Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

تحليل التدفق الخلوي لمعلمات الميتوكوندريا المتعددة في الخلايا الجذعية متعددة القدرات المستحثة بالإنسان ومشتقاتها العصبية والدبقية

Published: November 8, 2021 doi: 10.3791/63116
Automatic Translation
*1,2, *1,2,3,4, 1,2, 1,2
1Department of Clinical Medicine (K1), University of Bergen, 2Neuro-SysMed, Center of Excellence for Clinical Research in Neurological Diseases, Haukeland University Hospital, 3Department of Neurosurgery, Qilu Hospital and Institute of Brain and Brain-Inspired Science, Cheeloo College of Medicine, Shandong University, 4Shandong Key Laboratory of Brain Function Remodeling
* These authors contributed equally

Summary

تشير هذه الدراسة إلى نهج جديد لقياس المعلمات الوظيفية المتعددة للميتوكوندريا استنادا إلى قياس التدفق الخلوي والتلطيخ المزدوج باستخدام اثنين من المراسلين الفلوريين أو الأجسام المضادة للكشف عن التغيرات في حجم الميتوكوندريا ، وإمكانات غشاء الميتوكوندريا ، ومستوى أنواع الأكسجين التفاعلية ، وتكوين سلسلة الجهاز التنفسي للميتوكوندريا ، والحمض النووي للميتوكوندريا.

Abstract

الميتوكوندريا مهمة في الفيزيولوجيا المرضية للعديد من الأمراض التنكسية العصبية. غالبا ما تكون التغيرات في حجم الميتوكوندريا ، وإمكانات غشاء الميتوكوندريا (MMP) ، وإنتاج الميتوكوندريا لأنواع الأكسجين التفاعلية (ROS) ، وعدد نسخ الحمض النووي للميتوكوندريا (mtDNA) من سمات هذه العمليات. يفصل هذا التقرير نهجا جديدا قائما على قياس التدفق الخلوي لقياس معلمات الميتوكوندريا المتعددة في أنواع مختلفة من الخلايا ، بما في ذلك الخلايا الجذعية متعددة القدرات المستحثة من قبل الإنسان (iPSCs) والخلايا العصبية والدبقية المشتقة من iPSC. تستخدم هذه الاستراتيجية القائمة على التدفق الخلايا الحية لقياس حجم الميتوكوندريا ومستويات MMP و ROS ، بالإضافة إلى الخلايا الثابتة لتقدير مكونات السلسلة التنفسية للميتوكوندريا (MRC) والبروتينات المرتبطة ب mtDNA مثل عامل نسخ الميتوكوندريا A (TFAM).

من خلال المشاركة في التلطيخ مع مراسلي الفلورسنت ، بما في ذلك MitoTracker Green (MTG) ، و tetramethylrhodamine ethyl ester (TMRE) ، و MitoSox Red ، يمكن قياس التغيرات في حجم الميتوكوندريا و MMP و ROS الميتوكوندريا كميا والمتعلقة بمحتوى الميتوكوندريا. يسمح التلطيخ المزدوج بالأجسام المضادة ضد الوحدات الفرعية المعقدة MRC و translocase لغشاء الميتوكوندريا الخارجي 20 (TOMM20) بتقييم تعبير الوحدة الفرعية MRC. نظرا لأن كمية TFAM تتناسب مع عدد نسخ mtDNA ، فإن قياس TFAM لكل TOMM20 يعطي قياسا غير مباشر ل mtDNA لكل حجم الميتوكوندريا. يمكن تنفيذ البروتوكول بأكمله في غضون 2-3 ساعات. الأهم من ذلك ، تسمح هذه البروتوكولات بقياس معلمات الميتوكوندريا ، سواء على المستوى الكلي أو المستوى المحدد لكل حجم الميتوكوندريا ، باستخدام قياس التدفق الخلوي.

Introduction

الميتوكوندريا هي عضيات أساسية موجودة في جميع الخلايا حقيقية النواة تقريبا. الميتوكوندريا هي المسؤولة عن إمدادات الطاقة عن طريق إنتاج الأدينوسين ثلاثي الفوسفات (ATP) عن طريق الفسفرة التأكسدية وتعمل كوسطاء التمثيل الغذائي للتخليق الحيوي والتمثيل الغذائي. تشارك الميتوكوندريا بعمق في العديد من العمليات الخلوية المهمة الأخرى ، مثل توليد ROS ، وموت الخلايا ، وتنظيم Ca2 + داخل الخلايا. ارتبط خلل الميتوكوندريا بالعديد من الأمراض العصبية التنكسية ، بما في ذلك مرض باركنسون (PD) ، ومرض الزهايمر (AD) ، ومرض هنتنغتون (HD) ، وترنح فريدريش (FRDA) ، والتصلب الجانبي الضموري (ALS)1. ويعتقد أيضا أن زيادة الخلل الوظيفي في الميتوكوندريا وتشوه mtDNA تساهم في شيخوخة الإنسان 2,3.

تحدث أنواع مختلفة من خلل الميتوكوندريا في الأمراض العصبية التنكسية ، والتغيرات في حجم الميتوكوندريا ، وإزالة الاستقطاب MMP ، وإنتاج ROS ، والتغيرات في عدد نسخ mtDNA شائعة4،5،6،7. لذلك ، فإن القدرة على قياس هذه الوظائف وغيرها من وظائف الميتوكوندريا لها أهمية كبيرة عند دراسة آليات المرض واختبار العوامل العلاجية المحتملة. علاوة على ذلك ، نظرا لعدم وجود نماذج حيوانية تكرر بأمانة الأمراض العصبية التنكسية البشرية ، فإن إنشاء أنظمة نموذجية مناسبة في المختبر تلخص المرض البشري في خلايا الدماغ هو خطوة مهمة نحو فهم أكبر لهذه الأمراض وتطوير علاجات جديدة2،3،8،9.

يمكن استخدام iPSCs البشرية لتوليد خلايا دماغية مختلفة ، بما في ذلك الخلايا العصبية وغير العصبية (أي الخلايا الدبقية) ، وقد تم العثور على تلف الميتوكوندريا المرتبط بالأمراض العصبية التنكسية في كلا النوعينمن الخلايا 3،10،11،12،13. تتوفر الطرق المناسبة لتمايز iPSC إلى سلالات عصبية ودبقية 14،15،16. توفر هذه الخلايا منصة فريدة من نوعها للإنسان / المريض لنمذجة الأمراض في المختبر وفحص الأدوية. علاوة على ذلك ، نظرا لأن هذه مشتقة من المرضى ، فإن الخلايا العصبية المشتقة من iPSC والخلايا الدبقية توفر نماذج مرضية تعكس ما يحدث في البشر بشكل أكثر دقة.

حتى الآن ، تتوفر طرق قليلة ومريحة لقياس معلمات وظيفية متعددة للميتوكوندريا في iPSCs ، وخاصة الخلايا العصبية الحية والخلايا الدبقية. يوفر استخدام قياس التدفق الخلوي للعالم أداة قوية لقياس المعلمات البيولوجية ، بما في ذلك وظيفة الميتوكوندريا ، في الخلايا المفردة. يوفر هذا البروتوكول تفاصيل لتوليد أنواع مختلفة من خلايا الدماغ، بما في ذلك الخلايا الجذعية العصبية (NSCs)، والخلايا العصبية، والخلايا النجمية الدبقية من iPSCs، بالإضافة إلى النهج الجديدة القائمة على قياس التدفق الخلوي لقياس معلمات الميتوكوندريا المتعددة في أنواع الخلايا المختلفة، بما في ذلك iPSCs والخلايا العصبية والدبقية المشتقة من iPSC. يوفر البروتوكول أيضا استراتيجية تلطيخ مشترك لاستخدام قياس التدفق الخلوي لقياس حجم الميتوكوندريا ، MMP ، مستوى ROS الميتوكوندريا ، مجمعات MRC ، و TFAM. من خلال دمج مقاييس حجم الميتوكوندريا أو كتلتها ، تسمح هذه البروتوكولات أيضا بقياس كل من المستوى الكلي والمستوى المحدد لكل وحدة ميتوكوندريا.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

ملاحظة: راجع جدول المواد والجدول التكميلي S1 للاطلاع على وصفات جميع الوسائط والحلول المستخدمة في هذا البروتوكول.

1. تمايز iPSCs البشرية إلى NCSs ، والخلايا العصبية الدوبامين (DA) ، والخلايا النجمية

  1. إعداد لوحات مغلفة مصفوفة.
    1. قم بإذابة قارورة من 5 مل من المصفوفة على الجليد بين عشية وضحاها. قم بتخفيف 1 مل من المصفوفة مع 99 مل من النسر المتوسط المعدل من دولبيكو المتقدم البارد / F-12 من هام (DMEM / F12 المتقدم) (تركيز نهائي بنسبة 1٪). اصنع 1 مل من الأليكوتات وخزنها عند -20 درجة مئوية.
    2. قم بإذابة محلول المصفوفة عند 4 درجات مئوية (اجعله باردا) وقم بتغطية 6 آبار (1 مل لكل بئر في لوحة من 6 آبار).
    3. ضع اللوحة المطلية بالمصفوفة في حاضنة هواء رطبة بنسبة 5٪ CO2/95٪ عند 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة. أخرج اللوحة من الحاضنة واتركها تتوازن مع درجة حرارة الغرفة (RT).
      ملاحظة: يوصى باستخدام اللوحة في غضون 3 أيام من الطلاء. ومع ذلك ، يمكن تخزين اللوحة المطلية لمدة تصل إلى 2 أسابيع عند 4 درجات مئوية. فقط تذكر أن تخرجه واتركه يسخن إلى RT قبل الاستخدام. للتخزين لفترة طويلة، أضف 1 مل من وسط ثقافة iPSC إلى اللوحة المطلية لتجنب تجفيف المصفوفة.
  2. إذابة iPSCs
    1. قم بتسخين الألواح المطلية بالمصفوفة في RT أو في الحاضنة عند 37 درجة مئوية لمدة 20-30 دقيقة. قم بتسخين الكمية المطلوبة من وسيط ثقافة iPSC مسبقا في RT.
    2. امزج 6 مل من وسط ثقافة iPSC المسخن مسبقا مع 12 ميكرولتر من مثبط Y-27632 ROCK للحصول على تركيز نهائي قدره 10 ميكرومتر.
    3. قم بإذابة القارورة المجمدة من iPSCs جزئيا عند 37 درجة مئوية في حمام مائي حتى تبقى قطعة صغيرة من الجليد.
    4. أضف ببطء 1 مل من وسط زراعة iPSC المسخن مسبقا مع 12 ميكرولتر من مثبط ROCK إلى الخلايا. انقل المحتوى السائل للقارورة باستخدام iPSCs قطرة إلى بئر واحد من لوحة مسبقة الصنع من 6 آبار باستخدام ماصة سعة 5 مل.
    5. حرك اللوحة في اتجاهات عمودية لخلط محتويات البئر وإعادة اللوحة إلى الحاضنة. قم بتغيير وسط زراعة iPSC بعد 24 ساعة بعد الغسيل باستخدام محلول ملحي مخزن بالفوسفات (DPBS) من دولبيكو (1x) (Ca2 + / Mg2+-free) (4 مل لكل بئر في صفيحة من 6 آبار).
      ملاحظة: لا تقم بإضافة مثبط ROCK إلى الوجبات اللاحقة. تغيير وسيط ثقافة iPSC يوميا.
  3. الزراعة الفرعية ل iPSCs
    1. قم بتسخين الألواح المطلية بالمصفوفة في RT أو في الحاضنة عند 37 درجة مئوية لمدة 20-30 دقيقة. قم بتسخين الكمية المطلوبة من وسيط ثقافة iPSC مسبقا في RT.
    2. استنشاق وسط الثقافة من الألواح التي تحتوي على الخلايا. شطف iPSCs مع DPBS (1x) (Ca 2 + / Mg2 + مجانا) (4 مل لكل بئر في لوحة من 6 آبار).
    3. أضف EDTA (0.5 ملليمتر) (1 مل لكل بئر في لوحة من 6 آبار). احتضن الألواح عند 37 درجة مئوية حتى تبدأ حواف المستعمرات في الرفع من البئر (عادة 3-5 دقائق). شفط EDTA.
    4. أضف وسط ثقافة iPSC المسخن مسبقا (4 مل لكل بئر في صفيحة من 6 آبار) وافصل مستعمرات iPSC بقوة باستخدام ماصة معقمة سعة 10 مل مرة واحدة. لا تقم بماصة لأعلى ولأسفل لأن هذا قد يكسر كتل الخلايا إلى خلايا مفردة.
    5. انقل محتويات كل بئر إلى بئرين فرديين في صفيحة من 6 آبار مغلفة بالمصفوفة (2 مل لكل بئر في صفيحة من 6 آبار) واحتضنها عند 37 درجة مئوية. لا تولد فقاعات في التعليق أثناء السحب.
      ملاحظة: رج الطبق بلطف قبل الاحتفاظ به في الحاضنة. يمكن أن تكون نسبة الانقسام 1: 2 (بئر واحد إلى بئرين جديدين) إلى 1: 4 (بئر واحد في 4 آبار جديدة).
    6. استبدل الوسط يوميا حتى تصل المستعمرات إلى 60٪ من الالتقاء مع حجم جيد واتصالات.
  4. الحث العصبي وتوليد السلف العصبي
    1. تحضير 500 مل من الوسط المحدد كيميائيا (CDM) ، و 500 مل من وسط الحث العصبي (NIM) ، و 500 مل من وسط الخلايا الجذعية العصبية الخالي من المصل (NSC SF).
    2. شطف الخلايا مع DPBS (1x) (Ca 2 + / Mg2 + مجانا) (4 مل لكل بئر في لوحة من 6 آبار) وإضافة NIM (3 مل لكل بئر في لوحة من 6 آبار). إعداد اليوم 0.
    3. استبدل NIM (3 مل لكل بئر في صفيحة من 6 آبار) في اليوم 1 واليوم 3 واليوم 4 وراقب تحت الفحص المجهري يوميا.
    4. في اليوم 5 ، افصل الورود العصبية إلى ثقافة التعليق كما هو موضح أدناه.
      1. يغسل مرة واحدة بلطف باستخدام DPBS (1x) (Ca 2 + / Mg2 + -free) (4 مل لكل بئر في طبق من 6 آبار). أضف الكولاجيناز IV (1 مل لكل بئر في صفيحة من 6 آبار) واحتفظ بها في حاضنة لمدة دقيقة واحدة. استنشق الكولاجيناز IV واغسله مرة واحدة باستخدام DPBS (1x) (4 مل لكل بئر في طبق من 6 آبار) بلطف.
      2. أضف 2 مل من NSC SF Medium لكل بئر إلى لوحة من 6 آبار. افصل الخلايا عن طريق كشط قيعان الآبار عن طريق رسم الشبكات باستخدام طرف ماصة 200 ميكرولتر.
      3. اجمع تعليق الخلية من طبق 6 بئر في طبق غير ملتصق بطول 10 سم. اجعل الحجم يصل إلى 12 مل باستخدام NSC SF Medium.
      4. رج الطبق غير الملتصق عند 65-85 دورة في الدقيقة على شاكر مداري في حاضنة لمنع التجميع.
  5. DA تمايز الخلايا العصبية
    1. في اليوم 7 ، أضف 12 مل من آلية التنمية النظيفة المكملة بعامل نمو الخلايا الليفية 100 نانوغرام / مل -8b (FGF-8b) ووضع الطبق على الخلاط المداري في الحاضنة.
    2. في الأيام 8-13 ، قم بتغيير الوسط كل يومين وراقب تحت المجهر يوميا.
    3. في اليوم 14 ، أضف 12 مل من آلية التنمية النظيفة المكملة ب 100 نانوغرام / مل FGF-8b و 1 ميكرومتر بورمورفامين (PM). ضع الطبق على الخلاط المداري في الحاضنة.
    4. في الأيام 15-20 ، قم بتغيير الوسط كل يومين وراقب الخلايا تحت الفحص المجهري يوميا.
    5. قم بتمرير الكرات ميكانيكيا باستخدام نصائح 1000 ميكرولتر لتفتيت الكرات الأكبر.
      ملاحظة: يمكن أن تكون النسبة 1: 2 (طبق واحد إلى طبقين جديدين).
  6. إنهاء التمايز
    1. قم بتغطية صفيحة أو أغطية من 6 آبار بالبولي إل-أورنيثين (PLO) واللامينين كما هو موضح أدناه.
      1. قم بتغطية صفيحة من 6 آبار ب 1 مل من منظمة التحرير الفلسطينية لكل بئر ، واحتضن اللوحة عند 37 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة. استنشاق حل منظمة التحرير الفلسطينية.
      2. تعقيم اللوحة تحت الأشعة فوق البنفسجية لمدة 20 دقيقة. شطف الآبار مرتين باستخدام DPBS (1x) (4 مل لكل بئر في لوحة من 6 آبار).
      3. أضف محلول laminin 5 ميكروغرام / مل (1 مل لكل بئر في صفيحة من 6 آبار) إلى البئر واحتضنه عند 37 درجة مئوية لمدة 2 ساعة. استنشق اللامينين واغسل الآبار لفترة وجيزة باستخدام DPBS (1x) (4 مل لكل بئر في صفيحة من 6 آبار) مرة واحدة قبل الطلاء.
    2. اجمع جميع الكرات (من الخطوة 1.5.5) في أنابيب سعة 50 مل واشحن ب DPBS (1x). يقلب المزيج على 300 × غرام لمدة 5 دقائق. شفط السوبرناتانت.
    3. احتضان مع 2 مل من كاشف تفكك الخلايا (انظر جدول المواد) لمدة 10 دقائق عند 37 درجة مئوية في حمام مائي تليها التريتور لطيف مع ماصة 200 ميكرولتر (20-50 مرة اعتمادا على حجم الكرات، وتجنب تشكيل فقاعة).
    4. قم بتحييد كاشف تفكك الخلية باستخدام 2 مل من وسيط النسر المعدل من دولبيكو (DMEM) مع مصل بقري جنيني بنسبة 10٪ (FBS) وطرد مركزي للأنبوب المخروطي سعة 50 مل الذي يحتوي على الخلايا عند 300 × جم لمدة 5 دقائق في RT.
    5. أضف 1 مل من آلية التنمية النظيفة المكملة بعامل التغذية العصبية المشتق من الدماغ (BDNF) و 10 نانوغرام / مل من عامل التغذية العصبية المشتق من خط الخلايا الدبقية (GDNF) لإعادة تعليق كريات الخلايا عن طريق السحب بلطف لأعلى ولأسفل للحصول على معلقات أحادية الخلية.
    6. استنشاق محلول اللامينين من اللوحة (الخطوة 1.6.1.3) ، واغسله لفترة وجيزة باستخدام DPBS (1x) (4 مل لكل بئر في صفيحة من 6 آبار) ، وزرع الخلايا (من الخطوة 1.6.5) في الألواح المطلية مسبقا أو أغطية في 3 مل من CDM مكملة ب 10 نانوغرام / مل BDNF و 10 نانوغرام / مل GDNF. تغذية الخلايا كل 4 أيام.
      ملاحظة: يمكن الحفاظ على الثقافات المميزة لعدة أسابيع تصل إلى 3 أشهر. عادة ما يظهر المورفولوجيا العصبية بعد 2 أسابيع من الإنهاء ويمكن استخدامها لتحليلات المصب من تلك النقطة فصاعدا. BDNF و GDNF ليست ضرورية للزراعة لصيانة أطول (تصل إلى 2 أشهر).
  7. جيل مجلس الأمن القومي
    1. لوحات مصفوفة معطف.
    2. اجمع جميع الكرات العصبية (التي تم إنشاؤها من الخطوة 1.4) في أنابيب 50 مل واشحن مع DPBS (1x) (Ca 2 + / Mg2 + -free). يقلب المزيج على 300 × غرام لمدة 5 دقائق. شفط الخارقين.
    3. احتضان الكريات مع 2 مل من كاشف تفكك الخلايا لمدة 10 دقائق عند 37 درجة مئوية في حمام مائي ، تليها التريتور اللطيف مع ماصة 200 ميكرولتر (20-50 مرة اعتمادا على حجم المجالات ، وتجنب تكوين فقاعة).
    4. تحييد مع 2 مل من DMEM مع 10٪ FBS والطرد المركزي للأنابيب المخروطية 50 مل التي تحتوي على الخلايا في 300 × غرام لمدة 5 دقائق في RT. شفط supernatants. أعد تعليق كريات الخلايا عن طريق السحب بلطف لأعلى ولأسفل للحصول على معلقات أحادية الخلية.
    5. استنشاق محلول المصفوفة من لوحة مغلفة مسبقا وزرع الخلايا في الألواح المطلية مسبقا في NSC SF Medium (3 مل لكل بئر في لوحة من 6 آبار). تغذية الخلايا كل 2-3 أيام وتقسيم الخلايا عند التقاء.
      ملاحظة: من هذه المرحلة فصاعدا ، يمكن توسيع NSCs وتجميدها لأسفل.
  8. تمايز الخلايا النجمية الدبقية
    1. تمايز الخلايا النجمية عن NSCs
      1. تحضير 500 مل من وسط تمايز الخلايا النجمية.
      2. NSCs البذور على لوحات / أغطية مغلفة بالبولي دي ليسين (PDL) مع NSC SF Medium.
      3. في اليوم التالي ، اشطف الخلايا باستخدام DPBS (1x) (Ca 2 + / Mg2 + -free) (4 مل لكل بئر في صفيحة من 6 آبار) وأضف Astrocyte Differentiation Medium (3 مل لكل بئر في صفيحة من 6 آبار). إعداد اليوم 0.
      4. راقب NSCs تحت المجهر يوميا واستبدل وسط تمايز الخلايا النجمية (3 مل لكل بئر في صفيحة من 6 آبار) كل يومين من الأيام 1 إلى 27.
    2. نضج الخلايا النجمية
      1. إعداد وسط نضج الخلايا النجمية.
      2. في اليوم 28 ، اشطف الخلايا باستخدام DPBS (1x) (4 مل لكل بئر في صفيحة 6 آبار) وأضف وسط نضج الخلايا النجمية (3 مل لكل بئر في لوحة من 6 آبار).
      3. في اليوم 29 وما بعده ، راقب الخلايا تحت المجهر يوميا واستبدل وسط نضج الخلايا النجمية (3 مل لكل بئر في صفيحة 6 آبار) كل يومين.
      4. بعد شهر واحد من النضج ، قم بتوسيع الخلايا والحفاظ عليها بالتبريد من هذه المرحلة فصاعدا.
        ملاحظة: خلال هذه المرحلة، سيزداد عدد الخلايا. عند تقسيم الخلايا ، فإن الأغطية المغلفة ب PDL ليست ضرورية للزراعة.

2. توصيف الخلايا عن طريق الكيمياء المناعية وتلطيخ التألق المناعي

  1. في نهاية فترة الثقافة ، انقل الأغطية مع الخلايا إلى لوحة من 12 بئرا.
    شطف الخلايا مع المالحة العازلة بالفوسفات (PBS) (1x) مرتين واحتضان لمدة 10 دقائق في 4٪ بارافورمالدهيد (PFA) (0.5 مل لكل بئر في لوحة 12 بئر) في RT.
    ملاحظة: يمكن تغطية العينة الثابتة ب 2 مل من PBS (1x) وتخزينها عند 4 درجات مئوية حتى تكون مطلوبة للتلطيخ المناعي. PFA سام ويشتبه في أنه يسبب السرطان. منع تعرض الجلد والعين، والعمل تحت غطاء الدخان الكيميائي.
  2. قم بحظر الخلايا وتغلغلها واحتضانها باستخدام مخزن مؤقت مانع يحتوي على PBS (1x) و 0.3٪ Triton X-100 و 10٪ مصل الماعز العادي لمدة ساعة واحدة في RT.
  3. احتضان مع الأجسام المضادة الأولية في منع العازلة بين عشية وضحاها عند 4 درجات مئوية: بقع iPSCs مع عامل النسخ المرتبط بالأوكتامر 4 (Oct4) والمستضد الجنيني المضاد للمرحلة 4 (SSEA4) ، NSCs مع المنطقة المحددة للجنس Y box-2 (Sox2) ومضاد Nestin ، الكرات العصبية مع المربع المضاد للإقران -6 (Pax6) ومضاد Nestin ، الخلايا النجمية مع البروتين الحمضي الليفي المضاد للدبقية (GFAP) والبروتين المرتبط بالكالسيوم المضاد S100 β (S100β) ، والخلايا العصبية DA مع هيدروكسيلاز مضاد للتيروزين (TH) ، مضاد β III Tubulin (Tuj 1) ، مضاد Synaptophysin ، ومضاد PSD-95 (0.5 مل من محلول الأجسام المضادة الأساسي لكل بئر في لوحة من 12 بئرا ؛ انظر جدول المواد للحصول على التفاصيل).
  4. اغسل العينات باستخدام PBS (1x) ثلاث مرات لمدة 10 دقائق لكل منها مع اهتزاز لطيف.
  5. احتضان مع محلول الأجسام المضادة الثانوية (1:800 في المخزن المؤقت المانع ، 0.5 مل من محلول الأجسام المضادة الثانوية Alexa Fluor لكل بئر في صفيحة 12 بئر) لمدة 1 ساعة في RT مع هزاز لطيف.
  6. احتضن الخلايا باستخدام Hoechst 33342 (1:5,000 ، 0.5 مل لكل بئر في صفيحة من 12 بئرا) في PBS (1x) لمدة 15 دقيقة في RT لتسمية النوى.
  7. قم بتركيب الخلايا مع وسط التركيب وجاف بين عشية وضحاها في RT للتصوير تحت المجهر الفلوري في الظلام. انظر الشكل التكميلي S1 للاطلاع على إعدادات المجهر ومعلماته.

3. قياس التدفق الخلوي لحجم الميتوكوندريا ، MMP ، و ROS الميتوكوندريا في الخلايا الحية

  1. زرع الخلايا بشكل منفصل في 4 آبار في صفيحة من 6 آبار حتى تصل الخلايا إلى 50٪ -60٪ التقاء. قم بتسمية هذه الآبار الأربعة على أنها # 1 و # 2 و # 3 و # 4.
  2. في نهاية فترة الاستزراع ، قم بإعداد 5 حلول تلطيخ فردية (500 ميكرولتر لكل بئر في لوحة من 6 آبار) على النحو التالي: # 1 وسط استزراع فقط (إلى البئر # 1 يحتوي على خلايا فقط للتحكم ؛ # 2-1 يحتوي على FCCP (100 ميكرومتر) ؛ # 2-2 تحتوي على FCCP (100 ميكرومتر) + TMRE (100 نانومتر) + MTG (150 نانومتر) في وسط الاستزراع ؛ # 3 تحتوي على TMRE (100 نانومتر) + MTG (150 نانومتر) في وسط الثقافة ؛ # 4 يحتوي على MitoSox Red (10 μM) + MTG (150 nM) في PBS (1x) مع 10٪ FBS. انظر الشكل 1 أ والجدول التكميلي S2 وجدول المواد للحصول على تفاصيل حول هذه المركبات وإعداد قياس التدفق الخلوي.
    ملاحظة: استخدم الوسط الثقافي لإعداد محلول التلطيخ. قم بتسخين الوسط و PBS (1x) في RT قبل الاستخدام. FCCP سامة. منع تعرض الجلد والعين والعمل تحت غطاء الدخان الكيميائي.
  3. استنشاق الوسيط من البئر رقم 2 وأضف الحل رقم 2-1 (FCCP فقط). احتضن الخلايا عند 37 درجة مئوية لمدة 10 دقائق.
  4. قم بشفط الوسط من الآبار رقم 2 و # 3 وأضف الحل # 2-2 (FCCP + TMRE + MTG) في البئر رقم 2 والحل رقم 3 (TMRE + MTG) في # 3. احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية لمدة 45 دقيقة.
  5. استنشاق الوسيط من البئر رقم 4 وأضف الحل رقم 4 (MitoSox Red + MTG). احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة.
  6. شفط الوسط من جميع الآبار. يغسل مع PBS (1x) (4 مل لكل بئر في لوحة من 6 آبار). افصل الخلايا باستخدام 1 مل من كاشف تفكك الخلايا (1 مل لكل بئر في صفيحة من 6 آبار) عند 37 درجة مئوية لمدة 5 دقائق. تحييد كاشف تفكك الخلية في 1 مل من DMEM مع 10٪ FBS (2 مل لكل بئر في لوحة 6 آبار).
  7. جمع محتويات جميع الآبار في أنابيب مخروطية 15 مل. جهاز طرد مركزي للأنابيب عند 300 × غرام لمدة 5 دقائق. اغسل الكريات باستخدام PBS (1x) مرة أو مرتين.
  8. شفط supernatants ولكن ترك ما يقرب من 100 ميكرولتر في الأنابيب. أعد تعليق كريات الخلايا في 300 ميكرولتر من PBS (1x). انقل الخلايا إلى أنابيب الطرد المركزي الدقيقة 1.5 مل. حافظ على الأنابيب في الظلام في RT.
  9. تحليل الخلايا باستخدام مقياس التدفق الخلوي (مع تكوين ليزر 3 أزرق و 1 أحمر). اكتشف MTG في المرشح 1 (FL1) باستخدام مرشح تمرير النطاق الترددي 530/30 ، TMRE في المرشح 2 (FL2) باستخدام مرشح النطاق الترددي 585/40 ، و MitoSox Red في المرشح 3 (FL3) باستخدام مرشح تمرير النطاق الترددي 510/580.

4. قياس التدفق الخلوي للوحدات الفرعية المعقدة MRC و TFAM في الخلايا الثابتة

  1. في نهاية فترة الزرع ، افصل الخلايا (~ 106) عن طريق إضافة كاشف تفكك الخلية ؛ ثم ، بيليه وجمع الخلايا في أنبوب 15 مل. اغسل الخلايا عن طريق الطرد المركزي باستخدام PBS (1x) مرتين عن طريق الطرد المركزي عند 300 × جم لمدة 5 دقائق.
  2. ثبت الخلايا في 1.6٪ PFA (1 مل من 1.6٪ PFA في أنبوب 15 مل) في RT لمدة 10 دقائق. اغسل الخلايا عن طريق الطرد المركزي باستخدام PBS (1x) مرتين عن طريق الطرد المركزي عند 300 × جم لمدة 5 دقائق.
  3. تخلل الخلايا مع الميثانول المثلج البارد 90٪ (1 مل من الميثانول 90٪ في أنبوب 15 مل) عند -20 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة.
  4. قم بحظر العينات في المخزن المؤقت المانع الذي يحتوي على 0.3 مليون جليسين ، ومصل الماعز بنسبة 5٪ ، وألبومين مصل البقر (BSA) بنسبة 1٪ - الجزء V في PBS (1x) (1 مل من المخزن المؤقت المانع في أنبوب 15 مل). اغسل الخلايا عن طريق الطرد المركزي باستخدام PBS (1x) مرتين (كما في الخطوة 3.7).
  5. احتضن الخلايا بالأجسام المضادة الأولية التالية لمدة 30 دقيقة: anti-NDUFB10 (1:1,000) لقياس الوحدة الفرعية المعقدة I ، الوحدة الفرعية المعقدة لبروتين الفلافوبروتين A (SDHA ، 1:1,000) لقياس الوحدة الفرعية II المعقدة و anti-COX IV (1:1,000) لقياس الوحدة الفرعية IV المعقدة ، والأجسام المضادة المضادة TFAM المترافقة مع Alexa Fluor 488 (1:400). قم بتلطيخ نفس العدد من الخلايا بشكل منفصل باستخدام الأجسام المضادة المضادة TOMM20 المترافقة مع Alexa Fluor 488 (1:400) لمدة 30 دقيقة (1 مل من محلول الأجسام المضادة الأساسي في أنبوب 15 مل ؛ انظر جدول المواد للحصول على تفاصيل حول الأجسام المضادة).
  6. اغسل الخلايا باستخدام PBS (1x) مرة واحدة باستخدام الطرد المركزي عند 300 × جم لمدة 5 دقائق. أضف أجساما مضادة ثانوية (1:400) إلى أنابيب NDUFB10 و SDHA و COX IV واحتضن الخلايا بهذه المحاليل لمدة 30 دقيقة.
  7. اغسل الخلايا باستخدام PBS (1x) مرة واحدة عن طريق الطرد المركزي عند 300 × جم لمدة 5 دقائق. شفط supernatants ، وترك ما يقرب من 100 ميكرولتر في الأنابيب. أعد تعليق كريات الخلايا في 300 ميكرولتر من PBS (1x). انقل الخلايا إلى أنابيب الطرد المركزي الدقيقة 1.5 مل المحفوظة في الظلام على الجليد.
  8. تحليل الخلايا على مقياس التدفق الخلوي (مع تكوين ليزر أزرق 3 و 1 أحمر). اكتشف الإشارات في المرشح 1 (FL1) باستخدام مرشح تمرير النطاق الترددي 530/30. انظر الشكل التكميلي S2 للاطلاع على إعدادات المجهر والمعلمات.

5. اكتساب وتحليل قياس التدفق الخلوي

  1. استخدم أنبوب التحكم غير الملون لضبط مخططات تشتت منطقة التشتت الأمامية (FSC-A) ومنطقة التشتت الجانبية (SSC-A) بناء على حجم وتعقيد مجموعة الخلايا التي تم تحليلها. انظر الشكل التكميلي S2 للاطلاع على إعدادات المجهر والمعلمات.
    ملاحظة: قم بإعداد عناصر تحكم غير ملطخة لأنواع الخلايا الفردية.
  2. استخدم أنابيب التحكم غير الملطخة لتحديد البوابات الموجبة، واستخدم أنابيب التحكم أحادية اللون للتعويض عن التداخل الطيفي الفلوري بين MTG (الفلوروفور-1 [FL-1]) وTMRE (FL-2) في قياس التدفق الخلوي متعدد الألوان. استخدم التحكم في النمط المتماثل للتحكم السلبي لمراقبة تلطيخ الخلفية في عينات MRC و TFAM. استخدم أنبوب FCCP كعنصر تحكم في إزالة الاستقطاب لتلطيخ TMRE.
  3. قم بإخراج الحطام الدخيل لاختيار الخلايا الحية والبوابة الرئيسية من مخطط التشتت الأمامي والجانبي (الشكل 2A). قم بإخراج الثنائيات باستخدام ارتفاع تشتت أمامي (FSC-H) مقابل (مقابل) مخطط كثافة FSC-A لاستبعاد الثنائيات وكذلك بناء ارتفاع تشتت جانبي (SSC-H) مقابل مخطط SSC-A (الشكل 2A).
  4. الحصول على البيانات (مقياس التدفق الخلوي)
    1. باستخدام العينات غير الملطخة أو المتماثلة كعنصر تحكم سلبي ، قم بإنشاء بوابة فوق المجموعة الرئيسية لأحداث الخلية الواحدة أثناء عرض SSC-A والمرشحات المختلفة (FL1 و FL2 و FL3 و FL4) (الشكل 1B والشكل 2B).
  5. تحليل البيانات (برنامج CFlow)
    1. انسخ موضع البوابات على عينات الخلايا الملطخة ، وسجل كمية الخلايا الملطخة بشكل إيجابي للتلطيخ الإيجابي.
    2. لكل مجموعة فرعية من الخلايا ، حدد مخططا بيانيا وحلل متوسط كثافة التألق (MFI) لقنوات المرشح المختلفة (FL1 ، FL2 ، FL3 ، FL4) (المحور x).
      1. احسب مستويات TMRE عن طريق طرح MFI ل FL2 للخلايا المعالجة ب FCCP # 2 من MFI ل FL2 من العينات الملطخة ب TMRE # 3 في رسم بياني ، كما هو الحال في Eq (1) أدناه.
        مستويات TMRE = MFI من FL2 من # 3 عينات TMRE ملطخة - MFI من FL2 من # 2 الخلايا المعالجة FCCP (1)
      2. احسب القيم المحددة ل MMP و ROS الميتوكوندريا بواسطة MFI في TMRE أو MitoSox Red ، مع قسمة مؤشر حجم الميتوكوندريا MTG.
      3. احسب القيمة المحددة للوحدة الفرعية المعقدة و TFAM باستخدام MFI في التعبير المعقد أو TFAM ، مع قسمة مؤشر حجم الميتوكوندريا TOMM20.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

يوضح الشكل 3 وصفا تخطيطيا لطريقة التمايز واستراتيجيات التدفق الخلوي. يتم تمييز iPSCs البشرية إلى وريدات عصبية ثم يتم رفعها إلى ثقافة التعليق للتمايز في المجالات العصبية. يتم تمييز المجالات العصبية بشكل أكبر ونضجها إلى خلايا عصبية DA. يتم فصل الكرات العصبية إلى خلايا مفردة لتوليد الخلايا النجمية الدبقية ، ويتم طلاؤها في طبقات أحادية كNSCs ، ثم يتم تمييزها إلى خلايا نجمية. يوفر هذا البروتوكول الاستراتيجيات اللازمة للحصول على العينات وتحليلها عن طريق قياس التدفق الخلوي لقياس MMP وحجم الميتوكوندريا ومستويات ROS للميتوكوندريا ومستويات التعبير عن الوحدات الفرعية المعقدة MRC و TFAM (قياس غير مباشر لعدد نسخ mtDNA النسبي). على وجه التحديد ، تم استخدام التلطيخ المشترك مع مراسلي الفلورسنت ، TMRE و MTG ، للكشف عن التغيرات في MMP وحجم الميتوكوندريا وتحديدها كميا. يسمح التلطيخ المشترك مع MitoSox Red و MTG بقياس إنتاج ROS للميتوكوندريا في الخلايا الحية. يسمح التلطيخ بالأجسام المضادة ضد الوحدات الفرعية المعقدة MRC جنبا إلى جنب مع TOMM20 بتقييم MRC وتلطيخ TFAM و TOMM20 للتقييم غير المباشر لرقم نسخة mtDNA. الأهم من ذلك ، أن MTG و TOMM20 يسمحان بالقياس لكل حجم ميتوكوندريا ، مما يقاوم تأثير حجم الميتوكوندريا على هذه المعلمات.

يتم توليد الخلايا العصبية DA من iPSCs من خلال تثبيط SMAD المزدوج وتتعرض ل FGF-8b وناهض القنفذ الصوتي (SHH) PM ، كما هو موضح في الشكل 4A. يتم زرع iPSCs البشرية في وسط ثقافة iPSC على لوحات مغلفة بالمصفوفة. عندما تصل الخلايا إلى التقاء 50٪ -80٪ ، يتم تغيير الوسط إلى NIM باستخدام CDM مكمل ب SB431542 ، مثبط AMPK ، مركب C ، و N-acetylcysteine لمدة 5 أيام. بعد 5 أيام ، تتطور iPSCs (الشكل 4B ، أ) إلى مرحلة ظهارية عصبية تظهر هياكل وردة عصبية واضحة (الشكل 4B ، b). في اليوم 5 ، يتم إنشاء الكرات العصبية عن طريق رفع الظهارة العصبية إلى ثقافة التعليق وزراعتها في وسط NSC SF على اهتزاز مداري داخل الحاضنة. وترد في الشكل 4B, c) مجالات مستديرة ومحددة جيدا. في اليوم 7 ، يتم تغيير الوسط إلى آلية التنمية النظيفة مع استكمال 100 نانوغرام / مل FGF-8b. في اليوم 14 ، يتم تغيير الوسط إلى آلية التنمية النظيفة مع استكمال 100 نانوغرام / مل FGF-8b و 1 ميكرومتر PM. في اليوم 21 ، يتم فصل الكرات إلى خلايا عصبية DA في طبقة واحدة عن طريق فصلها إلى خلايا مفردة وزراعتها في CDM مع استكمال 10 نانوغرام / مل BDNF و 10 نانوغرام / مل GDNF في منظمة التحرير الفلسطينية وألواح / أغطية مغلفة بالصفيحة. تستخدم الخلايا العصبية (الشكل 4B ، e) الناضجة لمدة 15-30 يوما للقياسات الوظيفية للميتوكوندريا.

يتم إنتاج NSCs عن طريق فصل الكرات العصبية إلى خلايا مفردة ثم إعادة طلائها في طبقات أحادية لتوليد الخلايا النجمية. تظهر NSCs هذه مظهر السلف العصبي الكلاسيكي (الشكل 4B ، d). يمكن بسهولة توسيع NSCs في هذه المرحلة وتحويلها إلى بنوك لمزيد من الاستخدام. لبدء تمايز الخلايا النجمية ، يتم طلاء NSCs على أغطية مغلفة ب PDL في وسط NSC SF. في اليوم التالي ، يتم تغيير الوسط إلى وسط تمايز الخلايا النجمية لمدة 28 يوما. بعد 28 يوما ، يتم نضج الخلايا النجمية المتباينة بشكل أكبر في وسط نضج الخلايا النجمية. في هذه المرحلة ، يجب أن تعرض الخلايا النجمية مورفولوجيا على شكل نجمة (الشكل 4B ، f) ، ويمكن توسيع هذه الخلايا وتخزينها لمزيد من الاستخدام ، بما في ذلك التقييم الوظيفي للميتوكوندريا.

أثناء التمايز ، يتم تأكيد هوية الخلية باستخدام تلطيخ التألق المناعي. في الشكل 5A ، يوضح التلطيخ المناعي أن iPSCs تعبر عن علامات محددة متعددة القدرات ، SSEA4 و Oct4. يوضح الشكل 5B أن الكرات العصبية تظهر تلطيخا إيجابيا ل Nestin و Pax6 ، بينما يوضح الشكل 5C أن NSCs المشتقة من iPSC في الطبقات الأحادية تظهر تلطيخا إيجابيا ل Nestin و Sox2. لتحديد الخلايا العصبية DA ، يتم تلطيخ الخلايا بالعلامة العصبية β III Tubulin (Tuj 1) وعلامة DA العصبية التيروزين هيدروكسيلاز (TH) (الشكل 6B). بالإضافة إلى ذلك ، تظهر الخلايا العصبية DA تلطيخا للعلامات المتشابكة ، synaptophysin و PSD-95 ، مما يؤكد روابطها المشبكية الوظيفية (الشكل 5B). يظهر التلطيخ المناعي للخلايا النجمية المشتقة من iPSC التعبير عن علامات الخلايا النجمية والبروتين الحمضي الليفي الدبقي (GFAP) والبروتين المرتبط بالكالسيوم S100 β (S100β).

يتم إجراء التحقيق في وظيفة الميتوكوندريا في الخلايا العصبية المتباينة والخلايا النجمية باستخدام قياس التدفق الخلوي كما هو موضح أعلاه في أقسام البروتوكول 3 و 4. تم استخدام مقياس التدفق الخلوي للحصول على البيانات و CFlow Sampler لتحليل البيانات ، كما هو موضح في الشكل 1B.

يوضح الشكل 2 طريقة ربط الخلايا المفردة الحية. يتم استبعاد الخلايا الميتة وحطام الخلايا باستخدام مخطط FSC مقابل SSC (الشكل 2A ، أ). يتم استبعاد ثنائيات الخلايا باستخدام مخطط FSC-H مقابل FSC-A (الشكل 2A ، b) متبوعا بمخطط SSC-H مقابل SSC-A (الشكل 2A ، c). يتم تقييم التألق في الخلفية بشكل صحيح إذا تمت مقارنة المجموعة السلبية لنوع معين من الخلايا بالسكان الإيجابيين داخل نفس النوع من الخلايا (الشكل 2B ، أ). بالنسبة لعينات MMP ، فإن معالجة الخلايا باستخدام FCCP تقضي على التداخل من إمكانات غشاء الميتوكوندريا وتلطيخ TMRE (الشكل 2B ، b).

تم استخدام هذه الأساليب الخلوية للتدفق الخلوي لدراسة الخلايا العصبية DA المتولدة من iPSCs البشرية التي تحمل طفرة (طفرات) في الوحدة الفرعية الحفازة لبوليميراز الحمض النووي للميتوكوندريا ، POLG (W748S) ، ومقارنتها بعينات خالية من الأمراض تم إنشاؤها من الخلايا الليفية في ديترويت 551. كما ذكر سابقا4 ، أظهرت هذه الدراسة أيضا انخفاض MMP وزيادة مستويات ROS محددة للميتوكوندريا في الخلايا العصبية POLG DA (الشكل 7). ومع ذلك ، فإن حجم الميتوكوندريا ، وإجمالي MMP ، وإجمالي مستوى ROS للميتوكوندريا لم يتغير. في الشكل 8 ، تظهر النتائج انخفاضا في مستويات I المعقدة المحددة ، ومستويات TFAM الكلية والمحددة المنخفضة ، ولكن مستويات II المعقدة المحددة المماثلة في الخلايا العصبية DA المتحولة مقارنة بالضوابط.

تم استخدام هذا النهج أيضا لدراسة الخلايا النجمية المتولدة من نفس خطوط iPSC. وكما ذكر سابقا7 والمبين في الشكل 9، تظهر النتائج أن الخلايا النجمية المتحورة بواسطة POLG لديها MMP أقل كليا ومحددا ولكن حجم الميتوكوندريا و ROS للميتوكوندريا مماثلة مقارنة بالضوابط، فضلا عن انخفاض مستويات المجمعات المحددة I و IV (الشكل 10). ومع ذلك، لم تكن هناك تغييرات في المستويات الإجمالية للمجمعين الأول والرابع ولم يحدث أي تغيير في المستويات الكلية والمحددة للمجمع الثاني في الخلايا النجمية POLG. بشكل عام ، تشير هذه البيانات إلى أن تحليل التدفق الخلوي لمعلمات الميتوكوندريا المتعددة يوفر تقريب الخطوة الأولى الذي له قيمة في تقييم وظيفة الميتوكوندريا في الخلايا مثل iPSCs ومشتقاتها العصبية والدبقية.

Figure 1
الشكل 1: إعداد لقياس التدفق الخلوي. (أ) MMP ، حجم الميتوكوندريا ، وتلطيخ ROS الميتوكوندريا ؛ (ب) مثال على الحصول على البيانات في مقياس التدفق الخلوي C6. الاختصارات: MMP = إمكانات غشاء الميتوكوندريا. ROS = أنواع الأكسجين التفاعلية. FCCP = سيانيد الكربونيل p-trifluoromethoxyphenylhydrazone; TMRE = رباعي ميثيل رودامين إيثيل استر; MTG = ميتوتراكر الأخضر. انظر أيضا الجدول التكميلي دال-2. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2: استراتيجيات البوابات. (أ) الحصول على البيانات؛ (ب) المدرج التكراري للتألق مع تلطيخ MTG و TMRE في الخلايا الحية. الاختصارات: SSC-A = منطقة التشتت الجانبي. FSC-A = منطقة التشتت الأمامي ؛ SSC-H = ارتفاع التشتت الجانبي. FSC-H = ارتفاع التشتت الأمامي ؛ FL #-A = منطقة الفلوروفور # ؛ MTG = ميتوتراكر الأخضر; FCCP = سيانيد الكربونيل p-trifluoromethoxyphenylhydrazone; TMRE = رباعي ميثيل رودامين إيثيل استر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 3
الشكل 3: التمثيل التخطيطي لسير عمل البروتوكول. الاختصارات: DA = الدوبامين; MMP = إمكانات غشاء الميتوكوندريا ؛ ROS = أنواع الأكسجين التفاعلية. NDUFB 10 = NADH: الوحدة الفرعية Ubiquinone oxidoreductase 10; SDHA = الوحدة الفرعية لبروتين الفلافوبروتين المركب نازعة الهيدروجين السكسينات A ؛ COX IV = مركب السيتوكروم ج أوكسيديز IV ؛ mtDNA = الحمض النووي الميتوكوندريا; TFAM = عامل نسخ الميتوكوندريا A. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 4
الشكل 4: تمايز iPSC. (أ) مخطط انسيابي و (ب) صور تمثيلية للخلايا من مراحل مختلفة أثناء التمايز ، بما في ذلك iPSCs (a) ، وردة عصبية (b) ، ومجالات عصبية (c) ، NSCs (d) ، خلايا DA العصبية (e) ، والخلايا النجمية (f). أشرطة المقياس = 25 ميكرومتر. الاختصارات: iPSC = الخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات. NSC = الخلايا الجذعية العصبية; DA = الدوبامين; SFM = وسط خال من المصل; CDM = وسط محدد كيميائيا؛ FGF-8b = عامل نمو الخلايا الليفية-8b; PM = بورمورفامين. BDNF = عامل التغذية العصبية المشتق من الدماغ; GDNF = عامل التغذية العصبية المشتق من خط الخلية الدبقية ؛ منظمة التحرير الفلسطينية = بولي L-أورنيثين. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 5
الشكل 5: صور تمثيلية متحدة البؤرة ل iPSCs ومشتقاتها العصبية . (أ) تلطيخ مناعي ل SSEA4 (أحمر) و Oct4 (أخضر) في iPSCs. (ب) التلطيخ المناعي للنستين (الأحمر) و Pax6 (الأخضر) في المجالات العصبية المشتقة من iPSC. (ج) التلطيخ المناعي للنستين (الأحمر) و Sox2 (الأخضر) في NSCs المشتقة من iPSC. النوى ملطخة ب DAPI (أزرق). أشرطة المقياس = 50 ميكرومتر. الاختصارات: iPSCs = الخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات. NSCs = الخلايا الجذعية العصبية; SSEA4 = مستضد جنيني خاص بالمرحلة -4; Oct4 = عامل النسخ المرتبط بالأوكتامر 4 ؛ Pax6 = مربع مقترن -6 ؛ Sox2 = منطقة تحديد الجنس Y box-2 ؛ DAPI = 4',6-diamidino-2-phenylindole. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 6
الشكل 6: صور تمثيلية متحدة البؤرة للخلايا النجمية المشتقة من iPSC والخلايا العصبية DA. (A) التلطيخ المناعي ل GFAP (الأحمر) و S100β (الأخضر) في الخلايا النجمية المشتقة من iPSC. (ب) التلطيخ المناعي لعلامة النسب العصبية TH (الأخضر) ، Tuj 1 (الأحمر) ، والعلامة الوظيفية العصبية Synaptophysin (الأخضر) و PSD-95 (الأحمر) في الخلايا العصبية DA المشتقة من iPSC. النوى ملطخة ب DAPI (أزرق). أشرطة المقياس = 25 ميكرومتر. الاختصارات: iPSCs = الخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات. GFAP = البروتين الحمضي الليفي الدبقي. S100β = β البروتين المرتبط بالكالسيوم S100 ؛ Tuj 1 = β III Tubulin; PSD-95 = بروتين الكثافة ما بعد المشبكي 95 ؛ DA = الدوبامين; DAPI = 4',6-diamidino-2-phenylindole. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 7
الشكل 7: تحليل التدفق الخلوي للخلايا العصبية DA المشتقة من استنساخ واحد من iPSCs مريض POLG واستنساخ واحد من iPSCs التحكم في ديترويت 551. (أ) حجم الميتوكوندريا المقاسة بواسطة MTG ، (ب) إجمالي MMP مقاسة بواسطة TMRE ، (C) مستوى MMP محدد محسوب بإجمالي TMRE / MTG ، (D) إجمالي ROS الميتوكوندريا مقاسا بواسطة MitoSox Red ، و (E ) مستوى ROS محدد للميتوكوندريا محسوب بإجمالي MitoSox Red / MTG. البيانات المقدمة كمتوسط ± خطأ معياري للمتوسط (SEM) لعدد العينات (n ≥ 3 لكل استنساخ). تم تحليل البيانات وإنتاجها باستخدام برنامج GraphPad Prism. تم استخدام اختبار Mann-Whitney U لتقييم الدلالة الإحصائية للمتغيرات. يشار إلى الأهمية ل P < 0.05. * P < 0.05 ؛ ns ، ليست كبيرة. الاختصارات: DA = الدوبامين; POLG = وحدة غاما بوليميراز الحمض النووي. iPSCs = الخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات; MMP = إمكانات غشاء الميتوكوندريا ؛ ROS = أنواع الأكسجين التفاعلية. MTG = ميتوتراكر الأخضر; TMRE = رباعي ميثيل رودامين إيثيل استر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 8
الشكل 8: تحليل التدفق الخلوي للخلايا النجمية المشتقة من استنساخ واحد من iPSCs مريض POLG واستنساخ واحد من iPSCs التحكم في ديترويت 551. (أ) حجم الميتوكوندريا المقاسة بواسطة MTG ، (B) إجمالي MMP مقاسة بواسطة TMRE ، (C) مستوى MMP محدد محسوب بإجمالي TMRE / MTG ، (D) إجمالي ROS Rmitochondrial مقاسا بواسطة MitoSox Red ، و (E ) مستوى ROS محدد للميتوكوندريا محسوب بإجمالي MitoSox Red / MTG. البيانات المقدمة كمتوسط ± خطأ معياري للمتوسط (SEM) لعدد العينات (n ≥ 3 لكل استنساخ). تم تحليل البيانات وإنتاجها باستخدام برنامج GraphPad Prism. تم استخدام اختبار Mann-Whitney U لتقييم الدلالة الإحصائية للمتغيرات. يشار إلى الأهمية ل P < 0.05. * P < 0.05 ؛ ns ، ليست كبيرة. الاختصارات: POLG = وحدة فرعية من بوليميراز الحمض النووي غاما. iPSC = الخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات. MMP = إمكانات غشاء الميتوكوندريا ؛ ROS = أنواع الأكسجين التفاعلية. MTG = ميتوتراكر الأخضر; TMRE = رباعي ميثيل رودامين إيثيل استر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 9
الشكل 9: تحليل التدفق الخلوي للخلايا العصبية DA المشتقة من استنساخ واحد من iPSCs مريض POLG واستنساخ واحد من iPSCs التحكم في ديترويت 551. (أ) إجمالي المركب I الذي تم قياسه بواسطة NDUFB10 ، (B) المستوى I المركب المحدد المحسوب بإجمالي NDUFB10 / TOMM20 ، (C) إجمالي المركب II الذي تم قياسه بواسطة SDHA ، (D) المستوى الثاني المركب المحدد المحسوب بإجمالي SDHA / TOMM20 ، (E) إجمالي TFAM المقاس بواسطة TFAM ، و (F) مستوى TFAM المحدد المحسوب بإجمالي TFAM / TOMM20. البيانات المقدمة كمتوسط ± خطأ معياري للمتوسط (SEM) لعدد العينات (n ≥ 3 لكل استنساخ). تم تحليل البيانات وإنتاجها باستخدام برنامج GraphPad Prism. يستخدم اختبار Mann-Whitney U لتقييم الدلالة الإحصائية للمتغيرات. يشار إلى الأهمية ل P < 0.05. * P < 0.05 ؛ ns ، ليست كبيرة. الاختصارات: DA = الدوبامين; POLG = وحدة غاما بوليميراز الحمض النووي. iPSC = الخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات. NDUFB10 = NADH: الوحدة الفرعية Ubiquinone oxidoreductase 10 ؛ TOMM20 = ترانسلوكاس غشاء الميتوكوندريا الخارجي 20 ؛ SDHA = الوحدة الفرعية لبروتين الفلافوبروتين المركب نازعة الهيدروجين السكسينات A ؛ TFAM = عامل نسخ الميتوكوندريا A. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 10
الشكل 10: تحليل التدفق الخلوي للخلايا النجمية المستمدة من استنساخ واحد من iPSCs مريض POLG واستنساخ واحد من iPSCs التحكم في ديترويت 551. (أ) إجمالي المركب I الذي تم قياسه بواسطة NDUFB10 ، (B) المستوى الأول المعقد المحدد المحسوب بإجمالي NDUFB10 / TOMM20 ، (C) إجمالي المركب II الذي تم قياسه بواسطة SDHA ، (D) المستوى الثاني المركب المحدد المحسوب بإجمالي SDHA / TOMM20 ، (ه) إجمالي المركب الرابع الذي يقاس بواسطة COX IV ، (F) المستوى الرابع المعقد المحدد المحسوب بواسطة COX IV / TOMM20 ، (G) إجمالي TFAM الذي تم قياسه بواسطة TFAM ، و (H) مستوى TFAM المحدد المحسوب بإجمالي TFAM / TOMM20. البيانات المقدمة كمتوسط ± خطأ معياري للمتوسط (SEM) لعدد العينات (n ≥ 3 لكل استنساخ). تم تحليل البيانات وإنتاجها باستخدام برنامج GraphPad Prism. تم استخدام اختبار Mann-Whitney U لتقييم الدلالة الإحصائية للمتغيرات. يشار إلى الأهمية ل P < 0.05. * P < 0.05 ؛ ** P < 0.01 ؛ ns ، ليست كبيرة. الاختصارات: POLG = وحدة فرعية من بوليميراز الحمض النووي غاما. iPSC = الخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات. NDUFB10 = NADH: الوحدة الفرعية Ubiquinone oxidoreductase 10 ؛ TOMM20 = ترانسلوكاس غشاء الميتوكوندريا الخارجي 20 ؛ SDHA = الوحدة الفرعية لبروتين الفلافوبروتين المركب نازعة الهيدروجين السكسينات A ؛ TFAM = عامل نسخ الميتوكوندريا A ؛ COX IV = مركب السيتوكروم ج أوكسيديز IV. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل التكميلي S1: إعدادات المجهر الفلوري للمسح الضوئي بالليزر البؤري وخطوات التقاط الصور. (أ) اختر أداة التكوين وحدد نوع الليزر الصحيح من الليزر المتاح حاليا واضبط قوته. (ب) اختر وضع الاكتساب - الاستحواذ - SEQ وحدد وضع الصورة ذات الطول الموجي الفلوري المقابل من قاعدة البيانات. (ج) اختر تحميل المسح الضوئي المتسلسل واستيراد الوضع المقابل. (D) اختر عدسة موضوعية 40x وأضف قطرة. (ه) معلمات إعداد محددة لالتقاط الصور بأطوال موجية مختلفة. (F) تعيين معلمات الصورة ومعاينتها وحفظها. يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الملف.

الشكل التكميلي S2: خطوات وإعدادات قياس التدفق الخلوي. (أ) افتح برنامج Cflow، واختر أداة الملف، وحدد فتح ملف أو قالب CFlow. (ب) إعداد 40000 حدث وتحديد البوابة التي تحتوي فقط على الخلايا المفردة الحية في لوحة حدود التشغيل. اختر سرعة متوسطة في لوحة الموائع. (ج) اختر FSC-A مقابل FSC-A قطعة الأرض (أ) لإعداد البوابة الرئيسية. اختر FSC-A مقابل FSC-H plot (b) و SSC-A مقابل SSC-H plot (c) لاستبعاد المزدوجات. اختر المرشحات المقابلة ، مثل FL1 أو FL2 ، واستخدم FL1-A مقابل FSC-A plot (d) أو FL2-A مقابل FSC-A لرسم الأحداث الإيجابية عند تشغيل الخلايا غير الملطخة. (D) إعداد نفس المعلمات ، معاينة ، تشغيل العينات الملطخة وحفظ الصورة. انظر أيضا الجدول التكميلي دال-2. يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الملف.

الجدول التكميلي S1: وصفات الوسائط والحلول. يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الجدول.

الجدول التكميلي S2: الإعداد لتلطيخ التدفق الخلوي. يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الجدول.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

فيما يلي بروتوكولات لتوليد الخلايا العصبية والخلايا النجمية المشتقة من iPSC وتقييم جوانب متعددة من وظيفة الميتوكوندريا باستخدام قياس التدفق الخلوي. تسمح هذه البروتوكولات بالتحويل الفعال ل iPSCs البشرية إلى كل من الخلايا العصبية والخلايا النجمية الدبقية والتوصيف التفصيلي لوظيفة الميتوكوندريا ، معظمها في الخلايا الحية. توفر البروتوكولات أيضا استراتيجية قائمة على قياس التدفق الخلوي المشترك للحصول على وظائف الميتوكوندريا المتعددة وتحليلها ، بما في ذلك مستويات ROS للحجم و MMP والميتوكوندريا في الخلايا الحية ومجمعات MRC و TFAM في الخلايا الثابتة. وعلى وجه التحديد، تسمح هذه البروتوكولات بتقدير كل من المستويات الكلية والمحددة لكل حجم من الميتوكوندريا. في حين أن هذه الاستراتيجية تكتشف خلل الميتوكوندريا في مرض الميتوكوندريا المعروف (POLG) في الخلايا العصبية DA والخلايا النجمية ، فإن هذه التقنيات قابلة للتطبيق على أي نوع من الخلايا والأمراض. وعلاوة على ذلك، فإن البروتوكول قوي وقابل للتكرار. وقد طبقت العديد من الدراسات السابقة بنجاح هذا البروتوكول لتحليل التغيرات الميتوكوندريا في الخلايا الليفية ، iPSCs ، NSCs ، الخلايا العصبية DA ، والخلايا النجمية2،3،13،17.

هناك بعض النقاط الحرجة التي يجب مراعاتها أثناء تنفيذ هذا البروتوكول. لضمان التمايز المتسق وعالي الكفاءة ، من الأهمية بمكان بدء التحويل باستخدام iPSCs عالية الجودة (خلايا تحتوي على خلايا متمايزة بنسبة <5٪). على الرغم من أن الوسائط المحددة الأخرى المتاحة تجاريا يمكن أن تكون بدائل صالحة ، إلا أن هذه الدراسة لم تتناول البدائل. نظرا لأن التركيب المتوسط والاختلافات النسلية لخطوط iPSC يمكن أن تؤثر على كل من انتشار مجموعة خلايا البداية وكفاءة التمايز ، فمن المحتمل أن يتطلب تكييف هذا البروتوكول مع وسائط الصيانة الأخرى التحسين.

تمت دراسة العلاقة بين MTG و MMP fluorescence سابقا3. هذا مهم حيث يتم الإبلاغ عن أن تألق MTG مستقل عن18 وحساس ل MMP 19,20. وفي الدراسات السابقة التي تمت فيها معايرة iPSCs بتركيزات مختلفة من TMRE وملطخة ب 150 نانومتر MTG، ظل مستوى MTG كما هو عند تركيزات أقل من TMRE (5-100 نانومتر)، في حين لوحظت إشارة MTG منخفضة لتركيزات TMRE أعلى (أكثر من 100 نانومتر). لذلك ، تم اختيار 100 نانومتر TMRE و 150 نانومتر MTG لقياس MMP المحدد. نظرا لأن هذه العلاقة قد تكون خاصة بالخلية ، يجب تقييم العلاقة بين تألق MTG و MMP قبل استخدام التلطيخ المزدوج MTG و TMRE لقياس MMP.

يمكن أن تؤثر كثافة الخلايا أيضا على وظيفة الميتوكوندريا واستقلاب الخلايا. في هذه الدراسة ، لوحظت تغيرات تعتمد على كثافة الخلايا في MMP ، والتي ظهرت أيضا في دراسات أخرى21. لذلك ، من المهم اختيار كثافة خلايا مماثلة في جميع العينات - ليست عالية أو منخفضة جدا - لتقليل التباين عند إنشاء بروتوكول التلطيخ المشترك لأنواع الخلايا المختلفة. بالمقارنة مع الفحوصات الأخرى القائمة على الفحص المجهري ، فإن قياس التدفق الخلوي له مزايا السرعة والتكرار عند تحليل أعداد كبيرة من الخلايا. في تحليل الصور المجهرية ، سيؤدي تحيز الباحثين إلى تشويه النتائج إلى حد ما ، وهي ليست مشكلة عند استخدام قياس التدفق الخلوي. بالإضافة إلى ذلك ، يتطلب تحليل قياس التدفق الخلوي أقل من مليون خلية ، ولا يستغرق تحليل عينة واحدة سوى بضع دقائق ، مما يعني أنه يمكن تحليل عشرات العينات في 1-2 ساعة. يمكن أيضا تطبيق هذه التقنية على مجموعة واسعة من أنواع الخلايا ، بما في ذلك تلك الناتجة عن الأمراض العصبية التنكسية الأخرى ، وبالتالي يجب أن تكون مفيدة لفهم الآليات واختبار العلاجات المحتملة في الأمراض العصبية التنكسية المختلفة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

وليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح للإفصاح عنه.

Acknowledgments

نشكر مركز التصوير الجزيئي والمرفق الأساسي لقياس التدفق الخلوي في جامعة بيرغن في النرويج. تم دعم هذا العمل بتمويل من مجلس البحوث النرويجي (رقم المنحة: 229652) ، Rakel og Otto Kr.Bruuns legat ومجلس المنح الدراسية الصيني (رقم المشروع: 201906220275).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
anti-Oct4 Abcam ab19857, RRID:AB_445175 Primary Antibody; use as 1:100, 10 μL in 1000 μL staining solution; use Alexa Fluor ® 488 goat anti-rabbit IgG  (1:400, Thermo Fisher Scientific, Catalog # A-11008) as secondary antibody.
anti-SSEA4 Abcam ab16287, RRID:AB_778073 Primary Antibody; use as 1:100, 10 μL in 1000 μL staining solution; use Alexa Fluor ® 594 goat anti-mouse IgG (1:800, Thermo Fisher Scientific, Catalog # A-11005) as secondary antibody.
anti-Sox2 Abcam ab97959, RRID:AB_2341193 Primary Antibody; use as 1:100, 10 μL in 1000 μL staining solution; use Alexa Fluor ® 488 goat anti-rabbit IgG  (1:400, Thermo Fisher Scientific, Catalog # A-11008) as secondary antibody.
anti-Pax6 Abcam ab5790, RRID:AB_305110 Primary Antibody; use as 1:100, 10 μL in 1000 μL staining solution; use Alexa Fluor ® 488 goat anti-rabbit IgG  (1:400, Thermo Fisher Scientific, Catalog # A-11008) as secondary antibody.
anti-Nestin Santa Cruz Biotechnology sc-23927, RRID:AB_627994 Primary Antibody; use as 1:50, 20 μL in 1000 μL staining solution; use Alexa Fluor ® 594 goat anti-mouse IgG (1:800, Thermo Fisher Scientific, Catalog # A-11005) as secondary antibody.
anti-GFAP Abcam ab4674, RRID:AB_304558 Primary Antibody; use as 1:100, 10 μL in 1000 μL staining solution;  use Alexa Fluor ® 594 goat anti-chicken IgG (1:800, Thermo Fisher Scientific, Catalog # A-11042) as secondary antibody.
anti-S100β  conjugated with Alexa Fluor 488 Abcam ab196442, RRID:AB_2722596 Primary Antibody; use as 1:400, 2.5 μL in 1000 μL staining solution;
anti-TH Abcam ab75875, RRID:AB_1310786 Primary Antibody; use as 1:100, 10 μL in 1000 μL staining solution; use Alexa Fluor ® 488 goat anti-rabbit IgG  (1:400, Thermo Fisher Scientific, Catalog # A-11008) as secondary antibody.
anti-Tuj 1 Abcam ab78078, RRID:AB_2256751 Primary Antibody; use as 1:1000, 1 μL in 1000 μL staining solution; use Alexa Fluor ® 594 goat anti-mouse IgG (1:800, Thermo Fisher Scientific, Catalog # A-11005) as secondary antibody.
anti-Synaptophysin Abcam ab32127, RRID:AB_2286949 Primary Antibody; use as 1:100, 10 μL in 1000 μL staining solution; use Alexa Fluor ® 488 goat anti-rabbit IgG  (1:400, Thermo Fisher Scientific, Catalog # A-11008) as secondary antibody.
anti-PSD-95 Abcam ab2723, RRID:AB_303248 Primary Antibody; use as 1:100, 10 μL in 1000 μL staining solution;  use Alexa Fluor ® 594 goat anti-chicken IgG (1:800, Thermo Fisher Scientific, Catalog # A-11042) as secondary antibody.
anti-TFAM conjugated with Alexa Fluor 488 Abcam ab198308 Primary Antibody; use as 1:400, 2.5 μL in 1000 μL staining solution; use mouse monoclonal IgG2b  Alexa Fluor® 488 as an isotype control.
anti-TOMM20 conjugated with Alexa Fluor 488 Santa Cruz Biotechnology Cat# sc-17764 RRID:AB_628381 Primary Antibody; use as 1:400, 2.5 μL in 1000 μL staining solution; use mouse monoclonal IgG2a  Alexa Fluor® 488 as an isotype control.
anti-NDUFB10 Abcam ab196019 Primary Antibody; use as 1:1000, 1 μL in 1000 μL staining solution; use Alexa Fluor ® 488 goat anti-rabbit IgG  (1:400, Thermo Fisher Scientific, Catalog # A-11008) as secondary antibody; use rabbit monoclonal IgG as an isotype control.
anti-SDHA Abcam ab137040 Primary Antibody; use as 1:1000, 1 μL in 1000 μL staining solution;  use Alexa Fluor ® 488 goat anti-rabbit IgG  (1:400, Thermo Fisher Scientific, Catalog # A-11008) as secondary antibody; use rabbit monoclonal IgG as an isotype control.
anti-COX IV Abcam ab14744, RRID:AB_301443 Primary Antibody; use as 1:1000, 1 μL in 1000 μL staining solution; use  Alexa Fluor ® 488 goat anti-mouse IgG  (1:400, Thermo Fisher Scientific, Catalog # A-11001) as secondary antibody; use mouse monoclonal IgG as an isotype control.
Activin A PeproTech 120-14E Astrocyte differentiation medium ingredient
ABM Basal Medium Lonza CC-3187 Basal medium for astrocyte culture
AGM SingleQuots Supplement Pack Lonza CC-4123 Supplement for astrocyte culture
Antibiotic-Antimycotic Thermo Fisher Scientific 15240062 CDM ingredient
Advanced DMEM/F-12 Thermo Fisher Scientific 12634010 Basal medium for dilute Geltrex
Bovine Serum Albumin Europa Bioproducts EQBAH62-1000 Blocking agent to prevent non-specific binding of antibodies in immunostaining assays and CDM ingredient
BDNF PeproTech 450-02 DA neurons medium ingredient
B-27 Supplement Thermo Fisher Scientific 17504044 Astrocyte differentiation medium ingredient
BD Accuri C6 Plus Flow Cytometer BD Biosciences, USA
Chemically Defined Lipid Concentrate Thermo Fisher Scientific 11905031 CDM ingredient
Collagenase IV Thermo Fisher Scientific 17104019 Reagent for gentle dissociation of human iPSCs
CCD Microscope Camera Leica DFC3000 G Leica Microsystems, Germany
Corning non-treated culture dishes Sigma-Aldrich CLS430589 Suspension culture
DPBS Thermo Fisher Scientific 14190250 Used for a variety of cell culture wash
DMEM/F-12, GlutaMAX supplement Thermo Fisher Scientific 10565018 Astrocyte differentiation basal Medium
EDTA Thermo Fisher Scientific 15575020 Reagent for gentle dissociation of human iPSCs
Essential 8 Basal Medium Thermo Fisher Scientific A1516901 Basal medium for iPSC culture
Essential 8 Supplement (50X) Thermo Fisher Scientific A1517101 Supplement for iPSC culture
EGF Recombinant Human Protein Thermo Fisher Scientific PHG0314 Supplement for NSC culture
FGF-basic (AA 10–155) Recombinant Human Protein Thermo Fisher Scientific PHG0024 Supplement for NSC culture
Fetal Bovine Serum Sigma-Aldrich 12103C Medium ingredient
FGF-basic PeproTech 100-18B Astrocyte differentiation medium ingredient
FCCP Abcam ab120081 Eliminates mitochondrial membrane potential and TMRE staining
Fluid aspiration system BVC control Vacuubrand, Germany
Formaldehyde (PFA) 16% Thermo Fisher Scientific 28908 Cell fixation
Geltrex Thermo Fisher Scientific A1413302 Used for attachment and maintenance of human iPSCs
GlutaMAX Supplement Thermo Fisher Scientific 35050061 Supplement for NSC culture
GDNF Peprotech 450-10 DA neurons medium ingredient
Glycine Sigma-Aldrich G8898 Used for blocking buffer
Ham's F-12 Nutrient Mix Thermo Fisher Scientific 31765027 Basal medium for CDM
Heregulin beta-1 human Sigma-Aldrich SRP3055 Astrocyte differentiation medium ingredient
Hoechst 33342 Thermo Fisher Scientific H1399 Stain the nuclei for confocal image
Heracell 150i CO2 Incubators Fisher Scientific, USA
IMDM Thermo Fisher Scientific 21980032 Basal medium for CDM
Insulin Roche 1376497 CDM ingredient
InSolution AMPK Inhibitor Sigma-Aldrich 171261 Neural induction medium ingredient
Insulin-like Growth Factor-I human Sigma-Aldrich I3769 Astrocyte differentiation medium ingredient
KnockOut DMEM/F-12 medium Thermo Fisher Scientific 12660012 Basal medium for NSC culture
Laminin Sigma-Aldrich L2020 Promotes attachment and growth of neural cells in vitro
Leica TCS SP8 STED confocal microscope Leica Microsystems, Germany
Monothioglycerol Sigma-Aldrich M6145 CDM ingredient
MitoTracker Green FM Thermo Fisher Scientific M7514 Used for mitochondrial volume indicator
MitoSox Red Thermo Fisher Scientific M36008 Used for mitochondrial ROS indicator
N-Acetyl-L-cysteine Sigma-Aldrich A7250 Neural induction medium ingredient
N-2 Supplement Thermo Fisher Scientific 17502048 Astrocyte differentiation medium ingredient
Normal goat serum Thermo Fisher Scientific PCN5000 Used for blocking buffer
Orbital shakers - SSM1 Stuart Equipment, UK
Poly-L-ornithine solution Sigma-Aldrich P4957 Promotes attachment and growth of neural cells in vitro
Poly-D-lysine hydrobromide Sigma-Aldrich P7405 Promotes attachment and growth of neural cells in vitro
Purmorphamine STEMCELL Technologies 72204 Promotes DA neuron differentiation
ProLong Gold Antifade Mountant Thermo Fisher Scientific P36930 Mounting the coverslip for confocal image
PBS 1x Thermo Fisher Scientific 18912014 Used for a variety of wash
Recombinant Human/Mouse FGF-8b Protein R&D Systems 423-F8-025/CF Promotes DA neuron differentiation
SB 431542 Tocris Bioscience TB1614-GMP Neural Induction Medium ingredient
StemPro Neural Supplement Thermo Fisher Scientific A10508-01 Supplement for NSCs culture
TrypLE Express Enzyme Thermo Fisher Scientific 12604013 Cell dissociation reagent
Transferrin Roche 652202 CDM ingredient
TRITON X-100 VWR International 9002-93-1 Used for cells permeabilization in immunostaining assays
TMRE Abcam ab113852 Used for mitochondrial membrane potential staining
Water Bath Jb Academy Basic Jba5 JBA5 Grant Instruments Grant Instruments, USA

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Wang, Y., Xu, E., Musich, P. R., Lin, F. Mitochondrial dysfunction in neurodegenerative diseases and the potential countermeasure. CNS Neuroscience & Therapeutics. 25 (7), 816-824 (2019).
  2. Chen, A., et al. Nicotinamide riboside and metformin ameliorate mitophagy defect in induced pluripotent stem cell-derived astrocytes with POLG mutations. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 737304 (2021).
  3. Liang, K. X., et al. Disease-specific phenotypes in iPSC-derived neural stem cells with POLG mutations. EMBO Molecular Medicine. 12 (10), 12146 (2020).
  4. Chen, H., Chan, D. C. Mitochondrial dynamics--fusion, fission, movement, and mitophagy--in neurodegenerative diseases. Human Molecular Genetics. 18, 169-176 (2009).
  5. Lin, M. T., Beal, M. F. Mitochondrial dysfunction and oxidative stress in neurodegenerative diseases. Nature. 443 (7113), 787-795 (2006).
  6. Singh, A., Kukreti, R., Saso, L., Kukreti, S. Oxidative stress: A key modulator in neurodegenerative diseases. Molecules. 24 (8), Basel, Switzerland. 1583 (2019).
  7. Kondadi, A. K., Anand, R., Reichert, A. S. Functional interplay between cristae biogenesis, mitochondrial dynamics and mitochondrial DNA integrity. International Journal of Molecular Sciences. 20 (17), 4311 (2019).
  8. Sterneckert, J. L., Reinhardt, P., Schöler, H. R. Investigating human disease using stem cell models. Nature Reviews. Genetics. 15 (9), 625-639 (2014).
  9. Patani, R. Human stem cell models of disease and the prognosis of academic medicine. Nature Medicine. 26 (4), 449 (2020).
  10. Liang, K. X., et al. N-acetylcysteine amide ameliorates mitochondrial dysfunction and reduces oxidative stress in hiPSC-derived dopaminergic neurons with POLG mutation. Experimental Neurology. , 337 (2021).
  11. Kikuchi, T., et al. Human iPS cell-derived dopaminergic neurons function in a primate Parkinson's disease model. Nature. 548 (7669), 592-596 (2017).
  12. Juopperi, T. A., et al. Astrocytes generated from patient induced pluripotent stem cells recapitulate features of Huntington's disease patient cells. Molecular Brain. 5, 17 (2012).
  13. Liang, K. X., et al. Stem cell derived astrocytes with POLG mutations and mitochondrial dysfunction including abnormal NAD+ metabolism is toxic for neurons. bioRxiv. , (2020).
  14. Liu, Q., et al. Human neural crest stem cells derived from human ESCs and induced pluripotent stem cells: induction, maintenance, and differentiation into functional schwann cells. Stem Cells Translational Medicine. 1 (4), 266-278 (2012).
  15. Hong, Y. J., Do, J. T. Neural lineage differentiation from pluripotent stem cells to mimic human brain tissues. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 7, 400 (2019).
  16. Lundin, A., et al. Human iPS-derived astroglia from a stable neural precursor state show improved functionality compared with conventional astrocytic models. Stem Cell Reports. 10 (3), 1030-1045 (2018).
  17. Liang, K. X., et al. N-acetylcysteine amide ameliorates mitochondrial dysfunction and reduces oxidative stress in hiPSC-derived dopaminergic neurons with POLG mutation. Experimental Neurology. 337, 113536 (2021).
  18. Pendergrass, W., Wolf, N., Poot, M. Efficacy of MitoTracker Green™ and CMXrosamine to measure changes in mitochondrial membrane potentials in living cells and tissues. Cytometry. Part A. 61 (2), 162-169 (2004).
  19. Keij, J. F., Bell-Prince, C., Steinkamp, J. A. Staining of mitochondrial membranes with 10-nonyl acridine orange, MitoFluor Green, and MitoTracker Green is affected by mitochondrial membrane potential altering drugs. Cytometry. 39 (3), 203-210 (2000).
  20. Buckman, J. F., et al. MitoTracker labeling in primary neuronal and astrocytic cultures: influence of mitochondrial membrane potential and oxidants. Journal of Neuroscience Methods. 104 (2), 165-176 (2001).
  21. Zanchetta, L. M., Kirk, D., Lyng, F., Walsh, J., Murphy, J. E. Cell-density-dependent changes in mitochondrial membrane potential and reactive oxygen species production in human skin cells post sunlight exposure. Photodermatology, Photoimmunology & Photomedicine. 26 (6), 311-317 (2010).

Tags

علم الأعصاب ، العدد 177 ،
تحليل التدفق الخلوي لمعلمات الميتوكوندريا المتعددة في الخلايا الجذعية متعددة القدرات المستحثة بالإنسان ومشتقاتها العصبية والدبقية
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Liang, K. X., Chen, A., Kristiansen, … More

Liang, K. X., Chen, A., Kristiansen, C. K., Bindoff, L. A. Flow Cytometric Analysis of Multiple Mitochondrial Parameters in Human Induced Pluripotent Stem Cells and Their Neural and Glial Derivatives. J. Vis. Exp. (177), e63116, doi:10.3791/63116 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter