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JoVE Journal Genetics
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Genetics

Exploration heuristique des génotypes hiérarchiques et des loci du génome accessoire dans les populations bactériennes

Published: December 7, 2021 doi: 10.3791/63115
Automatic Translation
*1, *2,3, 2,3
1Department of Computer Science and Engineering, University of Nebraska-Lincoln, 2Department of Food Science and Technology, University of Nebraska-Lincoln, 3Nebraska Food for Health Center, University of Nebraska-Lincoln
* These authors contributed equally

Summary

Cette plate-forme informatique analytique fournit des conseils pratiques aux microbiologistes, aux écologistes et aux épidémiologistes intéressés par la génomique des populations bactériennes. Plus précisément, les travaux présentés ici ont démontré comment effectuer: i) une cartographie guidée par la phylogénie des génotypes hiérarchiques; ii) l’analyse des génotypes fondée sur la fréquence; iii) analyses de la parenté et de la clonalité; iv) l’identification des loci accessoires différenciant la lignée.

Abstract

L’utilisation systématique et systématique du séquençage bactérien du génome entier (SGC) améliore l’exactitude et la résolution des enquêtes épidémiologiques menées par les laboratoires de santé publique et les organismes de réglementation. De grands volumes de données WGS accessibles au public peuvent être utilisés pour étudier les populations pathogènes à grande échelle. Récemment, une plate-forme de calcul disponible gratuitement appelée ProkEvo a été publiée pour permettre des analyses génomiques de population reproductibles, automatisées et évolutives basées sur des hiérarchies à l’aide de données WGS bactériennes. Cette mise en œuvre de ProkEvo a démontré l’importance de combiner la cartographie génotypique standard des populations avec l’extraction du contenu génomique accessoire pour l’inférence écologique. En particulier, les travaux mis en évidence ici ont utilisé des résultats dérivés de ProkEvo pour des analyses hiérarchiques à l’échelle de la population utilisant le langage de programmation R. L’objectif principal était de fournir un guide pratique aux microbiologistes, aux écologistes et aux épidémiologistes en montrant comment: i) utiliser une cartographie guidée par la phylogénie des génotypes hiérarchiques; ii) évaluer les distributions de fréquence des génotypes comme approximation de l’aptitude écologique; iii) déterminer les relations de parenté et la diversité génétique à l’aide de classifications génotypiques spécifiques; et iv) la lignée cartographique différenciant les loci accessoires. Pour améliorer la reproductibilité et la portabilité, des fichiers de démarque R ont été utilisés pour démontrer l’ensemble de l’approche analytique. L’exemple d’ensemble de données contenait des données génomiques provenant de 2 365 isolats de l’agent pathogène zoonotique d’origine alimentaire Salmonella Newport. La cartographie ancrée dans la phylogénie des génotypes hiérarchiques (Serovar -> BAPS1 -> ST -> cgMLST) a révélé la structure génétique de la population, mettant en évidence les types de séquences (ST) comme génotype différenciant clé de voûte. Dans les trois lignées les plus dominantes, ST5 et ST118 ont partagé un ancêtre commun plus récemment qu’avec le phylotype ST45 hautement clonal. Les différences fondées sur les ST ont également été mises en évidence par la distribution des loci de résistance aux antimicrobiens accessoires (RAM). Enfin, une visualisation ancrée dans la phylogénie a été utilisée pour combiner les génotypes hiérarchiques et le contenu de la RAM afin de révéler la structure de parenté et les signatures génomiques spécifiques à la lignée. Combinée, cette approche analytique fournit des lignes directrices pour la réalisation d’analyses heuristiques génomiques de populations bactériennes à l’aide d’informations pangénomiques.

Introduction

L’utilisation croissante du séquençage bactérien du génome entier (SGC) comme base de la surveillance de routine et des enquêtes épidémiologiques par les laboratoires de santé publique et les organismes de réglementation a considérablement amélioré les enquêtes sur les éclosions d’agents pathogènes 1,2,3,4. En conséquence, de grands volumes de données WGS anonymisées sont maintenant accessibles au public et peuvent être utilisés pour étudier des aspects de la biologie des populations d’espèces pathogènes à une échelle sans précédent, y compris des études basées sur : les structures de population, les fréquences de génotype et les fréquences de gènes/allèles dans plusieurs réservoirs, régions géographiques et types d’environnements5 . Les enquêtes épidémiologiques guidées par le WGS les plus couramment utilisées sont basées sur des analyses utilisant uniquement le contenu génomique de base partagé, où le contenu partagé (conservé) seul est utilisé pour la classification génotypique (par exemple, l’appel de variantes), et ces variantes deviennent la base de l’analyse épidémiologique et du traçage 1,2,6,7 . En règle générale, le génotypage basé sur le noyau bactérien est effectué avec des approches de typage de séquence multi-locus (MLST) utilisant sept à quelques milliers de loci 8,9,10. Ces stratégies basées sur mlST englobent la cartographie de séquences génomiques pré-assemblées ou assemblées sur des bases de données hautement organisées, combinant ainsi des informations alléliques en unités génotypiques reproductibles pour l’analyse épidémiologique et écologique11,12. Par exemple, cette classification basée sur MLST peut générer des informations génotypiques à deux niveaux de résolution : les types de séquences de niveau inférieur (ST) ou les lignées ST (7 loci), et les variantes MLST (cgMLST) du génome du noyau supérieur (~ 300-3 000 loci)10.

La classification génotypique basée sur MLST est portable sur le plan informatique et hautement reproductible entre les laboratoires, ce qui la rend largement acceptée comme une approche de sous-typage précise sous le niveaud’espèce bactérienne 13,14. Cependant, les populations bactériennes sont structurées avec des degrés de clonalité variables spécifiques à l’espèce (c.-à-d. homogénéité génotypique), des modèles complexes de parenté hiérarchique entre les génotypes 15,16,17 et un large éventail de variations dans la distribution du contenu génomique accessoire18,19 . Ainsi, une approche plus holistique va au-delà des classifications discrètes dans les génotypes MLST et intègre les relations hiérarchiques des génotypes à différentes échelles de résolution, ainsi que la cartographie du contenu génomique accessoire sur les classifications génotypiques, ce qui facilite l’inférence basée sur la population 18,20,21 . En outre, les analyses peuvent également se concentrer sur les modèles partagés d’hérédité des loci génomiques accessoires parmi les génotypes21,22, même éloignés. Dans l’ensemble, l’approche combinée permet d’interroger de manière agnostique les relations entre la structure de la population et la distribution de compositions génomiques spécifiques (p. ex., loci) parmi les gradients géospatiaux ou environnementaux. Une telle approche peut fournir des informations à la fois fondamentales et pratiques sur les caractéristiques écologiques de populations spécifiques qui peuvent, à leur tour, expliquer leur tropisme et leurs modèles de dispersion dans les réservoirs, tels que les animaux destinés à l’alimentation ou les humains.

Cette approche hiérarchique axée sur la population basée sur les systèmes exige de grands volumes de données WGS pour une puissance statistique suffisante pour prédire des signatures génomiques distinguables. Par conséquent, l’approche nécessite une plate-forme de calcul capable de traiter plusieurs milliers de génomes bactériens à la fois. Récemment, ProkEvo a été développé et est une plate-forme bioinformatique librement disponible, automatisée, portable et évolutive qui permet des analyses de population bactérienne intégrées basées sur la hiérarchie, y compris la cartographie pangénomique20. ProkEvo permet l’étude d’ensembles de données bactériennes à moyenne à grande échelle tout en fournissant un cadre pour générer des hypothèses épidémiologiques et écologiques testables et inférables et des prédictions phénotypiques qui peuvent être personnalisées par l’utilisateur. Ce travail complète ce pipeline en fournissant un guide sur la façon d’utiliser les fichiers de sortie dérivés de ProkEvo comme entrée pour les analyses et l’interprétation des classifications hiérarchiques des populations et l’exploration génomique accessoire. L’étude de cas présentée ici a utilisé la population de Salmonella enterica lignée I zoonotique sérovar S. Newport à titre d’exemple et visait spécifiquement à fournir des lignes directrices pratiques aux microbiologistes, aux écologistes et aux épidémiologistes sur la façon de: i) utiliser une approche automatisée dépendante de la phylogénie pour cartographier les génotypes hiérarchiques; ii) évaluer la distribution de fréquence des génotypes comme approximation pour évaluer l’aptitude écologique; iii) déterminer les degrés de clonalité propres à la lignée à l’aide d’approches statistiques indépendantes; et iv) cartographier les loci de RMI différenciant la lignée comme exemple de la façon d’exploiter le contenu génomique accessoire dans le contexte de la structure de la population. Plus largement, cette approche analytique fournit un cadre généralisable pour effectuer une analyse génomique basée sur la population à une échelle qui peut être utilisée pour déduire des modèles évolutifs et écologiques quelle que soit l’espèce ciblée.

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Protocol

1. Préparer les fichiers d’entrée

REMARQUE: Le protocole est disponible ici - https://github.com/jcgneto/jove_bacterial_population_genomics/tree/main/code. Le protocole suppose que le chercheur a spécifiquement utilisé ProkEvo (ou un pipeline comparable) pour obtenir les sorties nécessaires disponibles dans ce référentiel Figshare (https://figshare.com/account/projects/116625/articles/15097503 - les informations de connexion sont requises - L’utilisateur doit créer un compte gratuit pour avoir accès au fichier!). Il est à noter que ProkEvo télécharge automatiquement les séquences génomiques du référentiel NCBI-SRA et ne nécessite qu’un fichier .txt contenant une liste d’identifications du génome en entrée20, et celui utilisé pour ce travail sur S. Les isolats de Newport USA sont fournis ici (https://figshare.com/account/projects/116625/articles/15097503?file=29025729).  Des informations détaillées sur l’installation et l’utilisation de cette plateforme de génomique bactérienne sont disponibles ici (https://github.com/npavlovikj/ProkEvo/wiki/2.-Quick-start)20

  1. Générez la phylogénie noyau-génome en utilisant FastTree23 comme décrit précédemment20, qui ne fait pas partie de la plate-forme bioinformatique20. FastTree nécessite l’alignement noyau-génome Roary24 comme fichier d’entrée. Le fichier de phylogénie est nommé newport_phylogeny.tree (https://figshare.com/account/projects/116625/articles/15097503?file=29025690).
  2. Générer la sortie SISTR25 contenant les informations concernant les classifications des sérovars pour Salmonella et les données d’appel de variante cgMLST (sistr_output.csv - https://figshare.com/account/projects/116625/articles/15097503?file=29025699).
  3. Générer le fichier BAPS par fastbaps26,27 contenant la classification BAPS niveaux 1-6 des génomes en sous-groupes ou haplotypes (fastbaps_partition_baps_prior_l6.csv - https://figshare.com/account/projects/116625/articles/15097503?file=29025684).
  4. Générer une classification mlST des génomes en ST à l’aide du programme MLST (https://github.com/tseemann/mlst)28 (salmonellast_output.csv - https://figshare.com/account/projects/116625/articles/15097503?file=29025696).
  5. Générez la sortie ABRicate (https://github.com/tseemann/abricate)29 sous la forme d’un fichier .csv contenant des loci AMR cartographiés par génome (sabricate_resfinder_output.csv - https://figshare.com/account/projects/116625/articles/15097503?file=29025693).
    REMARQUE: L’utilisateur peut désactiver des parties spécifiques du pipeline de bioinformatique ProkEvo (consultez ici pour plus d’informations - https://github.com/npavlovikj/ProkEvo/wiki/4.2.-Remove-existing-bioinformatics-tool-from-ProkEvo). L’approche analytique présentée ici fournit des lignes directrices sur la façon de mener une analyse basée sur la population après l’exécution du pipeline de bioinformatique.

2. Téléchargez et installez le logiciel statistique et l’application d’environnement de développement intégré (IDE)

  1. Téléchargez la version la plus récente disponible gratuitement du logiciel R pour Linux, Mac ou PC30. Suivez les étapes d’installation par défaut.
  2. Téléchargez la version la plus récente disponible gratuitement de l’IDE de bureau RStudio ici31. Suivez les étapes par défaut pour l’installation.
    REMARQUE : Les étapes suivantes sont incluses dans le script disponible, y compris des informations détaillées sur l’utilisation du code, et doivent être exécutées séquentiellement pour générer les résultats et les chiffres présentés dans ce travail (https://github.com/jcgneto/jove_bacterial_population_genomics/blob/main/code/data_analysis_R_code.Rmd). L’utilisateur peut décider d’utiliser un autre langage de programmation pour effectuer cette analyse analytique/statistique telle que Python. Dans ce cas, utilisez les étapes des scripts comme cadre pour effectuer l’analyse.

3. Installer et activer des bibliothèques de science des données

  1. Installez toutes les bibliothèques de science des données à la fois comme première étape de l’analyse. Évitez d’installer les bibliothèques chaque fois que le script doit être réexécuté. Utilisez la fonction install.packages() pour l’installation de la bibliothèque. Alternativement, l’utilisateur peut cliquer sur l’onglet Packages à l’intérieur de l’IDE et installer automatiquement les packages. Le code utilisé pour installer toutes les bibliothèques nécessaires est présenté ici :
    # Installer Tidyverse
    install.packages(« tidyverse »)
    # Installer skimr
    install.packages(« skimr »)
    # Installer vegan
    install.packages(« végétalien »)
    # Installer forcats
    install.packages(« forcats »)
    # Installer naniar
    install.packages(« naniar »)
    # Installer ggpubr
    install.packages(« ggpubr »)
    # Installer ggrepel
    install.packages(« ggrepel »)
    # Installer reshape2
    install.packages(« reshape2 »)
    # Installer RColorBrewer
    install.packages(« RColorBrewer »)
    # Installer ggtree
    if (!requireNamespace(« BiocManager », tranquillement = TRUE))
    install.packages(« BiocManager »)
    BiocManager::install(« ggtree »)
    # L’installation de ggtree posera une question sur l’installation - la réponse est « a » pour installer / mettre à jour toutes les dépendances
  2. Activez toutes les bibliothèques ou tous les packages à l’aide de la fonction library() au début du script, juste après l’installation. Voici une démonstration sur la façon d’activer tous les paquets nécessaires:
    # Activer les bibliothèques et les packages
    bibliothèque(tidyverse)
    bibliothèque(skimr)
    bibliothèque (végétalien)
    bibliothèque(forcats)
    bibliothèque(naniar)
    bibliothèque(ggtree)
    bibliothèque(ggpubr)
    bibliothèque(ggrepel)
    bibliothèque(reshape2)
    bibliothèque(RColorBrewer)
  3. Supprimez la sortie du code utilisé pour l’installation et l’activation de la bibliothèque et du package à l’aide de {r, include = FALSE} dans le mandrin de code, comme suit :
    ''' {r, include = FAUX}
    # Installer Tidyverse
    install.packages(« tidyverse »)
    ```
    Remarque : cette étape est facultative mais évite d’afficher des morceaux de code inutile dans le rapport html, doc ou pdf final.
  4. Pour une brève description des fonctions spécifiques de toutes les bibliothèques ainsi que des liens utiles pour recueillir plus d’informations, reportez-vous aux étapes 3.4.1 à 3.4.11.
    1. Tidyverse - utilisez cette collection de packages utilisés pour la science des données, y compris la saisie de données, la visualisation, l’analyse et l’agrégation, et la modélisation statistique. En règle générale, ggplot2 (visualisation de données) et dplyr (data wrangling et modélisation) sont des packages pratiques présents dans cette bibliothèque32.
    2. skimr - utilisez ce package pour générer des statistiques récapitulatives des trames de données, y compris l’identification des valeurs manquantes33.
    3. végétalien - utilisez ce paquet pour les analyses statistiques de l’écologie communautaire, telles que le calcul de statistiques basées sur la diversité (par exemple, la diversité alpha et bêta)34.
    4. forcats - utilisez ce package pour travailler avec des variables catégorielles telles que la réorganisation des classifications. Ce package fait partie de la bibliothèque Tidyverse32.
    5. naniar - utilisez ce package pour visualiser la distribution des valeurs manquantes entre les variables d’une base de données, à l’aide de la fonction viss_miss()35.
    6. ggtree - utilisez ce paquet pour la visualisation des arbres phylogénétiques36.
    7. ggpubr - utilisez ce package pour améliorer la qualité des visualisations basées sur ggplot237.
    8. ggrepel - utilisez ce package pour l’étiquetage du texte à l’intérieur des graphiques38.
    9. reshape2 - utilisez la fonction melt() de ce package pour la transformation des trames de données du format large au format long39.
    10. RColorBrewer - utilisez ce package pour gérer les couleurs dans les visualisations basées sur ggplot240.
    11. Utilisez les fonctions de base suivantes pour l’analyse exploratoire des données : head() pour vérifier les premières observations dans une trame de données, tail() pour vérifier les dernières observations d’une trame de données, is.na() pour compter le nombre de lignes avec des valeurs manquantes dans une trame de données, dim() pour vérifier le nombre de lignes et de colonnes dans un jeu de données, table() pour compter les observations sur une variable, et sum() pour compter le nombre total d’observations ou d’instances.

4. Saisie et analyse des données

REMARQUE : Vous trouverez des informations détaillées sur chaque étape de cette analyse dans le script disponible (https://github.com/jcgneto/jove_bacterial_population_genomics/blob/main/code/data_analysis_R_code.Rmd). Cependant, voici quelques points importants à considérer :

  1. Effectuer toutes les saisies de données génomiques, y compris toutes les classifications génotypiques (sérovar, BAPS, ST et cgMLST) à l’aide de la fonction read_csv().
  2. Renommez, créez de nouvelles variables et sélectionnez les colonnes d’intérêt de chaque jeu de données avant l’agrégation multi-jeux de données.
  3. Ne supprimez pas les valeurs manquantes d’un jeu de données indépendant. Attendez que tous les jeux de données soient agrégés pour modifier ou exclure les valeurs manquantes. Si de nouvelles variables sont créées pour chaque jeu de données, les valeurs manquantes sont par défaut classées dans l’une des classifications nouvellement générées.
  4. Vérifiez s’il y a des caractères erronés tels que des traits d’union ou des marques d’interrogation et remplacez-les par NA (sans objet). Faites de même pour les valeurs manquantes.
  5. Données agrégées basées sur l’ordre hiérarchique des génotypes (sérovar -> BAPS1 -> ST -> cgMLST), et par regroupement basé sur les identifications du génome individuel.
  6. Vérifiez les valeurs manquantes à l’aide de plusieurs stratégies et traitez explicitement ces incohérences. Ne retirez un génome ou un isolat des données que si la classification n’est pas fiable. Sinon, considérez l’analyse en cours et supprimez les AN au cas par cas.
    NOTE: Il est fortement recommandé d’établir une stratégie pour traiter ces valeurs a priori. Évitez de supprimer tous les génomes ou isolats dont les valeurs sont manquantes dans toutes les variables. Par exemple, un génome peut avoir une classification ST sans avoir de numéro de variante cgMLST. Dans ce cas, le génome peut toujours être utilisé pour l’analyse basée sur ST.
  7. Une fois tous les jeux de données agrégés, affectez-les à un nom de bloc de données ou à un objet qui peut être utilisé à plusieurs endroits dans l’analyse de suivi, afin d’éviter d’avoir à générer le même fichier de métadonnées pour chaque figure du document.

5. Effectuer des analyses et générer des visualisations

REMARQUE: Une description détaillée de chaque étape nécessaire à la production de toutes les analyses et visualisations se trouve dans le fichier de démarque de ce document (https://github.com/jcgneto/jove_bacterial_population_genomics/tree/main/code). Le code de chaque figure est séparé en morceaux et le script entier doit être exécuté séquentiellement. De plus, le code de chaque figure principale et supplémentaire est fourni sous forme de fichier distinct (voir Dossier supplémentaire 1 et Dossier supplémentaire 2). Voici quelques points essentiels (avec des extraits de code) à prendre en compte lors de la génération de chaque chiffre principal et supplémentaire.

  1. Utilisez ggtree pour tracer un arbre phylogénétique avec des informations génotypiques (Figure 1).
    1. Optimisez la taille de la figure ggtree, y compris le diamètre et la largeur des anneaux, en modifiant les valeurs numériques à l’intérieur des fonctions xlim() et gheatmap(width = ), respectivement (voir l’exemple de code ci-dessous).
      tree_plot <- ggtree(arbre, mise en page = « circulaire ») + xlim(-250, NA)
      figure_1 <- gheatmap(tree_plot, d4, offset=.0, width=20, colnames = FALSE)
      REMARQUE: Pour une comparaison plus détaillée des programmes qui peuvent être utilisés pour le traçage phylogénétique, consultez ce travail20. Le travail a mis en évidence une tentative faite pour identifier des stratégies pour améliorer les visualisations basées sur ggtree, telles que la diminution de la taille de l’ensemble de données, mais les longueurs de branches et la topologie des arbres n’étaient pas aussi clairement discriminantes que phandango41.
    2. Regroupez toutes les métadonnées en aussi peu de catégories que possible pour faciliter le choix du panneau de coloration lors du traçage de plusieurs couches de données avec l’arbre phylogénétique (https://github.com/jcgneto/jove_bacterial_population_genomics/blob/main/code/figure_1.Rmd). Effectuer l’agrégation des données en fonction de la question de l’intérêt et de la connaissance du domaine.
  2. Utilisez un diagramme à barres pour évaluer les fréquences relatives (Figure 2).
    1. Agrégez les données pour les lignées ST et les variantes cgMLST afin de faciliter les visualisations. Choisissez un seuil empirique ou statistique utilisé pour l’agrégation des données, tout en tenant compte de la question posée.
    2. Pour un exemple de code qui peut être utilisé pour inspecter la distribution de fréquence des lignées ST afin de déterminer le seuil, voir ci-dessous:
      st_dist <- d2 %>% group_by(ST) %>% # groupe par la colonne ST
      count() %>% # compter le nombre d’observations
      arrange(desc(n)) # organiser les comptes par ordre décroissant
    3. Pour un exemple de code montrant comment les ST mineures (basse fréquence) peuvent être agrégées, reportez-vous ci-dessous. Comme indiqué ci-dessous, les ST qui ne sont pas numérotés comme 5, 31, 45, 46, 118, 132 ou 350, sont regroupés en tant que « Autres ST ». Utilisez un code similaire pour les variantes cgMLST (https://github.com/jcgneto/jove_bacterial_population_genomics/blob/main/code/figure_2.Rmd).
      d2$st <- ifelse(d2$ST == 5, « ST5 », # créer une nouvelle colonne ST pour laquelle les S T mineurs sont agrégés comme Autres
      ifelse(d2$ST == 31, « ST31 »,
      ifelse(d2$ST == 45, « ST45 »,
      ifelse(d2$ST == 46, « ST46 »,
      ifelse(d2$ST == 118, « ST118 »,
      ifelse(d2$ST == 132, « ST132 », ifelse(d2$ST == 350, « ST350 », « Autres ST »))))))
  3. Utilisez une approche imbriquée pour calculer la proportion de chaque lignée ST au sein de chaque sous-groupe BAPS1 afin d’identifier les ST qui sont ancestralement apparentés (appartiennent au même sous-groupe BAPS1) (Figure 3). Le code ci-dessous illustre comment la proportion basée sur ST peut être calculée entre les sous-groupes BAPS1 (https://github.com/jcgneto/jove_bacterial_population_genomics/blob/main/code/figure_3.Rmd) :
    baps <- d2b %>% filter(serovar == « Newport ») %>% # filter Newport serovars
    select(baps_1, ST) %>% # sélectionnez les colonnes baps_1 et ST
    mutate(ST = as.numeric(ST)) %>% # changer la colonne ST en numérique
    drop_na(baps_1, ST) %>% # supprimer les ARN
    group_by(baps_1, ST) %>% # groupe par baps_1 et ST
    résumer(n = n()) %>% # nombre d’observations
    mutate(prop = n/sum(n)*100) # calculer les proportions
  4. Tracez la distribution des loci AMR entre les lignées ST à l’aide des résultats d’annotation génique basés sur Resfinder (Figure 4).
    NOTE: Resfinder a été largement utilisé dans les études écologiques et épidémiologiques42. L’annotation des gènes codant pour les protéines peut varier en fonction de la fréquence à laquelle les bases de données sont organisées et mises à jour. S’il utilise le pipeline de bioinformatique suggéré, le chercheur peut comparer les classifications de loci basées sur la RAM dans différentes bases de données20. Assurez-vous de vérifier quelles bases de données sont continuellement mises à jour. N’utilisez pas de bases de données obsolètes ou mal organisées, afin d’éviter les erreurs d’appel.
    1. Utilisez un seuil empirique ou statistique pour filtrer les loci de RAM les plus importants afin de faciliter les visualisations. Fournissez un fichier .csv brut contenant les proportions calculées de tous les loci AMR sur toutes les lignées ST, comme illustré ici (https://figshare.com/account/projects/116625/articles/15097503?file=29025687).
    2. Calculez la proportion de RAM pour chaque ST à l’aide du code suivant (https://github.com/jcgneto/jove_bacterial_population_genomics/blob/main/code/figure_4.Rmd) :
      # Calculs pour ST45
      d2c <- data6 %>% filter(st == « ST45 ») # filtrer d’abord les données ST45
      # pour ST45, calculer la proportion de loci de RAM et ne garder que la proportion supérieure à 10%
      d3c <- d2c %>% select(id, gene) %>% # select columns
      group_by(id, gène) %>% # groupe par id et gène
      résumer(compter = n()) %>% # compter les observations
      mutate(count = replace(count, count == 2, 1)) %>% # replace counts equal to 2 with 1 to consider only one copy of each gene (les duplications peuvent ne pas être fiables), mais le chercheur peut décider de les exclure ou de les conserver. Si le chercheur veut les exclure, utilisez la fonction filter(count != 2) ou laissez tel quel
      filter(count <= 1) # nombre de filtres inférieur ou égal à 1
      d4c <- d3c %>% group_by(gène) %>% # groupe par gène
      résumer(valeur = n()) %>% # nombre d’observations
      mutate(total = table(data1$st)[6]) %>% # obtenir le nombre total de st mutate(prop = (valeur/total)*100) # calculer les proportions
      d5c <- d4c %>% mutate(st = « ST45 ») # créer une colonne st et ajouter des informations ST
    3. Une fois les calculs effectués pour tous les ST, combinez les jeux de données en une seule trame de données, à l’aide du code suivant :
      # Combiner des jeux de données
      d6 <- rbind(d5a, d5b, d5c, d5d, d5e, d5f, d5g, d5h) # jeux de données de liaison de ligne
    4. Pour exporter le fichier .csv contenant les proportions calculées, utilisez le code :
      # Exporter la table de données contenant des informations sur les loci ST et AMR
      abx_newport_st <- d6 write.csv(abx_newport_st,"abx_newport_st.csv », row.names = FALSE)
    5. Avant de tracer la distribution basée sur la RAM entre les lignées ST, filtrez les données en fonction d’un seuil pour faciliter les visualisations, comme indiqué ci-dessous :
      # Filtrer les loci AMR avec une proportion supérieure ou égale à 10%
      d7 <- d6 %>% filter(prop >= 10) # déterminer le seuil empiriquement ou statistiquement
  5. Tracez la phylogénie noyau-génome ainsi que les classifications génotypiques hiérarchiques et les données de RAM dans un seul graphique à l’aide de ggtree (Figure 5).
    1. Optimisez la taille de la figure à l’intérieur de ggtree en utilisant les paramètres mentionnés ci-dessus (voir étape 5.1.1.).
    2. Optimisez les visualisations en agrégeant des variables ou en utilisant une classification binaire telle que la présence ou l’absence de gènes. Plus le tracé est ajouté de fonctionnalités, plus le processus de sélection de la coloration devient difficile (https://github.com/jcgneto/jove_bacterial_population_genomics/blob/main/code/figure_5.Rmd).
      NOTE: Chiffres supplémentaires - une description détaillée de l’ensemble du code peut être trouvée ici (https://github.com/jcgneto/jove_bacterial_population_genomics/blob/main/code/data_analysis_R_code.Rmd).
  6. Utilisez un nuage de points dans ggplot2, sans agrégation de données, pour afficher la distribution des lignées ST ou des variantes cgMLST tout en mettant en évidence les génotypes les plus fréquents (Figure supplémentaire 1) (https://github.com/jcgneto/jove_bacterial_population_genomics/blob/main/code/supplementary_figure_s1.Rmd).
  7. Effectuer une analyse imbriquée pour évaluer la composition des lignées ST à travers la proportion de variantes cgMLST afin d’avoir un aperçu de la diversité génétique basée sur ST, tout en identifiant les variantes les plus fréquentes et leurs relations génétiques (c.-à-d. les variantes cgMLST qui appartiennent à la même ST ont partagé un ancêtre plus récemment que celles appartenant à des ST distincts) (Figure supplémentaire 2 ) (https://github.com/jcgneto/jove_bacterial_population_genomics/blob/main/code/supplementary_figure_s2.Rmd).
  8. Utiliser la métrique de l’écologie communautaire, à savoir l’indice de diversité D de Simpson, pour mesurer le degré de clonalité ou de diversité génotypique de chacune des principales lignées ST43 (figure supplémentaire 3).
    1. Calculer l’indice de diversité entre les lignées ST à différents niveaux de résolution génotypique, y compris baps de niveau 1 à 6 et cgMLST. Vous trouverez ci-dessous l’exemple de code sur la façon d’effectuer ce calcul au niveau BAPS 1 (BAPS1) de la résolution génotypique :
      # BAPS niveau 1 (BAPS1)
      # laisser tomber les ST et BAPS1 avec les NA, regrouper par ST et BAPS1, puis calculer l’indice de Simpson
      baps1 <- data6 %>%
      select(st, BAPS1) %>% # sélectionner les colonnes
      drop_na(st, BAPS1) %>% # supprimer les ARN
      group_by(st, BAPS1) %>% # grouper par colonnes
      résumer(n = n()) %>% # nombre d’observations
      mutate(simpson = diversity(n, « simpson »)) %>% # calculer la diversité
      group_by(st) %>% # grouper par colonne
      résumer(simpson = moyenne(simpson)) %>% # calculer la moyenne de l’indice
      melt(id.vars=c(« st »), measure.vars="simpson »,
      variable.name="index », value.name="valeur ») %>% # convertir en format long
      mutate(strat = « BAPS1 ») # créer une colonne strat
      REMARQUE: Une population génétiquement plus diversifiée (c.-à-d. plus de variantes à différentes couches de résolution génotypique) a un indice plus élevé au niveau cgMLST et produit une augmentation des valeurs basées sur l’indice allant du niveau BAPS 2 à 6 (https://github.com/jcgneto/jove_bacterial_population_genomics/blob/main/code/supplementary_figure_s3.Rmd).
  9. Examiner le degré de diversité génotypique des lignées ST en traçant la fréquence relative des sous-groupes BAPS à tous les niveaux de résolution (BAPS1-6) (Figure supplémentaire 4). Plus la population est diversifiée, plus la distribution des sous-groupes BAPS (haplotypes) devient clairsemée allant de BAPS1 (niveau de résolution inférieur) à BAPS6 (niveau de résolution plus élevé) (https://github.com/jcgneto/jove_bacterial_population_genomics/blob/main/code/supplementary_figure_s4.Rmd).

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Representative Results

En utilisant la plate-forme de calcul ProkEvo pour les analyses de génomique des populations, la première étape de l’exploration de données WGS bactériennes consiste à examiner la structure hiérarchique de la population dans le contexte d’une phylogénie noyau-génome (Figure 1). Dans le cas de S. lignée enterica I, illustrée par le S. Ensemble de données Newport, la population est structurée hiérarchiquement comme suit : sérovar (niveau de résolution le plus bas), sous-groupes ou haplotypes BAPS1, lignées ST et variantes cgMLST (niveau de résolution le plus élevé)20. Cette analyse guidée par la phylogénie de la structure hiérarchique de la population permet spécifiquement d’examiner les points suivants: i) distribution phylogénétique des génomes mal classés basés sur SISTR dans d’autres sérovars dans le cas de Salmonella; ii) la structure génétique ou de parenté de la population; iii) modèle de diversification à différents niveaux de résolution génotypique; iv) l’identification des principales unités génotypiques sous-jacentes à des modèles évolutifs, écologiques ou épidémiologiques; v) les relations ancestrales entre les lignées ST par le biais de sous-groupes BAPS1 ou de composition d’haplotypes, et entre les variantes cgMLST au sein des lignées ST; et vi) vue partielle du degré d’homogénéité génotypique d’une lignée ST par la composition de la variante cgMLST.

Figure 1
Figure 1 : Cartographie guidée par la phylogénie des génotypes hiérarchiques pour le S. Population de Newport. Une phylogénie noyau-génome (cercle centré noir) a été utilisée pour cartographier les génotypes hiérarchiques, y compris les sérovars (niveau de résolution le plus bas - cercle coloré le plus interne), les sous-groupes ou haplotypes BAPS de niveau 1 (BAPS1), les lignées ST et les variantes cgMLST (niveau de résolution le plus élevé - cercle coloré le plus externe). Les sérovars ont été regroupés à Newport (S. Newport) ou « Autres sérovars » basés sur la classification algorithmique SISTR des génomes, qui utilisait des informations MLST noyau-génome, et fonctionnait dans le cadre de la plate-forme informatique ProkEvo. BAPS1 stratifie agnostiquement la population en sous-groupes ou groupes d’haplotypes apparentés à l’aide de données génomiques de base dans ProkEvo. BAPS1 est placé hiérarchiquement entre les lignées sérovar et ST car il a capturé avec précision les relations ancestrales entre les ST. Les lignées ST sont formées sur la base d’une analyse MLST canonique utilisant sept loci dispersés dans le génome. Seuls les ST majeurs ou les plus fréquents (proportion >1 %) ont été représentés dans le graphique. Enfin, seules les variantes cgMLST les plus fréquentes (proportion >3,5%) ont été utilisées pour montrer l’ensemble de la structure hiérarchique du S. Population de Newport (n = 2 365 isolats aux États-Unis seulement). La catégorie « Autres ST » ou « Autres CGMLST » comprend des lignées ou des variantes mineures ou à basse fréquence, respectivement, avec un seuil effectué arbitrairement qui devrait être établi empiriquement ou statistiquement en fonction de l’ensemble de données. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Les fréquences relatives de tous les génotypes hiérarchiques ont ensuite été utilisées pour évaluer la distribution globale et les classifications les plus fréquemment observées (c.-à-d. les génotypes) (figure 2). Dans la figure 2C-D, les lignées ST moins fréquentes (mineures) ou les variantes cgMLST ont été agrégées comme « Autres ST » ou « Autres CGMLST », respectivement, afin de faciliter la visualisation des données (réduction de la dimensionnalité). Si l’échantillonnage est systématiquement effectué dans les environnements et/ou les hôtes et qu’il est alimenté statistiquement de manière appropriée, la distribution de fréquence peut devenir un indicateur de la condition écologique. C’est-à-dire que les lignées ou variantes les plus fréquentes pourraient alors être prédites comme ayant une meilleure aptitude, après une enquête plus approfondie pour déterminer les déterminants génétiques causaux sous-jacents à un tel trait quantitatif 6,30.

Figure 2
Figure 2 : Proportion de S. Génotypes hiérarchiques de Newport à différents niveaux de résolution. (A) Les sérovars sont des phénotypes du S. population de la lignée entérique I qui peut être prédite uniquement à partir de données génomiques de base en raison du déséquilibre héréditaire élevé de liaison entre les loci noyau et les loci codant antigéniques O et H (protéines de surface). Lors de l’utilisation de ProkEvo, les génomes de Salmonella sont automatiquement classés en sérovars à l’aide du programme SISTR. Bien que seulement S. Les génomes de Newport (Newport) du NCBI ont été prétendument téléchargés, certains ont été classés comme « Autres sérovars » dans ProkEvo. Environ 2 % (48 sur 2 365) de tous les génomes ont été classés comme autres que S. Sérovar de Newport. (B) La proportion de sous-groupes ou d’haplotypes BAPS de niveau 1 (BAPS1). BAPS1 est inséré entre les lignées sérovar et ST dans le schéma hiérarchique parce qu’il a capturé avec précision et agnostique les relations ancestrales entre les ST. (C) La proportion des principales lignées ST ne représentait que les ST qui étaient > 1% en fréquence relative. Les ST mineurs ont été regroupés sous la rubrique « Autres ST ». (D) La proportion des principales variantes de cgMLST n’a montré que quatre cgMLST prédominantes qui étaient >3% en fréquence relative. Les autres cgMLST ont été regroupés sous le nom de « Autres cgMLST ». (B-D) Les génomes classés par le SISTR comme « Autres sérovars » (2,03 %) ont été filtrés à partir des données avant de tracer les fréquences relatives BAPS1, ST et cgMLST. (C-D) Les seuils utilisés pour tracer les données ST et cgMLST ont été définis arbitrairement et devraient être établis empiriquement au cas par cas. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Alternativement, un nuage de points peut être utilisé pour évaluer la distribution et la proportion des lignées ST ou des variantes cgMLST, sans aucune agrégation de données (figure supplémentaire 1). Cette utilisation d’un nuage de points est particulièrement utile pour les lignées ST et les variantes cgMLST en raison de l’occurrence typique de centièmes, voire de milliers, de classifications pour les deux génotypes. Cette distribution clairsemée ne se produit généralement pas pour les niveaux de résolution sérovar et BAPS1, car ils sont à un niveau de résolution inférieur avec des séquences s’effondrant héréditairement en quelques sous-groupes ou catégories.

Ensuite, les relations ancestrales entre les ST ont été examinées à l’aide d’une approche imbriquée qui comprend l’évaluation de la fréquence relative des lignées ST par sous-groupes ou haplotypes BAPS1 (Figure 3). Les lignées ST qui appartenaient au même sous-groupe BAPS1 étaient plus susceptibles d’avoir partagé un ancêtre commun plus récemment qu’avec d’autres ST (c.-à-d. ST5 et ST118 vs ST45). De même, en examinant la distribution des variantes de la CGMLST au sein des lignées ST, le degré d’hétérogénéité génotypique entre les ST peut être capturé, tout en évaluant leur composition génétique et en révélant la relation ancestrale entre les cgMLST (c.-à-d. les variantes étroitement apparentées de la CgMLST appartiennent à la même lignée ST ou complexe clonal) (Figure supplémentaire 2).

Figure 3
Figure 3 : Distribution des lignées ST imbriquées dans les sous-groupes BAPS1 pour les S. Population de Newport. Ce graphique illustre la distribution de la lignée ST au sein de chaque sous-groupe ou haplotype BAPS de niveau 1, à l’exclusion des génomes classés comme « Autres sérovars » (2,03 % de l’ensemble des données). Les principaux ST (proportion >1 %) pour chaque sous-groupe BAPS1 sont mis en évidence dans chaque graphique. Plus le diamètre du cercle est grand, plus la proportion pour la lignée ST particulière est élevée. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Étant donné que le modèle de S. La diversification de la population de Newport semble être principalement déterminée par la composition des ST (figure 1), deux approches statistiques ont été utilisées pour évaluer le degré de clonalité (c.-à-d. homogénéité génétique) basé sur les ST), y compris l’indice de diversité D de Simpson (figure supplémentaire 3) et la distribution des sous-groupes ou haplotypes BAPS à l’aide des niveaux BAPS 1 à 6 (figure supplémentaire 4). ). L’évaluation du degré de clonalité d’une population peut élucider les aspects suivants : i) une meilleure compréhension de la diversité génétique et de la structure de la population; ii) affiner l’analyse des modèles de diversification entre les principales unités génotypiques telles que les lignées ST; et iii) être un indicateur de la nécessité d’utiliser l’exploration du génome accessoire pour trouver des unités génotypiques cryptiques qui peuvent révéler de nouveaux sous-groupes présents dans la population. Plus une population est clonale au niveau du génome central, plus il devient difficile de différencier les variantes, et plus le contenu du génome accessoire sera informatif pour stratifier la population en unités génotypiques significatives associées à des distributions écologiques uniques 18,19,21.

La fréquence relative des loci de la lignée ST différenciant la RAM a été évaluée afin d’identifier des signatures génomiques accessoires uniques liées au S. Structure de la population de Newport (figure 4). Cette étape de l’analyse était axée sur la distribution de la RAM parce qu’il s’agit d’un trait associé à la santé publique, mais la même approche peut être appliquée de manière supervisée (ciblée) ou agnostique pour examiner d’autres composants du génome accessoire, y compris les voies métaboliques, les facteurs de virulence, etc. Remarquablement, mdf(A)_1 et aac(6')-Iaa_1 loci semblent être acquis ancestralement par les S. la population de Newport; alors que st45 devrait être multirésistant aux médicaments. Fait frappant, ces données suggèrent également que les autres lignées majeures de ST, ST5 et ST118, sont plus susceptibles d’être sensibles à plusieurs médicaments par rapport à ST45. Ces points doivent être soigneusement examinés en raison des biais présents dans l’ensemble de données; toutefois, il s’agit d’une inférence épidémiologique potentielle qui pourrait être faite à partir de collectes de données plus robustes du SGM.

En général, voici quelques points à prendre en compte lors de la réalisation d’une cartographie du génome accessoire sur des génotypes hiérarchiques: i) considérez la distribution de fréquence comme un trait quantitatif, mais sachez que la composition allélique d’un locus peut modifier la variance des traits. De plus, la présence d’un ou de plusieurs locus doit être indicative de la fonction, mais pas causale, car le phénotype peut être polygénique ou varier en fonction de la composition allélique du locus causal (par exemple, une mutation non synonyme sur le site actif d’une protéine est plus susceptible d’affecter la fonction); ii) la distribution des loci peut démontrer des gènes qui sont fixés dans la population (p. ex., trouvés à haute fréquence dans toutes les lignées ST) ou récemment acquis par des lignées ST spécifiques et des variantes cgMLST, et peuvent refléter le modèle écologique ou épidémiologique; iii) la multirésistance aux médicaments peut être prédite à partir des données génomiques. Et si la distribution des loci de RAM, ou d’autres voies, est fortement liée ou généralement héritée par des lignées spécifiques, alors les phénotypes peuvent être prédits par inférence à partir de génotypes hiérarchiques, comme dans le cas des lignées ST45,46; et iv) la mesure des phénotypes en laboratoire est encore déterministe pour valider les prédictions computationnelles.

Figure 4
Figure 4 : Répartition des loci de RAM entre les principales lignées ST des S. Population de Newport. Distribution relative basée sur la fréquence d’un certain nombre de loci de RAM entre les principales lignées ST (>1 % de la population). Les ST mineurs ont été regroupés sous la rubrique « Autres ST ». Seuls les génomes classés comme S. Newport par l’algorithme SISTR ont été conservés dans l’analyse. Des loci de RAM dont la fréquence relative est supérieure ou égale à 10 % ont été sélectionnés pour la visualisation des données. Il s’agit d’un seuil arbitraire qui doit être déterminé pour chaque jeu de données. Les proportions ont été calculées à l’aide d’une matrice binaire composée de la présence ou de l’absence de gènes. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Enfin, une visualisation ancrée dans la phylogénie a été utilisée pour intégrer systématiquement les données de structure hiérarchique de la population ainsi que la lignée ST différenciant la distribution des loci RAM en fonction de l’occurrence des gènes (Figure 5). En combinant la structure de la population avec la composition génomique accessoire, l’ensemble de questions suivantes peut être abordé dans un ensemble de données donné : 1) Comment la population est-elle structurée? Comment les ST sont-ils liés les uns aux autres et ancestralement à travers les sous-groupes BAPS1? Quelle est la variable de la composition cgMLST entre les ST ? 2) Quel est le modèle de ramification phylogénétique et la topologie globale de l’arbre? et 3) Comment le génome accessoire est-il distribué? La composition génomique accessoire est-elle probablement acquise de manière ancestrale ou récemment dérivée? Qu’est-ce que la lignée ou le modèle spécifique à la variante ? Qu’est-ce que la prédiction phénotypique et l’inférence écologique? Existe-t-il des gènes transcendant les niches par rapport aux gènes spécifiant les niches? Comment le schéma observé se rapporte-t-il ou informe-t-il l’épidémiologie dans le cas des agents pathogènes? Les lignées ou les variantes peuvent-elles être sous-regroupées de manière informative en fonction du contenu génomique accessoire ?

Figure 5
Figure 5 : Cartographie guidée par la phylogénie des génotypes hiérarchiques et des loci AMR accessoires différenciant les principales lignées ST au sein du S. Population de Newport. Une phylogénie noyau-génome (cercle centré noir) a été utilisée pour cartographier les génotypes hiérarchiques, y compris les sérovars (niveau de résolution le plus bas - cercle coloré le plus interne), les sous-groupes ou haplotypes BAPS de niveau 1 (BAPS1), les lignées ST et les variantes cgMLST (niveau de résolution le plus élevé - cercle coloré le plus externe), ainsi que les loci AMR colorés en bleu foncé s’ils sont présents ou gris s’ils sont absents. Les sérovars ont été regroupés à Newport (S. Newport) ou « Autres sérovars » basé sur la classification algorithmique SISTR. BAPS1 est placé hiérarchiquement entre les lignées sérovar et ST car il a capturé avec précision et agnostique les relations ancestrales entre les ST. Les lignées ST sont formées sur la base d’une analyse MLST canonique utilisant sept loci dispersés dans le génome. Seuls les ST majeurs ou les plus fréquents (proportion >1 %) ont été représentés dans le graphique. En outre, seules les variantes cgMLST les plus dominantes (proportion >3,5%) ont été utilisées pour montrer l’ensemble de la structure hiérarchique du S. Population de Newport (n = 2 365 isolats aux États-Unis seulement). La catégorie « Autres ST » ou « Autres CGMLST » comprenant respectivement des lignées ou des variantes mineures ou à basse fréquence, et le seuillage a été effectué arbitrairement et devrait être défini en fonction de l’ensemble de données. Des loci de RAM dont la fréquence relative est supérieure ou égale à 10 % ont été sélectionnés pour la visualisation des données. Ce graphique spécifique montre une distribution unique des loci de RAM se produisant principalement dans les lignées ST31, ST45 et ST132. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure supplémentaire 1 : Distribution clairsemée des lignées ST et des variantes cgMLST pour le S. Population de Newport. (A) La proportion de lignées ST sans agrégation de ST à basse fréquence. Les ST avec une proportion >1% sont mises en évidence dans le graphique. (B) La proportion de variantes de cgMLST sans agrégation de cgMLST à basse fréquence. Les cgMLST avec une proportion > 3% sont mis en évidence dans le graphique. (A-B) Les seuils utilisés pour tracer les données ST et cgMLST ont été définis arbitrairement et devraient être établis en fonction de l’ensemble de données. Les génomes classés par le SISTR comme « Autres sérovars » (2,03 %) ont été filtrés à partir des données avant de tracer les fréquences relatives ST et cgMLST. Plus le diamètre du cercle est grand, plus la proportion est élevée pour la lignée ST ou la variante cgMLST. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Figure supplémentaire 2 : Distribution des variantes cgMLST imbriquées dans les lignées ST pour le S. Population de Newport. Ce graphique illustre la distribution de la variante cgMLST entre les lignées ST, à l’exclusion des génomes classés comme « Autres sérovars » (2,03% de l’ensemble des données). Les principaux cgMLST (proportion >15 %) pour chaque lignée ST sont mis en évidence dans chaque graphique. Plus le diamètre du cercle est grand, plus la proportion pour la variante cgMSLT spécifique est élevée. Les ST à basse fréquence ont été regroupés sous le nom de « Autres ST ». Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Figure supplémentaire 3 : Degré de diversité génétique de Simpson basé sur D à travers les lignées ST en utilisant les haplotypes BAPS de niveaux 1 à 6 ou les génotypes cgMLST comme données d’entrée pour le S. Population de Newport. Le degré de clonalité ou de diversité génétique de chaque lignée ST a été calculé sur différentes couches génotypiques de résolution, y compris les niveaux BAPS 1 (niveau de résolution le plus bas) à 6 (niveau de résolution le plus élevé) sous-groupes ou haplotypes, et en utilisant en outre la distribution des variantes basée sur cgMLST. Plus la valeur de l’indice est élevée, plus le degré de diversité génétique est élevé. Les lignées ST très diverses ont des valeurs d’indice plus élevées allant de BAPS1 à BAPS6 (c’est-à-dire que l’indice augmente généralement et finit par plafonner lorsqu’il passe de BAPS1 à BAPS6). Seuls les génomes classés comme S. Newport par le programme SISTR a été conservé dans l’analyse. Les ST à basse fréquence ont été regroupés sous le nom de « Autres ST ». Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Figure supplémentaire 4 : Répartition des sous-groupes ou haplotypes baps de niveau 1 à 6 entre les principales lignées ST de la population de S. Newport. Distribution relative basée sur la fréquence des sous-groupes ou haplotypes BAPS, entre les principales lignées ST, du niveau de résolution le plus bas (BAPS1) au niveau de résolution le plus élevé (BAPS6). Les principaux ST ont été sélectionnés en fonction d’une proportion >1 %. Seuls les génomes classés comme S. Newport par le programme SISTR a été conservé dans l’analyse. Plus le degré de clonalité est élevé, moins la distribution des sous-groupes ou haplotypes BAPS devient clairsemée ou répandue lors du passage de BAPS1 à BAPS6. En d’autres termes, une lignée ST génétiquement plus diversifiée a un plus large éventail de sous-groupes BAPS au niveau BAPS 6 (degré de résolution le plus élevé). Les ST à basse fréquence ont été regroupés sous le nom de « Autres ST ». Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Fichier supplémentaire 1 : Liens vers la liste des matériaux et la liste des génomes Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Dossier supplémentaire 2 : Analyse génomique des populations bactériennes basée sur la hiérarchie à l’aide de R Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

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Discussion

L’utilisation d’une analyse heuristique et hiérarchique de la structure des populations basée sur des systèmes fournit un cadre pour identifier de nouvelles signatures génomiques dans des ensembles de données bactériennes qui ont le potentiel d’expliquer des modèles écologiques et épidémiologiques uniques20. De plus, la cartographie des données génomiques accessoires sur la structure de la population peut être utilisée pour déduire des caractères acquis par l’ancestral et/ou récemment dérivés qui facilitent la propagation des lignées ST ou des variantes cgMLST dans les réservoirs 6,20,21,45,46. Plus généralement, une évaluation globale de la distribution du contenu pangénomique dans les populations bactériennes peut révéler des modèles de diversification qui sous-tendent les tropismes écologiques ou les goulots d’étranglement géospatiaux /temporels qu’une population aurait pu récemment surmonter18,21. Dans le cas des espèces pathogènes, en exploitant la structure de la population des isolats cliniques par rapport aux isolats environnementaux, les déterminants génétiques associés aux événements zoonotiques peuvent être identifiés et utilisés pour améliorer le diagnostic et la surveillance33,34. La même approche peut être appliquée aux espèces non pathogènes pour identifier les génotypes ayant des propriétés de greffe spécifiques à une niche souhaitables, comme dans le cas des souches probiotiques gastro-intestinales utilisées pour améliorer la santé humaine 49,50,51. Pourtant, l’utilisation des données WGS bactériennes pour les enquêtes basées sur la population nécessite l’utilisation de plates-formes de calcul reproductibles, automatisées et évolutives comme ProkEvo20. Toute approche informatique comporte ses mises en garde et ses nuances, mais en général, des plates-formes disponibles gratuitement, bien documentées, portables et conviviales telles que ProkEvo peuvent faciliter le travail des microbiologistes, des écologistes et des épidémiologistes effectuant une génomique heuristique basée sur la population bactérienne.

Dans le présent travail, il a été démontré comment utiliser les résultats dérivés de ProkEvo pour effectuer une analyse hiérarchique de la structure de la population qui peut être utilisée pour cartographier et suivre les génotypes d’intérêt à différents niveaux de résolution, ainsi que pour prédire les traits utiles à partir des données WGS. Ce protocole de calcul a été écrit en utilisant le langage de programmation R, mais le framework ou l’approche conceptuelle est généralisable à d’autres langages tels que Python grâce à l’utilisation de la bibliothèque Pandas, par exemple. Les données d’entrée sont générées par ProkEvo20, ce qui évite certains obstacles en termes de normalisation des sorties et des formats de données pour une analyse ultérieure. À l’exception des phylogénies, tous les autres ensembles de données d’entrée sont disponibles dans un format tabulaire qui peut facilement être contrôlé par la qualité, agrégé, analysé et intégré pour générer des rapports utiles pour l’interprétation des données. Cependant, il est important de souligner quelques étapes critiques pour améliorer la reproductibilité lors de l’utilisation de ce protocole: i) s’assurer que les versions du logiciel sont toujours mises à jour et suivies; ii) suivre les versions des bibliothèques de science des données utilisées et, de préférence, les mettre à jour au fil du temps; iii) contrôler la qualité des données à l’aide de l’expertise en connaissances du domaine pour donner un sens aux extrants générés par ProkEvo, ou un pipeline similaire, à la lumière de ce qui est compris pour la population bactérienne ciblée; iv) effectuer une analyse exploratoire des données avant d’utiliser une approche de modélisation; v) agréger les données sur la base de connaissances empiriques et/ou d’évaluations statistiques; vi) définir une stratégie pour traiter a priori les valeurs manquantes et être cohérent et totalement transparent à ce sujet; vii) si vous utilisez R, essayez d’utiliser tous les paquets fournis par Tidyverse, car cette collection facilite la programmation fonctionnelle, la portabilité, l’optimisation et est disponible gratuitement; et viii) être conscient que les approches de visualisation peuvent être difficiles parce qu’il faut quelques essais et erreurs pour obtenir le bon type de tracé et de schéma de coloration qui est le plus approprié pour la question posée et les données représentées.

Il est à noter que ce protocole comporte certaines limitations qui peuvent être encore améliorées. Par exemple, ProkEvo a une limite intrinsèque au nombre de génomes pouvant être utilisés pour l’analyse pangénomique, si l’étape d’alignement noyau-génome est générée de manière concomitante, tout en utilisant le programme Roary (~ 2 000-3 000 génomes)24. Il s’agit d’un goulot d’étranglement très spécifique dans le pipeline qui affectera le nombre de génomes pouvant être classés en haplotypes BAPS, car il dépend de l’alignement noyau-génome (c’est-à-dire une étape très exigeante en calcul). Cependant, l’alignement noyau-génome peut être fait avec d’autres programmes52, et de tels algorithmes, en théorie, pourraient être facilement incorporés dans ProkEvo. Sinon, les ensembles de données peuvent être stratégiquement divisés en sous-ensembles aléatoires, ou dans une autre base, par exemple en tenant compte de la structure de la population de l’organisme en question. Alternativement, ProkEvo peut être exécuté avec un seul génome pour obtenir une annotation basée sur ST, la composition des gènes de résistance aux antibiotiques et de virulence, et la cartographie des plasmides, mais le pipeline a été conçu pour la génomique basée sur la population. Il convient de noter que si les classifications BAPS1-6 ne sont pas nécessaires, l’option d’alignement noyau-génome de Roary peut être désactivée et, dans ce cas, ProkEvo peut être utilisé avec plusieurs centièmes de milliers de génomes - elle n’est limitée qu’en fonction du nombre de cœurs d’ordinateur disponibles. Un exemple de la façon d’implémenter un nouveau programme ou de désactiver l’option d’alignement noyau-génome dans Roary dans ProkEvo peut être trouvé dans les liens GitHub suivants (https://github.com/npavlovikj/ProkEvo/wiki/4.1.-Add-new-bioinformatics-tool-to-ProkEvo) et (https://github.com/npavlovikj/ProkEvo/wiki/4.3.-Change-running-options-for-existing-tool-in-ProkEvo), respectivement. Dans le cas de l’extraction génomique accessoire, une analyse agnostique dépend de l’utilisation de la pangénomique . Rtab généré par Roary24, qui n’a pas été spécifiquement utilisé ici, mais au lieu de cela, il a été stratégiquement démontré comment mapper les loci AMR avec ABRicate en utilisant la base de données Resfinder (https://github.com/tseemann/abricate). Néanmoins, il est possible d’élargir la portée de la cartographie génomique accessoire en utilisant plutôt un fichier pangénomique, ce qui peut être pratiquement considéré comme une expansion de l’approche actuelle (par exemple, plus de loci inclus dans l’ensemble de données tabulaires sous forme de nouvelles colonnes). Il est important de mentionner que la cartographie pangénomique effectuée par ProkEvo n’a fourni que des informations binaires en termes de composition des loci et, actuellement, ne peut pas être utilisée pour l’identification de polymorphismes nucléotidiques uniques entre les gènes.

Une autre limitation de ce protocole est la visualisation de l’arbre phylogénétique. Actuellement, ggtree est le programme de choix, mais cela se fait au prix de l’impossibilité d’inspecter avec précision les longueurs de branches et devient encombrant lorsque de nombreuses couches de données doivent être ajoutées à la phylogénie. Alternativement, phandango41 est une interface graphique (https://jameshadfield.github.io/phandango/#/) au format de page Web conviviale et évolutive qui pourrait facilement être utilisée pour atteindre le même objectif, et des informations plus détaillées sur la façon de l’utiliser avec les sorties ProkEvo ont récemment été publiées20. D’autres outils comme iTOL pourraient également être utilisés pour la visualisation dépendante de la phylogénie des données53, mais ils nécessitent l’utilisation d’une interface graphique et ne peuvent pas être incorporés dans des scripts automatisés. En outre, il peut être difficile d’estimer les phylogénies précises du génome du noyau en raison de l’impact cryptique du transfert horizontal de gènes dépendant des ensembles de données. Des programmes tels que Gubbins54 peuvent être utilisés à cette fin, mais ils présentent également certaines limitations telles que la nécessité d’utiliser l’alignement du génome entier et des ensembles de données spécifiques à la lignée ST pour l’estimation correcte des phylogénies. Au lieu de cela, d’autres approches indépendantes de la phylogénie peuvent être déployées, ce qui finit par nécessiter d’autres types de visualisations pour intégrer des métadonnées ou des informations génomiques accessoires, comme dans le cas de l’analyse multidimensionnelle55,56. Enfin, une approche empirique et arbitraire a été utilisée pour agréger les lignées ST mineures et les variantes cgMLST, en plus de filtrer les loci DERMA les plus importants à quantifier. Ce type d’agrégation de données peut être effectué empiriquement à l’aide de l’expertise en connaissances du domaine, mais pourrait également être réalisé statistiquement en définissant un critère a priori de la proportion de la distribution à afficher, ou en utilisant des mesures liées à la distribution telles que la plage interquartile, l’écart-type ou l’asymétrie, pour définir finalement un seuil. Il est important de noter que la définition des génotypes mineurs est directement influencée par la nature des données, car la taille de l’échantillon, et le biais dans les types d’échantillons environnementaux peut influencer directement la composition génotypique. Quoi qu’il en soit, la principale considération est que la cartographie du contenu du génome accessoire sur la structure de la population permet d’identifier les déterminants génétiques potentiels de la diversification écologique, tels que les gènestranscendant ou spécifiant les niches 57,58,59.

Bien que les scripts R disponibles aient été conçus pour l’automatisation du présent travail, tous les scripts fournis devraient être développés davantage pour devenir une bibliothèque de science des données abstraite et déployable, qui pourrait par exemple faire partie intégrante du pipeline ProkEvo. Néanmoins, l’utilisation de cette approche présente certains avantages spécifiques, tels que l’utilisation du génotypage ou du schéma de regroupement baps de niveau 1. Le placement des sous-groupes ou haplotypes BAPS de niveau 1 entre les lignées sérovar et ST a été défini empiriquement en fonction de la structure génétique de la population de Salmonella, mais il semble être applicable à d’autres espèces telles que Campylobacter jejuni et Staphylococcus aureus20. De plus, BAPS1 capture avec précision la relation ancestrale entre les lignées ST et fournit une approche évolutive pour l’analyse évolutive, en particulier lorsque les applications phylogénétiques sont limitéesà 20. En outre, l’utilisation d’une approche imbriquée pour examiner les relations hiérarchiques et les modèles de diversification facilite l’identification de l’ascendance entre les lignées ST à l’aide de sous-groupes BAPS1 et entre les variantes cgMLST utilisant des lignées ST, passant successivement d’une résolution génotypique inférieure à une résolution génotypique plus élevée dans l’évaluation de la structure de la population. Il est important de répéter que la distribution de fréquence des lignées ST et des variantes cgMLST, si elle est tirée d’un échantillon systématiquement collecté et alimenté statistiquement, peut devenir un indicateur de la condition écologique 1,6,43. Par conséquent, les lignées ST dominantes et les variantes de la CgMLST sont susceptibles de contenir des caractéristiques génomiques uniques qui peuvent être à la base du mécanisme biologique de leur dominance dans la population de cet environnement ou de cet hôte particulier.

Ici, deux mesures statistiques indépendantes ont été utilisées pour évaluer le degré de clonalité de la population, ce qui permet une compréhension auxiliaire de la diversité génétique de la population, ce qui peut indiquer l’apparition passée d’un biais d’échantillon, de goulots d’étranglement de population ou d’un effet fondateur. En particulier, l’évaluation agnostique des sous-groupes baps de niveau 1 à 6 à travers les lignées ST peut affiner la compréhension de la diversité génétique qui ne peut généralement pas être résolue en examinant simplement le niveau de variante de Salmonella cgMLST généré par SISTR. Comme mentionné précédemment, d’autres caractéristiques du pan-génome peuvent être mappées sur la structure de la population et des fichiers contenant la composition des gènes plasmidiques et virulences, en plus de l’utilisation d’autres bases de données AMR ainsi que d’un ensemble de données pan-génome agnostique, sont automatiquement générés par ProkEvo20. Il convient de noter que ProkEvo ne permet actuellement pas de différencier les loci AMR présents dans le chromosome bactérien des plasmides. Les métadonnées écologiques et épidémiologiques peuvent également être facilement intégrées dans cette approche analytique en incorporant d’autres variables dans un fichier .csv contenant toutes les informations génomiques. En particulier, les travaux présentés ici complètent spécifiquement l’utilisation de la plate-forme de calcul évolutive et portable ProkEvo, qui a été conçue pour être utilisée par des chercheurs axés sur les analyses heuristiques de la génomique des populations qui facilitent l’exploration et la personnalisation des données par l’utilisateur. D’autres plateformes peuvent être utilisées pour le génotypage, l’analyse de la structure des populations et/ou la cartographie des génomes accessoires tels que Enterobase5, PATRIC60 et BacWGSTdb61. Ces dernières sont d’excellentes ressources qui facilitent l’exploration de données génomiques pour les chercheurs qui ne cherchent pas à personnaliser et à utiliser l’informatique en grappe pour une analyse évolutive et complexe. L’approche analytique présentée ici est spécifiquement conçue pour les chercheurs qui souhaitent avoir la flexibilité d’effectuer une analyse génomique des populations à l’aide de scripts reproductibles sur leur machine locale ou en utilisant une plate-forme de calcul cloud ou haute performance.

En conclusion, la plate-forme analytique basée sur R présentée dans ce travail visait à fournir un guide pratique aux microbiologistes, aux écologistes et aux épidémiologistes sur la façon de: i) utiliser des approches dépendantes de la phylogénie pour cartographier les génotypes hiérarchiques; ii) évaluer la distribution de fréquence des génotypes comme approximation pour évaluer l’aptitude écologique; iii) déterminer les degrés de clonalité propres à la lignée à l’aide d’approches statistiques indépendantes; et iv) cartographier les loci de RMI différenciant la lignée comme exemple de la façon d’exploiter le contenu génomique accessoire dans le contexte de la structure de la population. Les scripts fournis ici peuvent être utilisés sur une machine locale ou sur une plate-forme de calcul haute performance. Pour les microbiologistes expérimentaux et environnementaux, cette approche facilite l’étude d’ensembles de données visant à identifier des traits uniques et des voies candidates pour d’autres études mécanistes qui peuvent finalement être contextualisées au niveau de la population. Les écologistes peuvent bénéficier de cette approche en étant en mesure d’analyser des ensembles de données modérés à volumineux, ce qui, en théorie, augmente le pouvoir statistique nécessaire pour trouver des signatures de sélection dans une population tout en tenant compte des relations de parenté et des modèles de diversification. Enfin, les épidémiologistes peuvent exploiter des informations pratiques uniques pour le diagnostic et la surveillance en définissant des unités génotypiques d’intérêt et en prédisant des traits associés à la santé publique tels que la RAM. Plus généralement, ce guide analytique fournit un cadre généralisable pour utiliser ProkEvo pour effectuer une analyse génomique basée sur la population qui peut être utilisée pour déduire des modèles évolutifs et écologiques pour les espèces pathogènes et non pathogènes puisque l’approche est généralisable à d’autres espèces bactériennes.

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Disclosures

Les auteurs ont déclaré qu’il n’existait pas d’intérêts concurrents.

Acknowledgments

Ce travail a été soutenu par un financement fourni par la Division de la recherche agricole de l’UNL-IANR et de l’Institut national de recherche et d’éducation sur la résistance aux antimicrobiens, ainsi que par le Nebraska Food for Health Center du Département des sciences et technologies alimentaires (UNL). Cette recherche n’a pu être complétée qu’en utilisant le Holland Computing Center (HCC) de l’UNL, qui reçoit le soutien de la Nebraska Research Initiative. Nous sommes également reconnaissants d’avoir accès, par l’intermédiaire du HCC, aux ressources fournies par l’Open Science Grid (OSG), qui est soutenu par la National Science Foundation et l’Office of Science du département de l’Énergie des États-Unis. Ce travail a utilisé le logiciel de gestion du flux de travail Pegasus qui est financé par la National Science Foundation (subvention n ° 1664162).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
amr_data_filtered https://figshare.com/account/projects/116625/articles/14829225?file=28758762
amr_data_raw https://figshare.com/account/projects/116625/articles/14829225?file=28547994
baps_output https://figshare.com/account/projects/116625/articles/14829225?file=28548003
Core-genome phylogeny https://figshare.com/account/projects/116625/articles/14829225?file=28548006
genome_sra https://figshare.com/account/projects/116625/articles/14829225?file=28639209
Linux, Mac, or PC any high-performance platform
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sistr_output https://figshare.com/account/projects/116625/articles/14829225?file=28548000
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Génétique numéro 178
Exploration heuristique des génotypes hiérarchiques et des loci du génome accessoire dans les populations bactériennes
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Pavlovikj, N., Gomes-Neto, J. C.,… More

Pavlovikj, N., Gomes-Neto, J. C., Benson, A. K. Heuristic Mining of Hierarchical Genotypes and Accessory Genome Loci in Bacterial Populations. J. Vis. Exp. (178), e63115, doi:10.3791/63115 (2021).

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