Summary
Le protocole actuel optimise les méthodes de perfusion/décellularisation in situ du foie et de microscopie à deux photons afin d’établir une plateforme fiable pour visualiser la dynamique du remodelage de la matrice extracellulaire (ECM) au cours de la stéatohépatite non alcoolique (NASH).
Abstract
La stéatohépatite non alcoolique (NASH) est la maladie hépatique chronique la plus courante aux États-Unis, affectant plus de 70 millions d’Américains. La NASH peut évoluer vers une fibrose et éventuellement vers une cirrhose, un facteur de risque important de carcinome hépatocellulaire. La matrice extracellulaire (MEC) fournit un soutien structurel et maintient l’homéostasie hépatique via des signaux matricellulaires. La fibrose hépatique résulte d’un déséquilibre dans le processus de remodelage dynamique de l’ECM et se caractérise par une accumulation excessive d’éléments structurels et des modifications associées des glycosaminoglycanes. Le schéma de fibrose typique de la NASH est appelé « fil de poulet », qui consiste généralement en une fibrose périsinusoïdale / péricellulaire de zone 3, basée sur les caractéristiques observées par la coloration trichrome de Masson et les taches rouge Picrosirius. Cependant, ces techniques traditionnelles d’imagerie bidimensionnelle mince (2D) basée sur des lames tissulaires ne peuvent pas démontrer les changements structurels détaillés de l’ECM tridimensionnelle (3D), ce qui limite la compréhension du remodelage dynamique de l’ECM dans la fibrose hépatique.
Les travaux actuels ont optimisé un protocole rapide et efficace pour imager la structure ECM native dans le foie via la décellularisation afin de relever les défis ci-dessus. Les souris ont été nourries avec du chow ou un régime de restauration rapide pendant 14 semaines. La décellularisation a été réalisée après perfusion in situ de la veine porte, et les techniques de microscopie à deux photons ont été appliquées pour imager et analyser les changements dans l’ECM natif. Les images 3D des foies normaux et NASH ont été reconstituées et analysées. La réalisation d’une décellularisation in situ de la perfusion et l’analyse de l’échafaudage par microscopie à deux photons ont fourni une plate-forme pratique et fiable pour visualiser le remodelage dynamique de l’ECM dans le foie.
Introduction
La stéatose hépatique non alcoolique (NAFLD) est la maladie hépatique la plus courante, affectant 20% à 25% de la population adulte. 25% des patients atteints de NAFLD évoluent vers une stéatohépatite non alcoolique (NASH), où le risque de cirrhose, d’insuffisance hépatique et de carcinome hépatocellulaire augmente1. Au cours des 20 prochaines années, on estime que la NASH représentera 2 millions de décès liés au foie aux États-Unis2. En l’absence de traitements homologués, il est urgent de décrypter les mécanismes responsables de la fibrose hépatique chez les patients NASH et de développer un traitement ciblé3.
La matrice extracellulaire (MCE) est un microenvironnement dynamique et complexe qui exerce une communication bidirectionnelle avec les cellules pour réguler l’homéostasie tissulaire4. La MEC hépatique est composée d’éléments structuraux tels que les protéoglycanes, le collagène, la fibronectine, l’élastine et d’autres protéines non structurelles (par exemple, l’olfactomedine et la thrombospondine) pour fournir un soutien physique et structurel4.
La fibrose hépatique est une réponse chronique à la cicatrisation des plaies aux lésions hépatiques de diverses étiologies, y compris la NASH3. Elle résulte d’un déséquilibre dans le processus dynamique de remodelage de la matrice ECM et se caractérise par un excès de protéines structurelles dans le foie blessé4. La fibrogenèse dépend de la communication dynamique cellule-cellule entre différents types de cellules hépatiques. Les cellules stellaires hépatiques (CSH), lorsqu’elles sont activées, se différencient en cellules de type myofibroblastes exprimant l’alpha 2 Smooth Muscle 2 et synthétisent les protéines ECM en tant qu’action de fermeture de la plaie. Les CSH activées sont les cellules centrales productrices de collagène dans le foie1.
Le mécanisme moléculaire du remodelage de l’ECM, les modèles de fibrose et leur relation avec les événements cellulaires ne sont pas clairs. Une meilleure compréhension de la structure tridimensionnelle (3D) de l’ECM est encore nécessaire, même si les techniques de spectrométrie de masse ont permis d’analyser la composition protéique de l’ECM4. Traditionnellement, la coloration trichrome de Masson, les taches rouge Picro Sirius et l’imagerie de deuxième génération harmonique (SHG) ont été réalisées sur des coupes de foie minces bidimensionnelles (2D). Le schéma de fibrose typique de la NASH est appelé « fil de poulet », qui s’étend à la zone 3 et est une fibrose périsinusoïdale / péricellulaire 5,6. Cependant, il y a eu un manque d’études axées sur la structure 3D du foie natif, en particulier celles qui n’impliquent pas de section tissulaire. Des approches d’imagerie robustes pour identifier les modèles et les caractéristiques de la fibrose tout au long du remodelage ECM dynamique dans la fibrose hépatique renforceraient considérablement la compréhension des mécanismes de la NASH et identifieraient de nouvelles cibles thérapeutiques.
Pour relever ces défis, un protocole rapide et efficace a été optimisé pour imager l’ECM hépatique native via la décellularisation7. La décellularisation du foie entier est une approche permettant d’éliminer le contenu cellulaire hépatique tout en maintenant le réseau ECM 3D natif grâce à la perfusion de détergent. Les souris ont été nourries avec du chow ou un régime de restauration rapide (FFD) pendant 14 semaines. La décellularisation a été réalisée après perfusion in situ de la veine porte avec un détergent doux et de faibles débits pour préserver les structures de collagène fibrillaire triple hélicoïdale et native. La microscopie à deux photons a été appliquée pour analyser les changements dans les structures de collagène dans l’ECM. Les images 3D de la structure ECM native dans les foies normaux et NASH ont été reconstituées et analysées. La réalisation d’une décellularisation par perfusion in situ et l’analyse de l’échafaudage par microscopie à deux photons fournissent une plate-forme pratique et abordable pour visualiser le remodelage dynamique de l’ECM dans le foie.
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Protocol
Les expériences sur les animaux sont effectuées selon les procédures expérimentales approuvées par les comités institutionnels de soin et d’utilisation des animaux (IACUC) de l’Université de Stanford et de l’hôpital des anciens combattants de Palo Alto. Des souris C57BL/6J mâles âgées de 6 à 8 semaines ont été nourries avec du chow ou un régime de restauration rapide complété par du sirop de maïs à haute teneur en fructose à 4,2 % (voir le tableau des matières) dans de l’eau potable pendant 14 semaines5. Les souris ont été gardées dans des cages standard à un cycle obscurité/lumière de 12 h.
1. Préparation chirurgicale et procédures de perfusion hépatique
- Pesez la souris avant la procédure.
- Anesthésier la souris en administrant de la kétamine (90 mg/kg) et de la xylazine (10 mg/kg) (voir le tableau des matières) par injection intrapéritonéale. Assurez-vous que la souris est complètement anesthésiée par pincement des orteils avant de passer à l’étape suivante.
REMARQUE: L’isoflurane n’est pas nécessaire ici puisqu’il s’agit d’une chirurgie de non-survie. - Rasez la région ventrale à l’aide d’une tondeuse à cheveux et désinfectez la peau avec de l’éthanol à 70%. Placez la souris sur son dos et immobilisez les jambes sur la planche chirurgicale avec du ruban adhésif.
- Après avoir reconfirmé la profondeur de l’anesthésie par un pincement d’orteil, utilisez des ciseaux Mayo et des pinces Adson (voir le tableau des matériaux) pour faire une incision latérale de 3 cm dans le bas-ventre, puis une incision verticale de 5 cm du bas-ventre au processus xiphoïde. Veillez à ne pas ouvrir la cavité thoracique.
- Après avoir ouvert le péritoine, placez doucement les intestins à gauche de l’animal et élevez le lobe droit du foie à l’aide d’un applicateur à pointe de rayonne (voir le tableau des matériaux) pour exposer la veine porte.
- Cathétériser la veine porte à l’aide d’un cathéter IV de 24 G. Introduisez le cathéter dans l’extrémité distale de la veine porte. Placez l’embout du cathéter avant que la veine porte ne se ramifie dans les lobes hépatiques.
- Retirez l’aiguille immédiatement lorsque le cathéter pénètre dans la veine. Vérifiez que le cathéter est correctement positionné à l’intérieur de la veine en perfusant le foie avec du PBS à l’aide d’une seringue de 1 ml via le cathéter.
REMARQUE: Lors de la perfusion PBS, tous les lobes doivent immédiatement blanchir. Si le cathéter est correctement placé, le sang veineux circulera rapidement à travers le cathéter. - Utilisez des micro-pinces Dumont, un porte-micro-aiguille Castroviejo et une suture 4-0 (voir Tableau des matériaux) pour placer un point sous la ramification de la veine porte et un deuxième point 1 cm en dessous pour fixer le cathéter.
2. Décellularisation tissulaire
- Connectez le cathéter à un tube en silicone (~1 m de longueur, 3 mm de diamètre intérieur et 4,1 mm de diamètre extérieur) avec un connecteur Luer. Connectez le tube en silicone à une pompe péristaltique et à un réservoir contenant de l’eau désionisée (voir le tableau des matériaux).
- Retirez soigneusement les bulles d’air à l’intérieur du tube et évitez de générer de nouvelles bulles pendant la perfusion. Réglez la pompe péristaltique à un débit de 0,2 mL/min (c.-à-d. 288 mL/24 h).
- Perfuser d’abord avec de l’eau désionisée (~50 mL/souris) pendant 2 h. La couleur du foie passera du rouge au jaune pendant la perfusion.
NOTE: L’animal expirera après 10 minutes de perfusion. - Basculer la solution de perfusion vers du désoxycholate de sodium à 0,5 % (poids/vol) (COD, voir le tableau des matières) et continuer pendant la nuit (18 h, ~250 mL/souris). Le foie deviendra blanc à la fin de la perfusion (Figure 1).
- Basculer la solution de perfusion vers de l’eau désionisée (~50 mL/souris) et perfuser pendant 2 h.
- Utilisez des micro-pinces Dumont et des ciseaux à micro-ressorts (voir le tableau des matières) pour recueillir le foie décellularisé et le laver soigneusement dans une boîte de Petri avec du PBS.
- Couper le tissu décellularisé en petits morceaux pour une imagerie immédiate ou congeler à -80 °C pour une analyse biochimique plus approfondie telle que la spectrométrie de masse en tandem, ELISA ou Western blot.
3. Préparation des lames pour l’imagerie (avec un microscope à fluorescence multiphoton/confocale)
- Transférer un petit morceau de foie décellularisé (<3 x 3 x 3 mm) sur une lame de microscope et placer le tissu au milieu.
- Ajouter 10 μL de support de montage antidécoloration (voir le tableau des matériaux) au mouchoir à l’aide d’une pipette pour éviter le dessèchement des tissus.
- Couvrez le tissu avec un verre de couverture et appliquez une petite force pour aplatir l’échantillon. Scellez les bords du verre de couverture avec du vernis à ongles incolore et transparent (Figure 2).
REMARQUE: En raison du réglage des deux photons verticaux à travers le microscope, un verre de couverture a été utilisé sur l’échantillon. Cependant, les échantillons pourraient être placés différemment si un microscope inversé est utilisé.
4. Acquisition d’images
- Placez une goutte d’huile d’immersion sur le dessus du verre de couverture et placez la lame sur le support de lame du microscope. Abaissez la lentille d’objectif d’huile 20x jusqu’à ce qu’elle entre en contact avec l’huile d’immersion.
- Passez au canal violet (405 nm), allumez l’obturateur et concentrez-vous sur l’échantillon. Naviguez et positionnez la zone d’intérêt pour l’imagerie. Éteignez l’obturateur avant de passer à l’acquisition d’image à l’aide de la lumière laser.
- Passez à la commande de l’ordinateur et démarrez le laser à deux photons. Allumez d’abord le laser à deux photons (Figure 3A), puis le contrôleur laser à deux photons (voir Tableau des matériaux) et l’obturateur (Figure 3B,C). Assurez-vous que la puissance de sortie est supérieure à 2,5 W.
Réduisez la puissance du laser pour éviter la trempe de fluorescence. Sélectionnez et ajustez les détecteurs (photomultiplicateurs et hybrides) pour s’adapter aux fluorophores choisis.
REMARQUE: L’imagerie à deux photons a été réalisée à une longueur d’onde d’excitation de 860 nm. Deux canaux ont été sélectionnés pour les images de collagène SHG et de fluorescence excitée à deux photons (TPEF), respectivement. Un canal correspondant à la gamme de longueurs d’onde de 415-445 nm a détecté la structure détaillée du collagène à partir de signaux SHG. Un autre canal couvrait la gamme de 465-669 nm pour collecter les signaux TPEF. - Choisissez des acquisitions d’images simultanées ou séquentielles. Ajustez le trou d’épingle à la valeur la plus élevée. Ajustez les longueurs d’onde, le gain, la puissance et le décalage du laser. Ajustez le temps de séjour des pixels, la taille des pixels, la moyenne et le zoom (Figure 4A).
- Faites défiler le contrôleur z de l’ordinateur et définissez les dimensions z, définissez le début et les points de terminaison, et choisissez le nombre d’images données dans un volume (z-stack). Acquérir des images.
REMARQUE : Ici, un volume Z de 20 μm et une taille de pas Z de 1 μm ont été choisis (Figure 4B).
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Representative Results
Les fibres de collagène ont été détectées par deuxième génération d’harmoniques et microscopie à deux photons. Le signal provient des structures de collagène fibrillaire tricoïdale et hélicoïdale frangible. Des anticorps spécifiques n’ont pas été utilisés pour analyser les sous-types de collagène; Cependant, cela pourrait être ajouté à la technique d’imagerie.
Lorsque le tissu hépatique est étudié sans décellularisation, il est difficile d’obtenir des images haute résolution du réseau de collagène (Figure 5A). Dans l’ECM décellularisée, les fibres de collagène (vert) apparaissent parallèles ou entrelacées (Figure 5B). Il y avait des différences apparentes dans la morphologie et la distribution spatiale des composants ECM entre les foies Chow et FFD. Les fibres de collagène chez les souris suivant un régime chow présentaient un réseau entrelacé et bien organisé. Chez les souris sous FFD, cependant, des faisceaux de collagène ont été observés avec moins de connectivité (Figure 5B).
Pour étudier plus en détail la structure 3D de l’ECM hépatique, des images des tranches ont été capturées avec un volume Z (épaisseur) de 20 μm et 1 μm de taille Z-step. Les fibres de collagène chez les souris suivant un régime chow ont montré un réseau bien organisé, mais pas chez les souris sous FFD (Figure 6). Pour confirmer la qualité du collagène fibrillaire dans l’ECM décellularisée, les lames ont été fixées et incorporées dans de la paraffine et colorées avec de l’hématoxyline et de l’éosine (H & E) et du rouge Picrosirius (PSR) (voir le tableau des matériaux). H&E montre que toutes les cellules ont été supprimées. Le PSR est une technique histologique couramment utilisée pour mettre en évidence le collagène dans les coupes de tissus incorporés dans la paraffine (Figure 7).
Figure 1 : Foie de souris pendant la perfusion. Le foie devient blanc et semi-transparent à la fin de la perfusion. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Préparation des diapositives pour l’imagerie. Le tissu est recouvert d’un verre de couverture et une petite force est appliquée pour aplatir l’échantillon. Les bords du verre de couverture sont scellés avec du vernis à ongles incolore et transparent. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : Capture d’écran du logiciel laser à deux photons, démarrage du laser à deux photons. (A) Tout d’abord, le laser à deux photons est allumé. (B) (C) Le contrôleur laser à deux photons et l’obturateur sont allumés. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 4 : Capture d’écran du logiciel laser à deux photons lors de l’acquisition d’images. (A) Assurez-vous de régler le trou d’épingle sur la valeur la plus élevée (flèches rouges). Ajustez les longueurs d’onde, le gain, la puissance et le décalage du laser. Ajustez le temps d’arrêt des pixels, la taille des pixels, la moyenne et le zoom. (B) Réglez le volume Z à 20 μm et la taille du pas Z à 1 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 5 : ECM décellularisée imagée par microscopie à deux photons. (A) Images SHG de fibres de collagène provenant d’une tranche de foie de 6 μm (fraîchement congelée) sans décellularisation. (B) Les images SHG représentent un réseau de collagène bien organisé dans le foie de souris suivant un régime témoin normal. Réseau de collagène remodelé chez des souris suivant un régime de restauration rapide (FFD). Flèche, zone de fibrose. Star, réseau de collagène remodelé. Barre d’échelle = 100 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 6: Structure 3D du réseau de collagène hépatique. Les fibres de collagène chez les souris suivant le régime chow ont montré un réseau bien organisé, mais pas chez les souris de régime de restauration rapide (FFD). Les images ont été capturées avec un volume Z (épaisseur) de 20 μm et une taille de pas en Z de 1 μm. Barre d’échelle = 100 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 7 : Coloration à l’hématoxyline et à l’éosine (H&E) et au rouge Picrosirius (PSR) de l’ECM décellularisée. H&E montre que toutes les cellules ont été supprimées. Dans les images de coloration PSR, l’ECM des souris nourries au chow a révélé un réseau bien organisé, et en revanche, les souris suivant un régime de restauration rapide (FFD) ont montré des fibres de collagène plus denses. Volume Z (épaisseur) = 6 μm. Barre d’échelle = 100 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
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Discussion
Le protocole actuel montre que la décellularisation par perfusion in situ DOC à faible débit préserve les structures de collagène fibrillaire tricoïdale et hélicoïdale frangible, fournissant une plate-forme fiable et rentable pour capturer le remodelage dynamique de l’ECM dans la fibrose hépatique NASH. Bien que la décellularisation ait été réalisée dans des foies normaux et fibrotiques avant d’identifier les composants de l’ECM ou de générer des échafaudages biologiques pour la culture cellulaire, la dynamique du remodelage de l’ECM dans la fibrose hépatique n’a pas été bien étudiée 8,9,10. Cette méthode permet aux chercheurs d’établir des comparaisons entre divers modèles de fibrose.
Actuellement, il existe des variétés de protocoles de perfusion utilisant la DNase, le dodécylsulfate de sodium (SDS) ou le Triton X-10011. Le coût de DNase est élevé car de grands volumes de solutions sont nécessaires. SDS est une solution dénaturante sévère, un détergent anionique qui perturbe les membranes cellulaires et dénature les protéines. Par conséquent, préserver l’ensemble du réseau de collagène après la perfusion SDS est un défi. En revanche, le Triton X-100, en tant que détergent doux non dénaturant et non ionique, perturbe les interactions lipides-lipides et lipides-protéines et préserve les interactions protéine-protéine. Cependant, il a été rapporté que Triton X-100 perturbe les échafaudages ECM, rendant l’ECM hépatique décellularisé impropre à une analyse plus approfondie par spectrométriede masse 11.
Le protocole de perfusion avec DOC a été modifié par rapport aux travaux précédents7, démontrant une meilleure préservation des structures de collagène fibrillaire triple hélicoïdale et native dans la plupart des tissus. Le réseau de collagène a été étudié par microscopie de deuxième génération harmonique (SHG) sans anticorps, reflétant les structures de collagène fibrillaire triple hélicoïdale et native. L’ECM hépatique décellularisée de souris FFD a également été testée, et les changements structurels de la NASH ont été confirmés.
Les étapes les plus critiques du protocole sont la mise en place du cathéter et la mise en place du système de perfusion. Le cathétérisme de la veine porte est vital, mais la veine cave inférieure pourrait également être utilisée si la veine porte est endommagée. Les bulles dans le tampon et les tubes doivent être évitées car elles affectent la perfusion. Comme un microscope droit à deux photons a été utilisé, la taille de l’échantillon était limitée. Cela peut être modifié si un microscope inversé doit être utilisé.
Il y a un intérêt croissant pour l’ECM remodelé dans les maladies chroniques du foie et l’hépatocarcinogenèse12,13,14. Des échafaudages ECM décellularisés ont été utilisés dans la réparation chirurgicale et la médecine régénérative comme matériau d’échafaudage biologique approprié15,16,17. Cependant, ce processus de décellularisation légère a également des limites, car certains composants cellulaires tels que l’ADN ou les restes lipidiques peuvent ne pas être entièrement éliminés. Un temps de perfusion de COD plus long et une augmentation du débit peuvent aider à obtenir des échafaudages décellularisés ultra-purifiés. L’ajout de DNase dans la solution de lavage après la perfusion de DOC peut également aider à éliminer l’ADN. Le protocole peut être ajusté pour les biopsies hépatiques humaines, améliorant ainsi la compréhension des altérations de l’ECM au cours de la progression de la NASH.
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Disclosures
Les auteurs déclarent qu’il n’y a pas de conflits d’intérêts concernant cet article.
Acknowledgments
Nous remercions Hyesuk Park pour l’aide technique. Cette recherche a été financée par le National Institute of Diabetes and Digestive and Kidney Diseases (NIDDK), le NIH (R01 2DK083283, au NJT), le National Institute on Aging (NIA), NIH (1R01AG060726, au NJT). Nous remercions Jon Mulholland et Kitty Lee du Cell Sciences Imaging Facility du Centre Beckman pour leur assistance technique dans l’imagerie par microscopie à deux photons.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4-0 MONOCRYL UNDYED 1 x 18" P-3 | MONOCRYL | Y494G | |
| 4-0 suture | fisher scientific | 10-000-649 | https://www.fishersci.com/shop/products/monomid-nylon-non-absorbable-sutures-7/10000649?keyword=true |
| AnaSed Injection (xylazine) | AnaSed | NDC 59399-110-20 | this drug to use by or on the order of a licensed veterinarian. |
| BD INSYTE AUTOGUARD I.V. CATHETER WITH BC TECHNOLOGY | BD | 382612 | |
| Chow diet | Envigo | # 2918 | Control diet. A fixed formula, non-autoclavable diet manufactured with high quality ingredients and designed to support gestation, lactation, and growth of rodents. |
| Fast-food diet (AIN76A Western Diet) | Test Diet | 1810060 | https://www.testdiet.com/cs/groups/lolweb/@testdiet/documents/web_content/mdrf/mdux/~edisp/ducm04_051601.pdf |
| Hematoxylin and Eosin Stain Kit | vectorlabs | H-3502 | https://vectorlabs.com/hematoxylin-and-eosin-stain-kit.html |
| Kent Scientific Rat Surgical Kit | fisher scientific | 13-005-205 | https://www.fishersci.com/shop/products/rat-surgical-kit/13005205#?keyword=mouse%20surgery%20kit |
| KETAMINE HYDROCHLORIDE INJECTION | Vedco | NDC 50989-996-06 - 10 mL - vial. | KetaVed has been clinically studied in subhuman primates in addition to those species listed under Administration and Dosage. |
| Leica SP5 upright Confocal, multi-photon | Leica | SP5 | |
| Luer connector (Three-way stopcock with SPIN-LOCK®) | bbraun | D300 | https://www.bbraunusa.com/en/products/b0/three-way-stopcockwithspin-lock.html |
| Picrosirius Red Stain Kit | Polysciences, Inc. | 24901 | https://www.polysciences.com/default/picrosirius-red-stain-kit-40771 |
| Rayon tipped applicator | puritan | 25-806 1PR | |
| Sodium deoxycholate | sigmaaldrich | D6750-100G | |
| Syrup | www.target.com | 24 fl oz | https://www.target.com/p/pancake-syrup-24-fl-oz-market-pantry-8482/-/A-13007801 |
| Variable Speed Peristaltic Pump | INTLLAB | BT100 | https://www.amazon.com/gp/product/B082K97W5W/ref=ox_sc_saved_title_2?smid=A12NUUP87ZRRAR&psc=1 |
| VECTASHIELD Antifade Mounting Medium | vectorlabs | H-1000-10 | https://vectorlabs.com/vectashield-mounting-medium.html |
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