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JoVE Journal Genetics
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Genetics

细菌种群中分层基因型和辅助基因组位点的启发式挖掘

Published: December 7, 2021 doi: 10.3791/63115
Automatic Translation
*1, *2,3, 2,3
1Department of Computer Science and Engineering, University of Nebraska-Lincoln, 2Department of Food Science and Technology, University of Nebraska-Lincoln, 3Nebraska Food for Health Center, University of Nebraska-Lincoln
* These authors contributed equally

Summary

该分析计算平台为对细菌种群基因组学感兴趣的微生物学家，生态学家和流行病学家提供实用指导。具体而言，这里介绍的工作展示了如何执行：i）分层基因型的系统发育指导映射;ii）基于频率的基因型分析;iii） 亲属关系和克隆性分析;iv）识别谱系分化附属位点。

Abstract

常规和系统地使用细菌全基因组测序（WGS）正在提高公共卫生实验室和监管机构开展的流行病学调查的准确性和分辨率。大量公开可用的WGS数据可用于大规模研究致病人群。最近，一个名为ProkEvo的免费计算平台被发布，以使用细菌WGS数据实现可重复，自动化和可扩展的基于分层的群体基因组分析。ProkEvo的这种实施证明了将种群的标准基因型图谱与挖掘辅助基因组内容以进行生态推断相结合的重要性。特别是，这里强调的工作使用ProkEvo派生的输出，使用R编程语言进行人口规模的分层分析。主要目标是通过展示如何：i）使用系统发育指导的分层基因型图谱;（ii）使用系统发育指导的分层基因型图谱;（iii）使用系统发育指导的分级基因型图谱图;（iii）使用分级基因型图ii）评估基因型的频率分布，作为生态适应性的代理;iii）使用特定的基因型分类确定亲属关系和遗传多样性;和iv）地图谱系区分附属位点。为了增强可重复性和可移植性，使用R markdown文件来演示整个分析方法。示例数据集包含来自 2，365 个人畜共患食源性病原体 纽波特沙门氏菌 分离株的基因组数据。分层基因型（血清->BAPS1 ->ST -> cgMLST）的系统发育锚定图揭示了群体遗传结构，突出了序列类型（STs）作为区分基因型的基石。在三个最主要的谱系中，ST5和ST118比高克隆的ST45系统型更晚地共享一个共同的祖先。基于ST的差异进一步突出了辅助抗菌素耐药性（AMR）位点的分布。最后，使用系统发育锚定的可视化来结合分层基因型和AMR内容，以揭示亲缘结构和谱系特异性基因组特征。综合起来，这种分析方法为使用泛基因组信息进行启发式细菌群体基因组分析提供了一些指导。

Introduction

公共卫生实验室和监管机构越来越多地使用细菌全基因组测序（WGS）作为常规监测和流行病学调查的基础，大大加强了病原体疫情调查1，2，3，4。因此，大量去识别的WGS数据现已公开，可用于以前所未有的规模研究致病物种的种群生物学的各个方面，包括基于以下方面的研究：多个储层，地理区域和环境类型的种群结构，基因型频率和基因/等位基因频率5.最常用的WGS引导的流行病学调查基于仅使用共享核心基因组内容的分析，其中共享（保守）内容仅用于基因型分类（例如，变异呼叫），这些变异成为流行病学分析和追踪的基础1，2，6，7.通常，基于细菌核心基因组的基因分型是使用7到几千个位点8，9，10的多位点序列分型（MLST）方法进行的。这些基于MLST的策略包括将预组装或组装的基因组序列映射到高度策划的数据库，从而将等位基因信息组合成可重复的基因型单元，用于流行病学和生态学分析11，12。例如，这种基于MLST的分类可以在两个分辨率水平上生成基因型信息：较低级别的序列类型（ST）或ST谱系（7个位点），以及更高级别的核心基因组MLST（cgMLST）变体（〜300-3，000个位点）10。

基于MLST的基因型分类在实验室之间具有可计算性和高度可重复性，使其被广泛接受为细菌物种水平13，14以下的精确亚型方法。然而，细菌种群的结构具有物种特异性的不同程度的克隆性（即基因型同质性），基因型之间等级亲缘关系的复杂模式15，16，17，以及辅助基因组内容分布的广泛差异18，19.因此，一种更全面的方法超越了离散分类，进入了MLST基因型，并结合了不同分辨率下基因型的层次结构关系，以及将辅助基因组内容映射到基因型分类上，这有助于基于人群的推断18，20，21.此外，分析还可以集中在偶异相关基因型21，22中辅助基因组位点的共同遗传模式上。总体而言，组合方法能够对种群结构与地理空间或环境梯度中特定基因组组成（例如，位点）的分布之间的关系进行不可知论的询问。这种方法可以产生关于特定种群生态特征的基本和实用信息，这些信息反过来又可以解释它们在水库（如食用动物或人类）中的向性和分散模式。

这种基于系统的分层人口导向方法需要大量的WGS数据，以获得足够的统计能力来预测可区分的基因组特征。因此，该方法需要一个能够同时处理数千个细菌基因组的计算平台。最近，ProkEvo被开发出来，是一个免费获得，自动化，便携式和可扩展的生物信息学平台，允许基于分层的综合细菌种群分析，包括泛基因组图谱20。ProkEvo允许研究中大规模细菌数据集，同时提供一个框架来生成可测试且可推断的流行病学和生态假设以及可由用户自定义的表型预测。这项工作补充了该管道，提供了有关如何利用ProkEvo派生的输出文件作为分析和解释分层种群分类和辅助基因组挖掘的输入的指南。这里介绍的案例研究利用了 肠道沙门氏菌 谱系I人畜共患血清 S的种群。以纽波特为例，特别旨在为微生物学家，生态学家和流行病学家提供有关如何：i）使用自动化系统发育依赖性方法来绘制分层基因型的实用指南;ii）评估基因型的频率分布，作为评估生态适应性的代理;iii）使用独立的统计方法确定谱系特异性的克隆程度;iv）绘制谱系分化AMR位点，作为如何在种群结构背景下挖掘附属基因组内容的示例。更广泛地说，这种分析方法提供了一个可推广的框架，可以在一定规模上进行基于人群的基因组分析，无论目标物种如何，都可以用来推断进化和生态模式。

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Protocol

1. 准备输入文件

注意：该协议可在此处获得 - https://github.com/jcgneto/jove_bacterial_population_genomics/tree/main/code。该协议假设研究人员专门使用ProkEvo（或类似的管道）来获取此Figshare存储库中可用的必要输出（https://figshare.com/account/projects/116625/articles/15097503 - 需要登录凭据 - 用户必须创建一个免费帐户才能访问文件！值得注意的是，ProkEvo会自动从NCBI-SRA存储库下载基因组序列，并且只需要一个包含基因组鉴定列表的.txt文件作为输入20，以及用于 S上这项工作的文件。这里提供了美国纽波特分离株（https://figshare.com/account/projects/116625/articles/15097503?file=29025729）。 有关如何安装和使用该细菌基因组学平台的详细信息，请参阅此处 （https://github.com/npavlovikj/ProkEvo/wiki/2.-Quick-start）20

  1. 如前所述，使用FastTree23 生成核心基因组系统发育20，这不是生物信息学平台20的一部分。FastTree需要Roary24 核心基因组比对作为输入文件。系统发育文件命名为 newport_phylogeny.tree （https://figshare.com/account/projects/116625/articles/15097503?file=29025690）。
  2. 生成 SISTR25 输出，其中包含有关 沙门氏菌 和 cgMLST 变体调用数据的血清分类的信息（sistr_output.csv - https://figshare.com/account/projects/116625/articles/15097503?file=29025699）。
  3. 通过fastbaps26，27 生成BAPS文件，其中包含BAPS水平1-6将基因组分类为亚组或单倍型（fastbaps_partition_baps_prior_l6.csv - https://figshare.com/account/projects/116625/articles/15097503?file=29025684）。
  4. 使用MLST程序生成基于MLST的基因组分类为ST（https://github.com/tseemann/mlst）28（salmonellast_output.csv - https://figshare.com/account/projects/116625/articles/15097503?file=29025696）。
  5. 生成 ABRicate （https://github.com/tseemann/abricate）29 输出作为.csv文件，其中包含每个基因组映射的 AMR 位点（sabricate_resfinder_output.csv - https://figshare.com/account/projects/116625/articles/15097503?file=29025693）。
    注意：用户可以关闭 ProkEvo 生物信息学管道的特定部分（有关详细信息，请查看此处 - https://github.com/npavlovikj/ProkEvo/wiki/4.2.-Remove-existing-bioinformatics-tool-from-ProkEvo）。此处介绍的分析方法为如何在运行生物信息学管道后进行基于人群的分析提供了指南。

2. 下载并安装统计软件和集成开发环境（IDE）应用程序

  1. 下载适用于 Linux、Mac 或 PC30 的最新免费 R 软件版本。按照默认安装步骤操作。
  2. 在此处下载最新的免费 RStudio 桌面 IDE 版本31。按照默认步骤进行安装。
    注意：后续步骤包含在可用的脚本中，包括代码利用率的详细信息，应按顺序运行以生成本工作中提供的输出和数字（https://github.com/jcgneto/jove_bacterial_population_genomics/blob/main/code/data_analysis_R_code.Rmd）。用户可以决定使用另一种编程语言来执行此分析/统计分析，例如Python。在这种情况下，请使用脚本中的步骤作为框架来执行分析。

3. 安装和激活数据科学库

  1. 作为分析的第一步，一次安装所有数据科学库。避免每次需要重新运行脚本时都安装库。使用函数 install.packages（） 进行库安装。或者，用户可以单击 IDE 内部的“ 包 ”选项卡并自动安装包。用于安装所有需要的库的代码如下所示：
    # 安装 Tidyverse
    install.packages（“tidyverse”）
    # 安装撇脂器
    install.packages（“skimr”）
    # 安装素食主义者
    install.packages（“素食主义者”）
    # 安装猫咪
    install.packages（“forcats”）
    # 安装 naniar
    install.packages（“naniar”）
    # 安装 ggpubr
    install.packages（“ggpubr”）
    # 安装 ggrepel
    install.packages（“ggrepel”）
    # 安装重塑2
    install.packages（“reshape2”）
    # 安装 RColorBrewer
    install.packages（“RColorBrewer”）
    # 安装 ggtree
    if （！requireNamespace（“BiocManager”， quietly = TRUE））
    install.packages（“BiocManager”）
    BiocManager：：install（“ggtree”）
    # ggtree 的安装会提示一个关于安装的问题 - 答案是“a”来安装/更新所有依赖项
  2. 安装后立即使用脚本开头的 library（） 函数激活所有库或包。下面是有关如何激活所有必需包的演示：
    # 激活库和包
    库（整齐）
    图书馆（略读）
    图书馆（素食）
    图书馆（猫）
    图书馆（纳尼亚尔）
    图书馆（ggtree）
    图书馆（ggpubr）
    图书馆（ggrepel）
    图书馆（重塑2）
    图书馆（RColorBrewer）
  3. 通过在代码卡盘中使用 {r， include = FALSE} 禁止输出用于库和包安装和激活的代码，如下所示：
    ''' {r， include = FALSE}
    # 安装 Tidyverse
    install.packages（“tidyverse”）
    ```
    注意：此步骤是可选的，但可避免在最终的 html、doc 或 pdf 报告中显示不必要的代码块。
  4. 有关所有库的特定功能的简要说明以及一些用于收集更多信息的有用链接，请参阅步骤 3.4.1-3.4.11。
    1. Tidyverse - 使用此包集合用于数据科学，包括数据输入、可视化、解析和聚合以及统计建模。通常，ggplot2（数据可视化）和dplyr（数据整理和建模）是存在于该库32中的实用包。
    2. skimr - 使用此包生成数据框的汇总统计数据，包括缺失值33 的标识。
    3. 素食主义者 - 将此软件包用于群落生态学统计分析，例如计算基于多样性的统计数据（例如，α和β-多样性）34。
    4. forcats - 使用此包来处理分类变量，如重新排序分类。此包是 Tidyverse 库32 的一部分。
    5. naniar - 使用此包，通过使用 viss_miss（） 函数35 来可视化数据框中变量之间缺失值的分布。
    6. ggtree - 使用此包进行系统发育树的可视化36.
    7. ggpubr - 使用此软件包可以提高基于 ggplot2 的可视化的质量37.
    8. ggrepel - 使用此包在图形38 内部进行文本标记。
    9. reshape2 - 使用此包中的 melt（） 函数将数据帧从宽格式转换为长格式39。
    10. RColorBrewer - 使用此包来管理基于 ggplot2 的可视化中的颜色40.
    11. 使用以下基本函数进行探索性数据分析：head（） 检查数据框中的第一个观测值，tail（） 检查数据框中的最后一个观测值，is.na（） 来计算数据框中缺失值的行数，dim（） 检查数据集中的行数和列数，table（） 检查变量中的观测值， 和 sum（） 来计算观测值或实例的总数。

4. 数据录入与分析

注意：有关此分析的每个步骤的详细信息，请参阅可用脚本（https://github.com/jcgneto/jove_bacterial_population_genomics/blob/main/code/data_analysis_R_code.Rmd）。但是，以下是一些需要考虑的要点：

  1. 使用read_csv（）函数输入所有基因组数据，包括所有基因型分类（血清，BAPS，ST和cgMLST）。
  2. 在多数据集聚合之前，重命名、创建新变量并从每个数据集中选择感兴趣的列。
  3. 不要从任何独立数据集中删除缺失值。等到聚合所有数据集后，再修改或排除缺失值。如果为每个数据集创建了新变量，则默认情况下，缺失值将分类到新生成的分类之一中。
  4. 检查是否有错误字符，如连字符或询问标记，并将其替换为 NA（不适用）。对缺失值执行相同的操作。
  5. 根据基因型（血清->BAPS1 ->ST -> cgMLST）的分层顺序以及基于个体基因组鉴定的分组来汇总数据。
  6. 使用多个策略检查缺失值，并显式处理此类不一致。仅当分类不可靠时才从数据中删除基因组或分离。否则，请考虑正在进行的分析，并根据具体情况删除NA。
    注意：强烈建议建立一个策略来 先验地处理这些值。避免删除所有基因组或任何变量中缺失值的分离株。例如，基因组可能具有ST分类，而没有cgMLST变异数。在这种情况下，基因组仍然可以用于基于ST的分析。
  7. 聚合所有数据集后，将其分配给可在后续分析中的多个位置使用的数据框名称或对象，以避免为论文中的每个图形生成相同的元数据文件。

5. 进行分析并生成可视化

注意：生成所有分析和可视化所需的每个步骤的详细说明可以在本文的 markdown 文件中找到（https://github.com/jcgneto/jove_bacterial_population_genomics/tree/main/code）。每个图的代码以块分隔，整个脚本应按顺序运行。此外，每个主图和补充图的代码作为单独的文件提供（请参见 补充文件 1 和 补充文件 2）。以下是在生成每个主要和补充数字时要考虑的一些要点（带有代码片段）。

  1. 使用ggtree绘制系统发育树以及基因型信息（图1）。
    1. 通过分别更改 xlim（） 和 gheatmap（width = ） 函数中的数值来优化 ggtree 图形大小，包括环的直径和宽度（请参阅下面的示例代码）。
      tree_plot <- ggtree（tree， layout = “circular”） + xlim（-250， NA）
      figure_1 <- gheatmap（tree_plot， d4， offset=.0， width=20， colnames = FALSE）
      注意：有关可用于系统发育绘图的程序的更详细比较，请查看这项工作20。这项工作强调了确定改进基于ggtree的可视化的策略的尝试，例如减小数据集大小，但与phandango 41相比，分支长度和树拓扑并不像phandango41那样具有明显的区别性。
    2. 将所有元数据聚合到尽可能少的类别中，以便在使用系统发育树（https://github.com/jcgneto/jove_bacterial_population_genomics/blob/main/code/figure_1.Rmd）绘制多层数据时方便选择着色面板。根据兴趣和领域知识问题进行数据汇总。
  2. 使用条形图评估相对频率（图 2）。
    1. 聚合意法半导体谱系和 cgMLST 变体的数据，以促进可视化。选择用于数据聚合的经验或统计阈值，同时考虑所提出的问题。
    2. 有关可用于检查 ST 谱系的频率分布以确定截止值的示例代码，请参阅下文：
      st_dist <- d2 %>% group_by（ST） %>% # 按 ST 列分组
      count（） %>% # 计算观测值的数量
      arrange（desc（n）） # 按降序排列计数
    3. 有关演示如何聚合次要（低频）ST 的示例代码，请参阅下文。如下图所示，未编号为 5、31、45、46、118、132 或 350 的 ST 被归为“其他 ST”。对 cgMLST 变体使用类似的代码（https://github.com/jcgneto/jove_bacterial_population_genomics/blob/main/code/figure_2.Rmd）。
      d2$st <- ifelse（d2$ST == 5， “ST5”， # 创建一个新的 ST 列，其中次要的 S T 被聚合为其他
      ifelse（d2$ST == 31， “ST31”，
      ifelse（d2$ST == 45， “ST45”，
      ifelse（d2$ST == 46， “ST46”，
      ifelse（d2$ST == 118， “ST118”，
      ifelse（d2$ST == 132， “ST132”， ifelse（d2$ST == 350， “ST350”， “Other ST”））））））
  3. 使用嵌套方法计算每个BAPS1子组中每个ST谱系的比例，以识别祖先相关的ST（属于同一BAPS1子组）（图3）。下面的代码说明了如何跨 BAPS1 子组 （https://github.com/jcgneto/jove_bacterial_population_genomics/blob/main/code/figure_3.Rmd） 计算基于 ST 的比例：
    baps <- d2b %>% filter（serovar == “Newport”） %>% # filter Newport serovars
    选择（baps_1，ST） %>% # 选择baps_1和 ST 列
    mutate（ST = as.numeric（ST）） %>% # 将 ST 列更改为数字
    drop_na（baps_1，ST） %>% # 丢弃 NA
    group_by（baps_1，ST） %>% # 按baps_1和 ST 分组
    summaryse（n = n（）） %>% # 计数观测值
    mutate（prop = n/sum（n）*100） # 计算比例
  4. 使用基于Resfinder的基因注释结果绘制AMR位点在ST谱系中的分布（图4）。
    注：再觅食者已广泛应用于生态学和流行病学研究42.蛋白质编码基因的注释可能会有所不同，具体取决于数据库的整理和更新频率。如果使用建议的生物信息学管道，研究人员可以比较不同数据库中基于AMR的位点分类20。请务必检查哪些数据库正在不断更新。不要使用过时或管理不善的数据库，以避免误判。
    1. 使用经验或统计阈值过滤掉最重要的AMR位点，以促进可视化。提供原始.csv文件，其中包含所有 ST 谱系中所有 AMR 位点的计算比例，如下所示 （https://figshare.com/account/projects/116625/articles/15097503?file=29025687）。
    2. 使用以下代码计算每个 ST 的 AMR 比率 （https://github.com/jcgneto/jove_bacterial_population_genomics/blob/main/code/figure_4.Rmd）：
      # ST45的计算
      d2c <- data6 %>% filter（st == “ST45”） # 先过滤 ST45 数据
      # 对于ST45，计算AMR位点的比例，只保持比例大于10%
      d3c <- d2c %>% select（id， gene） %>% # select columns
      group_by（id， gene） %>% # 按 id 和基因分组
      summarize（count = n（）） %>% # 计数观测值
      mutate（count = replace（count， count == 2， 1）） %>% # replace count 等于 2 with 1，只考虑每个基因的一个拷贝（重复可能不可靠），但研究人员可以决定排除或保留它们。如果研究人员想要排除它们，请使用过滤器（count ！= 2）函数，否则保持原样
      filter（count <= 1） # filter counts 小于或等于 1
      d4c <- d3c %>% group_by（基因） %>% # 按基因分组
      summarize（value = n（）） %>% # 计数观测值
      mutate（total = table（data1$st）[6]） %>% # 获取 st mutate（prop = （value/total）*100） # 计算比例
      d5c <- d4c %>% mutate（st = “ST45”） # 创建一个 st 列并添加 ST 信息
    3. 对所有 ST 进行计算后，使用以下代码将数据集合并为一个数据框：
      # 合并数据集
      d6 <- rbind（d5a， d5b， d5c， d5d， d5e， d5f， d5g， d5h） # 行绑定数据集
    4. 要导出包含计算比例的.csv文件，请使用以下代码：
      # 导出包含 ST 和 AMR 位点信息的数据表
      abx_newport_st <- d6 write.csv（abx_newport_st，“abx_newport_st.csv”， row.names = FALSE）
    5. 在绘制跨 ST 谱系的基于 AMR 的分布之前，请根据阈值筛选数据以方便可视化，如下所示：
      # 过滤比例高于或等于10%的AMR位点
      d7 <- d6 %>% 滤波（prop >= 10） # 根据经验或统计确定阈值
  5. 使用ggtree在单个图中绘制核心基因组系统发育以及分层基因型分类和AMR数据（图5）。
    1. 使用上述参数优化ggtree内部的图形大小（请参阅步骤5.1.1）。
    2. 通过聚合变量或使用二元分类（如基因存在或不存在）来优化可视化。添加到图中的要素越多，着色选择过程就越困难（https://github.com/jcgneto/jove_bacterial_population_genomics/blob/main/code/figure_5.Rmd）。
      注意：补充数字 - 整个代码的详细说明可以在这里找到（https://github.com/jcgneto/jove_bacterial_population_genomics/blob/main/code/data_analysis_R_code.Rmd）。
  6. 在没有数据聚合的情况下，在 ggplot2 中使用散点图来显示 ST 谱系或 cgMLST 变异的分布，同时突出显示最常见的基因型（补充图 1）（https://github.com/jcgneto/jove_bacterial_population_genomics/blob/main/code/supplementary_figure_s1.Rmd）。
  7. 通过cgMLST变异的比例进行嵌套分析以评估ST谱系的组成，以便瞥见基于ST的遗传多样性，同时识别最常见的变异及其遗传关系（即，属于同一ST的cgMLST变异比属于不同ST的cgMLST变异更晚共享祖先）（补充图2））（https://github.com/jcgneto/jove_bacterial_population_genomics/blob/main/code/supplementary_figure_s2.Rmd）。
  8. 使用群落生态学指标，即辛普森D多样性指数，来测量每个主要ST谱系43 的克隆度或基因型多样性（补充图3）。
    1. 计算不同基因型分辨率水平下 ST 谱系的多样性指数，包括 BAPS 1 至 6 级和 cgMLST。以下是有关如何在基因型分辨率的BAPS级别1（BAPS1）进行此计算的代码示例：
      # BAPS 级别 1 （BAPS1）
      # 用NA去掉STs和BAPS1，按ST和BAPS1分组，然后计算辛普森指数
      baps1 <- 数据6 %>%
      select（st， BAPS1） %>% # select columns
      drop_na（st， BAPS1） %>% # 丢弃 NAs
      group_by（st， BAPS1） %>% # 按列分组
      summarise（n = n（）） %>% # 计数观测值
      mutate（simpson = diversity（n， “simpson”）） %>% # 计算多样性
      group_by（st） %>% # 按列分组
      summaryse（simpson = mean（simpson）） %>% # 计算指数的平均值
      melt（id.vars=c（“st”）， measure.vars=“simpson”，
      variable.name=“索引”， value.name=“值”） %>% # 隐蔽成长格式
      mutate（strat = “BAPS1”） # 创建一个 strat 列
      注意：遗传多样性更强的群体（即，在不同基因分辨层的更多变异）在cgMLST水平上具有更高的指数，并产生从BAPS 2级到6级的基于指数的值的增加（https://github.com/jcgneto/jove_bacterial_population_genomics/blob/main/code/supplementary_figure_s3.Rmd）。
  9. 通过绘制BAPS亚组在所有分辨率水平下的相对频率（BAPS1-6）来检查ST谱系的基因型多样性程度（补充图4）。群体越多样化，BAPS亚组（单倍型）的分布就越稀疏，从BAPS1（较低的分辨率水平）到BAPS6（更高的分辨率水平）（https://github.com/jcgneto/jove_bacterial_population_genomics/blob/main/code/supplementary_figure_s4.Rmd）。

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Representative Results

通过利用计算平台ProkEvo进行群体基因组学分析，细菌WGS数据挖掘的第一步包括在核心基因组系统发育的背景下检查分层种群结构（图1）。在 S的情况下。 肠系 谱系I，如 S所示。 Newport数据集，总体的分层结构如下：血清（最低分辨率水平），BAPS1亚组或单倍型，ST谱系和cgMLST变体（最高分辨率）20。这种对分层种群结构的系统发育指导分析特别允许检查以下几点：i）基于SISTR的错误分类基因组的系统发育分布到 沙门氏菌的情况下的其他血清型;（二） 人口的遗传或亲属关系结构;iii）不同基因型分辨率水平下的多样化模式;iv）确定进化，生态或流行病学模式背后的主要基因型单位;v）通过BAPS1亚群或单倍型组成的ST谱系之间的祖先关系，以及ST谱系内cgMLST变体之间的祖先关系;和vi）通过cgMLST变体组成的ST谱系的基因型同质程度的部分视图。

Figure 1
图1： S 的分层基因型的系统发育引导映射。纽波特人口。 使用核心基因组系统发育（黑心圆）来绘制分层基因型，包括血清（最低分辨率水平 - 最内层彩色圆圈），BAPS水平1（BAPS1）亚组或单倍型，ST谱系和cgMLST变体（最高分辨率 - 最外层彩色圆圈）。Serovars被分组到Newport（S. Newport）或基于SISTR基因组算法分类的“其他血清型”，它利用核心基因组MLST信息，并作为计算平台ProkEvo的一部分运行。BAPS1使用ProkEvo中的核心基因组数据将种群不可知地分层为相关单倍型的子组或集群。BAPS1在等级上位于血清和ST谱系之间，因为它准确地捕获了ST之间的祖先关系，ST谱系是基于使用七个基因组散射位点的规范MLST分析形成的。图中仅描述了主要或最常见的ST（比例>1%）。最后，仅使用最常见的cgMLST变体（比例>3.5%）来显示S的整个层次结构 。 纽波特人群（n = 2，365 美国仅分离）。“其他ST”或“其他cgMLST”类别分别由次要或低频谱系或变体组成，其阈值任意完成，应根据数据集以经验或统计方式设置。 请点击此处查看此图的大图。

然后使用所有分层基因型的相对频率来评估总体分布和最常观察到的分类（即基因型）（图2）。在图2C-D中，不太频繁（次要）的ST谱系或cgMLST变体分别被聚合为“其他ST”或“其他cgMLST”，以促进数据可视化（降维）。如果跨环境和/或主机系统地进行采样，并且具有适当的统计功率，则频率分布可以成为生态适应性的代理。也就是说，可以预测最常见的谱系或变异具有更高的适应性，随后进一步调查以确定这种数量性状背后的致病遗传决定因素6，30。

Figure 2
图 2：S 的比例。 不同分辨率水平的纽波特分层基因型。（A）血清型是血清的表型。肠道谱系I群体，由于核心位点与O和H抗原编码位点（表面蛋白）之间的可遗传高连锁不平衡，仅可以从核心基因组数据中预测。使用ProkEvo时，沙门氏菌基因组使用SISTR程序自动分类为血清型。虽然只有S。 来自NCBI的Newport（Newport）基因组被推定下载，有些在ProkEvo中被归类为“其他血清型”。大约2%（2，365个基因组中的48个）被归类为S以外的其他基因组。 纽波特血清。（B）BAPS水平1（BAPS1）亚组或单倍型的比例。BAPS1 入到分层方案中的血清和 ST 谱系之间，因为它准确和不可知地捕获 & gt ; 了 ST 之间的祖先关系。 次要的在册部落被归类为“其他在册部落”。（四）主要cgMLST变体的比例显示只有四个主要的cgMLST相对频率>3%。其余的 cgMLST 被归类为“其他 cgMLST”。（B-D）在绘制BAPS1，ST和cgMLST相对频率之前，SISTR分类为“其他血清型”（2.03%）的基因组被过滤掉数据。（C-D）用于绘制ST和cgMLST数据的阈值是任意定义的，应根据具体情况进行经验确定。请点击此处查看此图的大图。

或者，散点图可用于评估 ST 谱系或 cgMLST 变体的分布和比例，而无需任何数据聚合（补充图 1）。散点图的使用对于ST谱系和cgMLST变体特别有用，因为两种基因型通常都有百分之一（如果不是数千个）分类。这种稀疏分布通常不会发生在血清和BAPS1水平的分辨率上，因为它们处于较低的分辨率水平，序列可遗传地折叠成几个子组或类别。

接下来，使用嵌套方法检查ST之间的祖先关系，其中包括通过BAPS1亚组或单倍型评估ST谱系的相对频率（图3）。属于同一BAPS1亚组的ST谱系比其他ST（即ST5和ST118与ST45）更有可能共享一个共同的祖先。同样，通过检查cgMLST变异在ST谱系内的分布，可以捕获STs之间的基因型异质性程度，同时评估其遗传组成并揭示cgMLST之间的祖先关系（即，密切相关的cgMLST变体属于相同的ST谱系或克隆复合物）（补充图2）。

Figure 3
图 3：嵌套在 S 的 BAPS1 子组中的 ST 谱系的分布 。 纽波特人口。 该图描绘了每个BAPS 1级亚组或单倍型中的ST谱系分布，不包括分类为“其他血清型”的基因组（占整个数据的2.03%）。每个BAPS1子组的主要ST（比例>1%）在每个图表中突出显示。圆直径越大，特定 ST 谱系的比例就越高。 请点击此处查看此图的大图。

鉴于 S 的模式 。 纽波特种群多样化似乎主要由ST组成驱动（图1），使用两种统计方法来评估基于ST的克隆程度（即遗传同质性），包括辛普森D多样性指数（补充图3），以及使用BAPS水平1-6的BAPS亚组或单倍型的分布（补充图4）).评估种群的克隆程度可以阐明以下几个方面：（一） 更好地理解遗传多样性和种群结构;（二） 更好地理解遗传多样性和种群结构;（三ii）对主要基因型单位（如ST谱系）的多样化模式进行微调分析;iii）是使用辅助基因组挖掘来寻找可能揭示种群中存在的新型亚簇的神秘基因型单元的必要性的指标。群体在核心基因组水平上的克隆越多，就越难区分变异，并且附属基因组内容就越有可能将种群分层为与独特生态分布相关的有意义的基因型单位18，19，21。

评估ST谱系分化AMR位点的相对频率，以鉴定与S相关的独特附属基因组特征。 纽波特人口结构（图4）。分析的这一步侧重于AMR分布，因为它是与公共卫生相关的性状，但相同的方法可以以监督（靶向）或不可知的方式应用于检查辅助基因组的其他组成部分，包括代谢途径，毒力因子等。值得注意的是，mdf（A）_1和aac（6'）-Iaa_1位点似乎是S祖先获得的。 纽波特人口;然而，预计ST45具有多重耐药性。引人注目的是，这些数据还表明，与ST45相比，其他主要的ST谱系ST5和ST118更有可能对多药敏感。由于数据集中存在的偏差，必须仔细考虑这些点;然而，这代表了一种潜在的流行病学推论，可以从更强大的WGS数据收集中得出。

一般来说，在对分层基因型进行辅助基因组映射时，需要考虑以下几点：i）将频率分布视为数量性状，但要注意位点的等位基因组成可以改变性状方差。此外，位点或位点的存在应指示功能，但不是因果关系，因为表型可能是多基因的，或者根据致病位点的等位基因组成而变化（例如，蛋白质活性位点上的非同义突变更有可能影响功能）;ii）位点分布可以证明在群体中固定的基因（例如，在所有ST谱系中以高频发现）或最近由特定ST谱系和cgMLST变异获得的基因，并且可能反映生态或流行病学模式;iii）多药耐药性可以从基因组学数据中预测。如果AMR位点或其他途径的分布具有很强的联系或通常由特定谱系遗传，则可以通过从分层基因型推断来预测表型，例如ST谱系45，46;iv）在实验室中测量表型仍然是验证计算预测的确定性。

Figure 4
图4：AMR位点在S的主要ST谱系中的分布 。 纽波特人口。 选定数量的AMR位点在主要ST谱系中的相对频率分布（>1%的人口）。次要的在册部落被归类为“其他在册部落”。只有被归类为S的基因组 。 Newport由SISTR算法保留在分析中。选择相对频率大于或等于10%的AMR位点进行数据可视化。这是应为每个数据集确定的任意阈值。使用由基因存在或不存在组成的二元矩阵计算比例。 请点击此处查看此图的大图。

最后，使用系统发育锚定的可视化来系统地整合分层种群结构数据以及基于基因发生率的ST谱系区分AMR位点分布（图5）。通过将群体结构与辅助基因组组成相结合，可以在任何给定的数据集中解决以下一组问题：1）群体的结构如何？在BS1亚群中，在祖先方面，在STs之间以及祖先之间是如何相互关联的？cgMLST 组成在 ST 之间的可变性有多大？2）什么是系统发育分支模式和整体树拓扑？3）副基因组是如何分布的？辅助基因组组成很可能是祖先获得的还是最近获得的？什么是谱系或特定于变体的模式？什么是表型预测和生态推断？是否存在超越利基与利基指定的基因？在病原体的情况下，观察到的模式如何关联或告知流行病学？谱系或变异体能否根据附属基因组内容进行信息性亚聚类？

Figure 5
图5：系统发育指导的分层基因型和附件AMR位点的映射，区分S内的主要ST谱系 。 纽波特人口。 使用核心基因组系统发育（黑心圆）来绘制分层基因型，包括血清（最低分辨率水平 - 最内层彩色圆圈），BAPS水平1（BAPS1）亚组或单倍型，ST谱系和cgMLST变体（最高分辨率 - 最外层彩色圆圈），以及AMR位点，如果存在，则为深蓝色或如果不存在则为灰色。Serovars被分组到Newport（S. Newport）或基于SISTR算法分类的“其他血清”。BAPS1在等级上位于血清和ST谱系之间，因为它准确和不可知地捕获了ST之间的祖先关系。图中仅描述了主要或最常见的ST（比例>1%）。此外，仅使用最主要的cgMLST变体（比例>3.5%）来显示S的整个层次结构 。 纽波特人群（n = 2，365 美国仅分离）。“其他ST”或“其他cgMLST”类别分别由次要或低频谱系或变体组成，阈值是任意完成的，应根据数据集进行设置。选择相对频率大于或等于10%的AMR位点进行数据可视化。该特定图显示了AMR位点的独特分布，主要发生在ST31，ST45和ST132谱系中。 请点击此处查看此图的大图。

补充图1：S的ST谱系和cgMLST变体的稀疏分布 。 纽波特人口。 （A）图中突出显示了不聚合低频ST的ST谱系的比例，具有>1%的ST。（B）在不聚合低频cgMLST的情况下cgMLST变体的比例。比例> 3% 的 cgMLST 在图中突出显示。（A-B）用于绘制 ST 和 cgMLST 数据的阈值是任意定义的，应基于数据集建立。在绘制ST和cgMLST相对频率之前，从数据中过滤掉被SISTR分类为“其他血清型”（2.03%）的基因组。圆直径越大，ST 谱系或 cgMLST 变体的比例就越高。 请点击此处下载此文件。

补充图 2：嵌套在 S 的 ST 谱系中的 cgMLST 变体的分布 。 纽波特人口。 该图描绘了cgMLST变异在ST谱系中的分布，不包括归类为“其他血清型”的基因组（占整个数据的2.03%）。每个ST谱系的主要cgMLST（比例>15%）在每个图中突出显示。圆直径越大，特定 cgMSLT 变体的比例就越高。低频的STs被归类为“其他ST”。 请点击此处下载此文件。

补充图3：辛普森基于D的跨ST谱系遗传多样性程度，使用BAPS水平1-6单倍型或cgMLST基因型作为S的输入数据 。 纽波特人口。 每个ST谱系的克隆程度或遗传多样性是在不同的基因型分辨率层上计算的，包括BAPS水平1（最低分辨率水平）到6（最高分辨率水平）亚组或单倍型，并额外使用基于cgMLST的变异分布。指数值越高，遗传多样性程度越高。高度多样化的ST谱系具有更高的指数值，从BAPS1到BAPS6（即，通常指数增加，最终从BAPS1到BAPS6时趋于平稳）。只有被归类为S的基因组 。 SISTR程序的纽波特被保留在分析中。低频的STs被归类为“其他ST”。 请点击此处下载此文件。

补充图4：BAPS水平1-6亚群或单倍型在 纽 波特氏菌群的主要ST谱系中的分布。 BAPS亚组或单倍型的相对频率分布，跨越主要的ST谱系，从最低（BAPS1）到最高分辨率（BAPS6）。主要在册部落的选择依据是比例>1%。只有被归类为S的基因组 。 SISTR程序的纽波特被保留在分析中。克隆度越高，从BAPS1到BAPS6时，BAPS亚群或单倍型的分布就越稀疏或扩散。换句话说，遗传更多样化的ST谱系在BAPS水平6（最高分辨率）具有更广泛的BAPS亚群。低频的STs被归类为“其他ST”。 请点击此处下载此文件。

补充文件1：材料清单和基因组清单的链接 请点击这里下载此文件。

补充文件2：使用R进行基于分层的细菌种群基因组学分析请单击此处下载此文件。

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Discussion

利用基于系统的启发式和分层种群结构分析为识别细菌数据集中的新基因组特征提供了一个框架，这些特征有可能解释独特的生态和流行病学模式20.此外，将辅助基因组数据映射到种群结构上可用于推断祖先获得的和/或最近衍生的性状，这些性状有助于ST谱系或cgMLST变体在储库6，20，21，45，46中的传播。更广泛地说，对细菌种群中泛基因组含量分布的全球评估可以揭示多样化模式，这些模式是生态向性或地理空间/时间瓶颈的基础，种群最近可能已经承受了18，21。在致病物种的情况下，通过挖掘临床与环境分离株的种群结构，可以鉴定与人畜共患病事件相关的遗传决定因素，并用于改进诊断和监测33，34。同样的方法可以应用于非致病性物种，以鉴定具有理想的生态位特异性移植特性的基因型，如用于改善人类健康的胃肠道益生菌菌株的情况49，50，51。然而，将细菌WGS数据用于基于人群的查询需要使用可重复，自动化和可扩展的计算平台，如ProkEvo20。任何计算方法都有其警告和细微差别，但一般来说，免费提供，记录充分，可移植且用户友好的平台（如ProkEvo）可以促进微生物学家，生态学家和流行病学家的工作，进行启发式细菌种群基因组学。

在本工作中，演示了如何使用ProkEvo衍生的输出进行分层种群结构分析，该分析可用于在不同分辨率水平下映射和跟踪感兴趣的基因型，以及从WGS数据中预测有用的特征。该计算协议是使用R编程语言编写的，但是框架或概念方法可以通过利用Pandas库等其他语言推广到其他语言，例如Python。输入数据由ProkEvo20生成，这可以防止在标准化输出和数据格式以进行后续分析方面遇到一些障碍。除系统发育外，所有其他输入数据集都采用表格格式，可以轻松进行质量控制、聚合、解析和集成，以生成用于数据解释的有用报告。但是，在使用此协议时，重要的是要强调一些关键步骤，以增强可重复性：i）确保软件版本始终更新和跟踪;ii）跟踪正在使用的数据科学库的版本，最好随着时间的推移更新它们;iii）使用领域知识专业知识对数据进行质量控制，以根据对目标细菌种群的理解，理解ProkEvo或类似管道产生的输出;iv）在使用任何建模方法之前进行探索性数据分析;v） 根据经验知识和/或统计评估汇总数据;vi）制定一项战略， 先验 地处理缺失的价值，并保持一致和完全透明;vii）如果使用R，请尝试使用Tidyverse提供的所有包，因为这个集合有利于函数式编程，可移植性，优化，并且是免费提供的;和viii）请注意，可视化方法可能很困难，因为需要一些试验和错误才能获得最适合所提问题和所描绘数据的正确类型的绘图和配色方案。

值得注意的是，该协议带有一些可以进一步改进的限制。例如，ProkEvo对可用于泛基因组分析的基因组数量有一个内在限制，如果核心基因组比对步骤是同时生成的，同时利用Roary程序（约2，000-3，000个基因组）24。这是管道中一个非常具体的瓶颈，它将影响可以分类为BAPS单倍型的基因组数量，因为它取决于核心基因组比对（即，高度计算要求的步骤）。然而，核心基因组比对可以用其他程序52完成，从理论上讲，这种算法可以很容易地整合到ProkEvo中。否则，数据集可以战略性地拆分为随机子集，或者在另一个基础上，例如通过考虑所讨论的生物体的种群结构。或者，ProkEvo可以使用单个基因组进行运行，以获得基于ST的注释，抗生素耐药性和毒力基因组成以及质粒的映射，但该管道是为基于人群的基因组学而设计的。值得注意的是，如果不需要BAPS1-6分类，则可以关闭Roary的核心基因组比对选项，在这种情况下，ProkEvo可以与数十万个基因组一起使用 - 它仅基于可用计算机核心的数量而受到限制。有关如何实现新程序或如何在ProkEvo中的Roary中关闭核心基因组比对选项的示例，可以分别在以下GitHub链接（https://github.com/npavlovikj/ProkEvo/wiki/4.1.-Add-new-bioinformatics-tool-to-ProkEvo）和（https://github.com/npavlovikj/ProkEvo/wiki/4.3.-Change-running-options-for-existing-tool-in-ProkEvo）中找到。在辅助基因组挖掘的情况下，不可知论分析取决于泛基因组的利用。由 Roary24 生成的 Rtab 文件，此处没有专门使用，而是战略性地演示了如何使用 Resfinder 数据库 （https://github.com/tseemann/abricate） 将 AMR 位点与 ABRicate 进行映射。尽管如此，还是可以选择通过使用全基因组文件来扩展附件基因组映射的范围，这实际上可以被视为当前方法的扩展（例如，表格数据集中包含更多位点作为新列）。值得一提的是，ProkEvo完成的泛基因组图谱仅提供了位点组成的二元信息，目前还不能用于鉴定基因间的单核苷酸多态性。

该协议的另一个局限性是系统发育树的可视化。目前，ggtree是首选程序，但代价是无法准确检查分支长度，并且当需要将许多数据层添加到系统发育中时，它会变得很麻烦。或者，phandango41 是一个用户友好，可扩展的网页格式GUI（https://jameshadfield.github.io/phandango/#/）41，可以很容易地用于实现相同的目标，有关如何将其与ProkEvo输出一起使用的更多详细信息最近发布20。iTOL等其他工具也可用于数据53的系统发育相关可视化，但它们需要使用GUI并且不能合并到自动化脚本中。此外，由于水平基因转移的隐秘数据集依赖性影响，准确的核心基因组系统发育可能难以估计。Gubbins54 等程序可用于此目的，但它们也具有某些局限性，例如需要使用全基因组比对和ST谱系特异性数据集来正确估计系统发育。相反，可以部署其他与系统发育无关的方法，这些方法最终需要其他类型的可视化来集成元数据或辅助基因组信息，如多维分析55，56的情况。最后，除了过滤要量化的最重要AMR位点外，还使用经验和任意方法来聚合次要的ST谱系和cgMLST变体。这种类型的数据聚合可以使用领域知识专业知识以经验方式完成，但也可以通过定义应显示的分布比例的 先验 标准，或者通过使用与分布相关的指标（如四分位距、标准差或偏度）来最终定义阈值，从而在统计上实现。重要的是，由于样本量，次要基因型的定义直接受到数据性质的影响，环境样本类型的偏差可以直接影响基因型组成。无论如何，主要考虑因素是，将辅助基因组内容映射到种群结构上，可以确定生态多样化的潜在遗传决定因素，例如生态位超越或生态位指定基因57，58，59。

尽管可用的 R 脚本是为自动化当前工作而设计的，但所有提供的脚本都需要进一步开发，以成为一个抽象且可部署的数据科学库，例如，这可能是 ProkEvo 管道的一个组成部分。尽管如此，利用这种方法有一些具体的好处，例如使用BAPS 1级基因分型或聚类方案。BAPS 1级亚组或单倍型在血清和ST谱系之间的位置是根据 沙门氏菌 群体的遗传结构经验定义的，但它似乎适用于其他物种，如 空肠弯曲杆菌 和 金黄色葡萄球菌20。此外，BAPS1准确地捕获了ST谱系之间的祖先关系，并为进化分析提供了一种可扩展的方法，特别是当系统发育应用限制为20时。此外，使用嵌套方法来检查分层关系和多样化模式有助于使用BAPS1子组识别ST谱系之间的祖先，以及使用ST谱系的cgMLST变体，在评估种群结构时从低到高的基因型分辨率。重要的是要重申，如果从系统收集和统计驱动的样本中提取ST谱系和cgMLST变体的频率分布，可以成为生态适应性1，6，43的代表。因此，显性ST谱系和cgMLST变体可能包含独特的基因组特征，这些特征可能是它们在该特定环境或宿主中在种群中占主导地位的生物学机制的基础。

本文使用两个独立的统计指标来评估群体的克隆程度，从而可以辅助理解群体遗传多样性，这可能表明过去发生的样本偏倚，群体瓶颈或创始人效应。特别是，对跨ST谱系的BAPS水平1-6亚组的不可知性评估可以完善对遗传多样性的理解，这些遗传多样性通常无法通过简单地查看SISTR产生的 沙门氏菌 cgMLST变异水平来解决。如前所述，泛基因组的其他特征可以映射到群体结构上，并且除了利用其他AMR数据库以及不可知的泛基因组数据集之外，还可以由ProkEvo20自动生成包含质粒和毒力基因组成的文件。值得注意的是，ProkEvo目前不允许区分细菌染色体中存在的AMR位点与质粒。通过将其他变量纳入包含所有基因组信息的.csv文件中，也可以轻松地将生态和流行病学元数据整合到这种分析方法中。特别是，这里介绍的工作特别补充了可扩展和便携式计算平台ProkEvo的利用，该平台旨在供专注于启发式群体基因组学分析的研究人员使用，以促进用户的数据挖掘和定制。其他平台可用于基因分型，群体结构分析和/或辅助基因组的绘图，例如Enterobase5，PATRIC60和BacWGSTdb61。后者是极好的资源，为那些不寻求定制和利用集群计算进行可扩展和复杂分析的研究人员提供基因组学数据挖掘。这里介绍的分析方法是专门为希望能够灵活地在本地机器上使用可重复脚本或使用云或高性能计算平台进行群体基因组学分析的研究人员量身定制的。

总之，本工作中提出的基于R的分析平台旨在为微生物学家，生态学家和流行病学家提供有关如何：i）使用系统发育依赖性方法来绘制分层基因型的实用指南;ii）评估基因型的频率分布，作为评估生态适应性的代理;iii）使用独立的统计方法确定谱系特异性的克隆程度;iv）绘制谱系分化AMR位点，作为如何在种群结构背景下挖掘附属基因组内容的示例。此处提供的脚本可以在本地计算机或高性能计算平台上使用。对于实验和环境微生物学家来说，这种方法有助于对数据集的研究，旨在确定独特的特征和候选途径，以便进行进一步的机理研究，最终可以在种群水平上进行情境化。生态学家可以通过分析中等到大型数据集来从这种方法中受益，从理论上讲，这增加了在考虑亲缘关系和多样化模式的同时找到种群选择特征所需的统计能力。最后，流行病学家可以通过定义感兴趣的基因型单位和预测AMR等公共卫生相关特征来利用独特的实用信息进行诊断和监测。更广泛地说，本分析指南提供了一个可推广的框架，以利用ProkEvo进行基于种群的基因组分析，该分析可用于推断致病性和非致病性物种的进化和生态模式，因为该方法可推广到其他细菌物种。

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Disclosures

作者宣布不存在相互竞争的利益。

Acknowledgments

这项工作得到了UNL-IANR农业研究司和国家抗菌素耐药性研究与教育研究所以及食品科学和技术部内布拉斯加州食品卫生中心提供的资金的支持。这项研究只能通过利用UNL的荷兰计算中心（HCC）来完成，该中心得到了内布拉斯加州研究计划的支持。我们还感谢通过HCC获得开放科学网格（OSG）提供的资源，该网格得到了美国国家科学基金会和美国能源部科学办公室的支持。这项工作使用了Pegasus Workflow Management Software，该软件由美国国家科学基金会（grant #1664162）资助。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
amr_data_filtered https://figshare.com/account/projects/116625/articles/14829225?file=28758762
amr_data_raw https://figshare.com/account/projects/116625/articles/14829225?file=28547994
baps_output https://figshare.com/account/projects/116625/articles/14829225?file=28548003
Core-genome phylogeny https://figshare.com/account/projects/116625/articles/14829225?file=28548006
genome_sra https://figshare.com/account/projects/116625/articles/14829225?file=28639209
Linux, Mac, or PC any high-performance platform
mlst_output https://figshare.com/account/projects/116625/articles/14829225?file=28547997
sistr_output https://figshare.com/account/projects/116625/articles/14829225?file=28548000
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遗传学，第178期，
细菌种群中分层基因型和辅助基因组位点的启发式挖掘
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Pavlovikj, N., Gomes-Neto, J. C.,… More

Pavlovikj, N., Gomes-Neto, J. C., Benson, A. K. Heuristic Mining of Hierarchical Genotypes and Accessory Genome Loci in Bacterial Populations. J. Vis. Exp. (178), e63115, doi:10.3791/63115 (2021).

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