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JoVE Journal Genetics
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Genetics

Mineração heurística de genótipos hierárquicos e genoma acessório Loci em populações bacterianas

Published: December 7, 2021 doi: 10.3791/63115
Automatic Translation
*1, *2,3, 2,3
1Department of Computer Science and Engineering, University of Nebraska-Lincoln, 2Department of Food Science and Technology, University of Nebraska-Lincoln, 3Nebraska Food for Health Center, University of Nebraska-Lincoln
* These authors contributed equally

Summary

Esta plataforma computacional analítica fornece orientação prática para microbiologistas, ecologistas e epidemiologistas interessados em genômica populacional bacteriana. Especificamente, o trabalho aqui apresentado demonstrou como realizar: i) mapeamento guiado por filogenia de genótipos hierárquicos; ii) análise baseada em frequência de genótipos; iii) análises de parentesco e clonalidade; iv) identificação da linhagem diferenciando loci acessório.

Abstract

O uso rotineiro e sistemático do sequenciamento de genomas integrais bacterianos (WGS) está aumentando a precisão e a resolução das investigações epidemiológicas realizadas por laboratórios e agências reguladoras de Saúde Pública. Grandes volumes de dados WGS disponíveis publicamente podem ser usados para estudar populações patogênicas em larga escala. Recentemente, uma plataforma computacional livremente disponível chamada ProkEvo foi publicada para permitir análises genômicas populacionais hierárquicas reprodutíveis, automatizadas e escaláveis usando dados wgs bacterianos. Esta implementação do ProkEvo demonstrou a importância de combinar mapeamento genotipado padrão de populações com mineração de conteúdo genômico acessório para inferência ecológica. Em particular, o trabalho aqui destacado utilizou saídas derivadas do ProkEvo para análises hierárquicas em escala populacional usando a linguagem de programação R. O objetivo principal foi fornecer um guia prático para microbiologistas, ecologistas e epidemiologistas, mostrando como: i) utilizar um mapeamento guiado por filogenia de genótipos hierárquicos; ii) avaliar as distribuições de frequência dos genótipos como proxy para a aptidão ecológica; iii) determinar relações de parentesco e diversidade genética utilizando classificações genotipas específicas; e iv) linhagem de mapa diferenciando loci acessório. Para melhorar a reprodutibilidade e a portabilidade, os arquivos de marcação R foram usados para demonstrar toda a abordagem analítica. O conjunto de dados do exemplo continha dados genômicos de 2.365 isolados do patógeno zoonótico Salmonella Newport. O mapeamento ancorado em filogenia de genótipos hierárquicos (Serovar -> BAPS1 -> ST-> cgMLST) revelou a estrutura genética populacional, destacando os tipos de sequência (STs) como o genótipo de diferenciação de pedra-chave. Através das três linhagens mais dominantes, ST5 e ST118 compartilharam um ancestral comum mais recentemente do que com o filotipo st45 altamente clonal. As diferenças baseadas em ST foram ainda destacadas pela distribuição de loci de resistência antimicrobiana acessória (AMR). Por fim, uma visualização ancorada em filogenia foi usada para combinar genótipos hierárquicos e conteúdo AMR para revelar a estrutura de parentesco e assinaturas genômicas específicas da linhagem. Combinada, essa abordagem analítica fornece algumas diretrizes para a realização de análises genômicas populacionais heurísticas da população bacteriana utilizando informações pan-genômicas.

Introduction

O uso crescente do sequenciamento do genoma bacteriano (WGS) como base para vigilância de rotina e inquérito epidemiológico por laboratórios e agências reguladoras de Saúde Pública aprimorou substancialmente as investigações de surtosde patógenos 1,2,3,4. Como consequência, grandes volumes de dados WGS não identificados estão agora disponíveis publicamente e podem ser usados para estudar aspectos da biologia populacional de espécies patogênicas em escala sem precedentes, incluindo estudos baseados em: estruturas populacionais, frequências de genótipos e frequências de genes/alelos em vários reservatórios, regiões geográficas e tipos de ambientes5 . Os inquéritos epidemiológicos mais utilizados pelo WGS baseiam-se apenas em análises utilizando apenas o conteúdo núcleo-genômico compartilhado, onde o conteúdo compartilhado (conservado) é usado apenas para classificação genotípica (por exemplo, chamada de variante), e essas variantes se tornam a base para análise epidemiológica e rastreamento 1,2,6,7 . Normalmente, o genotipagem baseado em núcleo bacteriano é realizado com abordagens de digitação de sequência de vários lócus (MLST) usando sete a alguns milhares de loci 8,9,10. Essas estratégias baseadas em MLST englobam o mapeamento de sequências genômicas pré-montadas ou montadas em bancos de dados altamente curados, combinando informações alélicas em unidades genotípicas reprodutíveis para análise epidemiológica e ecológica11,12. Por exemplo, esta classificação baseada em MLST pode gerar informações genotípicas em dois níveis de resolução: tipos de sequência de nível inferior (STs) ou linhagens ST (7 loci), e variantes MLST (cgMLST) de genoma-núcleo de nível superior (~ 300-3.000 loci)10.

A classificação genotípica baseada em MLST é computacionalmente portátil e altamente reprodutível entre laboratórios, tornando-a amplamente aceita como uma abordagem de sub-digitação precisa abaixo do nívelde espécies bacterianas 13,14. No entanto, as populações bacterianas são estruturadas com diferentes graus de clonalidade específicos das espécies (ou seja, homogeneidade genotípica), padrões complexos de parentesco hierárquico entre genótipos 15,16,17 e uma ampla gama de variações na distribuição do conteúdo genômico acessório 18,19 . Assim, uma abordagem mais holística vai além de classificações discretas em genótipos MLST e incorpora as relações hierárquicas de genótipos em diferentes escalas de resolução, juntamente com o mapeamento de conteúdo genômico acessório em classificações genotipas genotipas, o que facilita a inferência de base populacional 18,20,21 . Além disso, as análises também podem focar em padrões compartilhados de herança de loci genômico acessório entre mesmo genótipos distantes21,22. No geral, a abordagem combinada permite o interrogatório agnóstico das relações entre a estrutura populacional e a distribuição de composições genômicas específicas (por exemplo, loci) entre gradientes geoespaciais ou ambientais. Tal abordagem pode produzir informações fundamentais e práticas sobre as características ecológicas de populações específicas que podem, por sua vez, explicar seus padrões de tropismo e dispersão entre reservatórios, como animais alimentícios ou humanos.

Esta abordagem hierárquica orientada à população baseada em sistemas exige grandes volumes de dados do WGS para poder estatístico suficiente para prever assinaturas genômicas distintas. Consequentemente, a abordagem requer uma plataforma computacional capaz de processar milhares de genomas bacterianos ao mesmo tempo. Recentemente, o ProkEvo foi desenvolvido e é uma plataforma de bioinformática livremente disponível, automatizada, portátil e escalável que permite análises populacionais bacterianas de base hierárquica integrativa, incluindo mapeamento pan-genômico20. O ProkEvo permite o estudo de conjuntos de dados bacterianos de forma moderada a grande, ao mesmo tempo em que fornece uma estrutura para gerar hipóteses epidemiológicas e ecológicas testáveis e inferíveis e previsões fenotípicas que podem ser personalizadas pelo usuário. Este trabalho complementa esse pipeline ao fornecer um guia sobre como utilizar arquivos de saída derivados do ProkEvo como entrada para análises e interpretação de classificações populacionais hierárquicas e mineração genômica acessório. O estudo de caso aqui apresentado utilizou a população da linhagem Salmonella enterica I zoonotic serovar S. Newport como exemplo e foi especificamente destinada a fornecer diretrizes práticas para microbiologistas, ecologistas e epidemiologistas sobre como: i) usar uma abordagem automatizada dependente de filogenia para mapear genótipos hierárquicos; ii) avaliar a distribuição de frequência dos genótipos como proxy para avaliação da aptidão ecológica; iii) determinar graus específicos de clonalidade de linhagem utilizando abordagens estatísticas independentes; e iv) mapear a linhagem de linhagem amr loci como exemplo de como extrair conteúdo genômico acessório no contexto da estrutura populacional. De forma mais ampla, essa abordagem analítica fornece uma estrutura generalizável para realizar uma análise genômica baseada na população em uma escala que pode ser usada para inferir padrões evolutivos e ecológicos, independentemente das espécies-alvo.

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Protocol

1. Prepare arquivos de entrada

NOTA: O protocolo está disponível aqui - https://github.com/jcgneto/jove_bacterial_population_genomics/tree/main/code. O protocolo pressupõe que o pesquisador tenha usado especificamente o ProkEvo (ou um pipeline comparável) para obter as saídas necessárias disponíveis neste repositório Figshare (https://figshare.com/account/projects/116625/articles/15097503 - credenciais de login são necessárias - O usuário deve criar uma conta gratuita para ter acesso ao arquivo!). Note-se que o ProkEvo baixa automaticamente sequências genômicas do repositório NCBI-SRA e requer apenas um arquivo .txt contendo uma lista de identificações de genoma como uma entrada20, e a usada para este trabalho em S. Os isolados de Newport USA são fornecidos aqui (https://figshare.com/account/projects/116625/articles/15097503?file=29025729).  Informações detalhadas sobre como instalar e usar esta plataforma de genômica bacteriana estão disponíveis aqui (https://github.com/npavlovikj/ProkEvo/wiki/2.-Quick-start)20

  1. Gerar filogenia de genoma-núcleo usando FastTree23 como descrito anteriormente20, que não faz parte da plataforma de bioinformática20. FastTree requer o alinhamento roary24 núcleo-genoma como um arquivo de entrada. O arquivo filogenia é chamado newport_phylogeny.tree (https://figshare.com/account/projects/116625/articles/15097503?file=29025690).
  2. Gerar saída SISTR25 contendo as informações relativas às classificações serovars para Salmonella e dados de chamada variante cgMLST (sistr_output.csv - https://figshare.com/account/projects/116625/articles/15097503?file=29025699).
  3. Gerar arquivo BAPS por fastbaps 26,27 contendo os níveis BAPS 1-6 classificação de genomas em subgrupos ou haplotipos (fastbaps_partition_baps_prior_l6.csv - https://figshare.com/account/projects/116625/articles/15097503?file=29025684).
  4. Gerar classificação baseada em MLST de genomas em STs usando o programa MLST (https://github.com/tseemann/mlst)28 (salmonellast_output.csv - https://figshare.com/account/projects/116625/articles/15097503?file=29025696).
  5. Gerar saída ABRicate (https://github.com/tseemann/abricate)29 como um arquivo .csv contendo loci AMR mapeado por genoma (sabricate_resfinder_output.csv - https://figshare.com/account/projects/116625/articles/15097503?file=29025693).
    NOTA: O usuário pode desativar partes específicas do pipeline de bioinformática ProkEvo (verifique aqui para obter mais informações - https://github.com/npavlovikj/ProkEvo/wiki/4.2.-Remove-existing-bioinformatics-tool-from-ProkEvo). A abordagem analítica aqui apresentada fornece diretrizes para como realizar uma análise de base populacional após a execução do gasoduto bioinforático.

2. Baixe e instale o software estatístico e o aplicativo IDE (Integrated Development Environment, ambiente de desenvolvimento integrado)

  1. Baixe a versão mais atualizada e gratuitamente disponível do software R para Linux, Mac ou PC30. Siga as etapas padrão de instalação.
  2. Baixe a versão mais atualizada e gratuitamente disponível do RStudio desktop IDE aqui31. Siga as etapas padrão para instalação.
    NOTA: Os próximos passos estão incluídos no script disponível, incluindo informações detalhadas sobre a utilização do código, e devem ser executados sequencialmente para gerar as saídas e figuras apresentadas neste trabalho (https://github.com/jcgneto/jove_bacterial_population_genomics/blob/main/code/data_analysis_R_code.Rmd). O usuário pode decidir usar outra linguagem de programação para conduzir essa análise analítica/estatística, como python. Nesse caso, use as etapas nos scripts como uma estrutura para realizar a análise.

3. Instale e ative bibliotecas de ciência de dados

  1. Instale todas as bibliotecas de ciência de dados de uma só vez como um primeiro passo na análise. Evite instalar as bibliotecas sempre que o script precisar ser re-executado. Use a função install.packages() para instalação da biblioteca. Alternativamente, o usuário pode clicar na guia Pacotes dentro do IDE e instalar automaticamente os pacotes. O código usado para instalar todas as bibliotecas necessárias é apresentado aqui:
    # Instalar Tidyverse
    install.packages("tidyverse")
    # Instalar skimr
    install.packages("skimr")
    # Instalar vegan
    install.packages("vegan")
    # Instalar forcats
    install.packages("forcats")
    # Instalar naniar
    install.packages("naniar")
    # Instalar ggpubr
    install.packages("ggpubr")
    # Instalar ggrepel
    install.packages("ggrepel")
    # Instalar remodele2
    install.packages("remodele2")
    # Instalar RColorBrewer
    install.packages("RColorBrewer")
    # Instalar ggtree
    se (!requeronospace("BiocManager", silenciosamente = TRUE))
    install.packages("BiocManager")
    BiocManager::install("ggtree")
    # A instalação do ggtree solicitará uma pergunta sobre a instalação - a resposta é "a" para instalar/atualizar todas as dependências
  2. Ative todas as bibliotecas ou pacotes usando a função biblioteca no início do script, logo após a instalação. Aqui está uma demonstração sobre como ativar todos os pacotes necessários:
    Ative as bibliotecas e pacotes
    biblioteca (tidyverse)
    biblioteca (skimr)
    biblioteca (vegan)
    biblioteca (forcats)
    biblioteca (naniar)
    biblioteca (ggtree)
    biblioteca (ggpubr)
    biblioteca (ggrepel)
    biblioteca (remodele2)
    biblioteca (RColorBrewer)
  3. Suprimir a saída do código usado para instalação e ativação de bibliotecas e pacotes usando {r, incluir = FALSE} no mandril de código, da seguinte forma:
    ''' {r, include = FALSE}
    # Instalar Tidyverse
    install.packages("tidyverse")
    ```
    NOTA: Esta etapa é opcional, mas evita mostrar pedaços de código desnecessário no relatório final html, doc ou pdf.
  4. Para obter uma breve descrição das funções específicas de todas as bibliotecas, juntamente com alguns links úteis para coletar mais informações, consulte as etapas 3.4.1-3.4.11.
    1. Tidyverse - use esta coleção de pacotes utilizados para ciência de dados, incluindo entrada de dados, visualização, análise e agregação e modelagem estatística. Normalmente, ggplot2 (visualização de dados) e dplyr (disputa de dados e modelagem) são pacotes práticos presentes nesta biblioteca32.
    2. escaramuça - use este pacote para gerar estatísticas sumárias de quadros de dados, incluindo a identificação de valores faltantes33.
    3. vegan - use este pacote para análises estatísticas de ecologia comunitária, como o cálculo de estatísticas baseadas na diversidade (por exemplo, alfa e beta-diversidade)34.
    4. forcats - use este pacote para trabalhar com variáveis categóricas, como reordenar classificações. Este pacote faz parte da biblioteca Tidyverse32.
    5. naniar - use este pacote para visualizar a distribuição de valores ausentes entre variáveis em um quadro de dados, utilizando a função viss_miss()35.
    6. ggtree - use este pacote para a visualização de árvores filogenéticas36.
    7. ggpubr - use este pacote para melhorar a qualidade das visualizações baseadas em ggplot237.
    8. ggrepel - use este pacote para rotulagem de texto dentro dos gráficos38.
    9. remodele2 - use a função melt() deste pacote para a transformação de quadros de dados de amplo para longo formato39.
    10. RColorBrewer - use este pacote para gerenciar cores em visualizações baseadas em ggplot240.
    11. Use as seguintes funções básicas para análise de dados exploratórios: head() para verificar as primeiras observações em um quadro de dados, cauda() para verificar as últimas observações de um quadro de dados, is.na() para contar o número de linhas com valores faltantes em um quadro de dados, dim() para verificar o número de linhas e colunas em um conjunto de dados, tabela() para contar observações em uma variável, e soma() para contar o número total de observações ou instâncias.

4. Entrada e análise de dados

NOTA: Uma informação detalhada sobre cada etapa desta análise pode ser encontrada no script disponível (https://github.com/jcgneto/jove_bacterial_population_genomics/blob/main/code/data_analysis_R_code.Rmd). No entanto, aqui estão alguns pontos importantes a serem considerados:

  1. Faça toda a entrada de dados genômicos, incluindo todas as classificações genotipíticas (serovar, BAPS, ST e cgMLST) usando a função read_csv().
  2. Renomeie, crie novas variáveis e selecione colunas de interesse de cada conjunto de dados antes da agregação de vários conjuntos de dados.
  3. Não remova valores ausentes de nenhum conjunto de dados independente. Aguarde até que todos os conjuntos de dados sejam agregados para modificar ou excluir valores faltantes. Se novas variáveis forem criadas para cada conjunto de dados, os valores ausentes ão por padrão categorizados em uma das classificações recém-geradas.
  4. Verifique se há caracteres errados, como hífens ou marcas de interrogatórios e substitua-os por NA (Não aplicável). Faça o mesmo por valores perdidos.
  5. Dados agregados com base na ordem hierárquica dos genótipos (sorovar -> BAPS1 -> ST -> cgMLST), e por agrupamento com base nas identificações individuais do genoma.
  6. Verifique se faltam valores usando várias estratégias e lide com essas inconsistências de forma explícita. Remova apenas um genoma ou isole dos dados se a classificação não for confiável. Caso contrário, considere a análise que está sendo feita e remova as NAs caso a caso.
    NOTA: É altamente recomendável estabelecer uma estratégia para lidar com tais valores a priori. Evite remover todos os genomas ou isolados com valores perdidos em quaisquer variáveis. Por exemplo, um genoma pode ter classificação ST sem ter o número da variante cgMLST. Nesse caso, o genoma ainda pode ser usado para a análise baseada em ST.
  7. Uma vez que todos os conjuntos de dados são agregados, atribua-os a um nome ou objeto de quadro de dados que pode ser usado em vários locais na análise de acompanhamento, para evitar ter que gerar o mesmo arquivo de metadados para cada figura do papel.

5. Realizar análises e gerar visualizações

NOTA: Uma descrição detalhada de cada etapa necessária para produzir todas as análises e visualizações pode ser encontrada no arquivo de marcação deste papel (https://github.com/jcgneto/jove_bacterial_population_genomics/tree/main/code). O código para cada figura é separado em pedaços e todo o script deve ser executado sequencialmente. Além disso, o código para cada figura principal e suplementar é fornecido como um arquivo separado (ver Arquivo Suplementar 1 e Arquivo Suplementar 2). Aqui estão alguns pontos essenciais (com trechos de código) a serem considerados ao gerar cada número principal e suplementar.

  1. Use ggtree para traçar uma árvore filogenética juntamente com informações genotipópicas (Figura 1).
    1. Otimize o tamanho da figura ggtree, incluindo diâmetro e largura dos anéis, alterando os valores numéricos dentro das funções xlim() e gheatmap(largura =), respectivamente (veja o código do exemplo abaixo).
      tree_plot <-ggtree (árvore, layout = "circular") + xlim (-250, NA)
      figure_1 <-gheatmap(tree_plot, d4, offset=.0, largura=20, colnames = FALSE)
      NOTA: Para uma comparação mais detalhada de programas que podem ser usados para plotagem filogenética, verifique este trabalho20. O trabalho destacou uma tentativa de identificar estratégias para melhorar as visualizações baseadas em ggtree, como a diminuição do tamanho do conjunto de dados, mas os comprimentos dos galhos e a topologia das árvores não foram tão claramente discriminantes em comparação com o phandango41.
    2. Agrego todos os metadados em as poucas categorias possíveis para facilitar a escolha do painel de coloração ao traçar várias camadas de dados com a árvore filogenética (https://github.com/jcgneto/jove_bacterial_population_genomics/blob/main/code/figure_1.Rmd). Conduzir a agregação de dados com base na questão do interesse e conhecimento do domínio.
  2. Use um gráfico de barras para avaliar frequências relativas (Figura 2).
    1. Dados agregados para ambas as linhagens ST e variantes cgMLST para facilitar visualizações. Escolha um limiar empírico ou estatístico utilizado para agregação de dados, considerando a pergunta que está sendo feita.
    2. Para um código de exemplo que pode ser usado para inspecionar a distribuição de frequência de linhagens ST para determinar o corte ver abaixo:
      st_dist <- d2 %>% group_by(ST) %>% # grupo pela coluna ST
      contagem() %>% # conte o número de observações
      organizar(desc(n)) # organizar as contagens em ordem decrescente
    3. Para um código de exemplo que mostra como STs menores (de baixa frequência) podem ser agregados, consulte abaixo. Como demonstrado abaixo, as STs que não são numeradas como 5, 31, 45, 46, 118, 132 ou 350, são agrupadas como "Outras STs". Use um código semelhante para variantes cgMLST (https://github.com/jcgneto/jove_bacterial_population_genomics/blob/main/code/figure_2.Rmd).
      d2$st <-ifelse(d2$ST == 5, "ST5", # criar uma nova coluna ST para a qual S Ts menores são agregados como Outros
      ifelse(d2$ST == 31, "ST31",
      ifelse(d2$ST == 45, "ST45",
      ifelse(d2$ST == 46, "ST46",
      ifelse(d2$ST == 118, "ST118",
      ifelse(d2$ST == 132, "ST132", ifelse(d2$ST == 350, "ST350", "Outros STs"))))))
  3. Use uma abordagem aninhada para calcular a proporção de cada linhagem ST dentro de cada subgrupe BAPS1 para identificar STs que estejam relacionadas ancestralmente (pertencem ao mesmo subgrupe BAPS1) (Figura 3). O código abaixo exemplifica como a proporção baseada em ST pode ser calculada entre subgrupos BAPS1 (https://github.com/jcgneto/jove_bacterial_population_genomics/blob/main/code/figure_3.Rmd):
    baps <- d2b %>% filtro (serovar == "Newport") %>% # filtro Newport serovars
    selecionar (baps_1, ST) %>% # selecionar baps_1 e ST colunas
    mutação(ST = as.numérico(ST)) %>% # alterar coluna ST para numérica
    drop_na(baps_1, ST) %>% # queda NAs
    group_by(baps_1, ST) %>% # grupo por baps_1 e ST
    summarise(n = n()) %>% # observações de contagem
    mutação (prop = n/sum(n)*100) # proporções de cálculo
  4. Plote a distribuição de loci AMR através das linhagens ST usando os resultados de anotação genética baseada em Resfinder (Figura 4).
    NOTA: O Resfinder tem sido amplamente utilizado em estudos ecológicos e epidemiológicos42. A anotação de genes codificadores de proteínas pode variar dependendo da frequência com que os bancos de dados são curados e atualizados. Se usar o pipeline de bioinformática sugerido, o pesquisador pode comparar classificações loci baseadas em AMR em diferentes bancos de dados20. Certifique-se de verificar quais bancos de dados estão sendo continuamente atualizados. Não use bancos de dados desatualizados ou mal curados, a fim de evitar erros de chamadas.
    1. Use um limiar empírico ou estatístico para filtrar o loci AMR mais importante para facilitar visualizações. Forneça um arquivo de .csv bruto contendo as proporções calculadas de todos os loci AMR em todas as linhagens ST, como mostrado aqui (https://figshare.com/account/projects/116625/articles/15097503?file=29025687).
    2. Calcule a proporção AMR para cada ST usando o seguinte código (https://github.com/jcgneto/jove_bacterial_population_genomics/blob/main/code/figure_4.Rmd):
      # Cálculos para ST45
      d2c <- data6 %>% filtro(st == "ST45") # filtrar os dados ST45 primeiro
      # para ST45, calcule a proporção de AMR loci e só mantenha proporção superior a 10%
      d3c <- d2c %>% selecionar (id, gene) %>% # colunas selecionadas
      group_by(id, gene) %>% # grupo por id e gene
      summarize (contagem = n()) %>% # observações de contagem
      mutação (contagem = substituição(contagem, contagem == 2, 1)) %>% # substituir contagens iguais a 2 por 1 considerar apenas uma cópia de cada gene (duplicações podem não ser confiáveis), mas o pesquisador pode decidir excluí-las ou mantê-las. Se o pesquisador quiser excluí-los, use a função filter (contagem != 2) ou então deixe como está
      filtro (contagem <= 1) # contagem de filtros abaixo ou igual a 1
      d4c <- d3c %>% group_by%>% # grupo por gene
      summarize (valor = n()) %>% # observações de contagem
      mutação (total = tabela(data1$st)[6]) %>% # obter as contagens totais de st mutate(prop = (valor/total)*100) # proporções de cálculo
      d5c <- d4c %>% mutação (st = "ST45") # crie uma coluna st e adicione informações st
    3. Após os cálculos serem feitos para todos os STs, combine conjuntos de dados como um quadro de dados, usando o seguinte código:
      Combine conjuntos de dados
      d6 <-rbind(d5a, d5b, d5c, d5d, d5e, d5f, d5g, d5h) # conjuntos de dados de ligação de linha
    4. Para exportar o arquivo .csv contendo as proporções calculadas, use o código:
      # Tabela de dados de exportação contendo informações de loci ST e AMR
      abx_newport_st <- d6 escrever.csv(abx_newport_st,"abx_newport_st.csv", row.names = FALSE)
    5. Antes de traçar a distribuição baseada em AMR através de linhagens ST, filtrar os dados com base em um limiar para facilitar visualizações, como mostrado abaixo:
      # Filtro AMR loci com proporção maior ou igual a 10%
      d7 <- d6 % >% filtro (prop >= 10) # determinar o limiar empiricamente ou estatisticamente
  5. Plote a filogenia do genoma-núcleo juntamente com as classificações genotiplicas hierárquicas e dados AMR em um único plot usando ggtree (Figura 5).
    1. Otimize o tamanho da figura dentro do ggtree usando os parâmetros acima mencionados (ver passo 5.1.1.).
    2. Otimizar visualizações através de variáveis agregando, ou usando classificação binária, como presença genética ou ausência. Quanto mais recursos são adicionados ao enredo, mais difícil fica o processo de seleção de coloração (https://github.com/jcgneto/jove_bacterial_population_genomics/blob/main/code/figure_5.Rmd).
      NOTA: Figuras suplementares - descrição detalhada de todo o código podem ser encontradas aqui (https://github.com/jcgneto/jove_bacterial_population_genomics/blob/main/code/data_analysis_R_code.Rmd).
  6. Use um gráfico de dispersão em ggplot2, sem agregação de dados, para exibir a distribuição de linhagens ST ou variantes cgMLST, destacando os genótipos mais frequentes (Figura Suplementar 1) (https://github.com/jcgneto/jove_bacterial_population_genomics/blob/main/code/supplementary_figure_s1.Rmd).
  7. Faça uma análise aninhada para avaliar a composição das linhagens ST através da proporção de variantes cgMLST, a fim de obter um vislumbre da diversidade genética baseada em ST, ao mesmo tempo em que identifica as variantes mais frequentes e suas relações genéticas (ou seja, variantes cgMLST que pertencem ao mesmo ST compartilharam um ancestral mais recentemente do que aquelas pertencentes a STs distintas) (Figura Suplementar 2 ) (https://github.com/jcgneto/jove_bacterial_population_genomics/blob/main/code/supplementary_figure_s2.Rmd).
  8. Use a métrica de ecologia comunitária, ou seja, o índice D de diversidade de Simpson, para medir o grau de clonalidade ou diversidade genotipada de cada uma das principais linhagens ST43 (Figura Suplementar 3).
    1. Calcule o índice de diversidade entre as linhagens ST em diferentes níveis de resolução genotipítica, incluindo o BAPS nível 1 a 6 e o cgMLST. Abaixo está o exemplo de código sobre como fazer este cálculo no baps nível 1 (BAPS1) de resolução genotipa:
      # BAPS nível 1 (BAPS1)
      # solte os STs e BAPS1 com NAs, grupo por ST e BAPS1 e, em seguida, calcule o índice de Simpson
      baps1 <- dados6 %>%
      selecionar (st, BAPS1) %>% # selecionar colunas
      drop_na(st, BAPS1) %>% # queda NAs
      group_by(st, BAPS1) %>% # grupo por colunas
      summarise(n = n()) %>% # observações de contagem
      mutação (simpson = diversidade(n, "simpson")) %>% # calcular diversidade
      group_by(st) %>% # grupo por coluna
      summarise(simpson = média(simpson)) %>% # calcular a média do índice
      melt (id.vars=c("st"), measure.vars="simpson",
      variable.name="índice", value.name="valor") %>% # encoberto em formato longo
      mutação (estratos = "BAPS1") # criar uma coluna de estratos
      NOTA: Uma população mais geneticamente diversificada (ou seja, mais variantes em diferentes camadas de resolução genotipítica) tem um índice mais elevado no nível cgMLST e produz um aumento dos valores baseados em índices indo do nível BAPS 2 para 6 (https://github.com/jcgneto/jove_bacterial_population_genomics/blob/main/code/supplementary_figure_s3.Rmd).
  9. Examine o grau de diversidade genotipípica das linhagens ST, traçando a frequência relativa dos subgrupos BAPS em todos os níveis de resolução (BAPS1-6) (Figura Suplementar 4). Quanto mais diversificada for a população, menor é a distribuição de subgrupos baps (haplotipos) passando de BAPS1 (menor nível de resolução) para BAPS6 (maior nível de resolução) (https://github.com/jcgneto/jove_bacterial_population_genomics/blob/main/code/supplementary_figure_s4.Rmd).

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Representative Results

Utilizando a plataforma computacional ProkEvo para análises de genômica populacional, o primeiro passo na mineração de dados bacterianas do WGS é composto por examinar a estrutura populacional hierárquica no contexto de uma filogenia núcleo-genoma (Figura 1). No caso de S. linhagem enterica I, como exemplificado pelo S. O conjunto de dados de Newport, a população é hierarquicamente estruturada da seguinte forma: sorovar (nível mais baixo de resolução), subgrupos BAPS1 ou haplotipos, linhagens ST e variantes cgMLST (maior nível de resolução)20. Esta análise guiada por filogenia da estrutura populacional hierárquica permite especificamente que os seguintes pontos sejam examinados: i) distribuição filogenética de genomas mal classificados à base de SISTR em outros serovars no caso de Salmonella; ii) estrutura genética ou de parentesco da população; iii) padrão de diversificação em diferentes níveis de resolução genotipápica; iv) identificação das principais unidades genotípicas subjacentes a padrões evolutivos, ecológicos ou epidemiológicos; v) relações ancestrais entre linhagens ST através de subgrupos BAPS1 ou composição de haplotipos, e através de variantes cgMLST dentro de linhagens ST; e vi) visão parcial do grau de homogeneidade genotipítica de uma linhagem ST pela composição da variante cgMLST.

Figure 1
Figura 1: Mapeamento guiado por filogenia de genótipos hierárquicos para o S. População de Newport. Um filogenia de genoma-núcleo (círculo centrado negro) foi usado para mapear genótipos hierárquicos, incluindo sorovar (nível mais baixo de resolução - círculo de cor mais interna), subgrupos baps nível 1 (BAPS1) ou haplotipos, linhagens ST e variantes cgMLST (mais alto nível de resolução - círculo de cor mais externa). Serovars foram agrupados em Newport (S. Newport) ou "Outros serovars" baseados na classificação algorítmica SISTR de genomas, que utilizavam informações MLST do genoma central, e funcionavam como parte da plataforma computacional ProkEvo. O BAPS1 estratifica a população em subgrupos ou aglomerados de haplotipos relacionados usando dados genômicos do núcleo dentro do ProkEvo. O BAPS1 é hierarquicamente colocado entre linhagens de sorovar e ST porque capturou com precisão as relações ancestrais entre as linhagens ST são formadas com base na análise canônica do MLST usando sete locis espalhadas por genoma. Apenas as TS maiores ou mais frequentes (proporção >1%) foram retratadas no gráfico. Por fim, apenas as variantes cgMLST mais frequentes (proporção >3,5%) foram utilizadas para mostrar toda a estrutura hierárquica para o S. População de Newport (n = 2.365 EUA isolados apenas). A categoria "Outros STs" ou "Outros cgMLSTs" constituída por linhagens ou variantes menores ou de baixa frequência, respectivamente, com limiares feitos arbitrariamente que devem ser definidos empiricamente ou estatisticamente com base no conjunto de dados. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Frequências relativas de todos os genótipos hierárquicos foram então utilizadas para avaliar a distribuição geral e as classificações mais frequentes observadas (ou seja, genótipos) (Figura 2). Na Figura 2C-D, as linhagens ST menos frequentes (menores) ou as variantes cgMLST foram agregadas como "Outros STs" ou "Outros cgMLSTs", respectivamente, a fim de facilitar a visualização de dados (redução de dimensionalidade). Se a amostragem for feita sistematicamente em ambientes e/ou hospedeiros e for adequadamente alimentada estatisticamente, a distribuição de frequências pode se tornar um proxy para o condicionamento ecológico. Ou seja, as linhagens ou variantes mais frequentes poderiam então ser previstas para ter maior aptidão, após uma investigação mais aprofundada para determinar os determinantes genéticos causadores subjacentes a tal traço quantitativo 6,30.

Figure 2
Figura 2: Proporção de S. Genótipos hierárquicos de Newport em diferentes níveis de resolução. (A) Serovars são fenótipos do S. linhagem enterica I população que pode ser prevista apenas a partir de dados genômicos-núcleo devido ao desequilibrium de ligação herdável entre core-loci e O e H antigênico-codificação loci (proteínas superficiais). Ao usar ProkEvo, os genomas salmonela são automaticamente classificados para serovadores usando o programa SISTR. Embora apenas S. Os genomas de Newport (Newport) da NCBI foram baixados putativamente, alguns foram classificados como "Outros serovars" dentro do ProkEvo. Aproximadamente 2% (48 de 2.365) de todos os genomas foram classificados como outros que S. Newport Serovar. (B) A proporção de subgrupos ou haplotipos baps nível 1 (BAPS1). BAPS1 é inserido entre linhagens de serovar e ST no esquema hierárquico porque capturou com precisão e agnosticamente as relações ancestrais entre as TS. (C) A proporção das principais linhagens ST representava apenas as TS que eram > 1% em frequência relativa. As STs menores foram agrupadas como "Outros STs". (D) A proporção de variantes principais de CGMLST mostrou apenas quatro cgMLSTs predominantes que foram >3% em frequência relativa. Os demais CGMLSTs foram agrupados como "Outros cgMLSTs". (B-D) Os genomas classificados pelo SISTR como "Outros serovars" (2,03%) foram filtrados dos dados antes de traçar frequências relativas BAPS1, ST e cgMLST. (C-D) Os limiares utilizados para traçar os dados ST e cgMLST foram arbitrariamente definidos e devem ser estabelecidos empiricamente caso a caso. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Alternativamente, um gráfico de dispersão pode ser utilizado para avaliar a distribuição e proporção de ambas as linhagens ST ou variantes cgMLST, sem qualquer agregação de dados (Figura Suplementar 1). Este uso de um gráfico de dispersão é particularmente útil para linhagens ST e variantes cgMLST devido à ocorrência típica de centésimos, se não milhares, classificações para ambos os genótipos. Esta distribuição esparsa geralmente não ocorre para os níveis de resolução serovar e BAPS1, porque eles estão em um nível mais baixo de resolução com sequências herdáveis em colapso em alguns subgrupos ou categorias.

Em seguida, as relações ancestrais entre as TS foram examinadas por meio de uma abordagem aninhada que abrange a avaliação da frequência relativa das linhagens ST por subgrupos BAPS1 ou haplotipos (Figura 3). As linhagens ST que pertenciam ao mesmo subgrupe BAPS1 eram mais propensas a ter compartilhado um ancestral comum mais recentemente do que com outras STs (ou seja, ST5 e ST118 vs. ST45). Da mesma forma, examinando a distribuição das variantes cgMLST dentro das linhagens ST, o grau de heterogeneidade genotípica entre as TS pode ser capturado, ao mesmo tempo em que avalia sua composição genética e revela a relação ancestral entre cgMLSTs (ou seja, variantes cgMLST intimamente relacionadas pertencem à mesma linhagem ST ou complexo clonal) (Figura Suplementar 2).

Figure 3
Figura 3: Distribuição de linhagens ST aninhadas dentro de subgrupos BAPS1 para o S. População de Newport. Este enredo retrata a distribuição de linhagem ST dentro de cada subgrupe ou haplotipo baps nível 1, excluindo genomas classificados como "Outros serovars" (2,03% de todos os dados). As Principais STs (proporção >1%) para cada subgrupe BAPS1 são destacadas em cada gráfico. Quanto maior o diâmetro do círculo, maior a proporção para a linhagem ST particular. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Dado que o padrão de S. A diversificação populacional de Newport parecia ser principalmente impulsionada pela composição de ST (Figura 1), duas abordagens estatísticas foram utilizadas para avaliar o grau de clonalidade baseado em ST (ou seja, homogeneidade genética), incluindo o índice D de diversidade de Simpson (Figura Suplementar 3), e a distribuição de subgrupos ou haplotipos baps usando os níveis de BAPS 1-6 (Figura Suplementar 4) ). Avaliar o grau de clonalidade de uma população pode elucidar os seguintes aspectos: i) uma melhor compreensão da diversidade genética e da estrutura populacional; ii) análise de ajuste fino dos padrões de diversificação entre as principais unidades genotipas, como as linhagens ST; e iii) ser um indicador da necessidade de utilização da mineração de genomas acessórios para encontrar unidades genotípicas enigmáticas que possam revelar novos subgrupas presentes na população. Quanto mais clonal uma população estiver no nível do genoma central, mais difícil se torna diferenciar entre variantes, e maior a probabilidade de o conteúdo do genoma acessório ser informativo para estratificar a população em unidades genotippicas significativas associadas a distribuições ecológicas únicas 18,19,21.

A frequência relativa da linhagem ST diferenciando o AMR loci foi avaliada para identificar assinaturas genômicas acessórios únicas ligadas ao S. Estrutura populacional de Newport (Figura 4). Esta etapa da análise foi focada na distribuição da RM porque é um traço associado à Saúde Pública, mas a mesma abordagem pode ser aplicada de forma supervisionada (direcionada) ou agnóstica para examinar outros componentes do genoma acessório, incluindo vias metabólicas, fatores de virulência, etc. Notavelmente, mdf(A)_1 e aac(6')-Iaa_1 loci parecem ser adquiridos ancestralmente pelo S. População de Newport; que, se prevê que o ST45 seja resistente a vários medicamentos. Surpreendentemente, esses dados também sugerem que as outras principais linhagens ST, ST5 e ST118, são mais propensas a serem multidrogas suscetíveis quando comparadas ao ST45. Esses pontos devem ser cuidadosamente considerados devido aos vieses presentes no conjunto de dados; no entanto, isso representa uma potencial inferência epidemiológica que poderia ser feita a partir de coleções de dados WGS mais robustas.

Em geral, aqui estão alguns pontos a serem considerados ao realizar um mapeamento do genoma acessório em genótipos hierárquicos: i) considerar a distribuição de frequências como um traço quantitativo, mas estar ciente de que a composição aleólica de um lócus pode alterar a variância do traço. Além disso, a presença de lócus ou lóci deve ser indicativa de função, mas não causal, pois o fenótipo pode ser poligênico, ou variar de acordo com a composição arélica para o lócus causal (por exemplo, uma mutação não sinônimo no local ativo de uma proteína é mais provável que afete a função); ii) a distribuição de loci pode demonstrar genes fixados na população (por exemplo, encontrados em alta frequência em todas as linhagens ST) ou recentemente adquiridos por linhagens ST específicas e variantes cgMLST, podendo refletir o padrão ecológico ou epidemiológico; iii) a resistência a várias drogas pode ser prevista a partir de dados genômicos. E se a distribuição de AMR loci, ou outras vias, estiver fortemente ligada ou comumente herdada por linhagens específicas, então fenótipos podem ser previstos por inferência de genótipos hierárquicos, como no caso das linhagens ST45,46; e iv) medir fenótipos em laboratório ainda é determinista para validar previsões computacionais.

Figure 4
Figura 4: Distribuição de LOCI AMR através das principais linhagens ST do S. População de Newport. Distribuição relativa baseada em frequência de um número selecionado de loci AMR através das principais linhagens ST (>1% da população). As STs menores foram agrupadas como "Outros STs". Apenas genomas classificados como S. Newport pelo algoritmo SISTR foram mantidos na análise. Foram selecionados loci AMR com frequência relativa maior ou igual a 10% para visualização de dados. Este é um limiar arbitrário que deve ser determinado para cada conjunto de dados. As proporções foram calculadas utilizando-se uma matriz binária composta de presença ou ausência genética. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Por fim, foi utilizada uma visualização ancorada em filogenia para integrar sistematicamente os dados hierárquicos da estrutura populacional, juntamente com a linhagem ST diferenciando a distribuição de locis AMR com base na ocorrência genética (Figura 5). Ao combinar a estrutura populacional juntamente com a composição genômica acessório, o seguinte conjunto de questões pode ser abordado em qualquer conjunto de dados: 1) Como a população está estruturada? Como as STs se relacionam entre si e ancestralmente através de subgrupos BAPS1? Qual a variável composição do CGMLST entre os STs? 2) Qual é o padrão de ramificação filogenética e a topologia geral das árvores? e 3) Como o genoma do acessório é distribuído? A composição genômica do acessório é provavelmente adquirida ancestralmente ou recém-derivada? Qual é o padrão específico de linhagem ou variante? Qual é a previsão fenotípica e inferência ecológica? Existe um nicho transcendendo vs. genes especificados de nicho? Como o padrão observado relaciona ou informa a epidemiologia no caso dos patógenos? As linhagens ou variantes podem ser informativamente subacotadas com base no conteúdo genômico do acessório?

Figure 5
Figura 5: Mapeamento guiado por filogenia de genótipos hierárquicos e acessórios AMR loci diferenciando entre as principais linhagens ST dentro do S. População de Newport. Um filogenia de genoma-núcleo (círculo centrado preto) foi usado para mapear genótipos hierárquicos, incluindo seróvar (nível mais baixo de resolução - círculo mais colorido), subgrupos baps nível 1 (BAPS1) ou haplotipos, linhagens ST e variantes cgMLST (mais alto nível de resolução - círculo mais colorido externo), juntamente com amr loci colorido como azul-escuro se presente ou cinza se ausente. Serovars foram agrupados em Newport (S. Newport) ou "Outros serovars" com base na classificação algorítmica SISTR. O BAPS1 é hierarquicamente colocado entre linhagens de sorovar e ST porque capturou com precisão e agnosticamente as relações ancestrais entre as linhagens ST são formadas com base na análise canônica do MLST usando sete locis dispersos por genoma. Apenas as TS maiores ou mais frequentes (proporção >1%) foram retratadas no gráfico. Além disso, apenas as variantes mais dominantes do CGMLST (proporção >3,5%) foram utilizadas para mostrar toda a estrutura hierárquica para o S. População de Newport (n = 2.365 EUA isolados apenas). A categoria "Outros STs" ou "Outros cgMLSTs" constituída por linhagens ou variantes menores ou de baixa frequência, respectivamente, e o limiar foi feito arbitrariamente e deve ser definido com base no conjunto de dados. Foram selecionados loci AMR com frequência relativa maior ou igual a 10% para visualização de dados. Este gráfico específico mostra uma distribuição única das linhagens AMR loci predominantemente ocorrendo nas linhagens ST31, ST45 e ST132. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura suplementar 1: Distribuição esparsa das linhagens ST e variantes cgMLST para o S. População de Newport. (A) A proporção de linhagens ST sem agregar STs. STs de baixa frequência com proporção >1% são destacadas na trama. (B) A proporção de variantes cgMLST sem agregar cgMLSTs de baixa frequência. cgMLSTs com proporção > 3% são destacados na parcela. (A-B) Os limiares utilizados para traçar os dados ST e cgMLST foram arbitrariamente definidos e devem ser estabelecidos com base no conjunto de dados. Os genomas classificados pelo SISTR como "Outros serovars" (2,03%) foram filtrados dos dados antes de traçar as frequências relativas ST e cgMLST. Quanto maior o diâmetro do círculo, maior a proporção da linhagem ST ou da variante cgMLST. Clique aqui para baixar este Arquivo.

Figura suplementar 2: Distribuição de variantes cgMLST aninhadas dentro das linhagens ST para o S. População de Newport. Este enredo retrata a distribuição da variante cgMLST entre as linhagens ST, excluindo genomas classificados como "Outros serovars" (2,03% de todos os dados). Os cgMLSTs principais (proporção >15%) para cada linhagem ST são destacados em cada gráfico. Quanto maior o diâmetro do círculo, maior a proporção para a variante específica do CGMSLT. As STs de baixa frequência foram agrupadas como "Outros STs". Clique aqui para baixar este Arquivo.

Figura suplementar 3: O grau de diversidade genética baseado em D de Simpson em linhagens ST usando níveis BAPS 1-6 haplotipos ou genótipos cgMLST como dados de entrada para o S. População de Newport. O grau de clonalidade ou diversidade genética de cada linhagem ST foi calculado em diferentes camadas genotipadas de resolução, incluindo os níveis de BAPS 1 (menor nível de resolução) a 6 (maior nível de resolução) subgrupos ou haplotipos, e usando adicionalmente a distribuição baseada em cgMLST de variantes. Quanto maior o valor do índice, maior o grau de diversidade genética. As linhagens ST altamente diversas têm valores de índice mais elevados indo de BAPS1 a BAPS6 (ou seja, tipicamente o índice aumenta e eventualmente planalto quando vai de BAPS1 para BAPS6). Apenas genomas classificados como S. Newport pelo programa SISTR foram mantidos na análise. As STs de baixa frequência foram agrupadas como "Outros STs". Clique aqui para baixar este Arquivo.

Figura suplementar 4: Distribuição dos níveis de BAPS 1-6 subgrupos ou haplotipos através das principais linhagens ST da população de S. Newport. Distribuição relativa baseada em frequência de subgrupos ou haplotipos baps, através das principais linhagens ST, do menor (BAPS1) ao mais alto nível de resolução (BAPS6). As Principais STs foram selecionadas com base em uma proporção >1%. Apenas genomas classificados como S. Newport pelo programa SISTR foram mantidos na análise. Quanto maior o grau de clonalidade, menos esparso ou disseminação da distribuição de subgrupos ou haplotipos de BAPS se torna quando vai de BAPS1 para BAPS6. Em outras palavras, uma linhagem ST mais geneticamente diversificada tem uma gama mais ampla de subgrupos BAPS no nível BAPS 6 (maior grau de resolução). As STs de baixa frequência foram agrupadas como "Outros STs". Clique aqui para baixar este Arquivo.

Arquivo suplementar 1: Links para lista de materiais e lista de genomas Clique aqui para baixar este Arquivo.

Arquivo suplementar 2: Análise de genômica da população bacteriana baseada em hierarquia usando R Por favor clique aqui para baixar este Arquivo.

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Discussion

A utilização de uma análise heurística e hierárquica da estrutura populacional baseada em sistemas fornece uma estrutura para identificar novas assinaturas genômicas em conjuntos de dados bacterianos que têm o potencial de explicar padrões ecológicos e epidemiológicos únicos20. Além disso, o mapeamento de dados do genoma acessório na estrutura populacional pode ser usado para inferir traços adquiridos ancestralmente e/ou recém-derivados que facilitem a disseminação de linhagens ST ou variantes cgMLST nos reservatórios 6,20,21,45,46. De forma mais ampla, uma avaliação global da distribuição de conteúdo pan-genômico em populações bacterianas pode revelar padrões de diversificação que estão por trás dos tropismos ecológicos ou gargalos geoespaciais/temporais que uma população poderia ter recentemente resistidoa 18,21. No caso das espécies patogênicas, por meio da mineração da estrutura populacional de isolados clínicos versus ambientais, os determinantes genéticos associados a eventos zoonóticos podem ser identificados e utilizados para melhorar o diagnóstico e a vigilância33,34. A mesma abordagem pode ser aplicada a espécies não patogênicas para identificar genótipos com propriedades de engrafia específicas de nicho desejáveis, como no caso de cepas probióticas gastrointestinais usadas para melhorar a saúde humana 49,50,51. No entanto, a utilização de dados WGS bacterianos para consultas de base populacional requer o uso de plataformas computacionais reprodutíveis, automatizadas e escaláveis, como o ProkEvo20. Qualquer abordagem computacional vem com suas ressalvas e nuances, mas, em geral, plataformas livremente disponíveis, bem documentadas, portáteis e fáceis de usar, como o ProkEvo, podem facilitar o trabalho de microbiologistas, ecologistas e epidemiologistas que fazem genômica heurística bacteriana baseada na população.

No presente trabalho, foi demonstrado como usar saídas derivadas do ProkEvo para realizar uma análise hierárquica da estrutura populacional que pode ser usada para mapear e rastrear genótipos de interesse em diferentes níveis de resolução, além de prever traços úteis dos dados do WGS. Este protocolo computacional foi escrito usando a linguagem de programação R, mas a estrutura ou abordagem conceitual é generalizável para outras linguagens, como python através da utilização da biblioteca Pandas, por exemplo. Os dados de entrada são gerados pelo ProkEvo20, o que impede que alguns obstáculos sejam enfrentados em termos de padronização de saídas e formatos de dados para análise subsequente. Com exceção dos filogenies, todos os outros conjuntos de dados de entrada vêm em um formato tabular que pode ser facilmente controlado, agregado, analisado e integrado para gerar relatórios úteis para interpretação de dados. No entanto, é importante destacar algumas etapas críticas para melhorar a reprodutibilidade ao usar este protocolo: i) certificar-se de que as versões do software estão sempre atualizadas e rastreadas; ii) acompanhar as versões das bibliotecas de ciência de dados que estão sendo utilizadas e, preferencialmente, atualizá-las ao longo do tempo; iii) controle de qualidade dos dados utilizando a expertise de conhecimento de domínio para dar sentido às saídas geradas pelo ProkEvo, ou um pipeline semelhante, à luz do que é entendido para a população bacteriana alvo; iv) realizar uma análise exploratória de dados antes do uso de qualquer abordagem de modelagem; v) agregar os dados com base em conhecimentos empíricos e/ou avaliações estatísticas; vi) definir uma estratégia para lidar com valores perdidos a priori e ser consistente e completamente transparente sobre isso; vii) se utilizar R, tente utilizar todos os pacotes fornecidos pela Tidyverse, pois essa coleção facilita a programação funcional, portabilidade, otimização e está livremente disponível; e viii) esteja ciente de que abordagens de visualização podem ser difíceis porque é preciso alguma tentativa e erro para obter o tipo certo de esquema de plot e coloring que é mais apropriadamente aplicável para a pergunta que está sendo feita e os dados que estão sendo retratados.

Note-se que este protocolo vem com algumas limitações que podem ser melhoradas ainda mais. Por exemplo, o ProkEvo tem um limite intrínseco para quantos genomas podem ser usados para análise pan-genômica, se o passo de alinhamento núcleo-genoma for gerado concomitantemente, ao mesmo tempo em que utiliza o programa Roary (~ 2.000-3.000 genomas)24. Esse é um gargalo muito específico no pipeline que afetará o número de genomas que podem ser classificados em haplotipos BAPS, uma vez que depende do alinhamento núcleo-genoma (ou seja, passo altamente computacionalmente exigente). No entanto, o alinhamento núcleo-genoma pode ser feito com outros programas52, e tais algoritmos, em teoria, poderiam ser facilmente incorporados ao ProkEvo. Caso contrário, os conjuntos de dados podem ser divididos estrategicamente em subconjuntos aleatórios, ou em outra base, como considerando a estrutura populacional do organismo em questão. Alternativamente, prokEvo pode ser executado com um único genoma para obter anotação baseada em ST, resistência a antibióticos e composição genética de virulência, e mapeamento de plasmídeos, mas o pipeline foi projetado para genômica de base populacional. Notáveis, se as classificações BAPS1-6 não forem necessárias, então a opção de alinhamento núcleo-genoma de Roary pode ser desligada, e nesse caso, o ProkEvo pode ser usado com muitos centésimos de milhares de genomas - ele é limitado apenas com base no número de núcleos de computador disponíveis. Um exemplo de como implementar um novo programa ou como desativar a opção de alinhamento núcleo-genoma em Roary dentro do ProkEvo pode ser encontrado nos seguintes links gitHub (https://github.com/npavlovikj/ProkEvo/wiki/4.1.-Add-new-bioinformatics-tool-to-ProkEvo) e (https://github.com/npavlovikj/ProkEvo/wiki/4.3.-Change-running-options-for-existing-tool-in-ProkEvo), respectivamente. No caso da mineração genômica acessório, uma análise agnóstica depende da utilização da pan-genômica. Arquivo Rtab gerado pelo Roary24, que não foi especificamente usado aqui, mas, em vez disso, foi estrategicamente demonstrado como mapear o AMR loci com o ABRicate usando o banco de dados Resfinder (https://github.com/tseemann/abricate). No entanto, há uma opção para expandir o escopo do mapeamento genômico do acessório usando um arquivo pan-genômico, que pode ser praticamente visto como uma expansão da abordagem atual (por exemplo, mais loci incluído no conjunto de dados tabular como novas colunas). É importante mencionar que o mapeamento pan-genômico feito pelo ProkEvo apenas forneceu informações binárias em termos de composição de loci, e atualmente, não pode ser usado para a identificação de polimorfismos de nucleotídeos únicos entre genes.

Outra limitação deste protocolo é a visualização da árvore filogenética. Atualmente, ggtree é o programa de escolha, mas isso vem ao custo de ser incapaz de inspecionar com precisão os comprimentos do ramo e se torna complicado quando muitas camadas de dados precisam ser adicionadas à filogenia. Alternativamente, o phandango41 é uma GUI formatada de web amigável e escalável (https://jameshadfield.github.io/phandango/#/)41 que poderia ser facilmente usada para atingir o mesmo objetivo, e informações mais detalhadas sobre como usá-la com saídas ProkEvo são publicadas recentemente20. Outras ferramentas como o iTOL também podem ser usadas para visualização dependente de filogenia dos dados53, mas exigem o uso de uma GUI e não podem ser incorporadas em scripts automatizados. Além disso, filogenias de genoma-núcleo precisa podem ser difíceis de estimar devido ao impacto enigmático dependente do conjunto de dados da transferência de genes horizontais. Programas como o Gubbins54 podem ser usados para esse fim, mas também vêm com certas limitações, como a necessidade de usar o alinhamento do genoma inteiro e conjuntos de dados específicos da linhagem ST para a estimativa correta de filogenias. Em vez disso, outras abordagens filogenia-independentes podem ser implantadas, que acabam exigindo outros tipos de visualizações para integrar metadados ou informações genômicas acessórias, como no caso da análise multidimensional55,56. Por fim, utilizou-se uma abordagem empírica e arbitrária para agregar pequenas linhagens ST e variantes cgMLST, além de filtrar o loci AMR mais importante a ser quantificado. Esse tipo de agregação de dados pode ser feito empiricamente usando a expertise em conhecimento de domínio, mas também pode ser alcançado estatisticamente definindo um critério de priori da proporção da distribuição que deve ser exibida, ou usando métricas relacionadas à distribuição, como alcance interquartil, desvio padrão ou distorção, para definir, em última instância, um limiar. É importante ressaltar que a definição para genótipos menores é diretamente influenciada pela natureza dos dados desde o tamanho da amostra, e o viés nos tipos de amostras ambientais pode influenciar diretamente a composição genotipa. Independentemente disso, a principal consideração é que o mapeamento do conteúdo do genoma acessório na estrutura populacional permite identificar potenciais determinantes genéticos da diversificação ecológica, como genes transcendedores de nicho ou especificadores de nicho 57,58,59.

Embora os scripts R disponíveis tenham sido projetados para automação do presente trabalho, todos os scripts fornecidos precisariam ser desenvolvidos para se tornar uma biblioteca de ciência de dados abstrata e implantável, que poderia, por exemplo, ser parte integrante do pipeline ProkEvo. No entanto, existem algumas vantagens específicas de utilizar essa abordagem, como o uso do esquema de genotipagem ou clustering nível 1 do BAPS. A colocação de subgrupos baps nível 1 ou haplotipos entre linhagens de sorovar e ST foi definida empiricamente com base na estrutura genética da população salmonela, mas parece ser aplicável a outras espécies como Campylobacter jejuni e Staphylococcus aureus20. Além disso, o BAPS1 captura com precisão a relação ancestral entre as linhagens ST e fornece uma abordagem escalável para análise evolutiva, especialmente quando as aplicações filogenéticas são limitadasa 20. Além disso, o uso de uma abordagem aninhada para examinar relações hierárquicas e padrões de diversificação facilita a identificação de ancestrais entre as linhagens ST utilizando subgrupos BAPS1, e através das variantes cgMLST utilizando linhagens ST, indo sucessivamente de menor para maior resolução genotipada na avaliação da estrutura populacional. É importante reiterar que a distribuição de frequências de linhagens ST e variantes cgMLST, se extraída de uma amostra sistematicamente coletada e estatisticamente alimentada, pode se tornar um proxy para a aptidão ecológica 1,6,43. Consequentemente, as linhagens ST dominantes e as variantes cgMLST provavelmente contêm características genômicas únicas que podem ser a base do mecanismo biológico para sua dominância na população naquele ambiente ou hospedeiro particular.

Aqui, duas métricas estatísticas independentes foram utilizadas para avaliar o grau de clonalidade da população, o que permite uma compreensão auxiliar da diversidade genética populacional, o que pode indicar a ocorrência passada de viés amostral, gargalos populacionais ou efeito fundador. Em particular, a avaliação agnóstica dos subgrupos BAPS 1-6 através das linhagens ST pode refinar a compreensão da diversidade genética que normalmente não pode ser resolvida simplesmente olhando para o nível de variante Salmonella cgMLST gerado pelo SISTR. Como mencionado anteriormente, outras características do pan-genoma podem ser mapeadas na estrutura populacional e arquivos contendo composição genética plasmida e virulência, além da utilização de outros bancos de dados AMR, juntamente com o conjunto de dados agnósticos pan-genoma, são gerados automaticamente pelo ProkEvo20. Note-se que o ProkEvo não permite atualmente diferenciação entre os loci AMR presentes nos cromossomos bacterianos vs. plasmídeos. Os metadados ecológicos e epidemiológicos também podem ser facilmente integrados a essa abordagem analítica por incorporação de outras variáveis em um arquivo .csv contendo todas as informações genômicas. Em particular, o trabalho aqui apresentado complementa especificamente a utilização da plataforma computacional escalável e portátil ProkEvo, que foi projetada para ser utilizada por pesquisadores focados em análises heurísticas de genômica populacional que facilitam a mineração e a personalização de dados pelo usuário. Outras plataformas podem ser usadas para genotipagem, análise de estrutura populacional e/ou mapeamento de genomas acessórios como Enterobase5, PATRIC60 eBacWGSTdb61. Estes últimos são excelentes recursos que facilitam a mineração de dados de genômica para pesquisadores que não buscam personalizar e utilizar a computação em cluster para análises escaláveis e complexas. A abordagem analítica aqui apresentada aqui é especificamente adaptada para pesquisadores que desejam ter a flexibilidade para realizar uma análise de genômica populacional usando scripts reprodutíveis em sua máquina local ou usando uma plataforma computacional de nuvem ou de alto desempenho.

Em conclusão, a plataforma analítica baseada em R apresentada neste trabalho foi destinada a fornecer um guia prático para microbiologistas, ecologistas e epidemiologistas sobre como: i) utilizar abordagens dependentes de filogenia para mapear genótipos hierárquicos; ii) avaliar a distribuição de frequência dos genótipos como proxy para avaliação da aptidão ecológica; iii) determinar graus específicos de clonalidade de linhagem utilizando abordagens estatísticas independentes; e iv) mapear a linhagem de linhagem amr loci como exemplo de como extrair conteúdo genômico acessório no contexto da estrutura populacional. Os scripts fornecidos aqui podem ser usados em uma máquina local ou em uma plataforma computacional de alto desempenho. Para microbiologistas experimentais e ambientais, essa abordagem facilita estudos de conjuntos de dados que visam identificar traços únicos e caminhos candidatos para estudos mais mecanicistas que, em última análise, podem ser contextualizados no nível populacional. Os ecologistas podem se beneficiar dessa abordagem ao serem capazes de analisar conjuntos de dados moderados a grandes, que, em teoria, aumentam o poder estatístico necessário para encontrar assinaturas de seleção em uma população, considerando relações de parentesco e padrões de diversificação. Por fim, os epidemiologistas podem aproveitar informações práticas únicas para diagnósticos e vigilância, definindo unidades genotípicas de interesse e prevendo traços associados à Saúde Pública, como a AMR. De forma mais ampla, essa orientação analítica fornece uma estrutura generalizável para utilizar o ProkEvo para realizar uma análise genômica de base populacional que pode ser usada para inferir padrões evolutivos e ecológicos para espécies patogênicas e não patogênicas, uma vez que a abordagem é generalizável para outras espécies bacterianas.

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Disclosures

Os autores declararam que não existem interesses concorrentes.

Acknowledgments

Este trabalho foi apoiado por financiamento da Divisão de Pesquisa Agrícola da UNL-IANR e do Instituto Nacional de Pesquisa e Educação de Resistência Antimicrobiana e pelo Nebraska Food for Health Center do Departamento de Ciência e Tecnologia de Alimentos (UNL). Esta pesquisa só poderia ser concluída utilizando o Holland Computing Center (HCC) na UNL, que recebe apoio da Iniciativa de Pesquisa do Nebraska. Também somos gratos por ter acesso, através do HCC, aos recursos fornecidos pela Open Science Grid (OSG), que é apoiada pela National Science Foundation e pelo Escritório de Ciência do Departamento de Energia dos EUA. Este trabalho utilizou o Software de Gestão de Fluxo de Trabalho pegasus, que é financiado pela Fundação Nacional de Ciência (grant #1664162).

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Genética Edição 178
Mineração heurística de genótipos hierárquicos e genoma acessório Loci em populações bacterianas
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Pavlovikj, N., Gomes-Neto, J. C.,… More

Pavlovikj, N., Gomes-Neto, J. C., Benson, A. K. Heuristic Mining of Hierarchical Genotypes and Accessory Genome Loci in Bacterial Populations. J. Vis. Exp. (178), e63115, doi:10.3791/63115 (2021).

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