Summary
Este estudio informa un enfoque novedoso para medir múltiples parámetros funcionales mitocondriales basados en citometría de flujo y tinción doble con dos reporteros fluorescentes o anticuerpos para detectar cambios en el volumen mitocondrial, el potencial de la membrana mitocondrial, el nivel de especies reactivas de oxígeno, la composición de la cadena respiratoria mitocondrial y el ADN mitocondrial.
Abstract
Las mitocondrias son importantes en la fisiopatología de muchas enfermedades neurodegenerativas. Los cambios en el volumen mitocondrial, el potencial de membrana mitocondrial (MMP), la producción mitocondrial de especies reactivas de oxígeno (ROS) y el número de copias del ADN mitocondrial (ADNmt) son a menudo características de estos procesos. Este informe detalla un nuevo enfoque basado en la citometría de flujo para medir múltiples parámetros mitocondriales en diferentes tipos de células, incluidas las células madre pluripotentes inducidas por humanos (iPSC) y las células neurales y gliales derivadas de iPSC. Esta estrategia basada en el flujo utiliza células vivas para medir el volumen mitocondrial, MMP y niveles de ROS, así como células fijas para estimar los componentes de la cadena respiratoria mitocondrial (MRC) y las proteínas asociadas al ADNmt, como el factor de transcripción mitocondrial A (TFAM).
Al co-teñir con reporteros fluorescentes, incluyendo MitoTracker Green (MTG), tetramethylrhodamine ethyl ester (TMRE) y MitoSox Red, los cambios en el volumen mitocondrial, MMP y ROS mitocondrial pueden cuantificarse y relacionarse con el contenido mitocondrial. La doble tinción con anticuerpos contra subunidades del complejo MRC y translocasa de la membrana mitocondrial externa 20 (TOMM20) permite la evaluación de la expresión de la subunidad MRC. Como la cantidad de TFAM es proporcional al número de copias de ADNmt, la medición de TFAM por TOMM20 da una medición indirecta de ADNmt por volumen mitocondrial. Todo el protocolo se puede llevar a cabo en 2-3 h. Es importante destacar que estos protocolos permiten la medición de parámetros mitocondriales, tanto a nivel total como a nivel específico por volumen mitocondrial, utilizando citometría de flujo.
Introduction
Las mitocondrias son orgánulos esenciales presentes en casi todas las células eucariotas. Las mitocondrias son responsables del suministro de energía mediante la producción de trifosfato de adenosina (ATP) a través de la fosforilación oxidativa y actúan como intermediarios metabólicos para la biosíntesis y el metabolismo. Las mitocondrias están profundamente involucradas en muchos otros procesos celulares importantes, como la generación de ROS, la muerte celular y la regulación intracelular de Ca2+. La disfunción mitocondrial se ha asociado con diversas enfermedades neurodegenerativas, incluyendo la enfermedad de Parkinson (EP), la enfermedad de Alzheimer (EA), la enfermedad de Huntington (HD), la ataxia de Friedreich (FRDA) y la esclerosis lateral amiotrófica (ELA)1. También se cree que el aumento de la disfunción mitocondrial y la anomalía del ADNmt contribuyen al envejecimiento humano 2,3.
Varios tipos de disfunción mitocondrial ocurren en enfermedades neurodegenerativas, y los cambios en el volumen mitocondrial, la despolarización MMP, la producción de ROS y las alteraciones en el número de copias de ADNmt son comunes 4,5,6,7. Por lo tanto, la capacidad de medir estas y otras funciones mitocondriales es de gran importancia cuando se estudian los mecanismos de la enfermedad y se prueban posibles agentes terapéuticos. Además, en vista de la falta de modelos animales que repliquen fielmente las enfermedades neurodegenerativas humanas, el establecimiento de sistemas modelo in vitro adecuados que recapitulen la enfermedad humana en las células cerebrales es un paso importante hacia una mayor comprensión de estas enfermedades y el desarrollo de nuevas terapias 2,3,8,9.
Las iPSC humanas se pueden usar para generar varias células cerebrales, incluidas las células neuronales y no neuronales (es decir, células gliales), y se ha encontrado daño mitocondrial asociado con la enfermedad neurodegenerativa en ambos tipos de células 3,10,11,12,13. Se dispone de métodos apropiados para la diferenciación de iPSC en linajes neuronales y gliales14,15,16. Estas células proporcionan una plataforma única para el modelado de enfermedades in vitro y la detección de fármacos. Además, como estos se derivan de pacientes, las neuronas derivadas de iPSC y las células gliales proporcionan modelos de enfermedades que reflejan lo que está sucediendo en los humanos con mayor precisión.
Hasta la fecha, se dispone de pocos métodos convenientes y confiables para medir múltiples parámetros funcionales mitocondriales en iPSC, particularmente neuronas vivas y células gliales. El uso de la citometría de flujo proporciona al científico una poderosa herramienta para medir parámetros biológicos, incluida la función mitocondrial, en células individuales. Este protocolo proporciona detalles para la generación de diferentes tipos de células cerebrales, incluidas las células madre neurales (NSC), las neuronas y los astrocitos gliales de iPSC, así como nuevos enfoques basados en citometría de flujo para medir múltiples parámetros mitocondriales en diferentes tipos de células, incluidas las iPSC y las células neuronales y gliales derivadas de iPSC. El protocolo también proporciona una estrategia de tinción conjunta para usar citometría de flujo para medir el volumen mitocondrial, MMP, nivel de ROS mitocondriales, complejos MRC y TFAM. Al incorporar medidas de volumen o masa mitocondrial, estos protocolos también permiten la medición tanto del nivel total como del nivel específico por unidad mitocondrial.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
NOTA: Consulte la Tabla de materiales y la Tabla suplementaria S1 para obtener recetas de todos los medios y soluciones utilizados en este protocolo.
1. Diferenciación de iPSCs humanas en NCSs, neuronas dopaminérgicas (DA) y astrocitos
- Prepare placas recubiertas de matriz.
- Descongele un vial de 5 ml de matriz en hielo durante la noche. Diluir 1 mL de matriz con 99 mL de Cold Advanced Dulbecco's Modified Eagle Medium/Ham's F-12 (Advanced DMEM/F12) (1% de concentración final). Hacer 1 ml de alícuotas y almacenarlas a -20 °C.
- Descongele la solución de matriz a 4 °C (manténgala fría) y cubra 6 pocillos (1 ml por pocillo en una placa de 6 pocillos).
- Coloque la placa recubierta de matriz en una incubadora de aire humidificada al 5% de CO2/95% a 37 °C durante 1 h. Saque la placa de la incubadora y deje que se equilibre a temperatura ambiente (RT).
NOTA: Se recomienda utilizar la placa dentro de los 3 días posteriores al recubrimiento. Sin embargo, la placa recubierta puede conservarse hasta 2 semanas a 4 °C. Solo recuerde sacarlo y dejar que se caliente a RT antes de usarlo. Para un almacenamiento prolongado, agregue 1 ml de medio de cultivo iPSC a la placa recubierta para evitar el secado de la matriz.
- Descongelación de iPSCs
- Precaliente las placas recubiertas de matriz a RT o en la incubadora a 37 °C durante 20-30 min. Precaliente la cantidad requerida de medio de cultivo iPSC en RT.
- Mezclar 6 ml de medio de cultivo iPSC precalentado con 12 μL de inhibidor ROCK Y-27632 para obtener una concentración final de 10 μM.
- Descongelar parcialmente el vial congelado de iPSCs a 37 °C en un baño maría hasta que quede un pequeño trozo de hielo.
- Añadir lentamente 1 ml de medio de cultivo iPSC precalentado con 12 μL de inhibidor de ROCK gota a gota a las células. Transfiera el contenido líquido del vial con iPSCs gota a gota a un pocillo de una placa prerecubierta de 6 pocillos utilizando una pipeta de 5 ml.
- Mueva la placa en direcciones perpendiculares para mezclar el contenido del pozo y devolver la placa a la incubadora. Cambie el medio de cultivo iPSC después de 24 h después del lavado con solución salina tamponada con fosfato (DPBS) de Dulbecco (1x) (libre de Ca 2+/Mg2+) (4 ml por pocillo en una placa de 6 pocillos).
NOTA: No agregue inhibidor de ROCK a las alimentaciones posteriores. Cambie el medio de cultivo iPSC diariamente.
- Subcultivo de iPSCs
- Precaliente las placas recubiertas de matriz a RT o en la incubadora a 37 °C durante 20-30 min. Precaliente la cantidad requerida de medio de cultivo iPSC en RT.
- Aspirar el medio de cultivo de las placas que contienen las células. Enjuague las iPSC con DPBS (1x) (Ca 2+/Mg2+-libre) (4 mL por pocillo en una placa de 6 pocillos).
- Agregue EDTA (0.5 mM) (1 ml por pocillo en una placa de 6 pocillos). Incubar las placas a 37 °C hasta que los bordes de las colonias comiencen a levantarse del pozo (generalmente 3-5 min). Aspirar el EDTA.
- Añadir el medio de cultivo iPSC precalentado (4 ml por pocillo en una placa de 6 pocillos) y separar con fuerza las colonias de iPSC con una pipeta estéril de 10 ml una vez. No pipetear hacia arriba y hacia abajo, ya que esto puede romper los grupos de células en células individuales.
- Transfiera el contenido de cada pocillo a dos pocillos individuales en una placa de 6 pocillos recubierta de matriz (2 ml por pocillo en una placa de 6 pocillos) e incube a 37 °C. No genere burbujas en la suspensión durante el pipeteo.
NOTA: Agite el plato suavemente antes de guardarlo en la incubadora. La proporción de división puede ser de 1:2 (un pozo en 2 pozos nuevos) a 1:4 (un pozo en 4 pozos nuevos). - Reemplazar el medio diariamente hasta que las colonias alcancen el 60% de confluencia con buen tamaño y conexiones.
- Inducción neuronal y generación de progenitores neuronales
- Prepare 500 ml de medio químicamente definido (CDM), 500 ml de medio de inducción neural (NIM) y 500 ml de medio sin suero de células madre neurales (NSC SF).
- Enjuague las células con DPBS (1x) (Ca 2+/Mg2+-libre) (4 mL por pocillo en una placa de 6 pocillos) y agregue NIM (3 mL por pocillo en una placa de 6 pocillos). Configurado como Día 0.
- Reemplace el NIM (3 ml por pocillo en una placa de 6 pocillos) el día 1, el día 3 y el día 4 y observe bajo la microscopía diariamente.
- El día 5, separe las rosetas neurales en un cultivo de suspensión como se describe a continuación.
- Lavar una vez suavemente con DPBS (1x) (Ca 2+/Mg2+-libre) (4 mL por pocillo en un plato de 6 pocillos). Agregue colagenasa IV (1 ml por pocillo en una placa de 6 pocillos) y manténgala en una incubadora durante 1 minuto. Aspire suavemente la colagenasa IV y lávela una vez con DPBS (1x) (4 ml por pocillo en una placa de 6 pocillos).
- Agregue 2 ml de medio NSC SF por pocillo a una placa de 6 pocillos. Separe las células raspando los fondos de los pocillos dibujando rejillas con una punta de pipeta de 200 μL.
- Recoja la suspensión celular de la placa de 6 pocillos en un plato no adherente de 10 cm. Enrasar el volumen a 12 ml con NSC SF Medium.
- Agite el plato no adherente a 65-85 rpm en un agitador orbital en una incubadora para evitar la agregación.
- Diferenciación de neuronas DA
- El día 7, agregue 12 ml de CDM suplementado con 100 ng / ml de factor de crecimiento de fibroblastos-8b (FGF-8b) y coloque el plato en el agitador orbital en la incubadora.
- En los días 8-13, cambie el medio cada 2 días y observe bajo la microscopía diariamente.
- El día 14, agregue 12 ml de CDM suplementado con 100 ng / ml FGF-8b y 1 μM de purmorfamina (PM). Coloque el plato en el agitador orbital de la incubadora.
- En los días 15-20, cambie el medio cada 2 días y observe las células bajo la microscopía diariamente.
- Paso mecánico de las esferas mediante el uso de puntas de 1000 μL para romper las esferas más grandes.
NOTA: La proporción puede ser de 1:2 (un plato en 2 platos nuevos).
- Terminación de la diferenciación
- Cubra una placa o cubreobjetos de 6 pocillos con poli-L-ornitina (PLO) y laminina como se describe a continuación.
- Cubra una placa de 6 pocillos con 1 ml de PLO por pocillo e incube la placa a 37 °C durante 20 min. Aspirar la solución de PLO.
- Esterilice la placa bajo UV durante 20 min. Enjuague los pocillos dos veces con DPBS (1x) (4 ml por pocillo en una placa de 6 pocillos).
- Añadir 5 μg/ml de solución de laminina (1 ml por pocillo en una placa de 6 pocillos) al pocillo e incubar a 37 °C durante 2 h. Aspire la laminina y lave los pocillos brevemente con DPBS (1x) (4 ml por pocillo en una placa de 6 pocillos) una vez antes de enchapar.
- Recoja todas las esferas (del paso 1.5.5) en tubos de 50 ml y recargue con DPBS (1x). Girar a 300 × g durante 5 min. Aspirar el sobrenadante.
- Incubar con 2 ml de reactivo de disociación celular (ver tabla de materiales) durante 10 min a 37 °C en un baño maría, seguido de una trituración suave con una pipeta de 200 μL (20-50 veces dependiendo del tamaño de las esferas, evitando la formación de burbujas).
- Neutralizar el reactivo de disociación celular con 2 ml de Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) con 10% de suero bovino fetal (FBS) y centrifugar el tubo cónico de 50 mL que contiene las células a 300 × g durante 5 min en RT. Aspirar el sobrenadante.
- Agregue 1 ml de CDM suplementado con 10 ng / ml de factor neurotrófico derivado del cerebro (BDNF) y 10 ng / ml de factor neurotrófico derivado de la línea celular glial (GDNF) para resuspender los gránulos celulares pipeteando suavemente hacia arriba y hacia abajo para obtener suspensiones de células individuales.
- Aspirar la solución de laminina de la placa (paso 1.6.1.3), lavar brevemente con DPBS (1x) (4 ml por pocillo en una placa de 6 pocillos) y sembrar las células (a partir del paso 1.6.5) en las placas prerecubiertas o cubreobjetos en 3 ml de MDL suplementado con 10 ng/ml de BDNF y 10 ng/ml de GDNF. Alimente las células cada 4 días.
NOTA: Los cultivos diferenciadores se pueden mantener durante muchas semanas hasta 3 meses. La morfología neural generalmente aparece después de 2 semanas de terminación y se puede usar para análisis posteriores a partir de ese momento. BDNF y GDNF no son necesarios para el cultivo para un mantenimiento más prolongado (hasta 2 meses).
- Cubra una placa o cubreobjetos de 6 pocillos con poli-L-ornitina (PLO) y laminina como se describe a continuación.
- Generación NSC
- Placas matriciales de recubrimiento.
- Recopile todas las esferas neuronales (generadas a partir del paso 1.4) en tubos de 50 ml y recargue con DPBS (1x) (libre de Ca 2+/Mg2+). Girar a 300 × g durante 5 min. Aspirar los sobrenadantes.
- Incubar los gránulos con 2 ml de reactivo de disociación celular durante 10 min a 37 °C en un baño maría, seguido de una trituración suave con una pipeta de 200 μL (20-50 veces dependiendo del tamaño de las esferas, evitando la formación de burbujas).
- Neutralizar con 2 mL de DMEM con 10% de FBS y centrifugar los tubos cónicos de 50 mL que contienen las células a 300 × g durante 5 min en RT. Aspirar los sobrenadantes. Resuspenda los gránulos celulares pipeteando suavemente hacia arriba y hacia abajo para obtener suspensiones de una sola célula.
- Aspirar la solución de matriz de una placa prerecubierta y sembrar las células en las placas prerecubiertas en medio NSC SF (3 ml por pocillo en una placa de 6 pocillos). Alimente las células cada 2-3 días y divida las células cuando sean confluentes.
NOTA: A partir de esta etapa, los NSC se pueden expandir y congelar.
- Diferenciación de astrocitos gliales
- Diferenciación de astrocitos de NSCs
- Preparar 500 mL de medio de diferenciación de astrocitos.
- NSC de semillas en placas/cubreobjetos recubiertos de poli-D-lisina (PDL) con medio NSC SF.
- Al día siguiente, enjuague las células con DPBS (1x) (Ca 2+/Mg2+-libre) (4 mL por pocillo en una placa de 6 pocillos) y agregue medio de diferenciación de astrocitos (3 mL por pocillo en una placa de 6 pocillos). Configurado como Día 0.
- Observe las NSC bajo el microscopio diariamente y reemplace el medio de diferenciación de astrocitos (3 ml por pocillo en una placa de 6 pocillos) cada 2 días desde los días 1 hasta el 27.
- Maduración de astrocitos
- Preparar el medio de maduración de astrocitos.
- El día 28, enjuague las células con DPBS (1x) (4 ml por pocillo en una placa de 6 pocillos) y agregue medio de maduración de astrocitos (3 ml por pocillo en una placa de 6 pocillos).
- En el día 29 en adelante, observe las células bajo el microscopio diariamente y reemplace el medio de maduración de astrocitos (3 ml por pocillo en una placa de 6 pocillos) cada 2 días.
- Después de un mes de maduración, expanda las células y criopreserve a partir de esta etapa.
NOTA: Durante esta fase, el número de celdas aumentará. Al dividir las células, los cubreobjetos recubiertos con PDL no son necesarios para el cultivo.
- Diferenciación de astrocitos de NSCs
2. Caracterización celular por inmunocitoquímica y tinción por inmunofluorescencia
- Al final del período de cultivo, transfiera los cubreobjetos con las células a una placa de 12 pocillos.
Enjuague las células con solución salina tamponada con fosfato (PBS) (1x) dos veces e incube durante 10 minutos en paraformaldehído al 4% (PFA) (0,5 ml por pocillo en una placa de 12 pocillos) en RT.
NOTA: La muestra fija puede cubrirse con 2 ml de PBS (1x) y almacenarse a 4 °C hasta que sea necesario para la inmunotinción. La PFA es tóxica y se sospecha que causa cáncer. Evite la exposición de la piel y los ojos, y trabaje bajo una campana de humo químico. - Bloquear y permeabilizar las células e incubar con tampón de bloqueo que contiene PBS (1x), 0,3% Triton X-100 y 10% de suero de cabra normal durante 1 h en RT.
- Incubar con anticuerpos primarios en tampón de bloqueo durante la noche a 4 °C: tinción de iPSCs con factor de transcripción de unión a octameros 4 (Oct4) y antígeno-4 embrionario antiestadio específico (SSEA4), NSC con región antideterminante del sexo Y box-2 (Sox2) y anti-Nestin, esferas neurales con anti-pareado box-6 (Pax6) y anti-Nestin, astrocitos con proteína ácida fibrilar anti-glial (GFAP) y proteína de unión al calcio anti-S100 β (S100β), y neuronas DA con anti-tirosina hidroxilasa (TH), anti-β III Tubulina (Tuj 1), anti-Sinaptofisina, y anti-PSD-95 (0,5 ml de solución de anticuerpos primarios por pocillo en una placa de 12 pocillos; consulte la Tabla de materiales para obtener más detalles).
- Lave las muestras con PBS (1x) tres veces durante 10 minutos cada una con un balanceo suave.
- Incubar con solución de anticuerpos secundarios (1:800 en tampón de bloqueo, 0,5 ml de solución de anticuerpos secundarios de Alexa Fluor por pocillo en una placa de 12 pocillos) durante 1 h en RT con balanceo suave.
- Incubar las células con Hoechst 33342 (1:5.000, 0,5 ml por pocillo en una placa de 12 pocillos) en PBS (1x) durante 15 min en RT para marcar los núcleos.
- Monte las células con medio de montaje y séquelas durante la noche en RT para obtener imágenes bajo un microscopio de fluorescencia en la oscuridad. Consulte la Figura suplementaria S1 para conocer los ajustes y parámetros del microscopio.
3. Medición por citometría de flujo del volumen mitocondrial, MMP y ROS mitocondrial en células vivas
- Sembrar las células por separado en 4 pocillos en una placa de 6 pocillos hasta que las células alcancen una confluencia del 50% -60%. Etiquete estos cuatro pozos como #1, #2, #3 y #4.
- Al final del período de cultivo, preparar 5 soluciones de tinción individuales (500 μL por pocillo en una placa de 6 pocillos) de la siguiente manera: #1 solo medio de cultivo (hasta el pozo #1 que contiene solo células para control); #2-1 que contiene FCCP (100 μM); #2-2 que contiene FCCP (100 μM) + TMRE (100 nM) + MTG (150 nM) en medio de cultivo; #3 que contiene TMRE (100 nM) + MTG (150 nM) en medio de cultivo; #4 que contiene MitoSox Red (10 μM) + MTG (150 nM) en PBS (1x) con 10% de FBS. Consulte la Figura 1A, la Tabla suplementaria S2 y la Tabla de materiales para obtener detalles sobre estos compuestos y la configuración de la citometría de flujo.
NOTA: Utilice el medio de cultivo para preparar la solución de tinción. Caliente el medio y PBS (1x) en RT antes de usar. FCCP es tóxico; Evite la exposición de la piel y los ojos y trabaje bajo una campana de humos químicos. - Aspire el medio del pocillo # 2 y agregue la solución # 2-1 (solo FCCP). Incubar las células a 37 °C durante 10 min.
- Aspire el medio de los pozos #2 y #3 y agregue la solución #2-2 (FCCP + TMRE + MTG) en el pozo #2 y la solución #3 (TMRE + MTG) en #3. Incubar las células a 37 °C durante 45 min.
- Aspirar el medio del pozo #4 y añadir la solución #4 (MitoSox Red + MTG). Incubar las células a 37 °C durante 15 min.
- Aspirar el medio de todos los pocillos. Lavar con PBS (1x) (4 ml por pocillo en una placa de 6 pocillos). Separar las células utilizando 1 ml de reactivo de disociación celular (1 ml por pocillo en una placa de 6 pocillos) a 37 °C durante 5 min. Neutralizar el reactivo de disociación celular en 1 mL de DMEM con FBS al 10% (2 mL por pocillo en una placa de 6 pocillos).
- Recoja el contenido de todos los pocillos en tubos cónicos de 15 ml. Centrifugar los tubos a 300 × g durante 5 min. Lave los gránulos con PBS (1x) una o dos veces.
- Aspirar los sobrenadantes pero dejar aproximadamente 100 μL en los tubos. Resuspender los gránulos celulares en 300 μL de PBS (1x). Transfiera las células a tubos de microcentrífuga de 1,5 ml. Mantenga los tubos en la oscuridad en RT.
- Analice las células utilizando un citómetro de flujo (con una configuración de láser azul 3 y 1 rojo). Detecte MTG en el filtro 1 (FL1) utilizando un filtro de paso de banda 530/30, TMRE en el filtro 2 (FL2) utilizando el filtro de paso de banda 585/40 y MitoSox Red en el filtro 3 (FL3) utilizando un filtro de paso de banda 510/580.
4. Medición por citometría de flujo de subunidades del complejo MRC y TFAM en células fijas
- Al final del período de cultivo, separar las células (~106) añadiendo el reactivo de disociación celular; luego, pellet y recoger las células en un tubo de 15 ml. Lavar las células por centrifugación con PBS (1x) dos veces centrifugando a 300 × g durante 5 min.
- Fijar las células en PFA al 1,6% (1 ml de PFA al 1,6% en un tubo de 15 ml) a RT durante 10 min. Lavar las células por centrifugación con PBS (1x) dos veces centrifugando a 300 × g durante 5 min.
- Permeabilizar las células con metanol helado al 90% (1 ml de metanol al 90% en un tubo de 15 ml) a -20 °C durante 20 min.
- Bloquear las muestras en tampón de bloqueo que contenga 0,3 M de glicina, 5% de suero de cabra y 1% de albúmina sérica bovina (BSA) - Fracción V en PBS (1x) (1 ml de tampón de bloqueo en un tubo de 15 ml). Lavar las células por centrifugación con PBS (1x) dos veces (como en el paso 3.7).
- Incubar las células con los siguientes anticuerpos primarios durante 30 min: anti-NDUFB10 (1:1.000) para la medición de la subunidad del complejo I, anti-succinato deshidrogenasa complejo flavoproteína subunidad A (SDHA, 1:1.000) para la medición de la subunidad del complejo II y anti-COX IV (1:1.000) para la medición de la subunidad del complejo IV, y anticuerpo anti-TFAM conjugado con Alexa Fluor 488 (1:400). Tiñe el mismo número de células por separado con el anticuerpo anti-TOMM20 conjugado con Alexa Fluor 488 (1:400) durante 30 min (1 ml de solución de anticuerpos primarios en un tubo de 15 ml; consulte la Tabla de materiales para obtener detalles sobre los anticuerpos).
- Lavar las células con PBS (1x) una vez con centrifugación a 300 × g durante 5 min. Agregue anticuerpos secundarios (1:400) en tubos de NDUFB10, SDHA y COX IV e incube las células con estas soluciones durante 30 minutos.
- Lave las células con PBS (1x) una vez centrifugando a 300 × g durante 5 min. Aspirar los sobrenadantes, dejando aproximadamente 100 μL en los tubos. Resuspender los gránulos celulares en 300 μL de PBS (1x). Transfiera las células a tubos de microcentrífuga de 1,5 ml mantenidos en la oscuridad sobre hielo.
- Analice las células en el citómetro de flujo (con una configuración de láser azul 3 y 1 rojo). Detecte señales en el filtro 1 (FL1) utilizando un filtro de paso de banda 530/30. Consulte la figura suplementaria S2 para conocer los ajustes y parámetros del microscopio.
5. Adquisición y análisis de citometría de flujo
- Utilice el tubo de control no teñido para establecer los gráficos de dispersión del área de dispersión directa (FSC-A) y del área de dispersión lateral (SSC-A) en función del tamaño y la complejidad de la población celular analizada. Consulte la figura suplementaria S2 para conocer los ajustes y parámetros del microscopio.
NOTA: Configure controles no teñidos para tipos de celdas individuales. - Utilice los tubos de control sin manchas para seleccionar las puertas positivas, y utilice tubos de control de un solo color para compensar la superposición espectral de fluorescencia entre MTG (fluoróforo-1 [FL-1]) y TMRE (FL-2) en citometría de flujo multicolor. Utilice el control de isotipo para el control negativo para monitorear la tinción de fondo en muestras MRC y TFAM. Utilice el tubo FCCP como control de despolarización para la tinción de TMRE.
- Elimine los desechos extraños para seleccionar celdas vivas y la puerta principal del diagrama de dispersión frontal y lateral (Figura 2A). Elimine los dobletes utilizando una altura de dispersión directa (FSC-H) frente a (vs.) gráfica de densidad FSC-A para excluir dobletes y también construir una gráfica de altura de dispersión lateral (SSC-H) frente a SSC-A (Figura 2A).
- Adquisición de datos (citómetro de flujo)
- Usando las muestras no teñidas o isotipo como control negativo, cree una puerta por encima de la población principal de los eventos de una sola célula mientras ve SSC-A y los diversos filtros (FL1, FL2, FL3, FL4) (Figura 1B y Figura 2B).
- Análisis de datos (software CFlow)
- Copie la posición de las puertas en las muestras de células teñidas y registre la cantidad de células teñidas positivamente para la tinción positiva.
- Para cada subpoblación celular, seleccione un gráfico de histograma y analice la intensidad de fluorescencia mediana (MFI) de los diferentes canales de filtro (FL1, FL2, FL3, FL4) (eje x).
- Calcule los niveles de TMRE restando la MFI de FL2 de las células tratadas con FCCP # 2 de la MFI de FL2 de muestras teñidas con TMRE # 3 en un histograma, como en Eq (1) a continuación.
Niveles de TMRE = MFI de FL2 de muestras teñidas con TMRE #3 - MFI de FL2 de células tratadas con FCCP #2 (1) - Calcule los valores específicos para MMP y ROS mitocondrial por MFI en TMRE o MitoSox Red, dividiendo el indicador de volumen mitocondrial MTG.
- Calcule el valor específico para la subunidad compleja y TFAM utilizando MFI en expresión compleja o TFAM, dividiendo el indicador de volumen mitocondrial TOMM20.
- Calcule los niveles de TMRE restando la MFI de FL2 de las células tratadas con FCCP # 2 de la MFI de FL2 de muestras teñidas con TMRE # 3 en un histograma, como en Eq (1) a continuación.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
En la Figura 3 se muestra una descripción esquemática del método de diferenciación y las estrategias de citometría de flujo. Las iPSC humanas se diferencian en rosetas neuronales y luego se elevan a la cultura de suspensión para su diferenciación en esferas neuronales. Las esferas neuronales se diferencian aún más y maduran en neuronas DA. Las esferas neuronales se disocian en células individuales para generar astrocitos gliales, se recolocan en monocapas como NSC y luego se diferencian en astrocitos. Este protocolo proporciona las estrategias necesarias para adquirir y analizar las muestras por citometría de flujo para la medición de MMP, volumen mitocondrial, niveles de ROS mitocondriales, niveles de expresión de subunidades del complejo MRC y TFAM (una medida indirecta del número relativo de copias de ADNmt). Específicamente, se utilizó la tinción conjunta con reporteros fluorescentes, TMRE y MTG, para detectar y cuantificar cambios en MMP y volumen mitocondrial. La tinción conjunta con MitoSox Red y MTG permite medir la producción de ROS mitocondriales en células vivas. La tinción con anticuerpos contra subunidades del complejo MRC junto con TOMM20 permite la evaluación del MRC y la tinción de TFAM y TOMM20 para la evaluación indirecta del número de copias de ADNmt. Es importante destacar que MTG y TOMM20 permiten la medición por volumen mitocondrial, contrarrestando la influencia del volumen mitocondrial en estos parámetros.
Las neuronas DA se generan a partir de iPSCs a través de la inhibición dual de SMAD y se exponen a FGF-8b y al agonista Sonic hedgehog (SHH) PM, como se muestra en la Figura 4A. Las iPSC humanas se siembran en medio de cultivo iPSC en placas recubiertas de matriz. Cuando las células alcanzan el 50% -80% de confluencia, el medio se cambia a NIM utilizando un CDM suplementado con SB431542, inhibidor de AMPK, compuesto C y N-acetilcisteína durante 5 días. Después de 5 días, las iPSCs (Figura 4B, a) progresan a una etapa epitelial neural exhibiendo estructuras claras de roseta neural (Figura 4B, b). El día 5, las esferas neuronales se generan levantando el epitelio neural en cultivo de suspensión y cultivándolas en medio NSC SF en un agitador orbital dentro de la incubadora. Las esferas redondas y bien definidas se muestran en la Figura 4B, c. El día 7, el medio se transforma en MDL suplementado con 100 ng/mL FGF-8b. El día 14, el medio se transforma en el MDL suplementado con 100 ng/mL FGF-8b y 1 μM PM. El día 21, las esferas se disocian en neuronas DA en una monocapa disociándolas en células individuales y cultivándolas en CDM suplementado con 10 ng / ml BDNF y 10 ng / ml GDNF en PLO y placas / cubreobjetos recubiertos de laminina. Las neuronas (Figura 4B, e) maduradas durante 15-30 días se utilizan además para mediciones funcionales mitocondriales.
Las NSC se producen disociando esferas neuronales en células individuales y luego recolocándolas en monocapas para generar astrocitos. Estas NSC muestran una apariencia clásica de progenitor neural (Figura 4B, d). Los NSC en esta etapa pueden expandirse y almacenarse fácilmente para su uso posterior. Para iniciar la diferenciación de astrocitos, los NSC se colocan en cubreobjetos recubiertos de PDL en medio NSC SF. Al día siguiente, el medio se transforma en medio de diferenciación de astrocitos durante 28 días. Después de 28 días, los astrocitos diferenciados maduran aún más en el medio de maduración de los astrocitos. En esta etapa, los astrocitos deben mostrar morfología en forma de estrella (Figura 4B, f), y estas células pueden expandirse y almacenarse para su uso posterior, incluida la evaluación funcional mitocondrial.
Durante la diferenciación, la identidad celular se confirma mediante tinción de inmunofluorescencia. En la Figura 5A, la inmunotinción muestra que las iPSCs expresan los marcadores pluripotentes específicos, SSEA4 y Oct4. La Figura 5B muestra que las esferas neuronales exhiben tinción positiva de Nestin y Pax6, mientras que la Figura 5C muestra que las NSC derivadas de iPSC en monocapas exhiben tinción positiva de Nestin y Sox2. Para identificar las neuronas DA, las células se tiñen con el marcador neural β III Tubulina (Tuj 1) y el marcador neuronal DA tirosina hidroxilasa (TH) (Figura 6B). Además, las neuronas DA muestran tinción para los marcadores sinápticos, sinaptofisina y PSD-95, confirmando sus conexiones sinápticas funcionales (Figura 5B). La inmunotinción de astrocitos derivados de iPSC muestra la expresión de los marcadores de astrocitos, la proteína ácida fibrilar glial (GFAP) y la proteína de unión al calcio S100 β (S100β).
La investigación de la función mitocondrial en neuronas diferenciadas y astrocitos utilizando citometría de flujo se realiza como se describe anteriormente en las secciones 3 y 4 del protocolo. Se utilizó un citómetro de flujo para la adquisición de datos y CFlow Sampler para el análisis de datos, como se muestra en la Figura 1B.
La Figura 2 muestra el método para activar células individuales vivas. Las células muertas y los desechos celulares se excluyen utilizando un gráfico FSC vs. SSC (Figura 2A, a). Los dobletes celulares se excluyen utilizando una gráfica FSC-H vs. FSC-A (Figura 2A, b) seguida de una gráfica SSC-H vs. SSC-A (Figura 2A, c). La fluorescencia de fondo se evalúa adecuadamente si la población negativa de un tipo de célula particular se compara con la población positiva dentro de ese mismo tipo de célula (Figura 2B, a). Para muestras MMP, el tratamiento de las células con FCCP elimina la interferencia del potencial de membrana mitocondrial y la tinción TMRE (Figura 2B, b).
Estos enfoques citométricos de flujo se han utilizado para estudiar las neuronas DA generadas a partir de las iPSC humanas portadoras de mutaciones en la subunidad catalítica de la ADN polimerasa mitocondrial, POLG (W748S), y compararlas con muestras libres de enfermedad generadas a partir de fibroblastos Detroit 551. Como se informó anteriormente4, este estudio también demostró una disminución de MMP y un aumento de los niveles específicos de ROS mitocondriales en las neuronas POLG DA (Figura 7). Sin embargo, el volumen mitocondrial, la MMP total y el nivel total de ROS mitocondriales se mantuvieron sin cambios. En la Figura 8, los resultados muestran una disminución en los niveles específicos del complejo I, niveles más bajos de TFAM totales y específicos, pero niveles específicos similares del complejo II en las neuronas DA mutantes en comparación con los controles.
Este enfoque también se utilizó para estudiar astrocitos generados a partir de las mismas líneas iPSC. Como se informó anteriormente7 y se muestra en la Figura 9, los resultados muestran que los astrocitos mutados en POLG tenían una MMP total y específica más baja, pero un volumen mitocondrial y ROS mitocondriales similares en comparación con los controles, así como niveles disminuidos de complejos específicos I y IV (Figura 10). Sin embargo, no hubo cambios en los niveles totales de los complejos I y IV y no hubo cambios en los niveles totales y específicos del complejo II en los astrocitos POLG. En general, estos datos sugieren que el análisis citométrico de flujo de múltiples parámetros mitocondriales proporciona una aproximación de primer paso que es valiosa para evaluar la función mitocondrial en células como las iPSC y sus derivados neuronales y gliales.
Figura 1: Configuración para citometría de flujo. (A) MMP, volumen mitocondrial y tinción mitocondrial ROS; (B) un ejemplo de adquisición de datos en un citómetro de flujo C6. Abreviaturas: MMP = potencial de membrana mitocondrial; ROS = especies reactivas de oxígeno; FCCP = cianuro de carbonilo p-trifluorometoxifenilhidrazona; TMRE = éster etílico de tetrametilrodamina; MTG = MitoTracker Verde. Véase también el cuadro suplementario S2. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Estrategias de acceso. a) Adquisición de datos; (B) los histogramas de la fluorescencia con tinción MTG y TMRE en células vivas. Abreviaturas: SSC-A = área de dispersión lateral; FSC-A = área de dispersión hacia adelante; SSC-H = altura de dispersión lateral; FSC-H = altura de dispersión hacia adelante; FL#-A = área # fluoróforo; MTG = MitoTracker Verde; FCCP = cianuro de carbonilo p-trifluorometoxifenilhidrazona; TMRE = éster etílico de tetrametilrodamina. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Representación esquemática del flujo de trabajo del protocolo. Abreviaturas: DA = dopaminérgico; MMP = potencial de membrana mitocondrial; ROS = especies reactivas de oxígeno; NDUFB 10 = NADH: Subunidad 10 de la ubiquinona oxidorreductasa; SDHA = subunidad A de flavoproteína del complejo succinato deshidrogenasa; COX IV = complejo IV de citocromo c oxidasa; ADNmt = ADN mitocondrial; TFAM = factor de transcripción mitocondrial A. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Diferenciación de iPSC. (A) Diagrama de flujo y (B) imágenes representativas de las células de diferentes etapas durante la diferenciación, incluyendo iPSCs (a), roseta neural (b), esferas neurales (c), NSCs (d), neuronas DA (e) y astrocitos (f). Barras de escala = 25 μm. Abreviaturas: iPSC = célula madre pluripotente inducida; NSC = célula madre neural; DA = dopaminérgico; MFS = medio sin suero; MDL = medio químicamente definido; FGF-8b = factor de crecimiento de fibroblastos-8b; PM = purmorfamina; BDNF = factor neurotrófico derivado del cerebro; GDNF = factor neurotrófico derivado de la línea celular glial; PLO = poli-L-ornitina. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: Imágenes confocales representativas de iPSCs y sus derivados neuronales. (A) Inmunotinción de SSEA4 (rojo) y Oct4 (verde) en iPSCs. (B) Inmunotinción de Nestin (rojo) y Pax6 (verde) en esferas neuronales derivadas de iPSC. (C) Inmunotinción de Nestin (rojo) y Sox2 (verde) en NSC derivadas de iPSC. Los núcleos se tiñen con DAPI (azul). Barras de escala = 50 μm. Abreviaturas: iPSCs = células madre pluripotentes inducidas; NSCs = células madre neurales; SSEA4 = antígeno-4 embrionario específico del estadio; Oct4 = factor de transcripción de unión al octámero 4; Pax6 = caja pareada-6; Sox2 = región determinante del sexo Y caja-2; DAPI = 4',6-diamidino-2-fenilindol. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 6: Imágenes confocales representativas de los astrocitos derivados de iPSC y las neuronas DA . (A) Inmunotinción de GFAP (rojo) y S100β (verde) en astrocitos derivados de iPSC. (B) Inmunotinción del marcador de linaje neural TH (verde), Tuj 1 (rojo) y el marcador funcional neural Sinaptofisina (verde) y PSD-95 (rojo) en neuronas DA derivadas de iPSC. Los núcleos se tiñen con DAPI (azul). Barras de escala = 25 μm. Abreviaturas: iPSCs = células madre pluripotentes inducidas; GFAP = proteína ácida fibrilar glial; S100( = proteína de unión al calcio S100 β; Tuj 1 = β III Tubulin; PSD-95 = proteína de densidad postsináptica 95; DA = dopaminérgico; DAPI = 4',6-diamidino-2-fenilindol. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 7: Análisis citométrico de flujo para neuronas DA derivadas de un clon de iPSCs de pacientes POLG y un clon de iPSCs de control Detroit 551. (A) volumen mitocondrial medido por MTG, (B) MMP total medido por TMRE, (C) nivel específico de MMP calculado por TMRE/MTG total, (D) ROS mitocondrial total medido por MitoSox Red, y (E ) nivel específico de ROS mitocondrial calculado por el total de MitoSox Red/MTG. Los datos presentados como media ± error estándar de la media (SEM) para el número de muestras (n ≥ 3 por clon). Datos analizados y producidos utilizando el software GraphPad Prism. Se utilizó la prueba U de Mann-Whitney para evaluar la significación estadística de las variables. La significación se denota para P < 0,05. *P < 0,05; ns, no significativo. Abreviaturas: DA = dopaminérgico; POLG = subunidad gamma de la ADN polimerasa; iPSCs = células madre pluripotentes inducidas; MMP = potencial de membrana mitocondrial; ROS = especies reactivas de oxígeno; MTG = MitoTracker Verde; TMRE = éster etílico de tetrametilrodamina. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 8: Análisis citométrico de flujo para astrocitos derivados de un clon de iPSCs de pacientes con POLG y un clon de iPSCs de control Detroit 551. (A) volumen mitocondrial medido por MTG, (B) MMP total medido por TMRE, (C) nivel específico de MMP calculado por TMRE/MTG total, (D) ROS Rmitocondrial total S medido por MitoSox Red, y (E ) nivel específico de ROS mitocondrial calculado por el total de MitoSox Red/MTG. Los datos presentados como media ± error estándar de la media (SEM) para el número de muestras (n ≥ 3 por clon). Datos analizados y producidos utilizando el software GraphPad Prism. Se utilizó la prueba U de Mann-Whitney para evaluar la significación estadística de las variables. La significación se denota para P < 0,05. *P < 0,05; ns, no significativo. Abreviaturas: POLG = subunidad gamma de la ADN polimerasa; iPSC = célula madre pluripotente inducida; MMP = potencial de membrana mitocondrial; ROS = especies reactivas de oxígeno; MTG = MitoTracker Verde; TMRE = éster etílico de tetrametilrodamina. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 9: Análisis citométrico de flujo para neuronas DA derivadas de un clon de iPSCs de pacientes POLG y un clon de iPSCs de control Detroit 551. (A) Complejo I total medido por NDUFB10, (B) nivel de complejo específico I calculado por NDUFB10/TOMM20 total, (C) complejo II total medido por SDHA, (D) nivel de complejo II específico calculado por SDHA/TOMM20 total, (E) TFAM total medido por TFAM, y (F) nivel específico de TFAM calculado por TFAM/TOMM20 total. Los datos presentados como media ± error estándar de la media (SEM) para el número de muestras (n ≥ 3 por clon). Datos analizados y producidos utilizando el software GraphPad Prism. Prueba U de Mann-Whitney utilizada para evaluar la significación estadística de las variables. La significación se denota para P < 0,05. *P < 0,05; ns, no significativo. Abreviaturas: DA = dopaminérgico; POLG = subunidad gamma de la ADN polimerasa; iPSC = célula madre pluripotente inducida; NDUFB10 = NADH: Subunidad 10 de la ubiquinona oxidorreductasa; TOMM20 = translocasa de la membrana mitocondrial externa 20; SDHA = subunidad A de flavoproteína del complejo succinato deshidrogenasa; TFAM = factor de transcripción mitocondrial A. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 10: Análisis citométrico de flujo para astrocitos derivados de un clon de iPSCs de pacientes con POLG y un clon de iPSCs de control Detroit 551. (A) Complejo I total medido por NDUFB10, (B) nivel de complejo específico I calculado por NDUFB10/TOMM20 total, (C) complejo II total medido por SDHA, (D) nivel específico del complejo II calculado por SDHA/TOMM20 total, (E) complejo IV total medido por COX IV, (F) nivel IV complejo específico calculado por COX IV/TOMM20, (G) TFAM total medido por TFAM, y (H) nivel específico de TFAM calculado por TFAM/TOMM20 total. Los datos presentados como media ± error estándar de la media (SEM) para el número de muestras (n ≥ 3 por clon). Datos analizados y producidos utilizando el software GraphPad Prism. Se utilizó la prueba U de Mann-Whitney para evaluar la significación estadística de las variables. La significación se denota para P < 0,05. *P < 0,05; ** P < 0,01; ns, no significativo. Abreviaturas: POLG = subunidad gamma de la ADN polimerasa; iPSC = célula madre pluripotente inducida; NDUFB10 = NADH: Subunidad 10 de la ubiquinona oxidorreductasa; TOMM20 = translocasa de la membrana mitocondrial externa 20; SDHA = subunidad A de flavoproteína del complejo succinato deshidrogenasa; TFAM = factor de transcripción mitocondrial A; COX IV = complejo IV de citocromo c oxidasa. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura suplementaria S1: Ajustes del microscopio de fluorescencia de barrido láser confocal y pasos para tomar imágenes. (A) Elija la herramienta Configuración y seleccione el tipo de láser correcto de Láser disponible actual y ajuste su potencia. (B) Elija Acquire-Acquisition Mode-SEQ y seleccione el modo fotográfico de longitud de onda de fluorescencia correspondiente de la base de datos. (C) Elija Sequential Scan-Load e importe el modo correspondiente. (D) Elija la lente del objetivo 40x y agregue gotas. (E) Parámetros de ajuste específicos para tomar fotos en diferentes longitudes de onda. (F) Establezca los parámetros de la foto, obtenga una vista previa y guarde la foto. Haga clic aquí para descargar este archivo.
Figura suplementaria S2: Pasos y ajustes para la citometría de flujo. (A) Abra el software Cflow, elija la herramienta Archivo y seleccione Abrir archivo o plantilla CFlow. (B) Configure 40000 eventos y seleccione la puerta que contiene solo las celdas individuales activas en el panel Límites de ejecución. Seleccione Velocidad media en el panel Fluidos. (C) Elija FSC-A vs. FSC-A parcela (a) para configurar la gata principal. Elija FSC-A vs. FSC-H plot (b) y SSC-A vs. SSC-H plot (c) para excluir dobletes. Elija los filtros correspondientes, como FL1 o FL2, y use FL1-A vs. gráfico FSC-A (d) o FL2-A vs. FSC-A para dibujar los eventos positivos al ejecutar las celdas no teñidas. (D) Configure los mismos parámetros, obtenga una vista previa, ejecute las muestras teñidas y guarde la foto. Véase también el cuadro suplementario S2. Haga clic aquí para descargar este archivo.
Tabla suplementaria S1: Recetas de medios y soluciones. Haga clic aquí para descargar esta tabla.
Tabla suplementaria S2: Configuración para la tinción por citometría de flujo. Haga clic aquí para descargar esta tabla.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Aquí hay protocolos para generar neuronas y astrocitos derivados de iPSC y evaluar múltiples aspectos de la función mitocondrial utilizando citometría de flujo. Estos protocolos permiten la conversión eficiente de iPSCs humanas tanto en neuronas como en astrocitos gliales y la caracterización detallada de la función mitocondrial, principalmente en células vivas. Los protocolos también proporcionan una estrategia basada en citometría de flujo de tinción conjunta para adquirir y analizar múltiples funciones mitocondriales, incluidos el volumen, MMP y los niveles de ROS mitocondrial en células vivas y complejos MRC y TFAM en células fijas. En concreto, estos protocolos permiten estimar tanto los niveles totales como los específicos por volumen mitocondrial. Si bien esta estrategia detecta la disfunción mitocondrial en una enfermedad mitocondrial conocida (POLG) en neuronas DA y astrocitos, estas técnicas son aplicables a cualquier tipo de célula y enfermedad. Además, el protocolo es robusto y reproducible. Varios estudios previos han aplicado con éxito este protocolo para analizar los cambios mitocondriales en fibroblastos, iPSCs, NSCs, neuronas DA y astrocitos 2,3,13,17.
Hay algunos puntos críticos a considerar al ejecutar este protocolo. Para garantizar una diferenciación consistente y de alta eficiencia, es fundamental iniciar la conversión con iPSC de alta calidad (células que contienen <5% de células diferenciadas). Aunque otros medios definidos disponibles comercialmente pueden ser alternativas válidas, este estudio no abordó las alternativas. Como la composición del medio y las diferencias clonales de las líneas iPSC pueden influir tanto en la proliferación de la población celular inicial como en la eficiencia de la diferenciación, la adaptación de este protocolo a otros medios de mantenimiento probablemente requerirá optimización.
La relación entre la fluorescencia MTG y MMP ha sido estudiada previamente3. Esto es importante ya que se informa que la fluorescencia MTG es independiente de18 y sensible a MMP 19,20. En estudios previos en los que las iPSC se titularon con diferentes concentraciones de TMRE y se tiñeron conjuntamente con 150 nM MTG, el nivel de MTG se mantuvo igual a concentraciones más bajas de TMRE (5-100 nM), mientras que se observó una disminución de la señal de MTG para concentraciones más altas de TMRE (más de 100 nM). Por lo tanto, se eligieron 100 nM TMRE y 150 nM MTG para medir el MMP específico. Como esta relación puede ser específica de la célula, la correlación entre la fluorescencia MTG y MMP debe evaluarse antes de utilizar la tinción dual MTG y TMRE para medir MMP.
La densidad celular también puede influir en la función mitocondrial y el metabolismo celular. En este estudio, se observaron cambios dependientes de la densidad celular en MMP, lo que también se ha demostrado en otros estudios21. Por lo tanto, es importante elegir una densidad celular similar en todas las muestras, ni demasiado alta ni baja, para minimizar la variación al establecer el protocolo de co-tinción para diferentes tipos de células. En comparación con otros ensayos basados en microscopía, la citometría de flujo tiene las ventajas de velocidad y reproducibilidad al analizar un gran número de células. En el análisis de imágenes microscópicas, el sesgo de los investigadores distorsionará los resultados hasta cierto punto, lo que no es un problema cuando se utiliza la citometría de flujo. Además, el análisis de citometría de flujo requiere menos de un millón de células, y el análisis de una muestra solo toma unos minutos, lo que significa que se pueden analizar docenas de muestras en 1-2 h. Esta técnica también se puede aplicar a una amplia variedad de tipos de células, incluidas las de otras enfermedades neurodegenerativas, y por lo tanto debería ser útil para comprender los mecanismos y probar posibles terapias en diferentes enfermedades neurodegenerativas.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Los autores no tienen conflictos de intereses que revelar.
Acknowledgments
Agradecemos amablemente al Centro de Imágenes Moleculares y a la Instalación Central de Citometría de Flujo de la Universidad de Bergen en Noruega. Este trabajo fue apoyado por fondos del Consejo Noruego de Investigación (número de subvención: 229652), Rakel og Otto Kr.Bruuns legat y el Consejo de Becas de China (número de proyecto: 201906220275).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| anti-Oct4 | Abcam | ab19857, RRID:AB_445175 | Primary Antibody; use as 1:100, 10 μL in 1000 μL staining solution; use Alexa Fluor ® 488 goat anti-rabbit IgG (1:400, Thermo Fisher Scientific, Catalog # A-11008) as secondary antibody. |
| anti-SSEA4 | Abcam | ab16287, RRID:AB_778073 | Primary Antibody; use as 1:100, 10 μL in 1000 μL staining solution; use Alexa Fluor ® 594 goat anti-mouse IgG (1:800, Thermo Fisher Scientific, Catalog # A-11005) as secondary antibody. |
| anti-Sox2 | Abcam | ab97959, RRID:AB_2341193 | Primary Antibody; use as 1:100, 10 μL in 1000 μL staining solution; use Alexa Fluor ® 488 goat anti-rabbit IgG (1:400, Thermo Fisher Scientific, Catalog # A-11008) as secondary antibody. |
| anti-Pax6 | Abcam | ab5790, RRID:AB_305110 | Primary Antibody; use as 1:100, 10 μL in 1000 μL staining solution; use Alexa Fluor ® 488 goat anti-rabbit IgG (1:400, Thermo Fisher Scientific, Catalog # A-11008) as secondary antibody. |
| anti-Nestin | Santa Cruz Biotechnology | sc-23927, RRID:AB_627994 | Primary Antibody; use as 1:50, 20 μL in 1000 μL staining solution; use Alexa Fluor ® 594 goat anti-mouse IgG (1:800, Thermo Fisher Scientific, Catalog # A-11005) as secondary antibody. |
| anti-GFAP | Abcam | ab4674, RRID:AB_304558 | Primary Antibody; use as 1:100, 10 μL in 1000 μL staining solution; use Alexa Fluor ® 594 goat anti-chicken IgG (1:800, Thermo Fisher Scientific, Catalog # A-11042) as secondary antibody. |
| anti-S100β conjugated with Alexa Fluor 488 | Abcam | ab196442, RRID:AB_2722596 | Primary Antibody; use as 1:400, 2.5 μL in 1000 μL staining solution; |
| anti-TH | Abcam | ab75875, RRID:AB_1310786 | Primary Antibody; use as 1:100, 10 μL in 1000 μL staining solution; use Alexa Fluor ® 488 goat anti-rabbit IgG (1:400, Thermo Fisher Scientific, Catalog # A-11008) as secondary antibody. |
| anti-Tuj 1 | Abcam | ab78078, RRID:AB_2256751 | Primary Antibody; use as 1:1000, 1 μL in 1000 μL staining solution; use Alexa Fluor ® 594 goat anti-mouse IgG (1:800, Thermo Fisher Scientific, Catalog # A-11005) as secondary antibody. |
| anti-Synaptophysin | Abcam | ab32127, RRID:AB_2286949 | Primary Antibody; use as 1:100, 10 μL in 1000 μL staining solution; use Alexa Fluor ® 488 goat anti-rabbit IgG (1:400, Thermo Fisher Scientific, Catalog # A-11008) as secondary antibody. |
| anti-PSD-95 | Abcam | ab2723, RRID:AB_303248 | Primary Antibody; use as 1:100, 10 μL in 1000 μL staining solution; use Alexa Fluor ® 594 goat anti-chicken IgG (1:800, Thermo Fisher Scientific, Catalog # A-11042) as secondary antibody. |
| anti-TFAM conjugated with Alexa Fluor 488 | Abcam | ab198308 | Primary Antibody; use as 1:400, 2.5 μL in 1000 μL staining solution; use mouse monoclonal IgG2b Alexa Fluor® 488 as an isotype control. |
| anti-TOMM20 conjugated with Alexa Fluor 488 | Santa Cruz Biotechnology | Cat# sc-17764 RRID:AB_628381 | Primary Antibody; use as 1:400, 2.5 μL in 1000 μL staining solution; use mouse monoclonal IgG2a Alexa Fluor® 488 as an isotype control. |
| anti-NDUFB10 | Abcam | ab196019 | Primary Antibody; use as 1:1000, 1 μL in 1000 μL staining solution; use Alexa Fluor ® 488 goat anti-rabbit IgG (1:400, Thermo Fisher Scientific, Catalog # A-11008) as secondary antibody; use rabbit monoclonal IgG as an isotype control. |
| anti-SDHA | Abcam | ab137040 | Primary Antibody; use as 1:1000, 1 μL in 1000 μL staining solution; use Alexa Fluor ® 488 goat anti-rabbit IgG (1:400, Thermo Fisher Scientific, Catalog # A-11008) as secondary antibody; use rabbit monoclonal IgG as an isotype control. |
| anti-COX IV | Abcam | ab14744, RRID:AB_301443 | Primary Antibody; use as 1:1000, 1 μL in 1000 μL staining solution; use Alexa Fluor ® 488 goat anti-mouse IgG (1:400, Thermo Fisher Scientific, Catalog # A-11001) as secondary antibody; use mouse monoclonal IgG as an isotype control. |
| Activin A | PeproTech | 120-14E | Astrocyte differentiation medium ingredient |
| ABM Basal Medium | Lonza | CC-3187 | Basal medium for astrocyte culture |
| AGM SingleQuots Supplement Pack | Lonza | CC-4123 | Supplement for astrocyte culture |
| Antibiotic-Antimycotic | Thermo Fisher Scientific | 15240062 | CDM ingredient |
| Advanced DMEM/F-12 | Thermo Fisher Scientific | 12634010 | Basal medium for dilute Geltrex |
| Bovine Serum Albumin | Europa Bioproducts | EQBAH62-1000 | Blocking agent to prevent non-specific binding of antibodies in immunostaining assays and CDM ingredient |
| BDNF | PeproTech | 450-02 | DA neurons medium ingredient |
| B-27 Supplement | Thermo Fisher Scientific | 17504044 | Astrocyte differentiation medium ingredient |
| BD Accuri C6 Plus Flow Cytometer | BD Biosciences, USA | ||
| Chemically Defined Lipid Concentrate | Thermo Fisher Scientific | 11905031 | CDM ingredient |
| Collagenase IV | Thermo Fisher Scientific | 17104019 | Reagent for gentle dissociation of human iPSCs |
| CCD Microscope Camera Leica DFC3000 G | Leica Microsystems, Germany | ||
| Corning non-treated culture dishes | Sigma-Aldrich | CLS430589 | Suspension culture |
| DPBS | Thermo Fisher Scientific | 14190250 | Used for a variety of cell culture wash |
| DMEM/F-12, GlutaMAX supplement | Thermo Fisher Scientific | 10565018 | Astrocyte differentiation basal Medium |
| EDTA | Thermo Fisher Scientific | 15575020 | Reagent for gentle dissociation of human iPSCs |
| Essential 8 Basal Medium | Thermo Fisher Scientific | A1516901 | Basal medium for iPSC culture |
| Essential 8 Supplement (50X) | Thermo Fisher Scientific | A1517101 | Supplement for iPSC culture |
| EGF Recombinant Human Protein | Thermo Fisher Scientific | PHG0314 | Supplement for NSC culture |
| FGF-basic (AA 10–155) Recombinant Human Protein | Thermo Fisher Scientific | PHG0024 | Supplement for NSC culture |
| Fetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich | 12103C | Medium ingredient |
| FGF-basic | PeproTech | 100-18B | Astrocyte differentiation medium ingredient |
| FCCP | Abcam | ab120081 | Eliminates mitochondrial membrane potential and TMRE staining |
| Fluid aspiration system BVC control | Vacuubrand, Germany | ||
| Formaldehyde (PFA) 16% | Thermo Fisher Scientific | 28908 | Cell fixation |
| Geltrex | Thermo Fisher Scientific | A1413302 | Used for attachment and maintenance of human iPSCs |
| GlutaMAX Supplement | Thermo Fisher Scientific | 35050061 | Supplement for NSC culture |
| GDNF | Peprotech | 450-10 | DA neurons medium ingredient |
| Glycine | Sigma-Aldrich | G8898 | Used for blocking buffer |
| Ham's F-12 Nutrient Mix | Thermo Fisher Scientific | 31765027 | Basal medium for CDM |
| Heregulin beta-1 human | Sigma-Aldrich | SRP3055 | Astrocyte differentiation medium ingredient |
| Hoechst 33342 | Thermo Fisher Scientific | H1399 | Stain the nuclei for confocal image |
| Heracell 150i CO2 Incubators | Fisher Scientific, USA | ||
| IMDM | Thermo Fisher Scientific | 21980032 | Basal medium for CDM |
| Insulin | Roche | 1376497 | CDM ingredient |
| InSolution AMPK Inhibitor | Sigma-Aldrich | 171261 | Neural induction medium ingredient |
| Insulin-like Growth Factor-I human | Sigma-Aldrich | I3769 | Astrocyte differentiation medium ingredient |
| KnockOut DMEM/F-12 medium | Thermo Fisher Scientific | 12660012 | Basal medium for NSC culture |
| Laminin | Sigma-Aldrich | L2020 | Promotes attachment and growth of neural cells in vitro |
| Leica TCS SP8 STED confocal microscope | Leica Microsystems, Germany | ||
| Monothioglycerol | Sigma-Aldrich | M6145 | CDM ingredient |
| MitoTracker Green FM | Thermo Fisher Scientific | M7514 | Used for mitochondrial volume indicator |
| MitoSox Red | Thermo Fisher Scientific | M36008 | Used for mitochondrial ROS indicator |
| N-Acetyl-L-cysteine | Sigma-Aldrich | A7250 | Neural induction medium ingredient |
| N-2 Supplement | Thermo Fisher Scientific | 17502048 | Astrocyte differentiation medium ingredient |
| Normal goat serum | Thermo Fisher Scientific | PCN5000 | Used for blocking buffer |
| Orbital shakers - SSM1 | Stuart Equipment, UK | ||
| Poly-L-ornithine solution | Sigma-Aldrich | P4957 | Promotes attachment and growth of neural cells in vitro |
| Poly-D-lysine hydrobromide | Sigma-Aldrich | P7405 | Promotes attachment and growth of neural cells in vitro |
| Purmorphamine | STEMCELL Technologies | 72204 | Promotes DA neuron differentiation |
| ProLong Gold Antifade Mountant | Thermo Fisher Scientific | P36930 | Mounting the coverslip for confocal image |
| PBS 1x | Thermo Fisher Scientific | 18912014 | Used for a variety of wash |
| Recombinant Human/Mouse FGF-8b Protein | R&D Systems | 423-F8-025/CF | Promotes DA neuron differentiation |
| SB 431542 | Tocris Bioscience | TB1614-GMP | Neural Induction Medium ingredient |
| StemPro Neural Supplement | Thermo Fisher Scientific | A10508-01 | Supplement for NSCs culture |
| TrypLE Express Enzyme | Thermo Fisher Scientific | 12604013 | Cell dissociation reagent |
| Transferrin | Roche | 652202 | CDM ingredient |
| TRITON X-100 | VWR International | 9002-93-1 | Used for cells permeabilization in immunostaining assays |
| TMRE | Abcam | ab113852 | Used for mitochondrial membrane potential staining |
| Water Bath Jb Academy Basic Jba5 JBA5 Grant Instruments | Grant Instruments, USA |
References
- Wang, Y., Xu, E., Musich, P. R., Lin, F. Mitochondrial dysfunction in neurodegenerative diseases and the potential countermeasure. CNS Neuroscience & Therapeutics. 25 (7), 816-824 (2019).
- Chen, A., et al. Nicotinamide riboside and metformin ameliorate mitophagy defect in induced pluripotent stem cell-derived astrocytes with POLG mutations. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 737304 (2021).
- Liang, K. X., et al. Disease-specific phenotypes in iPSC-derived neural stem cells with POLG mutations. EMBO Molecular Medicine. 12 (10), 12146 (2020).
- Chen, H., Chan, D. C. Mitochondrial dynamics--fusion, fission, movement, and mitophagy--in neurodegenerative diseases. Human Molecular Genetics. 18, 169-176 (2009).
- Lin, M. T., Beal, M. F. Mitochondrial dysfunction and oxidative stress in neurodegenerative diseases. Nature. 443 (7113), 787-795 (2006).
- Singh, A., Kukreti, R., Saso, L., Kukreti, S. Oxidative stress: A key modulator in neurodegenerative diseases. Molecules. 24 (8), Basel, Switzerland. 1583 (2019).
- Kondadi, A. K., Anand, R., Reichert, A. S. Functional interplay between cristae biogenesis, mitochondrial dynamics and mitochondrial DNA integrity. International Journal of Molecular Sciences. 20 (17), 4311 (2019).
- Sterneckert, J. L., Reinhardt, P., Schöler, H. R. Investigating human disease using stem cell models. Nature Reviews. Genetics. 15 (9), 625-639 (2014).
- Patani, R. Human stem cell models of disease and the prognosis of academic medicine. Nature Medicine. 26 (4), 449 (2020).
- Liang, K. X., et al. N-acetylcysteine amide ameliorates mitochondrial dysfunction and reduces oxidative stress in hiPSC-derived dopaminergic neurons with POLG mutation. Experimental Neurology. , 337 (2021).
- Kikuchi, T., et al. Human iPS cell-derived dopaminergic neurons function in a primate Parkinson's disease model. Nature. 548 (7669), 592-596 (2017).
- Juopperi, T. A., et al. Astrocytes generated from patient induced pluripotent stem cells recapitulate features of Huntington's disease patient cells. Molecular Brain. 5, 17 (2012).
- Liang, K. X., et al. Stem cell derived astrocytes with POLG mutations and mitochondrial dysfunction including abnormal NAD+ metabolism is toxic for neurons. bioRxiv. , (2020).
- Liu, Q., et al. Human neural crest stem cells derived from human ESCs and induced pluripotent stem cells: induction, maintenance, and differentiation into functional schwann cells. Stem Cells Translational Medicine. 1 (4), 266-278 (2012).
- Hong, Y. J., Do, J. T. Neural lineage differentiation from pluripotent stem cells to mimic human brain tissues. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 7, 400 (2019).
- Lundin, A., et al. Human iPS-derived astroglia from a stable neural precursor state show improved functionality compared with conventional astrocytic models. Stem Cell Reports. 10 (3), 1030-1045 (2018).
- Liang, K. X., et al. N-acetylcysteine amide ameliorates mitochondrial dysfunction and reduces oxidative stress in hiPSC-derived dopaminergic neurons with POLG mutation. Experimental Neurology. 337, 113536 (2021).
- Pendergrass, W., Wolf, N., Poot, M. Efficacy of MitoTracker Green™ and CMXrosamine to measure changes in mitochondrial membrane potentials in living cells and tissues. Cytometry. Part A. 61 (2), 162-169 (2004).
- Keij, J. F., Bell-Prince, C., Steinkamp, J. A. Staining of mitochondrial membranes with 10-nonyl acridine orange, MitoFluor Green, and MitoTracker Green is affected by mitochondrial membrane potential altering drugs. Cytometry. 39 (3), 203-210 (2000).
- Buckman, J. F., et al. MitoTracker labeling in primary neuronal and astrocytic cultures: influence of mitochondrial membrane potential and oxidants. Journal of Neuroscience Methods. 104 (2), 165-176 (2001).
- Zanchetta, L. M., Kirk, D., Lyng, F., Walsh, J., Murphy, J. E. Cell-density-dependent changes in mitochondrial membrane potential and reactive oxygen species production in human skin cells post sunlight exposure. Photodermatology, Photoimmunology & Photomedicine. 26 (6), 311-317 (2010).
