Summary
O presente protocolo otimiza os métodos de perfusão/decelularização hepática in situ e microscopia de dois fótons para estabelecer uma plataforma confiável para visualizar a dinâmica do remodelamento da matriz extracelular (MEC) durante a esteato-hepatite não alcoólica (EHNA).
Abstract
A esteatohepatite não alcoólica (EHNA) é a doença hepática crônica mais comum nos Estados Unidos, afetando mais de 70 milhões de americanos. A EHNA pode evoluir para fibrose e, eventualmente, para cirrose, um importante fator de risco para carcinoma hepatocelular. A matriz extracelular (MEC) fornece suporte estrutural e mantém a homeostase hepática via sinais matricelulares. A fibrose hepática resulta de um desequilíbrio no processo de remodelamento dinâmico da MEC e é caracterizada pelo acúmulo excessivo de elementos estruturais e alterações associadas nos glicosaminoglicanos. O padrão típico de fibrose da EHNA é chamado de "fio de galinha", que geralmente consiste em fibrose perissinusoidal/pericelular da zona 3, com base nas características observadas pela coloração tricrômico de Masson e pelo vermelho de Picrosirius. No entanto, essas técnicas tradicionais de imagem em lâminas de tecido fino bidimensional (2D) não podem demonstrar as alterações estruturais detalhadas da MEC tridimensional (3D), limitando a compreensão do remodelamento dinâmico da MEC na fibrose hepática.
O trabalho atual otimizou um protocolo rápido e eficiente para obter imagens da estrutura nativa da MEC no fígado via decelularização para enfrentar os desafios acima. Os camundongos foram alimentados com ração ou dieta fast-food por 14 semanas. A descelularização foi realizada após perfusão in situ da veia porta, e as técnicas de microscopia de dois fótons foram aplicadas para imagear e analisar as alterações na MEC nativa. As imagens 3D dos fígados normal e NASH foram reconstituídas e analisadas. A realização da decelularização in situ da perfusão e a análise do arcabouço por microscopia de dois fótons forneceram uma plataforma prática e confiável para visualizar o remodelamento dinâmico da MEC no fígado.
Introduction
A doença hepática gordurosa não alcoólica (DHGNA) é a doença hepática mais comum, afetando 20%-25% da população adulta. 25% dos pacientes com DHGNA evoluem para esteato-hepatite não alcoólica (EHNA), onde o risco de cirrose, insuficiência hepática e carcinoma hepatocelular aumenta1. Nos próximos 20 anos, estima-se que a EHNA será responsável por 2 milhões de mortes relacionadas ao fígado nos EUA2. Como não existem tratamentos aprovados, há uma necessidade urgente de decifrar os mecanismos que causam fibrose hepática em pacientes com EHNA e desenvolver tratamento direcionado3.
A matriz extracelular (MEC) é um microambiente dinâmico e complexo que exerce comunicação bidirecional com as células para regular a homeostasetecidual4. A MEC hepática é composta por elementos estruturais como proteoglicanos, colágenos, fibronectina, elastina e outras proteínas não estruturais (por exemplo, olfactomedina e trombospondina) para fornecer suporte físico e estrutural4.
A fibrose hepática é uma resposta crônica da cicatrização de feridas ao dano hepático de várias etiologias, incluindo a EHNA3. Resulta de um desequilíbrio no processo dinâmico de remodelamento da matriz da MEC e é caracterizada pelo excesso de proteínas estruturais no fígado lesado4. A fibrogênese depende da comunicação dinâmica célula-célula entre diferentes tipos de células hepáticas. As células estreladas hepáticas (CTHs), quando ativadas, diferenciam-se em células do músculo liso alfa 2 que expressam, migram e proliferam miofibroblastos como células e sintetizam proteínas da MEC como uma ação de fechamento da ferida. As CTHs ativadas são as células centrais produtoras de colágeno no fígado1.
O mecanismo molecular do remodelamento da MEC, os padrões de fibrose e sua relação com eventos celulares não estão claros. Um melhor entendimento da estrutura tridimensional (3D) da MEC ainda é necessário, embora técnicas de espectrometria de massa tenham ajudado a analisar a composição proteica da MEC4. Tradicionalmente, a coloração tricrômico de Masson, as colorações Picro Sirius Red e a imagem de segunda geração harmônica (SHG) têm sido realizadas em cortes bidimensionais (2D) finos do fígado. O padrão típico de fibrose da EHNA é denominado "fio de galinha", que se estende até a zona 3 e é fibrose perissinusoidal/pericelular5,6. No entanto, há uma carência de estudos enfocando a estrutura 3D do fígado nativo, particularmente aqueles que não envolvem secção tecidual. Abordagens de imagem robustas para identificar padrões e características da fibrose ao longo do remodelamento dinâmico da MEC na fibrose hepática fortaleceriam significativamente a compreensão dos mecanismos da EHNA e identificariam novos alvos terapêuticos.
Para enfrentar esses desafios, um protocolo rápido e eficiente foi otimizado para obtenção de imagens da MEC hepática nativa via decelularização7. A descelularização do fígado total é uma abordagem para remover o conteúdo celular hepático enquanto mantém a rede nativa de MEC 3D através da perfusão em detergente. Os camundongos foram alimentados com ração ou dieta fast-food (FFD) por 14 semanas. A decelularização foi realizada após perfusão in situ da veia porta com detergente neutro e baixo fluxo, para preservar estruturas de colágeno fibrilar triplo-helicoidal e nativo. A microscopia de dois fótons foi aplicada para analisar as alterações nas estruturas do colágeno na MEC. As imagens 3D da estrutura da MEC nativa em fígados normais e NASH foram reconstituídas e analisadas. A realização da decelularização da perfusão in situ e a análise do arcabouço por microscopia de dois fótons fornecem uma plataforma prática e acessível para visualizar o remodelamento dinâmico da MEC no fígado.
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Protocol
Os experimentos com animais são realizados de acordo com os procedimentos experimentais aprovados pelos comitês institucionais de cuidados e uso de animais (IACUCs) da Universidade de Stanford e do Hospital de Assuntos de Veteranos em Palo Alto. Camundongos C57BL/6J machos de 6-8 semanas de idade foram alimentados com ração ou dieta fast-food suplementada com 4,2% de xarope de milho com alto teor de frutose (ver Tabela de Materiais) em água potável por 14 semanas5. Os camundongos foram mantidos em gaiolas padrão em um ciclo escuro/claro de 12 horas.
1. Preparo cirúrgico e procedimentos de perfusão hepática
- Pese o rato antes do procedimento.
- Anestesiar o rato administrando cetamina (90 mg/kg) e xilazina (10 mg/kg) (ver Tabela de Materiais) através de uma injeção intraperitoneal. Certifique-se de que o mouse esteja totalmente anestesiado pelo pinçamento dos dedos dos pés antes de prosseguir para a próxima etapa.
NOTA: O isoflurano não é necessário aqui, uma vez que esta é uma cirurgia de não-sobrevivência. - Raspar a área ventral usando um cortador de cabelo e desinfetar a pele com etanol 70%. Coloque o mouse nas costas e imobilize as pernas na prancha cirúrgica com fita adesiva.
- Depois de reconfirmar a profundidade da anestesia por uma pinça nos dedos, use uma tesoura Mayo e pinça de Adson (ver Tabela de Materiais) para fazer uma incisão de 3 cm lateralmente no abdome inferior e, em seguida, uma incisão de 5 cm verticalmente do abdome baixo até o processo xifoide. Tenha cuidado para não abrir a cavidade torácica.
- Depois de abrir o peritônio, coloque suavemente os intestinos à esquerda do animal e eleve o lobo direito do fígado com um aplicador com ponta de Rayon (ver Tabela de Materiais) para expor a veia porta.
- Cateterizar a veia porta com cateter IV de 24 G. Introduzir o cateter na extremidade distal da veia porta. Coloque a ponta do cateter antes que a veia porta se ramifica para os lobos hepáticos.
- Retire a agulha imediatamente quando o cateter entrar na veia. Verifique se o cateter está corretamente posicionado dentro da veia perfundindo o fígado com PBS usando uma seringa de 1mL através do cateter.
NOTA: Após a perfusão PBS, todos os lóbulos devem imediatamente embranquecer. Se o cateter for colocado corretamente, o sangue venoso fluirá rapidamente através do cateter. - Utilizar micropinça Dumont, suporte para microagulha Castroviejo e sutura 4-0 (ver Tabela de Materiais) para colocar um ponto abaixo da ramificação da veia porta e um segundo ponto 1 cm abaixo para fixar o cateter.
2. Descelularização tecidual
- Conecte o cateter a um tubo de silicone (~1 m de comprimento, 3 mm de diâmetro interno e 4,1 mm de diâmetro externo) com um conector Luer. Conecte a tubulação de silicone a uma bomba peristáltica e a um reservatório contendo água deionizada (consulte a Tabela de Materiais).
- Remova cuidadosamente as bolhas de ar dentro do tubo e evite gerar novas bolhas durante a perfusão. Ajuste a bomba peristáltica em uma saída de fluxo de 0,2 mL/min (ou seja, 288 mL/24 h).
- Perfundir primeiro com água deionizada (~50 mL/rato) durante 2 h. A cor do fígado mudará de vermelho para amarelo durante a perfusão.
OBS: O animal expirará após 10 minutos de perfusão. - Troque a solução de perfusão para desoxicolato de sódio a 0,5% (m/vol) (DOC, ver Tabela de Materiais) e continue durante a noite (18 h, ~250mL/mouse). O fígado ficará esbranquiçado ao final da perfusão (Figura 1).
- Troque a solução de perfusão por água deionizada (~50 mL/mouse) e perfunda por 2 h.
- Use micropinças Dumont e tesouras de micromola (ver Tabela de Materiais) para coletar o fígado decelularizado e lavá-lo cuidadosamente em uma placa de Petri com PBS.
- Corte o tecido decelularizado em pequenos pedaços para aquisição imediata de imagens ou congele a -80 °C para análises bioquímicas adicionais, como espectrometria de massa em tandem, ELISA ou western blot.
3. Preparo da lâmina para obtenção de imagens (com microscópio multifóton/confocal de fluorescência)
- Transfira um pequeno pedaço de fígado decelularizado (<3 x 3 x 3 mm) para uma lâmina de microscópio e coloque o tecido no meio.
- Adicionar 10 μL de meio de montagem antifade (ver Tabela de Materiais) ao tecido com uma pipeta para evitar o ressecamento do tecido.
- Cubra o tecido com um vidro de cobertura e aplique uma pequena força para achatar a amostra. Selar as bordas do vidro da tampa com esmalte incolor e transparente (Figura 2).
OBS: Devido à fixação dos dois fótons verticais através do microscópio, um vidro de cobertura foi utilizado na amostra. No entanto, as amostras podem ser colocadas de forma diferente se um microscópio invertido for usado.
4. Aquisição de imagens
- Coloque uma gota de óleo de imersão na parte superior do vidro da tampa e coloque a lâmina no suporte da lâmina do microscópio. Abaixe a objetiva de óleo de 20x até entrar em contato com o óleo de imersão.
- Mude para o canal violeta (405 nm), ligue o obturador e concentre-se na amostra. Navegue e posicione a área de interesse para geração de imagens. Desligue o obturador antes de passar para a aquisição de imagens usando luz laser.
- Mude para o controle do computador e inicie o laser de dois fótons. Ligue primeiro o laser de dois fótons (Figura 3A), depois ligue o controlador de laser de dois fótons (consulte Tabela de Materiais) e o obturador (Figura 3B,C). Certifique-se de que a potência de saída é superior a 2,5 W.
Reduza a potência do laser para evitar a têmpera da fluorescência. Selecione e ajuste os detectores (fotomultiplicadores e híbridos) para acomodar os fluoróforos escolhidos.
NOTA: Imagens de dois fótons foram realizadas em um comprimento de onda de excitação de 860 nm. Dois canais foram selecionados para imagens de SHG de colágeno e fluorescência excitada de dois fótons (TPEF), respectivamente. Um canal correspondente à faixa de comprimento de onda de 415-445 nm detectou a estrutura detalhada do colágeno a partir de sinais de SHG. Outro canal cobria a faixa de 465-669 nm para coletar sinais TPEF. - Escolha aquisições de imagens simultâneas ou sequenciais. Ajuste o orifício para o valor mais alto. Ajuste os comprimentos de onda do laser, ganho, potência e deslocamento. Ajuste o tempo de permanência do pixel, o tamanho do pixel, a média e o zoom (Figura 4A).
- Role o z-controller do computador e defina as z-dimensions, defina os pontos de início e fim e escolha o número de imagens fornecidas dentro de um volume (z-stack). Adquirir imagens.
NOTA: Aqui, um volume Z de 20 μm e um tamanho de passo Z de 1 μm foram escolhidos (Figura 4B).
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Representative Results
As fibras colágenas foram detectadas com segunda geração harmônica e microscopia de dois fótons. O sinal é proveniente das estruturas frangíveis de colágeno fibrilar triplo-helicoidal e nativo. Não foram utilizados anticorpos específicos para analisar os subtipos de colágeno; no entanto, isso poderia ser adicionado à técnica de imagem.
Quando o tecido hepático é estudado sem descelularização, é difícil obter imagens de alta resolução da rede de colágeno (Figura 5A). Na MEC decelularizada, as fibras colágenas (verdes) aparecem paralelas ou entrelaçadas (Figura 5B). Houve diferenças aparentes na morfologia e distribuição espacial dos componentes da MEC entre os fígados de Chow e FFD. Fibras colágenas em camundongos com dieta ração exibiram uma rede entrelaçada e bem organizada. Em camundongos em FFD, entretanto, feixes de colágeno foram observados com menor conectividade (Figura 5B).
Para um estudo mais aprofundado da estrutura 3D da MEC hepática, imagens dos cortes foram capturadas com 20 μm de volume Z (espessura) e 1 μm de tamanho Z-step. As fibras colágenas em camundongos com dieta ração mostraram uma rede bem organizada, mas não nos camundongos em FFD (Figura 6). Para confirmar a qualidade do colágeno fibrilar na MEC decelularizada, as lâminas foram fixadas e incluídas em parafina e coradas com Hematoxilina e eosina (H&E) e Picrosirius red (PSR) (ver Tabela de Materiais). H&E mostra que todas as células foram removidas. A PSR é uma técnica histológica comumente utilizada para destacar colágeno em cortes de tecido embebidos em parafina (Figura 7).
Figura 1: Fígado de camundongo durante a perfusão. O fígado torna-se branco e semitransparente no final da perfusão. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Preparação da lâmina para aquisição de imagens. O tecido é coberto com um vidro de cobertura, e uma pequena força é aplicada para achatar a amostra. As bordas do vidro da tampa são seladas com esmalte incolor e transparente. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Captura de tela do software do laser de dois fótons, iniciando o laser de dois fótons. (A) Primeiro, o laser de dois fótons é ligado. (B) (C) O controlador de laser de dois fótons e o obturador estão ligados. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Captura de tela do software laser de dois fótons durante a aquisição das imagens. (A) Certifique-se de ajustar o orifício para o valor mais alto (setas vermelhas). Ajuste os comprimentos de onda do laser, ganho, potência e deslocamento. Ajuste o tempo de permanência do pixel, o tamanho do pixel, a média e o zoom. (B) Ajuste o volume Z para 20 μm e o tamanho do passo Z para 1 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: ECM descelularizada com microscopia de dois fótons . (A) Imagens de SHG de fibras colágenas de um corte de fígado de 6 μm (fresco congelado) sem decelularização. (B) Imagens de SHG mostram uma rede de colágeno bem organizada em fígados de camundongos em dieta controle normal, chow. Rede de colágeno remodelada em camundongos em dieta fast-food (FFD). Seta, área de fibrose. Estrela, rede de colágeno remodelada. Barra de escala = 100 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 6: Estrutura 3D da rede de colágeno hepático. As fibras colágenas em camundongos na dieta chow mostraram uma rede bem organizada, mas não em camundongos fast-food diet (FFD). As imagens foram capturadas com volume Z de 20 μm (espessura) e tamanho de passo Z de 1 μm. Barra de escala = 100 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 7: Coloração hematoxilina e eosina (H&E) e Picrosirius red (PSR) da MEC decelularizada. H&E mostra que todas as células foram removidas. Nas imagens de coloração PSR, a MEC dos camundongos alimentados com ração revelou uma rede bem organizada e, em contraste, os camundongos em dieta fast-food (FFD) mostraram fibras colágenas mais densas. Volume Z (espessura) = 6 μm. Barra de escala = 100 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
O presente protocolo mostra que a decelularização através de uma perfusão in situ de COD de baixa taxa de fluxo preserva as estruturas frangíveis de colágeno fibrilar triplo-helicoidal e nativo, fornecendo uma plataforma confiável e econômica para capturar o remodelamento dinâmico da MEC na fibrose hepática da EHNA. Embora a descelularização tenha sido realizada em fígados normais e fibróticos antes da identificação dos componentes da MEC ou da geração de scaffolds biológicos para cultura celular, a dinâmica do remodelamento da MEC na fibrose hepática ainda não foi bem estudada8,9,10. Este método permite aos investigadores estabelecer comparações entre vários modelos de fibrose.
Atualmente, existem variedades de protocolos de perfusão utilizando DNase, dodecil sulfato de sódio (SDS) ou Triton X-10011. O custo da DNase é alto porque são necessários grandes volumes de soluções. O SDS é uma solução desnaturante áspera, um detergente aniônico que rompe as membranas celulares e desnatura proteínas. Portanto, preservar toda a rede de colágeno após a perfusão por SDS é um desafio. Em contraste, Triton X-100, como um detergente não-desnaturante suave, não-iônico, interrompe as interações lipídio-lipídio e lipídio-proteína e preserva as interações proteína-proteína. No entanto, tem sido relatado que o Triton X-100 perturba os arcabouços da MEC, tornando a MEC hepática decelularizada inadequada para análise posterior por espectrometria de massa11.
O protocolo de perfusão com COD foi modificado em relação ao trabalhoanterior7, demonstrando melhor preservação das estruturas do colágeno fibrilar triplo-helicoidal e nativo na maioria dos tecidos. A rede de colágeno foi estudada com microscopia de segunda geração harmônica (SHG) sem anticorpos, refletindo as estruturas de colágeno fibrilar triplo-helicoidal e nativo. A MEC hepática decelularizada de camundongos FFD também foi testada, e alterações estruturais na EHNA foram confirmadas.
As etapas mais críticas do protocolo são a colocação do cateter e a montagem do sistema de perfusão. O cateterismo da veia porta é vital, mas a veia cava inferior também pode ser usada se a veia porta estiver lesada. Bolhas no tampão e tubos devem ser evitadas, pois afetam a perfusão. Como foi utilizado microscópio vertical de dois fótons, o tamanho da amostra foi limitado. Isso pode ser modificado se um microscópio invertido for usado.
Há um crescente interesse na MEC remodelada nas doenças hepáticas crônicas e na hepatocarcinogênese12,13,14. Scaffolds de MEC descelularizados têm sido empregados no reparo cirúrgico e na medicina regenerativa como material apropriado para arcabouços biológicos15,16,17. No entanto, esse leve processo de descelularização também tem limitações, pois alguns componentes celulares, como DNA ou restos lipídicos, podem não ser totalmente removidos. Um tempo de perfusão DOC mais longo e um aumento na taxa de fluxo podem ajudar a obter arcabouços decelularizados ultrapurificados. A adição de DNase na solução de lavagem após a perfusão DOC também pode ajudar a remover o DNA. O protocolo pode ser ajustado para biópsias hepáticas humanas, melhorando assim a compreensão das alterações da MEC durante a progressão da EHNA.
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Disclosures
Os autores declaram não haver conflitos de interesse referentes a este artigo.
Acknowledgments
Agradecemos ao Hyesuk Park pela ajuda técnica. Esta pesquisa foi apoiada pelo financiamento do Instituto Nacional de Diabetes e Doenças Digestivas e Renais (NIDDK), NIH (R01 2DK083283, para NJT), o Instituto Nacional de Envelhecimento (NIA), NIH (1R01AG060726, para NJT). Agradecemos a Jon Mulholland e Kitty Lee, do Cell Sciences Imaging Facility do Beckman Center, pela assistência técnica com a imagem de microscopia de dois fótons.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4-0 MONOCRYL UNDYED 1 x 18" P-3 | MONOCRYL | Y494G | |
| 4-0 suture | fisher scientific | 10-000-649 | https://www.fishersci.com/shop/products/monomid-nylon-non-absorbable-sutures-7/10000649?keyword=true |
| AnaSed Injection (xylazine) | AnaSed | NDC 59399-110-20 | this drug to use by or on the order of a licensed veterinarian. |
| BD INSYTE AUTOGUARD I.V. CATHETER WITH BC TECHNOLOGY | BD | 382612 | |
| Chow diet | Envigo | # 2918 | Control diet. A fixed formula, non-autoclavable diet manufactured with high quality ingredients and designed to support gestation, lactation, and growth of rodents. |
| Fast-food diet (AIN76A Western Diet) | Test Diet | 1810060 | https://www.testdiet.com/cs/groups/lolweb/@testdiet/documents/web_content/mdrf/mdux/~edisp/ducm04_051601.pdf |
| Hematoxylin and Eosin Stain Kit | vectorlabs | H-3502 | https://vectorlabs.com/hematoxylin-and-eosin-stain-kit.html |
| Kent Scientific Rat Surgical Kit | fisher scientific | 13-005-205 | https://www.fishersci.com/shop/products/rat-surgical-kit/13005205#?keyword=mouse%20surgery%20kit |
| KETAMINE HYDROCHLORIDE INJECTION | Vedco | NDC 50989-996-06 - 10 mL - vial. | KetaVed has been clinically studied in subhuman primates in addition to those species listed under Administration and Dosage. |
| Leica SP5 upright Confocal, multi-photon | Leica | SP5 | |
| Luer connector (Three-way stopcock with SPIN-LOCK®) | bbraun | D300 | https://www.bbraunusa.com/en/products/b0/three-way-stopcockwithspin-lock.html |
| Picrosirius Red Stain Kit | Polysciences, Inc. | 24901 | https://www.polysciences.com/default/picrosirius-red-stain-kit-40771 |
| Rayon tipped applicator | puritan | 25-806 1PR | |
| Sodium deoxycholate | sigmaaldrich | D6750-100G | |
| Syrup | www.target.com | 24 fl oz | https://www.target.com/p/pancake-syrup-24-fl-oz-market-pantry-8482/-/A-13007801 |
| Variable Speed Peristaltic Pump | INTLLAB | BT100 | https://www.amazon.com/gp/product/B082K97W5W/ref=ox_sc_saved_title_2?smid=A12NUUP87ZRRAR&psc=1 |
| VECTASHIELD Antifade Mounting Medium | vectorlabs | H-1000-10 | https://vectorlabs.com/vectashield-mounting-medium.html |
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