. Acta Biomaterialia. 10 (2), 875-882 (2014).
- Ren, H., et al. Evaluation of two decellularization methods in the development of a whole-organ decellularized rat liver scaffold. Liver International. 33 (3), 448-458 (2013).
- Piersma, B., Hayward, M. K., Weaver, V. M. Fibrosis and cancer: A strained relationship. Biochimica et Biophysica Acta - Reviews on Cancer. 1873 (2), 188356 (2020).
- Cox, T. R.
- Mirdamadi, E. S., Kalhori, D., Zakeri, N., Azarpira, N., Solati-Hashjin, M. Liver tissue engineering as an emerging alternative for liver disease treatment. Tissue Engineering Part B: Reviews. 26 (2), 145-163 (2020).
- Mazza, G., et al. Decellularized human liver as a natural 3D-scaffold for liver bioengineering and transplantation. Scientific Reports. 5, 13079 (2015).
- Jia, Z., et al. 3D culture system for liver tissue mimicking hepatic plates for improvement of human hepatocyte (C3A) function and polarity. BioMed Research International. 2020, 6354183 (2020).
- Shimoda, H., et al. Decellularized liver scaffolds promote liver regeneration after partial hepatectomy. Scientific Reports. 9 (1), 12543 (2019).
