Summary
El presente protocolo optimiza los métodos de perfusión/descelularización in situ hepática y microscopía de dos fotones para establecer una plataforma confiable para visualizar la dinámica de la remodelación de la matriz extracelular (MEC) durante la esteatohepatitis no alcohólica (EHNA).
Abstract
La esteatohepatitis no alcohólica (EHNA) es la enfermedad hepática crónica más común en los Estados Unidos, que afecta a más de 70 millones de estadounidenses. NASH puede progresar a fibrosis y, finalmente, a cirrosis, un factor de riesgo significativo para el carcinoma hepatocelular. La matriz extracelular (ECM) proporciona soporte estructural y mantiene la homeostasis hepática a través de señales matricelulares. La fibrosis hepática es el resultado de un desequilibrio en el proceso dinámico de remodelación de la ECM y se caracteriza por una acumulación excesiva de elementos estructurales y cambios asociados en los glicosaminoglicanos. El patrón de fibrosis típico de NASH se llama "alambre de pollo", que generalmente consiste en fibrosis perisinusoidal/pericelular de zona 3, según las características observadas por la tinción tricrómica de Masson y las tinciones de rojo de Picrosirius. Sin embargo, estas técnicas tradicionales de imágenes bidimensionales delgadas (2D) basadas en diapositivas de tejido no pueden demostrar los cambios estructurales detallados de ECM tridimensional (3D), lo que limita la comprensión de la remodelación dinámica de ECM en la fibrosis hepática.
El trabajo actual optimizó un protocolo rápido y eficiente para obtener imágenes de la estructura nativa de ECM en el hígado a través de la descelularización para abordar los desafíos anteriores. Los ratones fueron alimentados con comida o dieta de comida rápida durante 14 semanas. La descelularización se realizó después de la perfusión de la vena porta in situ , y las técnicas de microscopía de dos fotones se aplicaron para obtener imágenes y analizar los cambios en la ECM nativa. Las imágenes 3D de los hígados normal y NASH fueron reconstituidas y analizadas. La realización de la descelularización de perfusión in situ y el análisis del andamio mediante microscopía de dos fotones proporcionaron una plataforma práctica y confiable para visualizar la remodelación dinámica de ECM en el hígado.
Introduction
La enfermedad del hígado graso no alcohólico (NAFLD) es la enfermedad hepática más común, que afecta al 20% -25% de la población adulta. El 25% de los pacientes con NAFLD progresan a esteatohepatitis no alcohólica (NASH), donde el riesgo de cirrosis, insuficiencia hepática y carcinoma hepatocelular aumenta1. En los próximos 20 años, se estima que NASH representará 2 millones de muertes relacionadas con el hígado en EE.UU.2. Como no existen tratamientos aprobados, existe una necesidad urgente de descifrar los mecanismos que causan fibrosis hepática en pacientes con EHNA y desarrollar un tratamiento dirigido3.
La matriz extracelular (MEC) es un microambiente dinámico y complejo que ejerce comunicación bidireccional con las células para regular la homeostasis tisular4. La ECM hepática está compuesta por elementos estructurales como proteoglicanos, colágenos, fibronectina, elastina y otras proteínas no estructurales (por ejemplo, olfactomedina y trombospondina) para proporcionar soporte físico y estructural4.
La fibrosis hepática es una respuesta crónica de cicatrización de heridas al daño hepático de diversas etiologías, incluida la EHNA3. Es el resultado de un desequilibrio en el proceso dinámico de remodelación de la matriz ECM y se caracteriza por un exceso de proteínas estructurales en el hígado lesionado4. La fibrogénesis depende de la comunicación dinámica célula-célula entre los diferentes tipos de células hepáticas. Las células estrelladas hepáticas (HSC), cuando se activan, se diferencian en células similares a miofibroblastos que expresan actina, migran y proliferan en músculo liso alfa 2 y sintetizan proteínas ECM como una acción de cierre de heridas. Las HSC activadas son las células productoras de colágeno central en el hígado1.
El mecanismo molecular de la remodelación de la ECM, los patrones de fibrosis y su relación con los eventos celulares no están claros. Todavía se necesita una mejor comprensión de la estructura tridimensional (3D) de la ECM, a pesar de que las técnicas de espectrometría de masas han ayudado a analizar la composición de la proteína ECM4. Tradicionalmente, la tinción tricrómica de Masson, las tinciones de rojo Picro Sirius y las imágenes de segunda generación armónica (SHG) se han realizado en secciones delgadas del hígado bidimensionales (2D). El patrón típico de fibrosis de NASH se llama "alambre de gallina", que se extiende a la zona 3 y es fibrosis perisinusoidal/pericelular 5,6. Sin embargo, ha habido una falta de estudios centrados en la estructura 3D del hígado nativo, particularmente aquellos que no implican la sección de tejido. Los enfoques de imagen robustos para identificar patrones y características de la fibrosis a través de la remodelación dinámica de la ECM en la fibrosis hepática fortalecerían significativamente la comprensión de los mecanismos de NASH e identificarían nuevos objetivos terapéuticos.
Para abordar estos desafíos, se optimizó un protocolo rápido y eficiente para obtener imágenes de la ECM hepática nativa a través de la descelularización7. La descelularización de todo el hígado es un enfoque para eliminar el contenido celular hepático mientras se mantiene la red 3D ECM nativa a través de la perfusión detergente. Los ratones fueron alimentados con comida o dieta de comida rápida (FFD) durante 14 semanas. La descelularización se realizó después de la perfusión in situ de la vena porta con detergente suave y bajas tasas de flujo para preservar las estructuras de colágeno fibrilar triple helicoidal y nativas. Se aplicó microscopía de dos fotones para analizar los cambios en las estructuras de colágeno en la ECM. Se reconstituyeron y analizaron las imágenes 3D de la estructura nativa de ECM en hígados normales y NASH. Realizar la descelularización de perfusión in situ y analizar el andamio mediante microscopía de dos fotones proporciona una plataforma práctica y asequible para visualizar la remodelación dinámica de ECM en el hígado.
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Protocol
Los experimentos con animales se realizan de acuerdo con los procedimientos experimentales aprobados por los comités institucionales de cuidado y uso de animales (IACUC) de la Universidad de Stanford y el Hospital de Asuntos de Veteranos en Palo Alto. Los ratones machos C57BL / 6J de 6-8 semanas de edad fueron alimentados con comida rápida o una dieta de comida rápida suplementada con jarabe de maíz con alto contenido de fructosa al 4,2% (consulte la Tabla de materiales) en agua potable durante 14 semanas5. Los ratones se mantuvieron en jaulas estándar en un ciclo de oscuridad / luz de 12 h.
1. Preparación quirúrgica y procedimientos de perfusión hepática
- Pese el ratón antes del procedimiento.
- Anestesiar al ratón administrando ketamina (90 mg/kg) y xilazina (10 mg/kg) (ver Tabla de materiales) mediante una inyección intraperitoneal. Asegúrese de que el ratón esté completamente anestesiado pellizcando los dedos de los pies antes de continuar con el siguiente paso.
NOTA: El isoflurano no es necesario aquí ya que esta es una cirugía de no supervivencia. - Afeite el área ventral con un cortapelos y desinfecte la piel con etanol al 70%. Coloque el ratón en su espalda e inmovilice las patas en la tabla quirúrgica con cinta adhesiva.
- Después de reconfirmar la profundidad de la anestesia con un pellizco en el dedo del pie, usa unas tijeras Mayo y fórceps Adson (consulta la Tabla de materiales) para hacer una incisión lateral de 3 cm en la parte inferior del abdomen y luego una incisión vertical de 5 cm desde la parte baja del abdomen hasta la apófisis xifoidea. Tenga cuidado de no abrir la cavidad torácica.
- Después de abrir el peritoneo, coloque suavemente los intestinos a la izquierda del animal y eleve el lóbulo derecho del hígado con un aplicador con punta de rayón (consulte la Tabla de materiales) para exponer la vena porta.
- Cateterizar la vena porta con un catéter IV de 24 G. Introduzca el catéter en el extremo distal de la vena porta. Coloque la punta del catéter antes de que la vena porta se ramifique hacia los lóbulos hepáticos.
- Extraiga la aguja inmediatamente cuando el catéter entre en la vena. Verifique que el catéter esté colocado correctamente dentro de la vena perfundiendo el hígado con PBS usando una jeringa de 1 ml a través del catéter.
NOTA: Tras la perfusión de PBS, todos los lóbulos deben blanquearse inmediatamente. Si el catéter está colocado correctamente, la sangre venosa fluirá rápidamente a través del catéter. - Use microfórceps Dumont, un soporte para microagujas Castroviejo y sutura 4-0 (consulte la Tabla de materiales) para colocar una sutura debajo de la ramificación de la vena porta y una segunda puntada 1 cm más abajo para asegurar el catéter.
2. Descelularización tisular
- Conecte el catéter a un tubo de silicona (~1 m de longitud, 3 mm de diámetro interior y 4,1 mm de diámetro exterior) con un conector Luer. Conecte el tubo de silicona a una bomba peristáltica y a un depósito que contenga agua desionizada (consulte la Tabla de materiales).
- Retire con cuidado las burbujas de aire dentro del tubo y evite generar nuevas burbujas durante la perfusión. Ajuste la bomba peristáltica a una salida de flujo de 0,2 ml/min (es decir, 288 ml/24 h).
- Perfundir primero con agua desionizada (~50 mL/ratón) durante 2 h. El color del hígado cambiará de rojo a amarillo durante la perfusión.
NOTA: El animal caducará después de 10 minutos de perfusión. - Cambie la solución de perfusión a desoxicolato de sodio al 0,5% (peso / vol) (DOC, consulte la Tabla de materiales) y continúe durante la noche (18 h, ~ 250 ml / ratón). El hígado se volverá blanco al final de la perfusión (Figura 1).
- Cambie la solución de perfusión a agua desionizada (~ 50 ml / ratón) y perfunda durante 2 h.
- Use microfórceps Dumont y tijeras de microresorte (consulte la Tabla de materiales) para recoger el hígado descelularizado y lávelo cuidadosamente en una placa de Petri con PBS.
- Cortar el tejido descelularizado en trozos pequeños para obtener imágenes inmediatas o congelarlo a -80 °C para un análisis bioquímico adicional, como espectrometría de masas en tándem, ELISA o western blot.
3. Preparación del portaobjetos para la obtención de imágenes (con un microscopio de fluorescencia multifotón/confocal)
- Transfiera un pequeño trozo de hígado descelularizado (<3 x 3 x 3 mm) a un portaobjetos de microscopio y coloque el tejido en el medio.
- Añadir 10 μL de medio de montaje antidecoloración (ver Tabla de materiales) al tejido con una pipeta para evitar que el tejido se seque.
- Cubra el pañuelo con un vaso de cobertura y aplique una pequeña fuerza para aplanar la muestra. Selle los bordes del vidrio de la cubierta con esmalte de uñas incoloro y transparente (Figura 2).
NOTA: Debido a la colocación de los dos fotones verticales a través del microscopio, se utilizó un vidrio de cubierta en la muestra. Sin embargo, las muestras podrían colocarse de manera diferente si se utiliza un microscopio invertido.
4. Adquisición de imágenes
- Coloque una gota de aceite de inmersión en la parte superior del vidrio de la cubierta y coloque el portaobjetos en el portaobjetos del microscopio. Baje la lente del objetivo de aceite 20x hasta que entre en contacto con el aceite de inmersión.
- Cambie al canal violeta (405 nm), encienda el obturador y enfoque la muestra. Navegue y posicione el área de interés para la obtención de imágenes. Apague el obturador antes de pasar a la adquisición de imágenes mediante luz láser.
- Cambie al control de la computadora e inicie el láser de dos fotones. Encienda primero el láser de dos fotones (Figura 3A), luego encienda el controlador láser de dos fotones (consulte Tabla de materiales) y el obturador (Figura 3B, C). Asegúrese de que la potencia de salida sea superior a 2,5 W.
Reduzca la potencia del láser para evitar el enfriamiento de la fluorescencia. Seleccione y ajuste los detectores (tanto fotomultiplicadores como híbridos) para acomodar los fluoróforos elegidos.
NOTA: Las imágenes de dos fotones se realizaron a una longitud de onda de excitación de 860 nm. Se seleccionaron dos canales para las imágenes de colágeno SHG y fluorescencia excitada de dos fotones (TPEF), respectivamente. Un canal correspondiente al rango de longitud de onda de 415-445 nm detectó la estructura detallada del colágeno a partir de señales SHG. Otro canal cubrió el rango de 465-669 nm para recoger señales TPEF. - Elija adquisiciones de imágenes simultáneas o secuenciales. Ajuste el agujero de alfiler al valor más alto. Ajuste las longitudes de onda del láser, la ganancia, la potencia y el desplazamiento. Ajuste el tiempo de permanencia de los píxeles, el tamaño de píxel, el promedio y el zoom (Figura 4A).
- Desplácese por el controlador z de la computadora y establezca las dimensiones z, defina los puntos inicial y final, y elija el número de imágenes dadas dentro de un volumen (pila z). Adquirir imágenes.
NOTA: Aquí, se eligió un volumen Z de 20 μm y un tamaño de paso Z de 1 μm (Figura 4B).
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Representative Results
Las fibras de colágeno se detectaron con segunda generación armónica y microscopía de dos fotones. La señal proviene de las estructuras frangibles de colágeno fibrilar triple helicoidal y nativas. No se utilizaron anticuerpos específicos para analizar los subtipos de colágeno; Sin embargo, esto podría agregarse a la técnica de imagen.
Cuando se estudia el tejido hepático sin descelularización, es difícil obtener imágenes de alta resolución de la red de colágeno (Figura 5A). En la ECM descelularizada, las fibras de colágeno (verde) aparecen paralelas o entrelazadas (Figura 5B). Hubo diferencias aparentes en la morfología y distribución espacial de los componentes de la ECM entre los hígados Chow y FFD. Las fibras de colágeno en ratones con una dieta de comida exhibieron una red entretejida y bien organizada. En ratones con FFD, sin embargo, se observaron haces de colágeno con menos conectividad (Figura 5B).
Para estudiar más a fondo la estructura 3D de la ECM hepática, se capturaron imágenes de los cortes con un volumen Z (espesor) de 20 μm y 1 μm de tamaño de paso Z. Las fibras de colágeno en ratones con dieta de comida mostraron una red bien organizada, pero no en los ratones con FFD (Figura 6). Para confirmar la calidad del colágeno fibrilar en la ECM descelularizada, los portaobjetos se fijaron e incrustaron en parafina y se tiñeron con hematoxilina y eosina (H&E) y rojo Picrosirius (PSR) (ver Tabla de materiales). H&E muestra que todas las células han sido eliminadas. La PSR es una técnica histológica comúnmente utilizada para resaltar el colágeno en secciones de tejido incrustado en parafina (Figura 7).
Figura 1: Hígado de ratón durante la perfusión. El hígado se vuelve blanco y semitransparente al final de la perfusión. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Preparación de diapositivas para imágenes. El tejido se cubre con un vidrio de cubierta y se aplica una pequeña fuerza para aplanar la muestra. Los bordes del vidrio de la cubierta están sellados con esmalte de uñas incoloro y transparente. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Captura de pantalla del software láser de dos fotones, iniciando el láser de dos fotones. (A) Primero, se enciende el láser de dos fotones. (B) (C) El controlador láser de dos fotones y el obturador están encendidos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Captura de pantalla del software láser de dos fotones durante la adquisición de imágenes. (A) Asegúrese de establecer el agujero de alfiler en el valor más alto (flechas rojas). Ajuste las longitudes de onda del láser, la ganancia, la potencia y el desplazamiento. Ajuste el tiempo de permanencia de los píxeles, el tamaño del píxel, el promedio y el zoom. (B) Ajuste el volumen Z a 20 μm y el tamaño del paso Z a 1 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: ECM descelularizada con microscopía de dos fotones . (A) Imágenes SHG de fibras de colágeno de una rebanada de hígado de 6 μm (fresca congelada) sin descelularización. (B) Las imágenes de SHG muestran una red de colágeno bien organizada en hígados de ratones con control normal, dieta chow. Red de colágeno remodelada en ratones con dieta de comida rápida (FFD). Flecha, área de fibrosis. Estrella, red de colágeno remodelada. Barra de escala = 100 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 6: Estructura 3D de la red de colágeno hepático. Las fibras de colágeno en ratones en la dieta chow mostraron una red bien organizada, pero no en ratones de dieta de comida rápida (FFD). Las imágenes fueron capturadas con un volumen Z de 20 μm (espesor) y un tamaño de paso Z de 1 μm. Barra de escala = 100 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 7: Tinción de hematoxilina y eosina (H&E) y rojo de Picrosirius (PSR) de la ECM descelularizada. H&E muestra que todas las células han sido eliminadas. En las imágenes de tinción de PSR, la ECM de los ratones alimentados con comida reveló una red bien organizada y, en contraste, los ratones con dieta de comida rápida (FFD) mostraron fibras de colágeno más densas. Volumen Z (espesor) = 6 μm. Barra de escala = 100 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
El presente protocolo muestra que la descelularización a través de una perfusión in situ DOC de bajo caudal preserva las estructuras frangibles de colágeno fibrilar de triple hélice y nativas, proporcionando una plataforma confiable y rentable para capturar la remodelación dinámica de la ECM en la fibrosis hepática NASH. Aunque la descelularización se realizó en hígados normales y fibróticos antes de identificar componentes de la MCE o generar andamios biológicos para cultivo celular, la dinámica de la remodelación de la MEC en la fibrosis hepática no ha sido bien estudiada 8,9,10. Este método permite a los investigadores hacer comparaciones entre varios modelos de fibrosis.
Actualmente, existen variedades de protocolos de perfusión que utilizan DNasa, dodecil sulfato de sodio (SDS) o Triton X-10011. El costo de DNase es alto porque se requieren grandes volúmenes de soluciones. SDS es una solución desnaturalizante dura, un detergente aniónico que interrumpe las membranas celulares y desnaturaliza las proteínas. Por lo tanto, preservar toda la red de colágeno después de la perfusión SDS es un desafío. En contraste, Triton X-100, como un detergente suave no desnaturalizante y no iónico, interrumpe las interacciones lípido-lípido y lípido-proteína y preserva las interacciones proteína-proteína. Sin embargo, se ha informado que Triton X-100 perturba los andamios de ECM, haciendo que la ECM hepática descelularizada no sea adecuada para un análisis adicional de espectrometría de masas11.
El protocolo de perfusión con DOC fue modificado a partir del trabajo anterior7, demostrando una mejor preservación de las estructuras de colágeno fibrilar de triple hélice y nativas en la mayoría de los tejidos. La red de colágeno se estudió con microscopía de segunda generación armónica (SHG) sin anticuerpos, reflejando las estructuras de colágeno fibrilar de triple hélice y nativas. También se probó la ECM hepática descelularizada de ratones FFD, y se confirmaron cambios estructurales en NASH.
Los pasos más críticos en el protocolo son la colocación del catéter y la configuración del sistema de perfusión. El cateterismo de la vena porta es vital, pero la vena cava inferior también podría usarse si la vena porta está dañada. Las burbujas en el tampón y los tubos deben evitarse porque afectan la perfusión. Debido a que se utilizó un microscopio vertical de dos fotones, el tamaño de la muestra fue limitado. Esto se puede modificar si se va a utilizar un microscopio invertido.
Existe un creciente interés en la REMODELACIÓN de la MEC en enfermedades hepáticas crónicas y hepatocarcinogénesis12,13,14. Los andamios ECM descelularizados se han empleado en reparación quirúrgica y medicina regenerativa como material de andamio biológico apropiado15,16,17. Sin embargo, este proceso leve de descelularización también tiene limitaciones, ya que algunos componentes celulares como el ADN o los restos de lípidos pueden no eliminarse por completo. Un mayor tiempo de perfusión DOC y un aumento en el caudal pueden ayudar a obtener andamios descelularizados ultrapurificados. Agregar DNasa a la solución de lavado después de la perfusión DOC también puede ayudar a eliminar el ADN. El protocolo se puede ajustar para biopsias hepáticas humanas, mejorando así la comprensión de las alteraciones de la ECM durante la progresión de la EHNA.
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Disclosures
Los autores declaran que no hay conflictos de intereses con respecto a este artículo.
Acknowledgments
Agradecemos a Hyesuk Park por la ayuda técnica. Esta investigación fue apoyada por fondos del Instituto Nacional de Diabetes y Enfermedades Digestivas y Renales (NIDDK), NIH (R01 2DK083283, a NJT), el Instituto Nacional sobre el Envejecimiento (NIA), NIH (1R01AG060726, a NJT). Agradecemos a Jon Mulholland y Kitty Lee del Centro de Imágenes de Ciencias Celulares en el Centro Beckman por su asistencia técnica con las imágenes de microscopía de dos fotones.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4-0 MONOCRYL UNDYED 1 x 18" P-3 | MONOCRYL | Y494G | |
| 4-0 suture | fisher scientific | 10-000-649 | https://www.fishersci.com/shop/products/monomid-nylon-non-absorbable-sutures-7/10000649?keyword=true |
| AnaSed Injection (xylazine) | AnaSed | NDC 59399-110-20 | this drug to use by or on the order of a licensed veterinarian. |
| BD INSYTE AUTOGUARD I.V. CATHETER WITH BC TECHNOLOGY | BD | 382612 | |
| Chow diet | Envigo | # 2918 | Control diet. A fixed formula, non-autoclavable diet manufactured with high quality ingredients and designed to support gestation, lactation, and growth of rodents. |
| Fast-food diet (AIN76A Western Diet) | Test Diet | 1810060 | https://www.testdiet.com/cs/groups/lolweb/@testdiet/documents/web_content/mdrf/mdux/~edisp/ducm04_051601.pdf |
| Hematoxylin and Eosin Stain Kit | vectorlabs | H-3502 | https://vectorlabs.com/hematoxylin-and-eosin-stain-kit.html |
| Kent Scientific Rat Surgical Kit | fisher scientific | 13-005-205 | https://www.fishersci.com/shop/products/rat-surgical-kit/13005205#?keyword=mouse%20surgery%20kit |
| KETAMINE HYDROCHLORIDE INJECTION | Vedco | NDC 50989-996-06 - 10 mL - vial. | KetaVed has been clinically studied in subhuman primates in addition to those species listed under Administration and Dosage. |
| Leica SP5 upright Confocal, multi-photon | Leica | SP5 | |
| Luer connector (Three-way stopcock with SPIN-LOCK®) | bbraun | D300 | https://www.bbraunusa.com/en/products/b0/three-way-stopcockwithspin-lock.html |
| Picrosirius Red Stain Kit | Polysciences, Inc. | 24901 | https://www.polysciences.com/default/picrosirius-red-stain-kit-40771 |
| Rayon tipped applicator | puritan | 25-806 1PR | |
| Sodium deoxycholate | sigmaaldrich | D6750-100G | |
| Syrup | www.target.com | 24 fl oz | https://www.target.com/p/pancake-syrup-24-fl-oz-market-pantry-8482/-/A-13007801 |
| Variable Speed Peristaltic Pump | INTLLAB | BT100 | https://www.amazon.com/gp/product/B082K97W5W/ref=ox_sc_saved_title_2?smid=A12NUUP87ZRRAR&psc=1 |
| VECTASHIELD Antifade Mounting Medium | vectorlabs | H-1000-10 | https://vectorlabs.com/vectashield-mounting-medium.html |
References
- Friedman, S. L., Pinzani, M. Hepatic fibrosis: 2022 unmet needs and a blueprint for the future. Hepatology. 75 (2), 473-488 (2021).
- Ye, Q., et al. Global prevalence, incidence, and outcomes of non-obese or lean non-alcoholic fatty liver disease: A systematic review and meta-analysis. The Lancet Gastroenterology and Hepatology. 5 (8), 739-752 (2020).
- Schwabe, R. F., Tabas, I., Pajvani, U. B. Mechanisms of fibrosis development in non-alcoholic steatohepatitis. Gastroenterology. 158 (7), 1913-1928 (2020).
- Arteel, G. E., Naba, A. The liver matrisome - looking beyond collagens. JHEP Reports. 2 (4), 100115 (2020).
- Jiang, J. X., et al. Nonphagocytic activation of NOX2 is implicated in progressive non-alcoholic steatohepatitis during aging. Hepatology. 72 (4), 1204-1218 (2020).
- Dehnad, A., et al. AGER1 downregulation associates with fibrosis in non-alcoholic steatohepatitis and type 2 diabetes. Journal of Clinical Investigation. 130 (8), 4320-4330 (2020).
- Mayorca-Guiliani, A. E., et al. Decellularization and antibody staining of mouse tissues to map native extracellular matrix structures in 3D. Nature Protocols. 14 (12), 3395-3425 (2019).
- Mazza, G., et al. Cirrhotic human liver extracellular matrix 3D scaffolds promote smad-dependent tgf-beta1 epithelial mesenchymal transition. Cells. 9 (1), 83 (2019).
- Klaas, M., et al. The alterations in the extracellular matrix composition guide the repair of damaged liver tissue. Scientific Reports. 6, 27398 (2016).
- Mattei, G., et al. Mechanostructure and composition of highly reproducible decellularized liver matrices. Acta Biomaterialia. 10 (2), 875-882 (2014).
- Ren, H., et al. Evaluation of two decellularization methods in the development of a whole-organ decellularized rat liver scaffold. Liver International. 33 (3), 448-458 (2013).
- Piersma, B., Hayward, M. K., Weaver, V. M. Fibrosis and cancer: A strained relationship. Biochimica et Biophysica Acta - Reviews on Cancer. 1873 (2), 188356 (2020).
- Cox, T. R.
- Mirdamadi, E. S., Kalhori, D., Zakeri, N., Azarpira, N., Solati-Hashjin, M. Liver tissue engineering as an emerging alternative for liver disease treatment. Tissue Engineering Part B: Reviews. 26 (2), 145-163 (2020).
- Mazza, G., et al. Decellularized human liver as a natural 3D-scaffold for liver bioengineering and transplantation. Scientific Reports. 5, 13079 (2015).
- Jia, Z., et al. 3D culture system for liver tissue mimicking hepatic plates for improvement of human hepatocyte (C3A) function and polarity. BioMed Research International. 2020, 6354183 (2020).
- Shimoda, H., et al. Decellularized liver scaffolds promote liver regeneration after partial hepatectomy. Scientific Reports. 9 (1), 12543 (2019).
