Summary
Das vorliegende Protokoll optimiert die Methoden der Leber-in-situ-Perfusion/Dezellularisierung und der Zwei-Photonen-Mikroskopie, um eine zuverlässige Plattform zur Visualisierung der Dynamik des Remodells der extrazellulären Matrix (EZM) während der nicht-alkoholischen Steatohepatitis (NASH) zu schaffen.
Abstract
Die nichtalkoholische Steatohepatitis (NASH) ist die häufigste chronische Lebererkrankung in den Vereinigten Staaten und betrifft mehr als 70 Millionen Amerikaner. NASH kann zu einer Fibrose und schließlich zu einer Zirrhose fortschreiten, einem signifikanten Risikofaktor für ein hepatozelluläres Karzinom. Die extrazelluläre Matrix (EZM) bietet strukturelle Unterstützung und hält die Leberhomöostase über matrizelluläre Signale aufrecht. Die Leberfibrose resultiert aus einem Ungleichgewicht im dynamischen EZM-Umbauprozess und ist gekennzeichnet durch eine übermäßige Akkumulation von Strukturelementen und damit verbundene Veränderungen der Glykosaminoglykane. Das typische Fibrosemuster von NASH wird als "Maschendraht" bezeichnet, der in der Regel aus perisinusoidaler/perizellulärer Fibrose der Zone 3 besteht, basierend auf Merkmalen, die durch die Trichromfärbung von Masson und die Färbung von Picrosirius Red beobachtet wurden. Diese traditionellen dünnen zweidimensionalen (2D) Gewebeobjektträger-basierten Bildgebungsverfahren können jedoch die detaillierten dreidimensionalen (3D) EZM-Strukturveränderungen nicht darstellen, was das Verständnis des dynamischen EZM-Umbaus bei Leberfibrose einschränkt.
In der aktuellen Arbeit wurde ein schnelles und effizientes Protokoll zur Abbildung der nativen EZM-Struktur in der Leber mittels Dezellularisierung optimiert, um die oben genannten Herausforderungen zu bewältigen. Die Mäuse wurden 14 Wochen lang entweder mit Chow- oder Fast-Food-Diät gefüttert. Die Dezellularisierung wurde nach in situ Pfortaderperfusion durchgeführt, und die Zwei-Photonen-Mikroskopietechniken wurden angewendet, um Veränderungen in der nativen EZM abzubilden und zu analysieren. Die 3D-Bilder der Normal- und NASH-Leber wurden rekonstituiert und analysiert. Die Durchführung einer in situ Perfusionsdezellularisierung und die Analyse des Gerüsts mittels Zwei-Photonen-Mikroskopie boten eine praktische und zuverlässige Plattform zur Visualisierung des dynamischen EZM-Umbaus in der Leber.
Introduction
Die nichtalkoholische Fettlebererkrankung (NAFLD) ist die häufigste Lebererkrankung und betrifft 20%-25% der erwachsenen Bevölkerung. 25 % der NAFLD-Patienten entwickeln eine nicht-alkoholische Steatohepatitis (NASH), bei der das Risiko für Zirrhose, Leberversagen und hepatozelluläres Karzinom steigt1. Es wird geschätzt, dass NASH in den nächsten 20 Jahren für 2 Millionen leberbedingte Todesfälle in den USAverantwortlich sein wird. Da es keine zugelassenen Behandlungen gibt, ist es dringend notwendig, die Mechanismen zu entschlüsseln, die eine Leberfibrose bei NASH-Patienten verursachen, und eine gezielte Behandlung zu entwickeln3.
Die extrazelluläre Matrix (EZM) ist eine dynamische, komplexe Mikroumgebung, die eine bidirektionale Kommunikation mit Zellen ausübt, um die Gewebehomöostasezu regulieren 4. Die Leber-EZM besteht aus Strukturelementen wie Proteoglykanen, Kollagenen, Fibronektin, Elastin und anderen Nichtstrukturproteinen (z. B. Olfactomedin und Thrombospondin), um die physikalische und strukturelle Unterstützung zu gewährleisten4.
Leberfibrose ist eine chronische wundheilende Reaktion auf Leberschäden verschiedener Ätiologien, einschließlich NASH3. Sie resultiert aus einem Ungleichgewicht im dynamischen Remodellierungsprozess der EZM-Matrix und ist durch einen Überschuss an Strukturproteinen in der geschädigten Leber gekennzeichnet4. Die Fibrogenese hängt von der dynamischen Zell-Zell-Kommunikation zwischen verschiedenen hepatischen Zelltypen ab. Hepatische Sternzellen (HSCs) differenzieren sich, wenn sie aktiviert werden, in Smooth Muscle Alpha 2 Actin-exprimierende, migrierende und proliferierende Myofibroblasten-ähnliche Zellen und synthetisieren EZM-Proteine als wundschließende Wirkung. Aktivierte HSZ sind die zentralen kollagenproduzierenden Zellen in der Leber1.
Der molekulare Mechanismus des EZM-Umbaus, die Muster der Fibrose und ihre Beziehung zu zellulären Ereignissen sind nicht klar. Ein besseres Verständnis der dreidimensionalen (3D) EZM-Struktur ist noch erforderlich, auch wenn Massenspektrometrietechniken zur Analyse der Zusammensetzung der ECM-Proteine beigetragen haben4. Traditionell wurden die Trichromfärbung nach Masson, die Picro Sirius Red-Färbung und die Bildgebung der zweiten harmonischen Generation (SHG) an zweidimensionalen (2D) dünnen Leberschnitten durchgeführt. Das typische Fibrosemuster von NASH wird als "Maschendraht" bezeichnet, der sich bis Zone 3 erstreckt und eine perisinusoidale/perizelluläre Fibrose 5,6 ist. Es fehlt jedoch an Studien, die sich auf die 3D-Struktur der nativen Leber konzentrieren, insbesondere an solchen, die keine Gewebeschnitte beinhalten. Robuste bildgebende Verfahren zur Identifizierung von Mustern und Merkmalen der Fibrose während des dynamischen EZM-Remodellings bei Leberfibrose würden das Verständnis der NASH-Mechanismen erheblich verbessern und neue therapeutische Ziele identifizieren.
Um diesen Herausforderungen zu begegnen, wurde ein schnelles und effizientes Protokoll optimiert, um die native Leber-EZM mittels Dezellularisierung abzubilden7. Die Dezellularisierung der gesamten Leber ist ein Ansatz, um den zellulären Inhalt der Leber zu entfernen und gleichzeitig das native 3D-EZM-Netzwerk durch Detergenzienperfusion aufrechtzuerhalten. Die Mäuse wurden 14 Wochen lang entweder mit Chow oder Fast-Food-Diät (FFD) gefüttert. Die Dezellularisierung wurde nach in situ Pfortaderperfusion mit milder Detergenzienz und niedrigen Flussraten durchgeführt, um triple-helikale und native fibrilläre Kollagenstrukturen zu erhalten. Die Zwei-Photonen-Mikroskopie wurde eingesetzt, um Veränderungen der Kollagenstrukturen in der EZM zu analysieren. Die 3D-Bilder der nativen EZM-Struktur in normaler und NASH-Leber wurden rekonstituiert und analysiert. Die Durchführung einer in situ Perfusionsdezellularisierung und die Analyse des Gerüsts mittels Zwei-Photonen-Mikroskopie bietet eine praktische und kostengünstige Plattform zur Visualisierung des dynamischen EZM-Umbaus in der Leber.
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Protocol
Tierversuche werden nach den experimentellen Verfahren durchgeführt, die von den Institutional Animal Care and Use Committees (IACUCs) der Stanford University und dem Veterans Affairs Hospital in Palo Alto genehmigt wurden. 6-8 Wochen alte männliche C57BL/6J-Mäuse wurden 14 Wochen lang entweder mit Chow oder einer Fast-Food-Diät gefüttert, die mit 4,2 % Maissirup mit hohem Fruktosegehalt (siehe Materialtabelle) ergänzt wurde5. Die Mäuse wurden in Standardkäfigen mit einem 12-stündigen Dunkel-Hell-Zyklus gehalten.
1. Chirurgische Vorbereitung und Verfahren der Leberperfusion
- Wiegen Sie die Maus vor dem Eingriff.
- Betäuben Sie die Maus durch Verabreichung von Ketamin (90 mg/kg) und Xylazin (10 mg/kg) (siehe Materialtabelle) über eine intraperitoneale Injektion. Stellen Sie sicher, dass die Maus durch Zehenkneifen vollständig betäubt ist, bevor Sie mit dem nächsten Schritt fortfahren.
HINWEIS: Isofluran wird hier nicht benötigt, da es sich um eine Operation handelt, bei der es sich nicht um eine Überlebensoperation handelt. - Rasieren Sie den Bauchbereich mit einer Haarschneidemaschine und desinfizieren Sie die Haut mit 70% Ethanol. Legen Sie die Maus auf den Rücken und fixieren Sie die Beine mit Klebeband auf dem chirurgischen Brett.
- Nachdem Sie die Tiefe der Anästhesie durch eine Zehenzwicke erneut bestätigt haben, verwenden Sie eine Mayo-Schere und eine Adson-Pinzette (siehe Materialtabelle), um einen 3 cm langen Schnitt seitlich im Unterbauch und dann einen 5 cm langen Schnitt vertikal vom Unterbauch bis zum Processus xiphoideus zu machen. Achten Sie darauf, die Brusthöhle nicht zu öffnen.
- Nachdem Sie das Bauchfell geöffnet haben, platzieren Sie den Darm vorsichtig links vom Tier und heben Sie den rechten Leberlappen mit einem Viskose-Applikator (siehe Materialtabelle) an, um die Pfortader freizulegen.
- Katheterisieren Sie die Pfortader mit einem 24 G i.v. Katheter. Führen Sie den Katheter in das distale Ende der Pfortader ein. Setzen Sie die Katheterspitze an, bevor sich die Pfortader in die Leberlappen verzweigt.
- Ziehen Sie die Nadel sofort zurück, wenn der Katheter in die Vene eintritt. Überprüfen Sie, ob der Katheter richtig in der Vene positioniert ist, indem Sie die Leber mit einer 1-ml-Spritze über den Katheter mit PBS perfundieren.
HINWEIS: Nach der PBS-Perfusion sollten alle Lappen sofort blanchieren. Wenn der Katheter richtig platziert ist, fließt venöses Blut schnell durch den Katheter. - Verwenden Sie eine Dumont-Mikropinzette, einen Castroviejo-Mikronadelhalter und eine 4-0-Naht (siehe Materialtabelle), um einen Stich unter die Verzweigung der Pfortader und einen zweiten Stich 1 cm darunter zu setzen, um den Katheter zu sichern.
2. Dezellularisierung des Gewebes
- Schließen Sie den Katheter an einen Silikonschlauch (~1 m Länge, 3 mm Innendurchmesser und 4,1 mm Außendurchmesser) mit einem Luer-Anschluss an. Schließen Sie den Silikonschlauch an eine Schlauchpumpe und ein Reservoir mit deionisiertem Wasser an (siehe Materialtabelle).
- Entfernen Sie vorsichtig die Luftblasen im Inneren des Röhrchens und vermeiden Sie die Bildung neuer Blasen während der Perfusion. Stellen Sie die Peristaltikpumpe auf eine Durchflussleistung von 0,2 ml/min (d. h. 288 ml/24 h) ein.
- Perfundieren Sie zuerst mit deionisiertem Wasser (~50 ml/Maus) für 2 h. Die Farbe der Leber ändert sich während der Perfusion von rot zu gelb.
HINWEIS: Das Tier läuft nach 10 Minuten Perfusion ab. - Wechseln Sie die Perfusionslösung zu 0,5 % (wt/vol) Natriumdesoxycholat (DOC, siehe Materialtabelle) und fahren Sie über Nacht fort (18 h, ~250 ml/Maus). Die Leber wird am Ende der Perfusion weiß (Abbildung 1).
- Schalten Sie die Perfusionslösung auf deionisiertes Wasser (~50 ml/Maus) um und perfundieren Sie sie 2 h lang.
- Verwenden Sie eine Dumont-Mikrozange und eine Mikrofederschere (siehe Materialtabelle), um die dezellularisierte Leber zu entnehmen und sorgfältig in einer Petrischale mit PBS zu waschen.
- Schneiden Sie das dezellularisierte Gewebe für die sofortige Bildgebung in kleine Stücke oder frieren Sie es bei -80 °C für weitere biochemische Analysen wie Tandem-Massenspektrometrie, ELISA oder Western Blot ein.
3. Objektträgervorbereitung für die Bildgebung (mit einem Multiphotonen-/konfokalen Fluoreszenzmikroskop)
- Übertragen Sie ein kleines Stück dezellularisierter Leber (<3 x 3 x 3 mm) auf einen Objektträger und legen Sie das Gewebe in die Mitte.
- Geben Sie 10 μl Eindeckmittel (siehe Materialtabelle) mit einer Pipette in das Gewebe, um ein Austrocknen des Gewebes zu vermeiden.
- Decken Sie das Gewebe mit einem Deckglas ab und üben Sie eine kleine Kraft aus, um die Probe zu glätten. Versiegeln Sie die Ränder des Deckglases mit farblosem und transparentem Nagellack (Abbildung 2).
HINWEIS: Aufgrund der Einstellung des aufrechten Zwei-Photons durch das Mikroskop wurde ein Deckglas auf der Probe verwendet. Die Proben könnten jedoch anders platziert werden, wenn ein inverses Mikroskop verwendet wird.
4. Bildaufnahme
- Geben Sie einen Tropfen Immersionsöl auf die Oberseite des Deckglases und legen Sie den Objektträger auf den Objektträgerhalter. Senken Sie die 20-fach-Ölobjektivlinse ab, bis sie das Immersionsöl berührt.
- Wechseln Sie in den violetten Kanal (405 nm), schalten Sie den Verschluss ein und fokussieren Sie auf die Probe. Navigieren und positionieren Sie den Interessenbereich für die Bildgebung. Schalten Sie den Verschluss aus, bevor Sie mit der Bildaufnahme mit Laserlicht fortfahren.
- Wechseln Sie zur Computersteuerung und starten Sie den Zwei-Photonen-Laser. Schalten Sie zuerst den Zwei-Photonen-Laser ein (Abbildung 3A), dann den Zwei-Photonen-Lasercontroller (siehe Materialtabelle) und den Verschluss (Abbildung 3B, C). Stellen Sie sicher, dass die Ausgangsleistung höher als 2,5 W ist.
Reduzieren Sie die Laserleistung, um eine Fluoreszenzlöschung zu verhindern. Wählen Sie die Detektoren (sowohl Photomultiplier als auch den Hybriddetektor) aus und passen Sie sie an die ausgewählten Fluorophore an.
HINWEIS: Die Zwei-Photonen-Bildgebung wurde bei einer Anregungswellenlänge von 860 nm durchgeführt. Es wurden zwei Kanäle für Kollagen-SHG- bzw. Zwei-Photonen-angeregte Fluoreszenzbilder (TPEF) ausgewählt. Ein Kanal, der dem Wellenlängenbereich von 415-445 nm entspricht, detektierte die detaillierte Struktur von Kollagen aus SHG-Signalen. Ein weiterer Kanal deckte den Bereich von 465-669 nm ab, um TPEF-Signale zu sammeln. - Wählen Sie zwischen simultanen oder sequenziellen Bildaufnahmen. Stellen Sie die Lochblende auf den höchsten Wert ein. Passen Sie Laserwellenlängen, Verstärkung, Leistung und Offset an. Passen Sie die Pixelverweildauer, die Pixelgröße, die Mittelwertbildung und den Zoom an (Abbildung 4A).
- Scrollen Sie durch den Z-Controller des Computers und legen Sie die Z-Dimensionen fest, definieren Sie den Start- und Endpunkt und wählen Sie die Anzahl der Bilder aus, die innerhalb eines Volumes (Z-Stack) angegeben werden. Erfassen Sie Bilder.
HINWEIS: Hier wurde ein Z-Volumen von 20 μm und eine Z-Schrittweite von 1 μm gewählt (Abbildung 4B).
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Representative Results
Die Kollagenfasern wurden mit Hilfe der Erzeugung der zweiten Harmonischen und der Zwei-Photonen-Mikroskopie detektiert. Das Signal stammt von den zerbrechlichen dreifachhelikalen und nativen fibrillären Kollagenstrukturen. Spezifische Antikörper wurden nicht verwendet, um Kollagen-Subtypen zu analysieren; Dies könnte jedoch der Bildgebungstechnik hinzugefügt werden.
Wenn das Lebergewebe ohne Dezellularisierung untersucht wird, ist es schwierig, hochauflösende Bilder des Kollagennetzwerks zu erhalten (Abbildung 5A). Bei der dezellularisierten EZM erscheinen die Kollagenfasern (grün) parallel oder ineinander verwoben (Abbildung 5B). Es zeigten sich offensichtliche Unterschiede in der Morphologie und räumlichen Verteilung der ECM-Komponenten zwischen Chow- und FFD-Lebern. Kollagenfasern in Mäusen, die eine Chow-Diät erhielten, zeigten ein verwobenes und gut organisiertes Netzwerk. Bei Mäusen mit FFD wurden jedoch Kollagenbündel mit geringerer Konnektivität beobachtet (Abbildung 5B).
Um die 3D-Struktur der Leber-EZM weiter zu untersuchen, wurden Bilder der Schnitte mit einem Z-Volumen (Dicke) von 20 μm und einer Z-Schrittweite von 1 μm aufgenommen. Kollagenfasern zeigten bei Mäusen, die Chow-Diät erhielten, ein gut organisiertes Netzwerk, nicht jedoch bei Mäusen mit FFD (Abbildung 6). Um die Qualität des fibrillären Kollagens in der dezellularisierten EZM zu bestätigen, wurden die Objektträger fixiert und in Paraffin eingebettet und mit Hämatoxylin und Eosin (H&E) und Picrosiriusrot (PSR) gefärbt (siehe Materialtabelle). H&E zeigt, dass alle Zellen entfernt wurden. Die PSR ist eine häufig verwendete histologische Technik zur Darstellung von Kollagen in paraffineingebetteten Gewebeschnitten (Abbildung 7).
Abbildung 1: Leber der Maus während der Perfusion. Die Leber wird am Ende der Perfusion weiß und halbtransparent. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 2: Objektträgervorbereitung für die Bildgebung. Das Gewebe wird mit einem Deckglas abgedeckt und eine kleine Kraft ausgeübt, um die Probe zu glätten. Die Ränder des Deckglases sind mit farblosem und transparentem Nagellack versiegelt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 3: Screenshot der Zwei-Photonen-Laser-Software, die den Zwei-Photonen-Laser startet. (A) Zuerst wird der Zwei-Photonen-Laser eingeschaltet. (B) (C) Der Zwei-Photonen-Lasercontroller und der Verschluss sind eingeschaltet. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 4: Screenshot der Zwei-Photonen-Laser-Software während der Bildaufnahme. (A) Stellen Sie sicher, dass die Lochblende auf den höchsten Wert (rote Pfeile) eingestellt ist. Passen Sie Laserwellenlängen, Verstärkung, Leistung und Offset an. Passen Sie die Pixelverweildauer, die Pixelgröße, die Mittelung und den Zoom an. (B) Stellen Sie das Z-Volumen auf 20 μm und die Z-Schrittweite auf 1 μm ein. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 5: Dezellularisierte EZM, aufgenommen mit Zwei-Photonen-Mikroskopie . (A) SHG-Aufnahmen von Kollagenfasern aus einer 6 μm Leberscheibe (frisch gefroren) ohne Dezellularisierung. (B) SHG-Bilder zeigen ein gut organisiertes Kollagennetzwerk in der Leber von Mäusen, die eine normale Kontrolldiät erhielten. Remodelliertes Kollagennetzwerk bei Mäusen mit Fast-Food-Diät (FFD). Pfeil, Fibrosebereich. Stern, umgestaltetes Kollagennetzwerk. Maßstabsbalken = 100 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 6: 3D-Struktur des Kollagennetzwerks der Leber. Die Kollagenfasern in Mäusen, die eine Chow-Diät erhielten, zeigten ein gut organisiertes Netzwerk, aber nicht in Fast-Food-Diät (FFD)-Mäusen. Die Bilder wurden mit einem Z-Volumen von 20 μm (Dicke) und einer Z-Schrittweite von 1 μm aufgenommen. Maßstabsbalken = 100 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 7: Hämatoxylin- und Eosinfärbung (H&E) und Picrosiriusrot (PSR) Färbung der dezellularisierten EZM. H&E zeigt, dass alle Zellen entfernt wurden. In den PSR-Färbebildern zeigte die EZM der mit Chow-gefütterten Mäusen ein gut organisiertes Netzwerk, und im Gegensatz dazu zeigten Mäuse mit Fast-Food-Diät (FFD) dichtere Kollagenfasern. Z-Volumen (Dicke) = 6 μm. Maßstabsbalken = 100 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
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Discussion
Das vorliegende Protokoll zeigt, dass die Dezellularisierung durch eine niedrige Flussrate der DOC-in-situ-Perfusion die zerbrechlichen dreifachhelikalen und nativen fibrillären Kollagenstrukturen bewahrt und eine zuverlässige und kostengünstige Plattform zur Erfassung des dynamischen ECM-Umbaus bei NASH-Leberfibrose bietet. Obwohl die Dezellularisierung in normalen und fibrotischen Lebern durchgeführt wurde, bevor EZM-Komponenten identifiziert oder biologische Gerüste für die Zellkultur erzeugt wurden, ist die Dynamik des EZM-Umbaus bei Leberfibrose nicht gut untersuchtworden 8,9,10. Diese Methode ermöglicht es den Forschern, Vergleiche zwischen verschiedenen Fibrosemodellen zu ziehen.
Derzeit gibt es verschiedene Perfusionsprotokolle, die DNase, Natriumdodecylsulfat (SDS) oder Triton X-10011 verwenden. Die Kosten für DNase sind hoch, da große Mengen an Lösungen erforderlich sind. SDS ist eine scharfe Denaturierungslösung, ein anionisches Detergens, das die Zellmembranen aufbricht und Proteine denaturiert. Daher ist es eine Herausforderung, das gesamte Kollagennetzwerk nach der SDS-Perfusion zu erhalten. Im Gegensatz dazu stört Triton X-100 als mildes, nicht denaturierendes, nichtionisches Detergens die Lipid-Lipid- und Lipid-Protein-Wechselwirkungen und bewahrt Protein-Protein-Wechselwirkungen. Es wurde jedoch berichtet, dass Triton X-100 die ECM-Gerüste stört, wodurch das dezellularisierte Leber-ECM für weitere massenspektrometrische Analysen ungeeignet ist11.
Das Perfusionsprotokoll mit DOC wurde gegenüber der vorherigen Arbeitmodifiziert 7, was eine bessere Erhaltung der dreifachhelikalen und nativen fibrillären Kollagenstrukturen in den meisten Geweben zeigt. Das Kollagennetzwerk wurde mit Mikroskopie der zweiten harmonischen Generation (SHG) ohne Antikörper untersucht, was die dreifachhelikalen und nativen fibrillären Kollagenstrukturen widerspiegelt. Die dezellularisierte Leber-ECM von FFD-Mäusen wurde ebenfalls getestet, und strukturelle Veränderungen in NASH wurden bestätigt.
Die wichtigsten Schritte des Protokolls sind die Platzierung des Katheters und das Einrichten des Perfusionssystems. Die Pfortaderkatheteruntersuchung ist lebenswichtig, aber auch die untere Hohlvene kann eingesetzt werden, wenn die Pfortader geschädigt ist. Blasen im Puffer und in den Röhrchen müssen vermieden werden, da sie die Durchblutung beeinträchtigen. Da ein aufrechtes Zwei-Photonen-Mikroskop verwendet wurde, war die Probengröße begrenzt. Dies kann geändert werden, wenn ein inverses Mikroskop verwendet werden soll.
Es besteht ein zunehmendes Interesse an der umgestalteten EZM bei chronischen Lebererkrankungen und der Hepatokarzinogenese12,13,14. Dezellularisierte ECM-Gerüste wurden in der chirurgischen Reparatur und in der regenerativen Medizin als geeignetes biologisches Gerüstmaterial eingesetzt15,16,17. Dieser milde Dezellularisierungsprozess hat jedoch auch Grenzen, da einige zelluläre Bestandteile wie DNA oder Lipidreste möglicherweise nicht vollständig entfernt werden. Eine längere DOC-Perfusionszeit und eine Erhöhung der Flussrate können dazu beitragen, hochgereinigte dezellularisierte Gerüste zu erhalten. Die Zugabe von DNase in die Waschlösung nach der DOC-Perfusion kann ebenfalls helfen, DNA zu entfernen. Das Protokoll kann für menschliche Leberbiopsien angepasst werden, wodurch das Verständnis von EZM-Veränderungen während der NASH-Progression verbessert wird.
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Disclosures
Die Autoren erklären, dass keine Interessenkonflikte in Bezug auf diesen Artikel bestehen.
Acknowledgments
Wir danken Hyesuk Park für die technische Hilfe. Diese Forschung wurde durch Mittel des National Institute of Diabetes and Digestive and Kidney Diseases (NIDDK), des NIH (R01 2DK083283, an NJT), des National Institute on Aging (NIA) und des NIH (1R01AG060726, an NJT) unterstützt. Wir danken Jon Mulholland und Kitty Lee von der Cell Sciences Imaging Facility am Beckman Center für die technische Unterstützung bei der Zwei-Photonen-Mikroskopie-Bildgebung.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4-0 MONOCRYL UNDYED 1 x 18" P-3 | MONOCRYL | Y494G | |
| 4-0 suture | fisher scientific | 10-000-649 | https://www.fishersci.com/shop/products/monomid-nylon-non-absorbable-sutures-7/10000649?keyword=true |
| AnaSed Injection (xylazine) | AnaSed | NDC 59399-110-20 | this drug to use by or on the order of a licensed veterinarian. |
| BD INSYTE AUTOGUARD I.V. CATHETER WITH BC TECHNOLOGY | BD | 382612 | |
| Chow diet | Envigo | # 2918 | Control diet. A fixed formula, non-autoclavable diet manufactured with high quality ingredients and designed to support gestation, lactation, and growth of rodents. |
| Fast-food diet (AIN76A Western Diet) | Test Diet | 1810060 | https://www.testdiet.com/cs/groups/lolweb/@testdiet/documents/web_content/mdrf/mdux/~edisp/ducm04_051601.pdf |
| Hematoxylin and Eosin Stain Kit | vectorlabs | H-3502 | https://vectorlabs.com/hematoxylin-and-eosin-stain-kit.html |
| Kent Scientific Rat Surgical Kit | fisher scientific | 13-005-205 | https://www.fishersci.com/shop/products/rat-surgical-kit/13005205#?keyword=mouse%20surgery%20kit |
| KETAMINE HYDROCHLORIDE INJECTION | Vedco | NDC 50989-996-06 - 10 mL - vial. | KetaVed has been clinically studied in subhuman primates in addition to those species listed under Administration and Dosage. |
| Leica SP5 upright Confocal, multi-photon | Leica | SP5 | |
| Luer connector (Three-way stopcock with SPIN-LOCK®) | bbraun | D300 | https://www.bbraunusa.com/en/products/b0/three-way-stopcockwithspin-lock.html |
| Picrosirius Red Stain Kit | Polysciences, Inc. | 24901 | https://www.polysciences.com/default/picrosirius-red-stain-kit-40771 |
| Rayon tipped applicator | puritan | 25-806 1PR | |
| Sodium deoxycholate | sigmaaldrich | D6750-100G | |
| Syrup | www.target.com | 24 fl oz | https://www.target.com/p/pancake-syrup-24-fl-oz-market-pantry-8482/-/A-13007801 |
| Variable Speed Peristaltic Pump | INTLLAB | BT100 | https://www.amazon.com/gp/product/B082K97W5W/ref=ox_sc_saved_title_2?smid=A12NUUP87ZRRAR&psc=1 |
| VECTASHIELD Antifade Mounting Medium | vectorlabs | H-1000-10 | https://vectorlabs.com/vectashield-mounting-medium.html |
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